使用組合的二向色/高通濾光器的成像系統的製作方法

2023-10-09 01:44:49

專利名稱：使用組合的二向色/高通濾光器的成像系統的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及螢光成像系統，更具體地說涉及由二向色濾光器傳送的雜散廣角激發光的抑制。
背景技術：
最普通的螢光測量的原理是對靈敏度的要求，或由螢光的暗視場測量所提供的高信噪比電平。該螢光測量的主要目標是只允許螢光信號(波長的範圍)進入傳感器，並阻止激發波長。螢光測量的靈敏度通常受限於噪聲，該噪聲與危及暗視場的雜散光的背景相關聯。背景雜散光可以從樣本或測量系統發出；來自該系統的雜散光通過光譜過濾而緩和。光的光譜過濾對於螢光測量是必要的，其中必須從將必要的螢光能量信號導向光傳感器的光學光路中消除來自激發能量的雜散光。
對於許多螢光應用，最大的靈敏度是通過用只比發射波長低數十納米的波長的光激發而獲得，其中該激發/發射差稱為螢光物的斯託克斯譜移。通常應用二向色(幹涉)濾光器，因為它們能夠被設計和製造成使得能適當阻止來自產生的發射光的雜散激發光。當吸收具有色度載體(chromaphore)的光的高通濾光器可以被設計和製造成吸收激發並傳送發射時，它們一般不會使能在所需的數十納米上產生的阻止和透明度，且吸收色度載體傾向於發螢光(主測量波長噪聲的原因之一)。此外，二向色濾光器的設計/製造適合於使能提供用於發射的透射窗口的、由發射光譜的下截止(cut-on)和上截止(cut-off)波長指示(根據增加波長的常規光譜)的透射的光的帶通。設計良好的帶通二向分色鏡對於靈敏的螢光測量是必要的，因為除了作為測量目標的螢光物以外的材料也可以發螢光。很大程度上，那些其它材料發出出自為作為目標的螢光物設計的帶通的螢光，它們的發射被阻止並提高了螢光測量的靈敏度。
對螢光測量越來越普通的需要是成像應用，其中鏡頭的組合將螢光能量信號導向區域傳感器，例如膜或電子傳感器(CCD陣列)。為了增進螢光測量的靈敏度和動態範圍，越來越普通的是使用冷卻的CCD傳感器陣列。為了增進成像的速度和分辨能力，並加寬光學系統的操作範圍，必須使用很複雜的鏡頭(許多元件)。
將適當設計的二向色濾光器應用到成像應用中的困難是，二向色濾光器的帶通是該濾光器平面上的光的入射角的函數，如圖1A所示。具體地，離位入射的入射光在該幹涉塗層中經過更長的光程；因此，該二向色濾光器的下截止(和上截止)波長減小，或者帶通藍移。因此，對於由複雜鏡頭使能的廣角視域，發射濾光器帶通呈現隨圖像半徑而增大的藍移(圖1B)。如果發射濾光器的藍移的下截止與激發光的上截止顯著地重疊，那麼徑向藍移可引起高靈敏度螢光成像應用中的嚴重的贗象(artifact)。結果的雜散激發光滲透到視場的外圍，產生成像贗象，在其他暗場中常常可見為亮圈。通常，該亮圈贗象是多元件鏡頭中的圓形特徵的反映，該鏡頭將雜散光反射回到二向色濾光器，該濾光器阻止該光返回鏡頭並最終到達傳感器。該成像贗象的實例如圖2A所示。
管理廣角成像系統中的藍移帶通的一個方法是在鏡頭元件(在如圖1A所示的元件-虛線100)後放置二向色發射器濾光器。該方法在減少藍移方面略微更有效，因為廣角光線在設計良好的鏡頭中可被更多地抑制。儘管有效，但是該方法未能阻止來自具有反射和螢光材料的多重鏡頭元件和鏡頭內的表面的過多的激發光。作為結果的圖像贗象顯現為暗場中的薄霧(不需要相同)，其是背景噪聲的原因之一。
因此，需要一種成本有效的技術，來抑制阻礙靈敏的螢光測量的成像贗象。

發明內容
根據本發明，提供上述問題的解決方案和對需要的滿足。
根據本發明的特徵，提供的成像系統包含鏡頭；置於所述的鏡頭前方的二向色濾光器；以及置於所述鏡頭和所述二向色濾光器之間的高通濾光器。
