多診斷試劑盒的製作方法
2023-10-18 06:56:39
本發明涉及多診斷試劑盒。
背景技術：
：通常，用於診斷疾病如恙蟲病、鉤端螺旋體病和腎症候群出血熱的技術主要以以下方式進行：將生物樣品(如被懷疑感染了以上疾病的患者的血液或尿液)塗到診斷試紙條上並且檢查其與所述試紙條上的固定物的反應，由此確定患者是否感染了以上疾病。然而，這類技術只可用於診斷單一疾病，為了檢查多種疾病的感染，必須獨立地進行各個測試並且必須注入多個生物樣品，因此診斷過程非常複雜。技術實現要素：因此，考慮到相關技術中遇到的問題而做出了本發明，本發明旨在提供多診斷試劑盒，其可以快速且簡單地診斷恙蟲病、鉤端螺旋體病和腎症候群出血熱的感染。通過以下說明書，結合附圖，將清楚地理解本發明。本發明的實施方案提供包括試紙條的多診斷試劑盒，所述試紙條包含恙蟲抗原蛋白、鉤端螺旋體抗原和腎症候群出血熱抗原蛋白，所述恙蟲抗原蛋白含有恙蟲病東方體(orientiatsutsugamushi)gilliam、karp和kato的56kda融合蛋白(cr56)和恙蟲病東方體kangwon的56kda蛋白(kr56)。所述鉤端螺旋體抗原可包含從鉤端螺旋體的脂多糖(lps)中製備的核心多糖和o-特異側鏈。所述腎症候群出血熱抗原蛋白可包含核殼體蛋白，所述核殼體蛋白是從soochong病毒製備的並具有來自真核細胞的seqidno：2或3的胺基酸序列。根據本發明的實施方案，多診斷試劑盒可檢測恙蟲病、鉤端螺旋體病和腎症候群出血熱的感染。所述多診斷試劑盒可通過單次注入生物樣品而同時診斷多種疾病的感染。此外，所述多診斷試劑盒不包含任何非特異性抗體，從而確保高度精確的診斷結果。附圖說明從以下的詳細說明書並結合附圖，將更清楚地理解本發明的上述以及其它特徵和優點，其中：圖1示出了本發明的實施方案的多診斷試劑盒；圖2示出了本發明的實施方案的多診斷試劑盒的試紙條；圖3示出了本發明的實施方案的依賴恙蟲抗原蛋白濃度的試劑盒的反應；圖4示出了本發明的實施方案的依賴恙蟲抗原蛋白組成的試劑盒的反應；圖5示出了純化的多糖的抗原性，其是根據本發明的實施方案從patoc型和lai型中分離的多糖的sds-page(a)和蛋白質印跡法(b)的結果；圖6示出了本發明的實施方案的核殼體蛋白(np)、完整的np(cnp)和截短的np(cnp)在soochong病毒的s區段的基因結構；圖7示出了本發明的實施方案的聚合酶鏈反應(pcr)之後的tnp的dna條帶(約370bp)和cnp的dna條帶(約1300bp)；圖8示出了根據本發明的實施方案將tnp的dna和cnp的dna克隆到pgem-t-easypcr克隆載體中；圖9示出了根據本發明的實施方案將pgt-soov2-tnp和pgt-soov2-cnp的pcr產物克隆到在n-末端具有his-taq的杆狀病毒質粒載體中；圖10示出了根據本發明的實施方案使用杆狀病毒表達載體系統從pbac-soov2-tnp和pbac-soov2-cnp形成bac-soov2-tnp和bac-soov2-cnp；圖11示出了根據本發明的實施方案使用患者血清和正常血清檢測tnp的蛋白質印跡法的結果；以及圖12示出了本發明的實施方案的tnp和cnp的純化的粒狀沉澱(pellet)的蛋白質印跡法的結果。具體實施方式在下文中，將對本發明的實施方案進行詳細描述。本發明不限於本文所公開的實施方案，而是可以被修改為不同形式。提供這些實施方案是為了詳盡地解釋本公開內容並將本發明的精神充分地傳達給本領域技術人員。因此，所提出這些實施方案不應被理解為限制本發明。儘管術語如「第一」、「第二」等用於描述各種要素，但所述要素不應被此類術語所限制。這些術語僅用於將要素彼此區分。此外，當第一要素被描述為設置在第二要素上時，意味著第一要素可直接地形成於第二要素上，或在第一和第二要素之間可插入第三要素。在所有附圖中，可能誇大地描繪要素的尺寸或要素的相對尺寸以提供對本發明的容易理解的描述。此外，由於製造方法的變化，附圖中所示的要素的形狀可稍微改變。因此，除非另有說明，應理解，本發明的實施方案並不僅限於附圖中所示的形狀，一些修改可併入其中。如本文所用，術語「恙蟲病」是由恙蟲病東方體引起的疾病。如本文所用，術語「鉤端螺旋體病」是由鉤端螺旋體屬(leptospira)的致病螺旋茵引起的疾病。如本文所用，術語「腎症候群出血熱」是由漢他(hantaan)病毒和漢城(seoul)病毒引起的疾病。如本文所用，術語「診斷」指病理學狀態的存在或特徵的確定，並且在本發明中，診斷用來鑑定恙蟲病、鉤端螺旋體病和腎症候群出血熱。