將基因轉入植物的方法
2023-10-20 05:42:17 2
專利名稱：將基因轉入植物的方法
技術領域：
本發明涉及到一種基因轉入植物的方法，即利用分離後，未成熟的在試管內培養的花粉粒，以及從中產生的種子和繁殖產物。
將基因轉入植物內可採用不同的技術。每種技術都有它的優點和缺點(Goodmanetal.Science23648-53，1987)。根瘤土壤桿菌是現在最常用的載體。但是，它限制了宿主的範圍。將根瘤土壤桿菌用作載體，仍然依賴於體外培養的體細胞的再生，以產生能形成基因轉移子代的基因轉移植物。用電穿透，脂質體，顯微注射和其它物理一化學方法等進行的直接基因轉移，在很大程度上取決於採用原生質體作為靶細胞。然而，在很多品種中，從原生質體再生是困難的，甚至在某些品種中是不可能的。
作為這些基因轉移方法的改進，曾有人提出採用一種不同的靶細胞，即花粉粒。根據D.Hess，PlenumPress，NewYork，519-537(1975)，成熟花粉有可能載上外源DNA，並通過天然傳粉和受精作用將此外源DNA轉移至卵細胞，作為「超載體」。類似地，X-射線處理過的花粉據說能夠將照射過的基因組片段轉移至卵細胞(Pandey，Nature256310-313，1975)。Dewet(WO85/01856)報導，經外源DNA處理過的玉米花粉在發芽時可載此DNA，並在受精後將其轉移至卵細胞。
儘管基因轉移至花粉以及通過花粉進行轉移具有極大的潛在重要性，但其它實驗室至今還未能重複出Hess，Pandey和Dewet的結果。例如，Engvild(Theor，Appl，Genet69457-461，1985)就沒能重複出Pandey的實驗。在Hess(1975)和Dewet的實驗中，攜帶外源DNA至花粉粒，以及轉移的DNA的遺傳學和分子學證據是整個推理過程中的關鍵環節。表現型證據和生理學證據是不夠的(HessinGeneticManipulationinplantbreeding，deGruyter，Berlin，NewYork803-811，1986)。Sanford等人的實驗(Biotechnologyandecologyofpollen(MulcahyD.ed)，Springer，Heidelberg，NewYork，71-75，1968)也表明，將成熟的蘭根朵夫菸草花粉與土壤桿菌共同培養並不產生基因向花粉中的轉移。在大量實驗中，Negrutiu，Heberle-Bors和Potrykus(Loc.cit.65-70，1986)未能成功地轉移能產生抗卡那黴素藥性的新黴素磷酸轉移酶基因至成熟的花粉(shillitoetal.Biotechnology31099-1103，1985)。因此，根據近期文獻所述方法，無法證實Hess和Dewet的說法。Hess和Dewet的結果不能重複這一事實可這樣解釋，成熟的花粉粒一旦被置於對於基因轉移所必須的水介質中時，便立即開始形成花粉管，顯然，它們在此階段不再能育，或者說用於基因轉移的時間太短了。
在Planta170141-143(1987)中，Pareddy等人報導了未成熟玉米雄穗在體外的培養和成熟。用分離的成熟花粉傳粉，便可從傳過粉的植物得到種子。通過基因標誌物方法，不能證實是否有成功的受精作用。
意外的是，已發現可以在沒有天然營養組織情況下培養未成熟花粉粒，此外可將外源基因在成熟的不同階段引入到這些分離的，未成熟的花粉粒中，結果，利用這些成熟的花粉粒，植物可被傳粉，受精，從而使正常的種子形成，發芽，並繁殖。
因此，本發明涉及一種基因轉入植物的方法，其包含a)在營養溶液中從花葯分離未成熟花粉粒，並移除它們所附著的組織;
b)在一種營養溶液中培養這些分離的，未成熟的花粉粒，c)在體外培養和成熟過程中轉移外源遺傳物質至花粉粒，d)在體外使轉化的花粉粒完全成熟，e)用轉化的花粉粒向受體植物傳粉，並從受體植物得到種子。