根據本發明另外的特徵，提供的成像系統包含用於將螢光圖像成像在電子傳感器上的鏡頭；置於所述鏡頭前方以用於傳送螢光圖像的發射光譜和用於濾出激發光的二向色帶通濾光器；以及置於所述鏡頭和所述二向色濾光器之間的高通濾光器，該高通濾光器用於過濾由所述二向色濾光器傳送的任何雜散廣角激發光。
本發明有下列優點1、成像系統有用於抑制阻礙靈敏的螢光測量的成像贗象的成本有效的技術。
2、將廣角螢光成像系統中的激發光的藍移帶通減到最小。


圖1A是本發明實施例的圖解視圖。
圖1B是帶通濾光器的波長對透射度的圖示的圖。
圖2A和2B是解釋本發明時有用的圖解視圖。
圖3是示出激發/發射波長重疊的圖示的圖。
具體實施例方式
現參考圖1A，示出的是本發明的實施例。如所示，螢光圖像的物面10通過廣角鏡頭12成像到成像系統16的電子傳感器14上。
相同波長的光線入射在置於照相機鏡頭12前方的二向色帶通濾光器18上。光線1在幾乎垂直於濾光器表面的窄角(A1)入射，如圖的放大部分所示。光線2以廣角A2入射。二向色濾光器18被設計成具有在圖1B的透射度光譜中示出的帶通光譜。設計的濾光器18成功地阻止垂直的或窄角的光線。在廣角處的入射光線在幹涉塗層中經過較大光程，具有藍移帶通光譜的效應。在足夠寬的入射角(A2)處，諸如『2』的光線將由濾光器18傳送。插入在二向色濾光器18和鏡頭12之間的設計良好的高通濾光器(HP)20將衰減廣角光線，該廣角光線在窄角處將被正常地阻止。
依照本發明，提供一種用於抑制阻礙靈敏的螢光測量的成像贗象的成本有效的技術。本發明的本質特徵是在鏡頭12的正面和二向色濾光器18之間安放便宜的高通吸收濾光器20。高通濾光器20選擇成在激發的上截止波長處具有足夠的吸光率，以保證如果雜散激發光被在廣角操作的藍移的發射器濾光器傳送，則適當地衰減雜散激發光。本發明的效力的實例在圖2A和2B的對比圖像中顯而易見，對比的廣角圖像來自靈敏的螢光測量系統。視域的最廣角對應於垂直入射的大約21度。所測量的物是吸收入硝化纖維膜中的光帶格式的Cy5.5染色。圓形的圖像贗象如圖2A所示，僅使用二向色濾光器，則在圖2B中就沒有了，其中應用了添加的吸收濾光器。所使用的成像系統包括大TV鏡頭(10倍變焦)，過濾滷素光源的630nm AF30 Omega激發器，700nm DF30 Omega發射器濾光器。應用的吸收濾光器是Wratten70。照相機是柯達IS2000，且呈現的圖像是16位數位化輸出的8位顯微切片(通過256個等級的暗背景)。
通過分析建模能夠傳達對本發明的進一步的理解和設計原理。分析點是估計激發光與發射帶通之間的重疊。藍移源是入射角，並且是對高質量二向色濾光器所測量的每離位入射度大約0.5nm。廣角圖像系統包括在25度或更離位的入射光，導致發射器下截止藍移13nm。對於靈敏的螢光檢定，將使用激發器-發射器濾光器對，其在中心波長典型地間隔開大約60nm，且每個濾光器將會有30-35nm帶通(FWHM，在最大值一半的全部寬度)。具有35nm FWHM的高質量二向色帶通濾光器在0.001最大值(累積的實驗數據)處轉變到大於50nm帶通。對於靈敏的螢光檢定，保證在發射器帶通中的激發光的a＞10-6的抑制是必要的，且通過保證對於激發器上截止和發射器下截止都具有＞0.001衰減的主波長可獲得。圖3(右側)的曲線圖示出在0.001的部分透射處，對垂直入射在激發器上截止和發射器下截止之間存在大約5nm的域。但是，發射器中的13nm的藍移違犯了準則，意味著視域的最廣角將會允許有效的激發器光通過發射器濾光器。插入在激發器的0.001上截止電平處具有＞2的OD的吸收濾光器(在典型的Wratten高通之後建模的)足以剛好滿足衰減的10-6準則。