如本文所用，術語「樣品」指被懷疑感染了恙蟲病、鉤端螺旋體病和腎症候群出血熱的哺乳動物——包括人——的血液、血清和血漿。圖1示出了本發明的實施方案的多診斷試劑盒，圖2示出了本發明的實施方案的多診斷試劑盒的試紙條。參照圖1和2，多診斷試劑盒10可包括試紙條100，試紙條100可包括第一試紙條100a和第二試紙條100b。第一試紙條100a和第二試紙條100b可檢測來自樣品的恙蟲抗體、鉤端螺旋體抗體和腎症候群出血熱抗體。第一試紙條100a可檢測恙蟲igm抗體、鉤端螺旋體igm抗體和腎症候群出血熱igm抗體，第二試紙條100b可檢測恙蟲igg抗體、鉤端螺旋體igg抗體和腎症候群出血熱igg抗體。第一試紙條100a和第二試紙條100b中的每一個可包括支撐件110、反應膜120、樣品墊130、金標墊(goldconjugatepad)140、預反應線150、反應線160、對照線170、以及吸收墊180。支撐件110是試紙條100的基層，且在支撐件110上可設置反應膜120、樣品墊130、金標墊140和吸收墊180。反應膜120可為硝酸纖維素膜。在反應膜120上可設置預反應線150、反應線160和對照線170。預反應線150、反應線160和對照線170可以以2.0至4.5mm的間隔設置。樣品墊130可吸收經由樣品注入口200注入的樣品。第一試紙條100a的樣品墊130可通過以下步驟製造：浸入含有50mmtris(ph8.0)、1％吐溫20、0.5mnacl和0.1％nan3的溶液中，然後乾燥。第二試紙條100b的樣品墊130可通過以下步驟製造：浸入含有50mmtris(ph8.0)、1％吐溫20、0.2％bsa和0.1％nan3的溶液，然後乾燥。金標墊140可被設置成與樣品墊130重疊。被吸收到樣品墊130的樣品可通過毛細作用被移動到金標墊140中。金標墊140可包含標誌抗體(markerantibody)。所述標誌抗體可包含金標抗人igm、金標抗人igg和金標雞igy。所包含的金標抗人igm的濃度可為od1至3，所包含的金標抗人igg的濃度可為od2至4，所包含的金標雞igy的濃度可為od0.1至1。第一試紙條100a可包含金標抗人igm和金標雞igy，第二試紙條100b可包含金標抗人igg和金標雞igy。所述標誌抗體可與所述恙蟲抗體、鉤端螺旋體抗體以及腎症候群出血熱抗體結合，由此形成複合物。金標墊140可被設置成與反應膜120重疊，由此可使所述複合物向反應膜120移動。可使未與所述恙蟲抗體、鉤端螺旋體抗體以及腎症候群出血熱抗體結合的剩餘抗體向反應膜120移動。所述標誌抗體可包含有色顆粒。所述有色顆粒可為膠體金顆粒、有色玻璃或塑料珠。反應線160可包括第一反應線161、第二反應線162和第三反應線163。第一反應線161可包含鉤端螺旋體抗原。所述鉤端螺旋體抗原可包含源自鉤端螺旋體的脂多糖的核心多糖和o-特異側鏈。所包含的鉤端螺旋體抗原的濃度可為2至4mg/ml。在樣品包含鉤端螺旋體抗體的情況下，所述鉤端螺旋體抗體可與金標墊140中的標誌抗體結合，由此形成複合物。當所述複合物經過第一反應線161時，所述鉤端螺旋體抗體可與第一反應線161的鉤端螺旋體抗原結合。這種結合使得所述標誌抗體的有色顆粒能夠在第一反應線161中沉澱析出，從而形成紫紅色條帶。第二反應線162可包含恙蟲抗原蛋白。所述恙蟲抗原蛋白可包含以5∶3的體積比混合的恙蟲病東方體gilliam、karp和kato的56kda基因重組蛋白和恙蟲病東方體kangwon的56kda蛋白。所包含的恙蟲抗原蛋白的濃度可為0.4至0.8mg/ml。在樣品包含恙蟲抗體的情況下，所述恙蟲抗體可與金標墊140中的標誌抗體結合，由此形成複合物。當所述複合物經過第二反應線162時，所述恙蟲抗體可與第二反應線162的恙蟲抗原蛋白結合。這種結合使得所述標誌抗體的有色顆粒能夠在第二反應線162中沉澱析出，從而形成紫紅色條帶。第三反應線163可包含腎症候群出血熱抗原蛋白。所述腎症候群出血熱抗原蛋白可包含源自soochong病毒的具有seqidno：2的胺基酸序列的完整的核殼體蛋白(cnp)或源自soochong病毒的具有seqidno：3的胺基酸序列的截短的核殼體蛋白(tnp)。所包含的腎症候群出血熱抗原蛋白的濃度可為0.1至1.0mg/ml。在樣品包含腎症候群出血熱抗體的情況下，所述腎症候群出血熱抗體可與金標墊140中的標誌抗體結合，由此形成複合物。當所述複合物經過第三反應線163時，所述腎症候群出血熱抗體可與第三反應線163的腎症候群出血熱抗原蛋白結合。