使用具有白細胞介素-12受體的細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法及應用的製作方法

2023-10-20 01:14:27 1

使用具有白細胞介素-12受體的細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種使用具有白細胞介素-12受體的細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法及應用，包括以下步驟：（1）從液氮罐取出一支凍存的具有白細胞介素-12受體的細胞，復甦活化培養至對數生長期；（2）使用不同濃度的重組人白細胞介素-12標準品誘導具有白細胞介素-12受體的細胞產生γ幹擾素，得到重組人白細胞介素-12標準品濃度值ED50s；（3）使用不同濃度的待測重組人白細胞介素-12蛋白質誘導具有白細胞介素-12受體的細胞產生γ幹擾素，得到待測重組人白細胞介素-12蛋白質濃度值ED50r；（4）根據公式Pr=Ps×ED50s/ED50r，得到待測重組人白細胞介素-12蛋白質體外活性Pr。
【專利說明】使用具有白細胞介素-12受體的細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及重組人白細胞介素-12活性的檢測技術，具體涉及一種使用具有白細胞介素-12受體的細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法。
【背景技術】
[0002]具有白細胞介素-12受體的細胞，能夠受到白細胞介素-12的誘導，誘發細胞內的信號傳導。NK-92是一株白細胞介素-2依賴型自然殺傷細胞株。實驗證明，NK92細胞在白細胞介素-12的誘導下，調節細胞表面受體的表達量，增強與腫瘤細胞表面配體的結合，抑制和殺死腫瘤細胞。或者是NK92細胞通過分泌免疫因子(例如:幹擾素)和其他細胞因子直接抑制腫瘤細胞生長。白細胞介素-12 (IL-12)是一種異源二聚體分子，是由單核/巨噬細胞及B淋巴細胞產生的一種細胞因子。
[0003]重組人白細胞介素-12 (rhIL-12)是通過基因工程技術，採用真核細胞表達的編碼人的白細胞介素-12。實驗證明，重組人白細胞介素-12能夠通過刺激NK細胞和T細胞增殖活化從而介導主動和被動免疫保護反應，是連接天然免疫和獲得性免疫的功能性橋梁，具有多種重要生物學功能和藥理作用，可應用於抗腫瘤、抗感染、抗哮喘、抗結核等多個領域。近年的研究發現，小劑量的rhIL-12可以刺激骨髓造血、保護造血微環境從而全面恢復受損血像，起到輻射和腫瘤放化療防護的作用，作為抗輻射藥試劑，重組人IL-12具有巨大的藥物開發價值和臨床應用價值。目前的研究中，rhIL-12的體外活性檢測通常採用人的外周血，測定計數血細胞集落的方法，或者測定人外周血在rhIL-12刺激下產生Y幹擾素的方法。用人外周血測定rhIL-12的活性，一方面細胞來源不能得到保證，同時由於人的個體差異，不能保證每次採集的血細胞性能相同，導致實驗的準確性、精確性和重複性差。

【發明內容】

[0004]本發明所要解決的第一個技術問題是:針對現有技術中由於人的個體差異，導致rhIL-12的體外活性檢測結果的準確性、精確性和重複性差的問題，提供一種檢測準確性和精確性高、重複性好的使用具有白細胞介素-12受體的穩定細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法。
[0005]本發明所要解決的第二個技術問題是:提供使用具有白細胞介素-12受體的細胞在檢測重組人白細胞介素-12體外活性中的應用。
[0006]為解決上述技術問題，本發明的技術方案是:
[0007]使用具有白細胞介素-12受體的細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法，包括以下步驟:
[0008](I)從液氮罐取出一支凍存的具有白細胞介素-12受體的細胞，將細胞快速融化復甦，在培養基中靜置培養傳代至對數生長期。
[0009](2)使用不同濃度的重組人白細胞介素-12標準品與步驟(I)得到的具有白細胞介素-12受體的細胞在培養基中共培養，誘導具有白細胞介素-12受體的細胞產生Y幹擾素，以產生的Y幹擾素的量為縱坐標，以重組人白細胞介素-12標準品的濃度為橫坐標，得到S型標準曲線，從S型標準曲線中得到Y幹擾素的量的最大值的一半時所對應的重組人白細胞介素-12標準品的濃度值，該濃度值記作為ED50s。