一種全新的基因轉移至植物的策略是，將基因轉入分離的、未成熟的花粉粒，體外成熟，以及採用花粉作為普遍的「超載體」。與其它方法比較，此法大大簡化，因為細胞培養期大大縮短，而伴有比較麻煩的體克隆變異現象的再生階段也被省去了。採用此新方法，還可以轉化那些迄今未能成功進行基因轉移的植物例如，多種穀物，豆類和樹木不能從單細胞或原生質體再生。
基因轉移技術的潛在利益具有很大的經濟，生態學和社會價值。其目的在於從遺傳學上改變植物，使產量增加，植物更能抗病蟲害，耐寒，耐熱，耐旱，耐鹽及耐養分缺乏，並具有更高的營養質量，為生產新的工業原材料，或它們自己固氮，或以另一種方式不依賴於化肥。
對本發明來說，花粉粒培養時，周圍沒有組織，即是隔離的這一點很重要，這樣要轉移的遺傳物質，與載體偶聯或裸露，可直接與花粉粒接觸。如果培養完全的雄穗，則不能用常用的轉移方法(根瘤土壤桿菌，電穿透，顯微注射等)將基因轉移至花粉粒。這是由於很多周圍組織的障礙作用。
本發明的另一重要特點是採用未成熟花粉粒。這樣，基因轉移可在體外成熟的整個期間進行。向未成熟花粉粒的轉移，可在成熟的不同階段進行，它取決於植物的特點。重要的是，遺傳物質必須通過儘可能少的細胞壁以便進入精子核的基因組，並在受精時成為合子基因組的一部分，尤其是當載體用於基因轉移時。轉移最好在小孢子處於單核期時進行，但也可在早期雙核階段第一次花粉有絲分裂時進行，只要生殖細胞仍附於花粉壁上，或在其它情況下，那些植物的花粉在成熟階段為三核狀態(穀物)，即在第二次花粉有絲分裂不久之前或期間內進行基因轉移。
具體地講，此方法如下述那樣進行，菸草(Nicotianatabacum)作為一典型體系，此體系適用於可以通過傳粉而繁殖的所有植物，尤其是單子葉和雙子葉農作物，如小麥，玉米，水稻，大豆，油類作物，蔬菜植物，水果植物和森林植物。
在一個初步實驗中，所選定植物的花粉發育階段用常規方法以下列步驟確定分離一個花葯，壓片，加入例如乙酸洋紅後在顯微鏡下觀察。
當花粉已達到所需要的階段時，在無菌條件下於營養性介質中將花粉從花葯中擠出，過篩，洗滌，用離心方法收集，並重新懸浮，可分離出花粉粒。
在花粉粒早期發育階段細胞密度應該比發育階段後期的細胞密度高。對於菸草，雙核花粉粒的細胞密度約為105/毫升，約為單核小孢子情形的兩倍。
所用的營養介質含有培養和保持花粉粒的成熟能力所必需的所有養分及生長物質。根據不同的植物，可採用不同的成分，以便實現營養組分(花葯絨氈層)的功能。此處，營養介質的主要成分為糖，營養物質，無機鹽類和維生素，pH值為6.5至7.5。
在單核小孢子情況下，培養至雙核階段過程在富含糖，例如蔗糖，和其它營養物質的介質中進行。例如，額外的營養物質可以椰子汁的形式加入。當花粉粒達到雙核階段時，可將其轉移至一種營養物質較少的介質中。
當體外成熟完成以後，收集花粉粒進行傳粉。為此，進行離心，洗滌，為了傳粉，將此花粉粒加到那些已提前去掉花葯的花上去，以水溶液形式或乾粉形式均可，以常用方法從這些用體外成熟的花粉粒傳粉的植物得到發芽的種子。
為在體外培養時進行基因轉移，可將要轉移的外源遺傳物質引入花粉粒，採用一種常用載體，例如根瘤土壤桿菌，或用電穿透，顯微注射，或其它物理，化學方法直接轉移裸DNA均可。「外源遺傳物質」這個詞表示在要進行轉化的花粉粒之外產生的任何遺傳物質。當完全成熟後，按上述方法收集花粉粒以便傳粉。
為證實體外成熟的成功進行，具有2個標誌基因(KANR，NOS)的菸草植物的花粉粒在體外成熟，用這些花粉粒向正常野生型植物傳粉。將收集的種子滅菌，於一含有卡那黴素的發芽介質中發芽。這些標誌基因的孟德爾式分離通過計數選擇性培養基中的籽苗而得到證實。那些已在無卡那黴素培養基中發芽的籽苗經高效紙電泳作曙紅檢測也顯示NOS基因的孟得爾式分離。
這證明正是體外成熟的花粉粒進行了受精作用，而不是任何其它植物的雜質花粉。
為證實在體外培養過程中由轉化作用引進的外源基因的表達，在用轉化的花粉粒製備的勻漿液中用酶檢測法檢測了氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)的活性。