這種結合使得所述標誌抗體的有色顆粒在第三反應線163中沉澱析出，從而形成紫紅色條帶。可使未與所述恙蟲抗體、鉤端螺旋體抗體以及腎症候群出血熱抗體結合的剩餘標誌抗體通過反應線160向對照線170移動。預反應線150可包括第一預反應線151和第二預反應線152。第一預反應線151可包含大腸桿菌(e.coli)提取物。所述大腸桿菌提取物可與第一非特異性抗體結合。所述第一非特異性抗體可為與源自大腸桿菌的蛋白結合的抗體。第一預反應線151可排除以下情況：儘管實際上不存在針對恙蟲抗原蛋白的抗體，但由於上述非特異性抗體與包含在恙蟲抗原蛋白中的源自大腸桿菌的蛋白的結合，所述抗體實際上不存在但卻被誤判為存在。第二預反應線152可包含昆蟲細胞sf(草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda))提取物。所述昆蟲細胞sf提取物可與第二非特異性抗體結合。所述第二非特異性抗體可為與源自昆蟲細胞sf的蛋白結合的抗體。第二預反應線152可排除以下情況：由於上述非特異性抗體與包含在腎症候群出血熱抗原蛋白中的源自昆蟲細胞sr21的蛋白的結合，針對腎症候群出血熱抗原蛋白的抗體實際上不存在但卻被誤判為存在。對照線170可包含對照蛋白。所述對照蛋白可與所述標誌抗體結合。這種結合使得所述標誌抗體的有色顆粒能夠在對照線170中沉澱析出，從而形成紫紅色條帶。所述對照蛋白可為選自山羊抗雞igy多克隆抗體(山羊抗雞igy)、兔抗山羊igg多克隆抗體和兔抗山羊igm多克隆抗體的至少一種。所包含的對照蛋白的濃度可為0.1至2mg/ml。吸收墊180可吸收沿著反應膜120移動的剩餘樣品。吸收墊180可被設置成與反應膜120重疊。針對恙蟲抗原蛋白的實施例實施例1.抗原蛋白的表達和分離1.1.嵌合重組56kda(cr56)蛋白的表達恙蟲病東方體以與韓國專利申請公布第2002-0020281號中公開的實施例的方法相同的方式表達、分離和純化包含恙蟲病東方體gilliam、karp和kato的主要表位的嵌合重組蛋白(cr56)。具體而言，將恙蟲病東方體gilliam、karp和kato株在小鼠l-929細胞中培養，收集，然後純化。將純化的株用酶消化，隨後通過苯酚提取和乙醇沉澱進行dna純化。基於恙蟲病東方體的56kda蛋白基因的鹼基順序，在gilliam、karp和kato血清型中選擇具有30％或更高胺基酸序列同源性的蛋白位點，並且針對gilliam、karp和kato株的各株製備一對寡核苷酸引物。使用所提取的恙蟲病東方體的dna作為模板，採用各引物對進行pcr，以擴增gilliam、karp和kato株的dna片段。將pcr產物純化並克隆，以連接在ptyb12載體的相應限制酶消化位點。首先，將gilliam株的dna片段引入到ptyb12載體中以製備載體ptg3，並將karp株的dna片段引入到ptg3載體中以製備載體ptgp1。將kato株的dna片段引入到ptgp1載體中以製備載體ptgpt2。進一步將與gilliam、karp和kato株的dna片段串聯的連接體從ptgpt2載體上切下，並將所述連接體引入pet22b(+)載體中以製備載體petb7。採用所製備的表達載體轉化大腸桿菌，然後培養所述經轉化的大腸桿菌以誘導融合蛋白的表達。使用電泳和蛋白質印跡法鑑定所述融合蛋白，之後分離並純化所表達的融合蛋白抗原。1-2.重組kangwon56kda蛋白(kr56)的表達考慮到株系被分為全球原型株karp、gilliam和kato以及yonchon(與kangwon最相似)，基於種系發生分析(phylogenicanalysis)的結果(femamicrobiologyletters，1999，180：163-169)，上述四種株系被認為最適合用作抗原。karp、gilliam和kato由cr56表示。同樣，yonchon被表示為kangwon的kr56，kangwon與yonchon相似。本發明人使用kangwon56kda重組蛋白(kr56)作為嵌合重組蛋白(cr56)的輔助抗原。(1)kangwon56kda蛋白(kr56)表達的概述對被稱為kangwon87-61的主要抗原結構域的84(250bp)至445(1335bp)長的一部分胺基酸序列進行修飾以包含ncoi和sali識別位點，製備一對引物並進行pcr。採用限制酶ncoi和sali對pcr產物和表達載體pet30a進行消化，然後將它們彼此連接。使用所得到的質粒轉化大腸桿菌bl21，然後從所述大腸桿菌bl21中提取蛋白。上述引物示於下表1。