[0010](3)使用不同濃度的待測重組人白細胞介素-12蛋白質與步驟(1)得到的具有白細胞介素-12受體的細胞在培養基中共培養，誘導具有白細胞介素-12受體的細胞產生Y幹擾素，以產生的Y幹擾素的量為縱坐標，以待測重組人白細胞介素-12蛋白質的濃度為橫坐標，得到S型標準曲線，從S型標準曲線中得到Y幹擾素的量的最大值的一半時所對應的待測重組人白細胞介素-12蛋白質的濃度值，該濃度值記作為ED50r。
[0011](4)根據公式Pr=PsXED50s/ED50r，計算得到所述待測重組人白細胞介素-12蛋白質的體外活性Pr，其中Ps為重組人白細胞介素-12標準品的活性值。
[0012]所述步驟(2)和步驟(3)同時操作，並使用同源的具有白細胞介素-12受體的細胞，使用相同的培養條件和相同的操作步驟。
[0013]優選的，步驟(1)中，從液氮罐取出一支凍存的具有白細胞介素-12受體的細胞，將細胞快速融化復甦，置換掉凍存液，按照具有白細胞介素-12受體的細胞在培養基中的密度為2~3X IO5進行重懸後，靜置活化培養，將對數生長期的具有白細胞介素-12受體的細胞使用培養基重懸細胞，將活化後的具有白細胞介素-12受體的細胞轉移到檢測孔板中。
[0014]所述具有白細胞介素-12受體的細胞，具有表達人白細胞介素-12的受體β?和β2 (IL-12Ri3 1和β 2)的能力，能夠與人白細胞介素-12結合，並且誘導產生、幹擾素(INFi )。
[0015]所述具有白細胞介素-12受體的細胞，可以是細胞天然就有表達人白細胞介素-12受體β?和β 2的能力，也可以是通過人工重組的細胞，具有表達人白細胞介素-12受體β I和β 2的能力。
[0016]優選的，所述具有白細胞介素-12受體的細胞是ΝΚ92細胞，所述ΝΚ92細胞具有天然表達人白細胞介素-12受體β?和β 2的能力。
[0017]作為進一步的優選，所述ΝΚ92細胞購買自美國典型培養物收集庫(ATCC)，編號為CRL-2407。
[0018]優選的，步驟(1)、(2)、(3)中，所述培養和共培養均是在溫度37°C、二氧化碳體積濃度是5%的環境中培養至對數生長期。
[0019]優選的，步驟(1)、(2)、(3)中，培養至對數生長期時所述具有白細胞介素-12受體的細胞在步驟(1)中的培養基中以及在步驟(2)、(3)中的共培養體系中的密度均為I~5X IO5 個/ml。
[0020]作為進一步的優選，所述步驟(1)中的培養是在溫度37°C、二氧化碳體積濃度是5%的環境中培養12~72小時。
[0021]作為一種改進，所述步驟(2)和步驟(3)中重組人白細胞介素-12蛋白標準品和待測重組人白細胞介素-12蛋白質在共培養體系中的濃度為0.032ng/ml~51.2ng/ml，所述誘導具有白細胞介素-12受體的細胞產生Y幹擾素的時間為2~120小時。[0022]作為進一步的改進，所述步驟(2)和步驟(3)中重組人白細胞介素-12蛋白標準品和待測重組人白細胞介素-12蛋白質在共培養體系中的濃度分別為:0.032ng/ml、0.06ng/ml、0.lng/ml>0.2ng/ml、0.8ng/ml>1.6ng/ml、3.2ng/ml、6.4ng/ml>12.8ng/ml>25.6ng/ml和 51.2ng/ml。
[0023]作為另一種改進，步驟(1)、(2)、(3)中，所述培養基是在MBl培養基中添加β巰基乙醇、葉酸、rhIL-2、馬血清和胎牛血清組成的。
[0024]優選的，所述步驟(2)和步驟(3)中的培養基為MEM培養基中含有0.1mM的β巰基乙醇、0.02mM的葉酸、100U/ml的rhIL_2、12.5wt%的馬血清和12.5wt%的胎牛血清。
[0025]優選的，所述步驟(2)和步驟(3)中，產生的Y幹擾素的檢測方法為酶聯免疫法，所述酶聯免疫法使用的一抗為Y幹擾素抗體。
[0026]為解決上述第二個技術問題，本發明的技術方案是:
[0027]使用具有白細胞介素-12受體的細胞在檢測重組人白細胞介素-12體外活性中的應用。
[0028]由於採用了上述技術方案，本發明的有益效果是:
[0029]本發明採用具有白細胞介素-12受體的細胞作為重組人白細胞介素-12體外活性的檢測細胞株，具有傳代次數不受限制、容易培養和性能穩定的特點。具有白細胞介素-12受體的細胞膜表面具有白細胞介素-12的受體蛋白質，因此，具有白細胞介素-12受體的細胞能夠受到白細胞介素-12蛋白質的誘導，分泌Y幹擾素，實驗證明rhIL-12用量與產生Y幹擾素的效果具有很好的量效關係，是測定重組人白細胞介素-12體外活性合適的細胞株。
[0030]本發明操作簡單、快捷、結果重複性好、靈敏度高、特異性強。因此，本發明方法在重組人白細胞介素-12蛋白質的體外活性檢測方面具有廣闊的使用前景。