除了CAT基因，一種細胞化學可測基因，即β-葡糖苷酸酶基因(GUS基因)也被採用，在這個實驗中，土壤桿菌與花粉一起培養，然後每天用抗生物素claforan洗滌以便除去或殺死它們。在細胞化學檢驗中(花粉染為藍色)，可檢測出高於50%藍色，即體外成熟的花粉。非感染的花粉，或用土壤桿菌在沒有或有非功能性GUS基因情況下感染的花粉在加入底物時不表現蘭色染色。螢光測定法顯示在GUS-轉化花粉中有高的GUS活性，在作為陰性對照的GUS-轉化的植物的花粉中也發現高GUS活性。未被感染的花粉，或被沒有GUS基因的土壤桿菌感染的花粉，不顯示GUS活性。此外，用在T-DNA中無毒性基因但有完全GUS基因的土壤桿菌，感染後，在花粉中也不顯示GUS活性(用細胞化學方法測定及螢光法測定)。
這樣可得出結論，基因轉移至花粉是由根瘤土壤桿菌完成的。土壤桿菌可見地粘附於花粉表面形成纖維素纖絲(電鏡照片)可進一步證實基因轉移至花粉的成功。
實例1確定花粉發育的階段收集不同長度的菸草花，在無菌條件下分離花葯，5個花葯中的一個與一滴乙酸洋紅(4%洋紅置於45%強度乙酸中)一同加於玻片上製備成壓片。半小時後顯微鏡下確定花粉粒的發育階段。
實例2花粉粒的分離菸草花粉粒通過在一個小研缽的AMGLU介質(1)中，無菌條件下，小心用玻棒壓花葯而得到分離，然後將得到的花粉懸浮液通過一個75微米的篩，並用AMGLU介質衝洗花粉懸浮液兩遍。最後在Eppendorf離心機上以6，500轉/分的速度離心收集花粉懸浮液。
實例3使早期雙核花粉粒成熟的花粉培養分離早期雙核菸草花粉粒，調節AMGLU介質中細胞密度達到105/毫升。取1毫升花粉懸浮液在黑暗中於35毫米培養皿中25℃下培養。在培養2到5天後(確切時間取決於花粉粒的發育階段)它們就已成熟並可以收集了。
實例4使單核小孢子成熟的花粉培養將單核菸草小孢子培養於MR24介質(2)中，細胞密度為2×105/毫升。一旦花粉粒達到雙核階段(2到5天後，取決於確切年齡)，用離心方法收集，在MIS介質(3)中連續培養至完全成熟。
此外，當採用MR26介質(2′)進行培養時得到了非常好的結果。一旦花粉粒達到雙核階段(3天後)，加入等體積M2S介質，再過一天，用離心方法收集花粉粒，在M2S介質(3′)中繼續培養，細胞密度為105/毫升，至完全成熟(一天)。
實例5傳粉和受精的證據用離心方法收集菸草花粉粒，在BK介質中洗滌(Brewbaker and Kwack 1963)，將細胞密度調節至1.25×106/毫升。從含苞待放的花(紅花尖)上移去仍然關閉的花葯。一旦花開放了，藉助於20微升移液管加入4微升-滴花粉懸浮液至花柱頭，使柱頭完全被花粉懸浮液覆蓋。這些操作在沒有風及遠離同品種其它植物情況下進行。一旦液滴在柱頭上幹了，用4釐米草稈蓋住柱頭和雌蕊，防止交叉傳粉。然後將植物放回溫室。
實例6種子收集、發芽及遺傳學檢測為證實是體外成熟的花粉粒參與了傳粉和受精，使基因轉移植物的花粉粒在體外成熟，用這些花粉粒向野生型植物傳粉。該基因轉移植物含有新黴素磷酸轉移酶基因(抗卡那酶素)及曙紅合成酶基因作為標誌基因。也進行了自體受精和與體外成熟的野生型花粉的交叉受精。
收集由實例5中得到的成熟種子莢膜(褐色，乾燥)，切去莢膜尖並將種子粒直接轉移至一支Eppendorf試管中分離種子，種子在NaOCl(次氯酸鈉)溶液(3%游離氯)中表面滅菌5分鐘，用無菌水衝洗2次，置於含有卡那黴素的種子發芽介質(4)中。4周後，計數KanR和Kan5的籽苗數。在上述交叉實驗中，得到兩種按KanR∶Kan5φ1∶1分離的相互交叉物。採用高效紙電泳作曙紅檢驗在無卡那黴素存在下生長的籽苗表現出Nos+∶Nos-＝1∶1的分離。如所期望，對在體外成熟的野生型植物的自體受精觀察到兩種標誌基因的分離都是0∶1。基因轉移植物體外成熟花粉的自體受精得到3∶1的分離。