[表1]＊質粒pet30a表達his-標記的融合蛋白。(2)基因克隆與表達將通過聚合酶鏈反應擴增的dna(84(250bp)至445(1335bp)的362個胺基酸(共1086bp))在1.2％瓊脂糖凝膠中進行電泳，然後使用qiagen凝膠洗脫試劑盒(qiageninc.，美國)回收。將經擴增以適合於所需大小的dna條帶在紫外透射儀上切下，轉移至微量管，以相當於瓊脂糖凝膠體積3倍的量加入nai溶液，並在60℃下靜置5分鐘，以便凝膠完全溶解。進一步向凝膠溶液中加入玻璃乳(glassmilk)，攪拌10秒鐘，並在室溫下在17000g(hanil，ai.5s-24，12000rpm)下離心1分鐘，隨後除去上清液。使微量管在室溫下靜置5分鐘，然後乾燥。向其中加入洗脫緩衝液，之後攪拌微量管，然後在17000g(12000rpm)下離心，並將上清液轉移至新的微量管。將純化的pcr產物和pet30a載體用限制酶ncoi和sali完全消化，然後使用geneclean試劑盒ii通過相同的方法回收。將100ng經限制酶酶切的載體和100ng經限制酶酶切的pcr產物互相混合，與10×連接酶緩衝液(250mmtris-hclph7.8、100mmmgcl2、20mmdtt和4mmatp)和連接酶結合，並在4℃下反應18小時。(3)感受態細胞的製備與轉化將在lb培養基中培養了18小時的大腸杆茵bl21細胞用lb培養基稀釋100倍，然後再培養至在600nm處的吸光度達到0.3。使細胞在冰中靜置30分鐘，之後輕輕倒出培養基上清液，並以等於培養基體積一半的量加入0.1mcacl2，以懸浮大腸桿菌細胞。將懸浮的大腸桿菌細胞在冰中靜置1小時，在2000g(4100rpm)下離心10分鐘，然後懸浮於為培養基體積十分之一的0.1mcacl2中，然後用於轉化。(4)轉化將上述(3)中製備的感受態細胞與連接產物混合，置於冰中，然後在42℃下熱激1分30秒。向所得混合物中加入lb培養基，並在37℃下培養1小時。將肉湯接種到lb瓊脂平板培養基中，然後在37℃下培養。(5)從轉化的大腸杆茵中分離質粒dna將轉化的大腸杆茵的單個茵落接種到含有卡那黴素的lb培養基中，然後在37℃下震蕩培養。使用accuprep質粒提取試劑盒(accuprepplasmidextractionkit)進行質粒dna的提取。將肉湯在室溫下在750g(2500rpm)下離心10分鐘，由此僅回收細胞粒狀沉澱，然後向所述細胞粒狀沉澱中加入再懸浮緩衝液，攪拌，加入裂解緩衝液，然後在室溫下靜置5分鐘。向所得產物中加入中和緩衝液，在室溫下靜置，然後在17000×g(12000rpm)下離心，之後將上清液轉移到結合柱管中，然後在室溫下在17000×g(12000rpm)下離心，以除去經提取的溶液。隨後，進行80％乙醇等分(aliquoting)和離心，之後僅將結合柱放置在新試管中。向結合柱中加入洗脫緩衝液，使其在室溫下靜置，並離心，然後將上清液轉移至新微量管中。(6)蛋白表達和分離將當前的培養基在37℃下採用種子培養方法的肉湯進行接種，在220rpm下攪拌1小時45分鐘，當od為0.5至0.6時採用0.5mmiptg進行接種，並培養3小時。其後，在4℃下在3000rpm下離心30分鐘，向粒狀沉澱中加入1×結合緩衝液(6m尿素、500mmnacl、20mmtris-hcl(ph8.0)、5mm咪唑)，並使用超聲波儀將細胞破碎(脈衝：10秒開，20秒關，時間：6分鐘×2次(在此期間進行一次換向)，amp.：45％)。其後，將kr56在4℃下在14000rpm(高壓滅菌的超速離心機瓶中的轉子7)下離心15分鐘，之後，將上清液冷凍，並將粒狀沉澱再懸浮於1×結合緩衝液(50ml，基於1l錐形瓶中的肉湯計)。將粒狀沉澱在冰中放置1小時(靜置30分鐘，然後倒置)，在4℃下在14000rpm(高壓滅菌的超速離心機瓶中的轉子7)下離心30分鐘，從而得到上清液。將上清液用1×結合緩衝液(6m尿素)稀釋2倍，過濾(0.45nm注射過濾器)並在4℃下儲存。(7)蛋白純化採用2mlhisbind樹脂(novagen)填充柱，然後使用蒸餾水、1×載樣緩衝液(chargebuffer)和1×結合緩衝液進行準備。使抗原蛋白穿過所述柱以後，採用1×洗滌緩衝液洗滌所述柱。使1×洗脫緩衝液(6m尿素、500mmnacl、20mmtris-hcl(ph8.0)、500mm咪唑)穿過所述柱，回收1ml的每種蛋白。採用amiconultra30k進行濃縮後，使用bca蛋白測定確定各級分中蛋白的濃度。