在發射器/吸收器組合濾光器的設計中，使用這樣的分析建模的步驟是重要的。實際上，滿足10-6衰減充分準則是重要的，但是必須看作是臨界的最佳值。由吸收濾光器選擇更大的衰減的確會衰減在垂直入射處的產生的螢光發射，且由於該發射器二向色的徑向藍移而越來越成為圖像半徑的函數。此外，如果吸收了太多的激發光，那麼任何吸收濾光器易於產生螢光背景。因此，重要的是只在該二向色和鏡頭正面之間插入吸收濾光器。減少圖像贗象的吸收濾光器的額定效力被這樣一種原理放大了，即由藍移發射器傳送的廣角激發光在可參與圖像形成之前，必須通過吸收器不少於三次。因此，選擇在激發器的0.001上截止電平處具有＞1的OD的高通吸收器被認為是滿足最低條件。選擇具有＜1的OD的高通吸收器對於較窄的視場將的確是充分的。
參考圖3，示出的是作為用於螢光測量的激發和發射濾光器的波長函數的部分透射的圖像顯示。以納米給出距發射器濾光器的中心波長的波長刻度。激發器(EX)和發射器(EM)濾光器的中心波長被移位60nm；激發器濾光器是30nm FWHM，且發射器是35nm FWHM。實際上，激發器和發射器濾光器的最大透射度大約是0.8部分透射。根據濾光器特性的實驗測量對所提供的數據進行建模。表示的高通吸收濾光器是根據典型的Wratten濾光器。右邊的圖只是左邊刻度的放大，且表明激發器上截止(frTransEX)和藍移的發射器下截止(frTransBluEM)之間的最好的重疊。在0.001的透射處，大約5nm間隙將激發器上截止和正常發射器下截止(frTransEM)分開。吸收濾光器在激發器下截止的0.001電平處有＜0.01的部分透射，且大於充分抑制由乘積frTransBluEM*Wr表示的有關重疊。
在柯達IS2000裝置的情況中，這表明當激發器光進入鏡頭時，內部的鏡頭特徵反射回二向色面，被該二向色阻止(反射)的那些鏡頭特徵的圖像，再次進入鏡頭以最後形成內部鏡頭特徵的圖像。因為大部分的內部鏡頭特徵是同心圓(IS2000鏡頭還有一些不規則的″柱子″)，該圓形圖案(包括柱子)清楚地示出為對暗場的嚴重贗象，該暗場必須是「平的」以使能靈敏的螢光成像的適當分析。
已經測試了對該問題的解決方案，且似乎工作很好。組合濾光器與適當地選擇的接觸二向色發射器的背面(相機側面)的高通Wratten濾光器一起構造。由發射器的角藍移帶通的激發光被Wratten衰減，且上述下方的曲線圖示出的串音建模的計算表明，對於組合的濾光器的0.001準則的一致性。實驗上，暗場名義上是平的，且沒有圓形的和其它的贗象。組合濾光器的確示出的唯一效果是增強的、逐步的漸暈，因為組合發射器濾光器具有從中心到邊緣的逐漸縮小的帶通，且該漸暈隨著更寬的視場而變得越來越明顯。
權利要求
1.一種成像系統，其包含鏡頭；置於所述鏡頭前方的二向色濾光器；以及置於所述鏡頭和所述二向色濾光器之間的高通濾光器。
2.一種成像系統，其包含用於將螢光圖像成像在電子傳感器上的鏡頭；置於所述鏡頭前方以用於傳送所述螢光圖像的發射光譜和用於濾出激發光的二向色帶通濾光器；以及置於所述鏡頭和所述二向色濾光器之間的高通濾光器，所述高通濾光器用於過濾由所述二向色濾光器傳送的任何雜散廣角激發光。
3.根據權利要求2所述的成像系統，其中所述高通濾光器具有光密度大於1的適當的波長(所述激發濾光器的名義上的上截止波長)。
全文摘要
一種成像系統，其包含鏡頭；置於鏡頭前方的二向色濾光器；以及置於鏡頭和二向色濾光器之間的高通濾光器。一種調整這種成像系統的元件的適當設計，以減少涉及螢光物的廣角成像的成像贗象。
文檔編號G02B21/16GK1826520SQ200480020981
公開日2006年8月30日 申請日期2004年6月14日 優先權日2003年7月23日
發明者D·L·維扎德, W·E·麥克勞克林 申請人:伊斯曼柯達公司