實例7CAT基因的瞬時表達土壤桿菌(根瘤土壤桿菌，沒有瘤基因，含有與35S啟動子偶聯的CAT基因)在Luria肉湯中預培養1天。分離早期雙核階段的花粉粒，培養於AMGLU介質中。用AMGLU介質調節細菌懸浮液至OD580＝0.2，用AMGLU介質按1∶10進一步稀釋後，將20微升細菌懸浮液加至1毫升花粉懸浮液中共同培養24小時後，每毫升加入1微升claforan(1克/2毫升)以殺死土壤桿菌。再過2天，收集花粉粒，製備提取物。為此，將1.5毫升鈣洗液(5)(pH5.6)加入到每毫升花粉懸浮液中，混合液以4，000轉/分的速度離心5分鐘，用三羥甲基氨基甲烷緩衝液(0.25M，pH7.8)洗滌、離心後，將200微升三羥甲基氨基甲烷緩衝液加入到花粉沉澱物中，在冰環境中超聲勻漿(3×15秒)。在冰上10分鐘後，將混合物離心，上清液保存於-20℃。
按Sleigh描述的方法(Anal.Biochem.，56∶251-256，1986)進行CAT檢測。將30微升提取物與20微升氯黴素(8mM)，30微升三羥甲基氨基甲烷緩衝液和20微升14C標記的乙醯輔酶A(5微居裡/毫升於0.5mM冷乙醯輔酶A中)混合。37℃培養1小時後，用乙酸乙酯(2×100微升)振搖萃取乙醯化氯黴素，用閃爍計數器測放射活性。
在菸草花粉提取物與根瘤土壤桿菌共同培養後進行CAT檢測，放射活性(cpm)如下
cpm花粉在AMGLU介質中400花粉與土壤桿菌一起在AMGLU介質中6，000花粉與用乙醯丁香酸活化的土壤桿菌一起在AMGLU介質中6，000隻有土壤桿菌在AMGLU介質中500隻有乙醯丁香酸活化的土壤桿菌在AMGLU介質中500強的放射活性信號表明，土壤桿菌已成功地感染了花粉粒，T-DNA一定已經進入了生長細胞的核，並表達(轉錄)。
作為表明土壤桿菌本身並不具有CAT活性的進一步的對照，在培養於Luria肉湯中的土壤桿菌的整個生長周期中未檢測到CAT活性。
實例8GUS基因在菸草花粉中的表達將LBA4404土壤桿菌菌株(根瘤土壤桿菌，除去其防衛器官，具有β-葡糖苷酸酶(GUS)基因，與35s啟動子和終止區偶聯，(Matzke and Matzke in Plant Molecular Biology 7∶357-365(1986))於Luria肉湯中預培養1天。分離單核階段後期的花粉粒，在MR26介質中調節OD580＝0.2。在用MR26介質按1∶10稀釋後，將20微升細菌懸浮液加入到1毫升花粉懸浮液中。共同培養14～20小時後，離心收集花粉，用MR26介質(含有claforan，1克/2毫升)洗三次並繼續培養。每天更換含有claforan的介質，直至花粉成熟。最後向Luria肉湯中加入40微升介質(M2S，含Claforan)。未觀察到有細菌生長。
離心收集成熟花粉，其中一些置於MR26介質中。加入X-Glu(5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸)至終濃度1mM，並於37℃培養4～12小時(JeffersoninPlantMolecularBiologyReporter，Vol.5，No4，387-405，(1987))，形成靛藍色(X-Glu的β-葡糖苷酸酶產物)，可藉助於花粉的藍色染色於光學顯微鏡下觀察到。多於50%的活的成熟花粉顯示藍染色。
第二部分共同培養和體外成熟的花粉於GK介質(似BK介質，但有二倍濃度的硼酸)中發芽。在發芽花粉的花粉管中可檢測到GUS活性。
在對照實驗中，花粉用LBA4404土壤桿菌菌株感染，在該菌株的T-DNA中含有無啟動子的GUS基因(由Drs.Matzke，Salzburg提供)。此花粉在體外成熟和加入X-Glu以後未染上藍色，不含GUS基因的土壤桿菌也未染上藍色，但Kan35S基因在與花粉共同培養並加入X-Glu後染上藍色。。沒被土壤桿菌感染的花粉在加入X-Glu後也未染上藍色。作為一種陽性對照的GUS35S轉化植物的花粉(用葉-盤轉化方法得到)也未染上藍色。土壤桿菌的另一菌株，其T-DNA中含有功能性GUS基因，但不含Ti-質粒(雙載體)，在花粉中並不表現GUS活性。