對於包含在實施例1的恙蟲抗原蛋白中的恙蟲病東方體kangwon的56kda蛋白的具體胺基酸序列，可參見韓國專利第10-0796772號中公開的胺基酸序列。實施例2.依賴抗原濃度的試劑盒的反應(以確定假陽性)以0.6mg/ml、0.9mg/ml、1.2mg/ml和1.5mg/ml的濃度製備實施例1的恙蟲抗原蛋白。製備四個包含相應濃度的恙蟲抗原蛋白的試劑盒。使用免疫螢光抗體試驗(其為一種診斷恙蟲病的標準試驗方法)評價患者的樣品，之後製備一個陰性血清(dk13)和三個陽性血清(90-202、00-350、89-129)，將它們加到具有不同抗原濃度的各診斷試劑盒以觀察反應。圖3示出了本發明的實施方案的依賴恙蟲抗原蛋白濃度的試劑盒反應。依賴恙蟲抗原蛋白濃度的試劑盒反應在下表2中給出。[表2]從表2和圖3中可明顯看出，其中恙蟲抗原蛋白的濃度為0.9mg/ml、1.2mg/ml和1.5mg/ml的診斷試劑盒是假陽性，而其中恙蟲抗原蛋白的濃度為0.6mg/ml的診斷試劑盒不是假陽性。實施例3.依賴混合抗原組成的試劑盒反應以0.6mg/ml製備實施例1的恙蟲抗原蛋白，並以相同的濃度製備常規恙蟲抗原蛋白。常規恙蟲抗原蛋白由cr56、kr56和r21蛋白組成，所述cr56、kr56和r21蛋白以5∶2∶1的比例混合。製造包含實施例1的恙蟲抗原蛋白的診斷試劑盒以及包含常規恙蟲抗原蛋白的診斷試劑盒，並測量其對於陰性和陽性血清的反應性。作為對照組，通過ifa測量了陰性和陽性血清的ab效價。圖4示出了本發明的實施方案的依賴恙蟲抗原蛋白組成的試劑盒反應。常規恙蟲抗原蛋白和實施例1的恙蟲抗原蛋白的抗體應答的靈敏度結果由-＝0、+＝1、++＝2、+++＝3、++++＝4表示，如下表3所示。[表3]從表3和圖4中可明顯看出，當恙蟲抗原蛋白不合有r21並且kr56的量增加時，抗體應答的靈敏度升高。針對鉤端螺旋體抗原的實施例實施例4.鉤端螺旋體抗原4-1.鉤端螺旋體株的培養將emjh(鉤端螺旋體培養基基底ellinghausenmcculloughjohnsonharris)以0.23g/90ml溶解並消毒，然後加入10ml富含鉤端螺旋體的emjh以製備培養基。將該培養基用鉤端螺旋體接種並在30℃下震蕩培養5天。4-2.鉤端螺旋體抗原的製備將在emjh培養基中培養了5天的鉤端螺旋體在4000×g下離心20分鐘，採用1×pbs緩衝液(137mmnacl、2.7mmkcl、10mmna2hpo4和2mmkh2po4)洗滌三次，然後在100℃下加熱1小時。使其與150μg/ml蛋白酶k在37℃下反應16小時，加入2mmegta，使其在70℃下反應15分鐘，然後在4℃下在180000×g下離心2小時。將所得粒狀沉澱懸浮於h2o中，以得到脂多糖(westpha和jann，1965)。將如此純化的lps抗原用1％乙酸處理，在100℃下加熱1小時，並在3000×g下離心20分鐘，將沉澱析出的脂質a除去，得到多糖抗原。使用標準多糖測量如此獲得的抗原的量，所述標準多糖是通過以與上述相同的方式處理從大腸桿菌(escherichiacoli)中純化的lps(sigma)而得到的。實施例5.鉤端螺旋體多糖的抗原性評價5-1.蛋白質印跡法使用bio-radproteanii電泳裝置在厚度為1mm或1.5mm的12％凝膠上進行sds-page。使用bio-rad轉印槽(transblotcell)在80v下在30分鐘內將蛋白從電泳後的凝膠中轉移到膜上。將轉移後的膜用含有5％脫脂乳和0.1％吐溫20的1×tbs緩衝液封閉，一抗為兔免疫血清(問號鉤端螺旋體(l.interrogans)株wh-19)，二抗為稀釋至1∶10000的辣根過氧化物酶綴合的抗兔igg(bio-rad)。免疫反應完成後，使用ecl試劑盒(amershampharmaciabiotech)進行顯色。圖5示出了純化的多糖的抗原性，其是根據本發明的實施方案從patoc型和lai型中分離的多糖的sds-page(a)和蛋白質印跡法(b)的結果。如圖5所示，問號鉤端螺旋體(leptospirainterrogans)血清變lai型的多糖在sds-page凝膠電泳圖方面與問號鉤端螺旋體血清變型patoc型株patoc的多糖相似，並且14kda或更大的多糖存在於lai型和patoc型二者中並被認為充當抗原。5-2.斑點印跡法將1μg(1μg/1μl)抗原滴加到硝酸纖維素膜上，然後在37℃下乾燥1小時。將乾燥後的膜用5％脫脂乳-tbst封閉1小時，使其與作為一抗的患者血清(稀釋至1∶3000)反應1小時，並與作為二抗的辣根過氧化物酶綴合的抗人igg(稀釋至1∶10000)反應。