菸草根特異啟動子NtR2及其在轉基因植物上的應用的製作方法
2023-10-20 06:11:22
菸草根特異啟動子NtR2及其在轉基因植物上的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及菸草根特異啟動子NtR2及其在轉基因植物上的應用，屬於植物基因工程【技術領域】，本發明利用特異啟動子來安全有效的解決菸草生產過程中的根部病蟲害。所述菸草根特異啟動子，其至少含有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。在pBI121上構建由NtR2::GUS融合基因的植物表達載體，遺傳轉化本生菸草，通過GUS染色，表明該啟動子只在菸草根部表達，而不在菸草的其它器官表達，具有較強的特異性。
【專利說明】菸草根特異啟動子NtR2及其在轉基因植物上的應用
[0001]【技術領域】
本發明涉及一種菸草根特異啟動子NtR2及其在轉基因植物上的應用，屬於植物基因工程【技術領域】。
[0002]【背景技術】
長期以來菸草根部病害是影響菸草產量和品質的主要病害，如菸草青枯病、根腐病等，菸草青枯病是毀滅性病害，病菌從根部侵入，菸草青枯病是我國南方和長江流域的重要病害，屬細菌性病害，主要從根部侵入，很快導致植株枯萎死亡；由於尚無有效的防治藥劑，植物青枯病長期以來一直未能解決，對菸草青枯病的防治至今沒有特效藥可治。
[0003]關於根部特異表達的啟動子報導較少。Schneider K等利用T-DAN標籤技術分離克隆了可在Arabidopsis根毛表皮細胞中特異表達的核蛋白基因；Xu Y等對編碼水稻根部特異表達蛋白的兩個cDNA克隆(RCc2和RCc3的特性進行深入分析，發現其編碼的蛋白主要在幼根中表達)。目前在菸草上已克隆出一些組織特異性的啟動子，如種皮特異性啟動子、花葯特異啟動子TA29等(Fobert, 1994;李國勝等，1995)。Yamamoio等人(1991)報導菸草根特異表達的TobRB7基因的cds片段5』上遊ISOObp區段中的片段，具根組織特異表達調控功能，但主要在菸草幼根中表達。
[0004]福建農林大學油料所莊偉建等人(2010)報導菸草根特異啟動子NtR12，在菸草根部表達，表達量大大超過對照Pbi 121載體，莖部也微量表達，目前尚未見將菸草組織特異表達啟動子應用於轉外源目的基因的報導。
[0005]由於菸草是四倍體，遺傳背景及其複雜，選育良好的栽培種非常困難，而目前主要栽培的品種經過多年栽培，已經容易產生根部病蟲害。植物基因組學與功能基因組學的快速發展，通過分子育種來解決以往常規育種沒有辦法解決的科學難題已經成為了可能。定向的分子育種首先要考慮到啟動子，不同類型的啟動子給植物生長也帶來不同的影響，隨著轉基因安全性得到了普遍關注，因此選擇有效的啟動子成為了當前分子安全育種的熱點與難點。
[0006]
【發明內容】
本發明提供了一種菸草根特異啟動子NtR2及其在轉基因植物上的應用，利用特異啟動子來安全有效的解決菸草生產過程中的根部病蟲害。
[0007]本發明的菸草根特異啟動子，其至少含有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0008]克隆該菸草根特異啟動子的方法，是利用基因晶片進行了菸草各器官RNA差異雜交和表達譜分析，從中又篩選分離了高效根特異表達基因，RT-PCR鑑定特異基因的時空表達，克隆全長基因序列，進而克隆上遊特異啟動子；所述全長基因序列的核苷酸序列如SEQID N0.2 所示。
[0009]具體地說，是 利用基因晶片進行了菸草各器官RNA差異雜交和表達譜分析，從中又篩選分離了高效根特異表達基因，對篩選得到的根特異表達基因進行鑑定，並克隆得到了全長特異基因，進而克隆特異基因上遊的啟動子，構建特異啟動子驅動GUS基因的植物表達載體，經農桿菌介導將目的啟動子導入本生菸草上，對轉基因菸草進行GUS組織化學鑑定，確定了菸草啟動子的特異性。具體如下:
1、利用基因晶片進行了菸草各器官RNA差異雜交和表達譜分析，從中又篩選分離了高效根特異表達基因；
2、菸草特異啟動子NtR2的核苷酸序列如SEQID N0.1所示；
3、構建的植物表達載體為pBim-NtR2::GUS ;所述的pBim- NtR2::GUS指以財似為啟動子，GUS為報告基因，Nos為終止子，Kam為篩選轉基因陽性植株的植物表達載體；
4、通過農桿菌介導法，獲得轉基因菸草陽性植株，通過染色，證實了菸草啟動子NtRl2的特異性。
[0010]根據上述培育方法，已經成功獲得轉NtR2:..載體的轉基因菸草，通過與35S組合型啟動子進行對比鑑定，在根部的表達量高於35S，而在轉基因菸草莖部、葉片不表達，證實了菸草NtR2啟動子的特異性，為菸草轉基因安全育種提供了有利的前景。
[0011]本發明利用基因晶片進行了菸草各器官RNA差異雜交和表達譜分析，從中又篩選分離了高效根特異表達基因，克隆得到菸草根特異啟動子財似，並利用特異啟動子構建植物表達載體，建立以抗生素為篩選劑的轉基因遺傳體系，以及快速、高效的轉基因檢測技術，確定了菸草根部特異啟動子的遺傳表達，為分子育種菸草抗根部病害品種的培育奠定了良好的技術基礎。
[0012]本發明的菸草根部特異啟動子在轉基因植物上的應用:所述轉基因植物的製備方法，包括下述步驟:
(I)將菸草根部特異啟動子序列插入表達載體中，構建帶該特異啟動子驅動功能基因的植物表達載體。