[0031]本發明使用的具有白細胞介素-12受體的細胞為凍存的NK92細胞，凍存的NK92細胞購買自美國典型培養物收集庫(ATCC)，編號為CRL-2407，避免了現有技術中使用人的外周血，由於人的個體差異，實驗的準確性、精確性和重複性差的問題，因此，本發明的檢測結果準確性和重複性相比現有技術大大提高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
[0033]圖1是IL-12R β I和IL-12R β 2在具有白細胞介素-12受體的細胞中的表達原理圖；
[0034]圖2是IL-12誘導具有白細胞介素-12受體的細胞分泌INF- Y的信號通路圖；
[0035] 圖3是ELSIA方法測定INF- Y含量標準曲線圖:圖中縱坐標為INF- Y濃度值(pg/ml),橫坐標為450nm處的光吸收值；
[0036]圖4是IL-12標準品誘導NK92細胞產生INF- Y的曲線圖:圖中縱坐標為INF- Y濃度值(pg/ml)，橫坐標為重組人白細胞介素-12標準品的濃度(ng/ml)；
[0037]圖5是IL-12待測重組人白細胞介素-12誘導NK92細胞產生INF-Y的曲線圖。(3種線型分別代表3次重複試驗)。圖中縱坐標為INF-gamma濃度值(pg/ml )，橫坐標為待測重組人白細胞介素-12蛋白質的濃度(ng/ml)。【具體實施方式】
[0038]如圖1和圖2所示，泳道1:1L-12R@ I陽性對照；泳道2，泳道3:1L_12R@ I具有白細胞介素-12受體的細胞cDNA ;泳道4:1L-12R^2陽性對照；泳道5，泳道6:1L_12R3 2具有白細胞介素-12受體的細胞cDNA ;泳道7，泳道8:內參β -actin具有白細胞介素_12受體的細胞cDNA。
[0039]如圖1和圖2所示，IL-12能夠通過細胞膜表面IL-12受體結合具有白細胞介素-12受體的細胞,誘導具有白細胞介素-12受體的細胞啟動SATA4的信號通路,分泌高水平的INF- Y，因此，充分證明具有白細胞介素-12受體的細胞是可以用於檢測IL-12生物學體外活性的模式細胞株。[0040]具有白細胞介素-12受體的細胞膜表面具有白細胞介素-12的受體蛋白質,該受體有 2 個亞基，分別是 IL-12 受體 betal (IL_12RP I)和 IL-12 受體 beta2 (IL_12RP 2)，以具有白細胞介素-12受體的細胞cDNA為樣本，RT-PCR實驗證明，IL-12R β I和IL-12R β 2都能在具有白細胞介素-12受體的細胞中表達。
[0041]具有白細胞介素-12受體的細胞膜上的IL-12受體與IL-12結合後，誘導細胞內生成活性的轉導和轉錄活性因子4 (signal transducer and activatortranscription4, STAT4)，STAT4 進入細胞核內與 INF- Y 的 DNA 結合，促進 INF- y mRNA 的轉錄和表達。
[0042]使用IL-12標準品處理具有白細胞介素-12受體的細胞後，測定NK-92細胞中STAT4的磷酸化水平的改變的結果。在WHO IL-12標準品處理後，與對照的沒有被IL-12標準品處理的具有白細胞介素-12受體的細胞比，IL-12標準品處理的NK-92細胞中STAT4的磷酸化水平提高，但STAT4的總表達量沒有變化。
[0043]如表1所示，因為重組人白細胞介素-12是異源二聚體，由P35和P40兩個亞基組成，另外在天然狀態下，P40亞基容易形成同源二聚體P80。將NK92細胞培養至對數生長期，分別加入P35、P40、P80、P70 (rhIL_12WH0標準品)蛋白質與NK92細胞共培養，濃度為O~51.2ng/ml，誘導NK92細胞分泌Y幹擾素，結果顯示:只有P70 (rhIL_12WH0標準品)能夠刺激NK92產生Y幹擾素，而P35、P40、P80亞基都不能誘導NK92產生Y幹擾素，說明NK92細胞能夠特異性的檢測rhIL-12的體外活性。
[0044]表1P35，P40, P80 和 P70 (rhIL_12WH0 標準品)分別誘導 NK92 細胞產生 IFN- Y
的對比實驗。
[0045]
【權利要求】