反應完成後，使用ecl試劑盒進行顯色，並將其結果與mat結果進行比較。在大多數患者血清中，觀察到陽性信號。下表4示出了mat和斑點印跡法的比較結果。[表4]5-3.酶聯免疫吸附測定(elisa)在engvall和perlmann(1972)的方法的基礎上進行多糖elisa。將聚-l-賴氨酸(10μg/ml)用0.01mpbs稀釋以預處理板，並使其在室溫下反應24小時。將所述板用含有0.05％吐溫20的pbs緩衝液洗滌兩次，之後將多糖懸浮於pbs中用100μl/孔處理所述板。使經處理的板在37℃下反應1小時，採用含有0.05％吐溫20的pbs緩衝液洗滌三次，採用山羊血清處理，並在37℃下進行封閉。使用20名鉤端螺旋體病患者的血清和20名正常人的血清作為一抗，並使用辣根過氧化物酶綴合的抗人igg(bio-rad)(稀釋至1∶10000)作為二抗。每個孔用底物處理以由此觀察其顯色，使用酶標儀在490nm處測量吸光度。結果，發現鉤端螺旋體鞭毛(leptospiraflagella)重組蛋白表現出72％至88％的靈敏度和88％至90％的特異性，而本發明的多糖呈現出95％的靈敏度和95％的特異性。因此，作為用於鉤端螺旋體病早期診斷的抗原候選物，發現所述多糖優於所述蛋白。使用elisa對所述多糖的靈敏度和特異性進行測量的結果示於下表5。[表5]a：通過mat診斷的患者血清數：20b：正常血清數：20針對腎症候群出血熱抗原蛋白的實施例實施例6.soochong病毒和培養細胞將從韓國的大林姬鼠(apodemuspeninsulae)中分離的soochong病毒株soov-2在vero細胞中傳代培養。為了vero細胞的增殖和維持，在37℃的培養箱中使用含有10％胎牛血清(pbs)的emem(eagle最低基礎培養基)在5％cｏ2存在下進行培養，當培養至約90％的單層時使用細胞。實施例7：病毒rna的分離將soochong病毒在其中增殖的細胞在1075g(3000rpm)下離心3分鐘，加入750μltrizolls(gibco)溶液，使其在室溫下靜置5分鐘，加入200μl氯仿，然後再在室溫下靜置10分鐘。在4℃下在17000g(12000rpm)下離心15分鐘，之後除去沉澱析出的粒狀沉澱，向上清液中加入相同體積的異丙醇，使其在室溫下靜置10分鐘，在4℃下在17000g(12000rpm)下離心15分鐘，從而使rna沉澱析出，之後將所得到的rna粒狀沉澱用75％乙醇洗滌一次，在空氣中乾燥10分鐘，然後溶解於depc水溶液中。實施8：cdna的合成與pcr圖6示出了本發明的實施方案的核殼體蛋白(np)、完整的np(cnp)和截短的np(cnp)在soochong病毒的s區段的基因結構，圖7示出了本發明的實施方案在pcr之後的tnp的dna條帶(約370bp)和cnp的dna條帶(約1300bp)。用於製備soochong病毒重組抗原的pcr引物示於下表6中。[表6]從圖6和表6中可明顯看出，為了從編碼np的核酸序列(genbank登記號ay675350)seqidno：1合成cdna，向4μl實施例7的rna溶液中加入1μl表6中的各引物(10pmol)並加入包含5×逆轉錄酶緩衝液、10mmdntps、100pmol/μloligo(dt)、40單位/μlrna酶抑制劑(rnasin)和200單位/μlmmlv逆轉錄酶的混合物。反應在30℃下進行10分鐘，在45℃下進行30分鐘，在99℃下進行5分鐘並在5℃下進行5分鐘，得到cdna。包含5μlcdna產物、10pmol引物對、10mmdntps、10×taq緩衝液和5單位/μltaq聚合酶的混合物的pcr以如下的循環進行一次：95℃5分鐘、52℃2分鐘和72℃2分鐘；以如下的循環進行五次：95℃1分鐘、52℃1分鐘和72℃1分鐘；以如下的循環進行20次：95℃1分鐘、60℃1分鐘和72℃1分鐘；並以如下的循環進行一次：95℃1分鐘、60℃1分鐘和72℃7分鐘，從而擴增dna。將擴增的dna在-20℃下保存。圖7示出了pcr之後的tnp的dna條帶(約370bp)和cnp的dna條帶(約1300bp)。如圖7所示，使用各引物進行pcr，由此在約370bp處鑑定tnp的dna條帶，並在約1300bp處鑑定cnp的dna條帶。實施9.擴增產物的克隆圖8示出了本發明的實施方案的將tnp的dna和cnp的dna克隆到pgem-t-easypcr克隆載體中。