[0013](2)利用所述植物表達載體導入農桿菌，獲得轉化體。
[0014](3)將所述的轉化體轉化植物，獲得轉基因植株。
[0015]通過PLANTCARE分析該菸草根部特異啟動子NtR12啟動子序列中存在基本的啟動子序列TATA-box、GATA-box和CAAT_box。序列的鹼基組成含量顯示:NtR2啟動子AT佔64.6%,GC佔35.8%。AT豐富序列的低複雜度有利於DNA雙鏈結構的解螺旋，提高基因的轉錄效率。啟動子存在GC盒，因為GC盒一般位於TATA-box和CAAT_box的上遊，所以猜測這兩個基因啟動子序列可能都接近完整的啟動子。使用PLANTCARE預測顯示，這兩個基因啟動子都存在根啟動子的保守序列盒，這為下一步連入抗病基因，進一步進行菸草轉基因鑑定打下堅實的基礎。
[0016] 已有報導TobRB7基因啟動子是唯一的菸草根特異表達啟動子，主要在根端即幼根的伸長區表達，不在整個根系表達和伸長區以後的根部表達，因此不能滿足菸草根部病害的轉基因分子育種；而本發明得到的NtR2啟動子只在菸草根部表達，將NtR2啟動子轉到PBI121載體上，遺傳轉化本生菸草，通過⑶S染色，表明該啟動子只在菸草根部表達。
[0017]本發明的菸草根特異啟動子有以下優點:傳統的分子育種所用的啟動子為組合型35S啟動子，它在植株各組織器官發育的不同階段均表達，隨著轉基因安全性受到普遍的關注，組合型35S啟動子已經不能滿足轉基因發展的需要，而且35S組合型啟動子容易發生基因沉默；本研究所得到的財似根部特異啟動子，在菸草的根部表達量比35S啟動子要高，而葉片不表達，菸草是以收穫葉片器官的經濟作物，葉片上基因不表達，能提高菸草轉基因的安全性。[0018]大田菸草種植過程中容易受到許多根病蟲害的危害，而給菸草生產和品質造成很到的損失，克隆菸草根特異啟動子，通過分子設計育種，能夠安全有效的解決菸草種植過程中的根莖病蟲害。如圖1所示，為菸草特異啟動子驅使GUS基因在本生菸草的表達情況。從圖中可以看出菸草特異啟動子只在菸草根部表達，而不在菸草的其它器官表達，具有較強的特異性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1為菸草特異基因pBim- NtR2::GUS的RT-PCR結果。
[0020]圖2為轉pBI121 - NtR2:..基因菸草⑶S染色。
[0021]【具體實施方式】
【實施例1】菸葉根與葉片總RNA的提取
將K326原種盤栽，待煙株長至旺長期時，取煙株倒2、倒3、倒5、倒6、倒9葉位的葉片洗淨，迅速將葉片以主 脈為界，倒2、倒3葉位的葉片二等分；倒5、倒6葉位的葉片4等分，倒9葉位的葉片取葉片中間部位四等分，各取一份置於液氮中冷凍後置_80°C冰箱中保存。待葉片取樣完畢時，迅速將根洗淨，取白根置於液氮中冷凍後置_80°C冰箱中保存。取2.5g根(實驗組Tester)與葉(驅動組Driver)置於研缽中加液氮研磨,取0.1g倒入預冷的0.5ml異硫氰酸胍變性勻眾液中，充分混勻lmin。加入0.1ml 2mol/L NaAc (pH4.0)混勻Imin ;加入0.5ml水飽和酚，振蕩30秒，冰浴5min。加入0.2ml氯仿:異戊醇(24:1)，劇烈振蕩2次3min，冰上放置lOmin。4°C，12000g離心15min。小心移取上層水相，棄去中間和下層有機相。加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，振蕩2次3min，冰上放置5min。4°C，12000g離心10-15min，移取上層水相，棄去中間和下層有機相。加入等體積異丙醇，放置_20°C 30分種以沉澱RNA。4°C，12000g離心15min收集RNA沉澱，用75%乙醇洗滌沉澱；將RNA沉澱在空氣中乾燥。用30ul RNase-free ddH20或去離子甲醯胺溶解RNA沉澱。
[0022]【實施例2】利用DNA晶片分離目的基因
利用菸草青枯菌接種處理菸草植株，將受菸草青枯菌處理的菸草植株於3天、6天、9天、12天、15天後取菸草樣品，對不同抗感菸草青枯病品種轉錄出來的所有mRNA標記，與DNA晶片雜交，通過分析雜交位點及信號強弱，可得知在不同時間、不同菸草部位各基因的表達程度。根據表達圖譜進行不同條件下基因表達的對比分析，可找到在外部環境、各種細菌侵染時，哪些基因表達發生變化，變化多大，從而分析這些基因在受外部環境下，關鍵基因發生的生理功能，進而找出該生理功能的相關功能基因。通過分析基因表達，找出只在菸草根部表達量大的基因。相對於其他器官的表達，由於晶片的誤差，幾乎可以忽略不計。NtR2基因具體表達如表1所示。
[0023]表1基因晶片中NtR2基因在菸草各組織基因表達情況
【權利要求】
1.一種菸草根特異啟動子，其至少含有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.—種含有權利要求1所述的菸草根特異啟動子的植物表達載體。
3.如權利要求1所述的 菸草根部特異啟動子在轉基因植物上的應用。
【文檔編號】C12N15/113GK103966218SQ201410203765
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月14日 優先權日:2014年5月14日
【發明者】陳華, 蔡鐵城, 巫升鑫, 潘淑芳, 張衝, 陳順輝, 莊偉建 申請人:福建農林大學