從第三部分花粉中製備提取物，為此，離心收集部分4×105花粉，置於提取緩衝液(6)中。該花粉用玻璃珠粉碎，同時用超聲處理。按Jefferson描述的方法進行螢光GUS檢測，50微升提取物用提取緩衝液稀釋至1毫升，加入MUG(4-甲基傘形酮葡糖苷酸)至終濃度為1mM。每10至30秒取200微升試樣，用800微升(0.2M)碳酸鈉終止酶反應。在螢光計上，於365nm處激發後於455nm測吸收度，藉助於MUG標準溶液將此值轉換為濃度單位，以μm/ml表示。
來自菸草花粉提取物的β-葡糖苷酸酶在與根瘤土壤桿菌共同培養後在10，20和30分鐘時用螢光計測其活性(μM/ml)。
10分鐘20分鐘30分鐘標準11.01.01.0標準20.10.10.1無土壤桿菌時0.0160.0200.019花粉花粉，與GUS35S0.057 0.078 0.109土壤桿菌共同培養KAN35S土壤桿菌 0.023 0.019 0.021花粉，與沒有Ti質0.0220.0230.018粒但有來自基因轉移0.0510.0850.121的GUS+植物的GUS35S的雙載體共同培養培養基(1)AMGLU介質Miller粗鹽MS細鹽蔗糖(0.25M)穀氨醯胺(440mg/l)pH＝7
(2)MR24介質MS粗鹽MS細鹽蔗糖(0.5M)穀氨醯胺(440mg/l)椰子汁(2%體積)乳清蛋白水解產物(200mg/l)肌醇(100mg/l)pH＝7(2′)MR26介質似MR24介質，其中乳清蛋白水解產物濃度為1g/l(3)M1S介質Miller粗鹽MS細鹽Fe EDTA(乙二胺四乙酸鐵)(10-4M)蔗糖(0.25M)pH＝7(3′)M2S介質Kyo和Harada氏鹽(inPlanta186∶427-432(1986))蔗糖(0.25M)pH＝7
(4)種子發芽介質MS粗鹽MS細鹽Fe EDTA(10-4M)蔗糖(1%重量)瓊脂(0.8%重量)硫酸卡那黴素(50mg/l)pH＝5.5(5)鈣衝洗液CaCl2×2H2O(0.16M)MES緩衝液(0.5%重量)pH＝5.6(6)萃取緩衝液磷酸鈉(50mM，pH7)2-巰基乙醇(10mM)Na2EDTA(10mM)月桂醯肌氨酸鈉(0.1%)TritonX-100(0.1%)
權利要求
1.基因轉入植物的方法，其包括a)將未成熟花粉粒於營養溶液中，自花葯分離，並去掉它們所附著的組織，b)在一種營養溶液中培養這些分離的，未成熟的花粉粒，c)在體外培養和成熟過程中轉移外源遺傳物質至花粉粒，d)在體外使轉化的花粉粒完全成熟，e)用轉化的花粉粒向受體植物傳粉，並從受體植物得到種子。
2.權利要求1所述方法，其中外源遺傳物質的轉移是在單核小孢子階段進行的。
3.權利要求1所述方法，其中外源遺傳物質的轉移是在第一次花粉有絲分裂時進行的。
4.權利要求1所述方法，其中外源遺傳物質的轉移是在早期雙核階段進行的，只要生殖細胞仍附於花粉壁上。
5.權利要求1所述方法，其中外源物質轉移是在花粉第二次有絲分裂之前不久或其過程中進行的。
6.權利要求1所述方法，其中營養溶液含有對於培養和保持花粉粒成熟能力為必需的全部營養和生長物質。
7.權利要求2所述方法，其中在單核小孢子階段的基因轉移是在富含糖和其它營養物質的介質中進行的。
8.權利要求1所述方法，其中外源遺傳物質的轉移是通過與根瘤土壤桿菌共同培養進行的。
9.基因轉移花粉，包括在一種基因轉移至植物的方法中a)將未成熟花粉粒於營養溶液中自花葯分離，並去除它們所附著的組織，b)於一種營養溶液中培養分離的，未成熟的花粉粒，c)在體外培養和成熟過程中轉移外源遺傳物質至花粉粒，d)在體外使轉化的花粉粒完全成熟，並收集它們。
10.基因轉移種子，用權利要求1所述方法得到。
11.繁殖產物，從權利要求10中的基因轉移種子得到。
全文摘要
基因轉入植物的方法，其包括
文檔編號A01H1/00GK1030788SQ8810446
公開日1989年2月1日 申請日期1988年7月21日 優先權日1987年7月21日
發明者埃爾文·海貝爾拉-布爾斯, 羅薩瑪利·貝尼託莫裡諾, 安娜·奧文 申請人:化學控股有限公司