如圖8所示，將通過pcr擴增的在約370bp和約1300bp處的dna在瓊脂糖凝膠上進行電洗脫並克隆到pgem-teasypcr克隆載體(invitrogen)中。通過採用限制酶bglii和hindiii的消化來鑑定tnp和cnp的dna。這旨在製備cnp(1287bp：37-1323)和tnp(357bp：37-393)多肽。其胺基酸序列示於seqidno：2和3中。將其中插入了含tnp的369bp的質粒稱為pgt-soov2-tnp，將其中插入了含cnp的1299bp的質粒稱為pgt-soov2-cnp。實施例10.克隆到表達載體中圖9示出了本發明的實施方案的將pgt-soov2-tnp和pgt-soov2-cnp的pcr產物克隆到在n-末端具有his-taq的杆狀病毒質粒載體中。如圖9所示，將在n-末端具有his-taq的表達融合載體，即pblue-bac-his2b(invitrogen)，採用限制酶bglii和hindiii處理，並將pgt-soov2-tnp和pgt-soov2-cnp的pcr產物採用限制酶bglii和hindiii進行克隆，從而得到pbac-soov2-tnp和pbac-soov2-cnp。實施例11.重組杆狀病毒的形成圖10示出了本發明的實施方案的使用杆狀病毒表達載體系統從pbac-soov2-tnp和pbac-soov2-cnp形成bac-soov2-tnp和bac-soov2-cnp。如圖10所示，使用bac-n-blue杆狀病毒表達載體系統將pbac-soov2-tnp和pbac-soov2-cnp製成bac-soov2-tnp和bac-soov2-cnp。將對數期的sf9細胞(2×106)置於60mm的平皿中以形成單層。為了製備轉染混合物，將10μl(0.5μg)bac-n-bluetmdna置於微量離心機中，並加入以下溶液。pbac-soov2-tnp或pbac-soov2-cnp(1μg/μl)：4μlgrace昆蟲培養基(沒有補充劑或fbs)：1mlcellfectin試劑(在使用前混合均勻並在使用過程中不斷混合)：20μl使平皿在室溫下靜置15分鐘，從平皿中除去培養基，之後加入2ml既不合有補充劑也不合有fbs的grace昆蟲培養基，從單層中再次除去培養基，並將所製備的轉染混合物滴加到60mm的平皿中。使該平皿在室溫下靜置約4小時，加入1mltnm-fh培養基，密封，並在27℃下孵育72小時。當以這種方式進行共轉染時，將複製的重組杆狀病毒用作病毒原種(stock)。實施例12.重組杆狀病毒的純化使用終點稀釋法測量所述病毒原種的濃度。對於確定病毒效價的終點稀釋，對病毒接種溶液進行10-5至10-8倍的連續稀釋，將各稀釋溶液接種到以1×104/孔的細胞濃度等分到96孔板上的培養細胞中，並在27℃下進行連續培養。從感染了病毒的孔與未感染病毒的孔的比例計算病毒效價，以確定pfu(噬斑形成單位)。為了選擇純的病毒，將病毒接種溶液稀釋10-2至10-8倍，將各稀釋溶液接種到以1×104/孔的細胞濃度等分到96孔板上的培養細胞中，並在27℃下進行連續培養。從接種後第四天起，使用顯微鏡觀察到細胞內多面體晶體的形成以及病毒感染，選擇最大稀釋因子的孔中的病毒，並以相同的方式純化至少三次，最終得到純的病毒。實施例13.重組蛋白的表達和分離將sf9昆蟲細胞以約5×106的密度播種在75cm2燒瓶中，並用5moi重組病毒接種。在感染後第五天，觀察到包含體的形成並回收所有細胞。將回收的細胞在6000g(7000rpm)下離心，並收集粒狀沉澱，懸浮於1×結合緩衝液(5mm咪唑、20mmtris-hclph7.9、0.5mnacl)中，並使用超聲波儀在18hz下攪拌六次，每次15秒。在23400g(14000rpm)下離心15分鐘，並以可溶形式保存上清液。同樣，將不溶形式的粒狀沉澱懸浮於含有6m尿素的1×結合緩衝液中，使其在4℃下靜置1小時，並在23400g(14000rpm)下離心30分鐘以回收上清液(裂解的粒狀沉澱)。將經回收的裂解的粒狀沉澱通過his-結合色譜法純化以得到純化的粒狀沉澱。使所述可溶形式，裂解的粒狀沉澱和純化的粒狀沉澱進行sds-page，並通過蛋白質印跡法鑑定其中存在所述重組蛋白的任何級分。作為對照，使用野生型病毒感染的細胞的可溶形式。對於蛋白質印跡法，使用患有腎症候群出血熱(hfrs)的患者的血清和正常血清作為一抗。圖11示出了本發明的實施方案的使用患者血清和正常血清來檢測tnp的蛋白質印跡法的結果，其中下部箭頭處的條帶被指認為tnp的部分降解。