1.使用具有白細胞介素-12受體的細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)從液氮罐取出一支凍存的具有白細胞介素-12受體的細胞，將細胞快速融化復甦，在培養基中靜置培養傳代至對數生長期； (2)使用不同濃度的重組人白細胞介素-12標準品與步驟(1)得到的具有白細胞介素-12受體的細胞在培養基中共培養，誘導具有白細胞介素-12受體的細胞產生Y幹擾素，以產生的Y幹擾素的量為縱坐標，以重組人白細胞介素-12標準品的濃度為橫坐標，得到S型標準曲線，從S型標準曲線中得到Y幹擾素的量的最大值的一半時所對應的重組人白細胞介素-12標準品的濃度值，該濃度值記作為ED50s ； (3)使用不同濃度的待測重組人白細胞介素-12蛋白質與步驟(1)得到的具有白細胞介素-12受體的細胞在培養基中共培養，誘導具有白細胞介素-12受體的細胞產生Y幹擾素，以產生的Y幹擾素的量為縱坐標，以待測重組人白細胞介素-12蛋白質的濃度為橫坐標，得到S型標準曲線，從S型標準曲線中得到Y幹擾素的量的最大值的一半時所對應的待測重組人白細胞介素-12蛋白質的濃度值，該濃度值記作為ED50r ； (4)根據公式Pr=PsXED50s/ED50r,計算得到所述待測重組人白細胞介素_12蛋白質的體外活性Pr，其中Ps為重組人白細胞介素-12標準品的活性值； 所述步驟(2)和步驟(3)同 時操作，並使用同源的具有白細胞介素-12受體的細胞，使用相同的培養條件和相同的操作步驟。
2.如權利要求1所述的使用具有白細胞介素-12受體的細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法，其特徵在於:所述具有白細胞介素-12受體的細胞，具有表達人白細胞介素-12的受體β?和β 2的能力，能夠與人白細胞介素-12結合，並且被誘導產生Y幹擾素。
3.如權利要求2所述的使用具有白細胞介素-12受體的細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法，其特徵在於:所述具有白細胞介素-12受體的細胞，可以是細胞天然就有表達人白細胞介素-12受體β I和β 2的能力，也可以是通過人工重組的細胞，具有表達人白細胞介素-12受體β I和β 2的能力。
4.如權利要求3所述的使用具有白細胞介素-12受體的細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法，其特徵在於:所述具有白細胞介素-12受體的細胞是ΝΚ92細胞，所述ΝΚ92細胞具有天然表達人白細胞介素-12受體β I和β 2的能力。
5.如權利要求1所述的使用具有白細胞介素-12受體的細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法，其特徵在於:步驟(1)、(2)、(3)中，所述培養和共培養均是在溫度37 °C、二氧化碳體積濃度是5%的環境中培養至對數生長期。
6.如權利要求5所述的使用具有白細胞介素-12受體的細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法，其特徵在於:步驟(1)、(2)、(3)中，培養至對數生長期時所述具有白細胞介素-12受體的細胞在步驟(1)中的培養基中以及在步驟(2)、(3)中的共培養體系中的密度均為I~5 X IO5個/ml。
7.如權利要求1所述的使用具有白細胞介素-12受體的細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法，其特徵在於:所述步驟(2)和步驟(3)中重組人白細胞介素-12蛋白標準品和待測重組人白細胞介素-12蛋白質在共培養體系中的濃度為0.032ng/ml~·51.2ng/ml,所述誘導具有白細胞介素-12受體的細胞產生Y幹擾素的時間為2~120小時。
8.如權利要求1所述的使用具有白細胞介素-12受體的細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法，其特徵在於:步驟(1)、(2)、(3)中，所述培養基是在MEM培養基中添加β巰基乙醇、葉酸、rhIL-2、馬血清和胎牛血清組成的。
9.如權利要求1至8任一權利要求所述的使用具有白細胞介素-12受體的細胞檢測重組人白細胞介素-12體外活性的方法，其特徵在於:所述步驟(2)和步驟(3)中，產生Y幹擾素的檢測方法為酶聯免疫法，所述酶聯免疫法使用的一抗為Y幹擾素抗體。
10.使用具有白細胞介素-12受體的細胞在檢測重組人白細胞介素-12體外活性中的應用 。
【文檔編號】G01N33/68GK103837687SQ201410085883
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月10日 優先權日:2014年3月10日
【發明者】趙毅, 李友海, 李健, 章方良, 蔣忻坡, 黃冰, 盧世香, 裴秀芝, 王媛媛, 丁會芹 申請人:青島康立泰藥業有限公司