左邊的圖像示出了使用患有腎症候群出血熱的患者的血清作為一抗的結果，右邊的圖像示出了使用正常血清作為一抗的結果(第1道：感染了野生型杆狀病毒的細胞的溶液形式，第2道：感染了重組杆狀病毒的細胞的可溶形式，第3道：採用含有尿素的緩衝液處理細胞的不溶形式然後離心後的裂解的粒狀沉澱，第4道：3的純化的粒狀沉澱)。如圖11所示，對於tnp，該蛋白以可溶形式存在的量比以不溶形式存在的量更大。除了在22kda處的特異條帶——其對應tnp級分——之外，基於患者血清的蛋白質印跡法的結果，可以看出即使在純化的粒狀沉澱以及可溶形式中，本應顯示為弱的下部條帶是強的，因此認為這是由特異性反應引起的。對於正常血清，兩個條帶均未出現。下部條帶被認為是由tnp的部分降解造成的。圖12示出了本發明的實施方案的tnp和cnp的純化的粒狀沉澱的蛋白質印跡法的結果(第1道：未感染病毒的細胞，第2道：感染了杆狀病毒的細胞，第3道：感染了cnp克隆的重組杆狀病毒的細胞，第4道：感染了tnp克隆的重組杆狀病毒的細胞，第5道：感染了cnp克隆的重組杆狀病毒的細胞，第6道：感染了tnp克隆的重組杆狀病毒的細胞)。如圖12所示，僅在患有腎症候群出血熱(hfrs)的患者中觀察到cnp，並證實產生了約50kda的重組蛋白。實施例14：通過his-結合親和色譜法的重組蛋白的純化採用2mlhis-結合樹脂(novagen)填充柱，並使用蒸餾水、1×載樣緩衝液和1×結合緩衝液進行準備。使抗原蛋白穿過所述柱，採用1×結合緩衝液(5mm咪唑、20mmtris-hclph7.9、0.5mnacl)和1×洗滌緩衝液(40mm咪唑、20mmtris-hclph7.9、0.5mnacl)洗滌所述柱。使洗脫緩衝液(300mm咪唑、0.5mnacl、20mmtris-clph7.9)穿過所述柱以回收1ml的每種蛋白。通過lowry測定法確定各級分中蛋白的濃度。進行sds-page和蛋白質印跡法以鑑定蛋白。實施例15.重組蛋白測定法15-1.蛋白質印跡法在厚度為1mm或1.5mm的10％凝膠上對10μg純化的重組蛋白/孔進行電泳。使用bio-rad運送器在80v下在40分鐘內轉移電泳後的凝膠。將轉移後的膜用5％脫脂乳-tbst(tris緩衝的鹽水-吐溫20)封閉1小時，使其與作為一抗的患者血清(稀釋至1∶3000)反應1小時，並與作為二抗的辣根過氧化物酶綴合的抗人igg(稀釋至1∶10000)反應。反應完成後，使用ecl試劑盒進行顯色。基於蛋白質印跡法的結果，重組cnp和tnp只在患有腎症候群出血熱的患者的血清中分別在約50kda和22kda處反應，但不與正常血清反應。15-2.斑點印跡法將1μg重組蛋白滴加到硝酸纖維素膜上並在37℃下乾燥1小時。將乾燥後的膜用5％脫脂乳-tbst封閉1小時，使其與作為一抗的患者血清和正常血清(稀釋至1∶3000)反應1小時，並與作為二抗的辣根過氧化物酶綴合的抗人igg(稀釋至1∶10000)反應。反應完成後，使用ecl試劑盒進行顯色。使用感染了漢他病毒或漢城病毒的患有腎症候群出血熱(hfrs)的患者的血清進行斑點印跡法。如下表7所示，在cnp中顯示的陽性信號比在tnp中顯示的更強，並且與正常血清沒有發生反應。[表7]a：數據以強陽性(+++)、中陽性(++)或弱陽性(+)斑點印跡法結果的形式表示。＊十份正常血清不與重組np抗原反應。15-3.elisa將重組蛋白抗原用0.05m碳酸鹽緩衝液(ph9.6)在1μg/ml下進行稀釋，加入96孔微量板中，然後使其在4℃反應18小時。採用含有0.05％吐溫20的pbst洗滌兩次，並採用3％bsa在37℃下封閉2小時。使用稀釋形式的感染漢他病毒、漢城病毒、pummala病毒或prospecthill病毒的大鼠的血清作為一抗，二抗為稀釋至1∶6000的辣根綴合物抗大鼠igg(igm)。使用底物溶液進行顯色，使用酶標儀在490nm的波長下測量od。從下表8中可明顯看到，重組抗原cnp與漢他病毒和漢城病毒反應但不與pummala病毒或prospecthill病毒反應。[表8]針對以下病毒的大鼠抗血清漢他漢城pummalaprospecthill通過elisa測定的cnp的反應性++++++--儘管為了說明的目的公開了本發明的優選的實施方案，但是本領域技術人員將理解，在不背離所附權利要求書中公開的本發明的範圍和精神的情況下，可以從所述實施方案中做出各種修改和其他等同的實施方案。所公開的實施方案應被認為是示例性的而非限制性的。本發明的範圍並非示於上述說明書中而是示於權利要求書中，在與其等同的範圍內的所有變異應理解為併入本發明。當前第1頁12