溶藻弧菌外膜蛋白Pal(VA1061)的表達和作為疫苗組份的應用的製作方法

2023-10-08 15:39:44 1

專利名稱：溶藻弧菌外膜蛋白Pal(VA1061)的表達和作為疫苗組份的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及溶藻弧菌(rawo a/g/wo/;^c"s)表達的一種外膜蛋白(outer membrane protein, OM protein) Pal (VA1061)的免疫調節功能。
背景技術：
溶藻弧菌廣泛分布於世界各地海水及河口處，並且數量居海水類弧菌之首， 對於溶藻弧菌致病微生物，研究的重點就是免疫學分析，闡明其致病機理並找出 有效的防治方法，防治的辦法主要包括藥物即抗生素防治以及免疫防治，其中抗 生素雖然在最初的使用中取得了巨大的進展，然而隨著抗生素的廣泛使用，也出 現了一系列的相關問題，一方面抗生素的不合理使用，增加抗生素耐藥菌的產生， 細菌感染增多；另一方面，因抗生素的耐藥性而人為地加大劑量，加劇耐藥性的 產生。因此，研製以具有免疫保護作用的高效中和抗原為成分的疫苗具有廣闊的 應用前景。
在各種動物疾病的防治中，疫苗的使用是一個具有低成本、高效的方法，並 且已經有部分疫苗得到大規模使用並取得了不錯的防治效果。疫苗種類很多，以 細菌為例，包括全菌疫苗、亞單位疫苗以及DNA疫苗等。從實際應用的情況來 看，全菌疫苗雖然具有製作相對簡單而且成本也較低的優點，但它也存在不少由 於使用全菌體而固有的一些缺點。如減毒全菌疫苗可能出現菌株突變而導致的毒 性恢復等不良後果；滅活全菌疫苗則往往由於對細菌的滅活過程而導致一些免疫 保護基團活性的改變，而影響免疫保護的效果。而且對全菌疫苗來說，由於細菌 成分的複雜性，其中往往存在一些毒性成分(如LPS等)，會導致機體產生不良 反應。並且常規製得的全菌疫苗免疫保護效果不理想。然而，全菌疫苗仍然是目 前最為主要的疫苗種類。其原因可能與高效中和抗原的發現和鑑定困難有關。
隨著基因組學、蛋白質組學和轉錄分布圖技術的發展，這就為細菌疫苗提供 了新的契機。基因工程疫苗由於具有高效，且擺脫了傳統疫苗的種種缺點，成為 疫苗研究的重點，具有廣闊的應用與開發前景。外膜蛋白是革蘭氏陰性菌外膜的 主要成分之一，由於外膜蛋白直接面對宿主的體液及組織，細菌利用外膜蛋白進
行黏附、侵入和炎症等生理活動，更容易被宿主識別作為攻擊目標，使得革蘭氏 陰性菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不僅可以剌激體液免疫，而且對細胞免 疫亦有刺激作用。近年來，細菌的一些外膜蛋白已經被證實具有良好的免疫原性, 用其製備基因工程疫苗具有良好的前景。如在大腸桿菌中發現外膜蛋白OmpX 的免疫保護功能。但在本發明被公布之前，尚未有任何公開或報導過本專利申請 中提及的溶藻弧菌外膜蛋白Pal (VA1061)的免疫調節功能。
本專利率先採用分子克隆和免疫學等現代生物學技術，以溶藻弧菌為研究對 象，對外膜蛋白基因Pa皿(VA1061)進行克隆、表達和純化，並在此基礎上深入 研究其免疫保護性。免疫和攻毒實驗結果表明溶藻弧菌的外膜蛋白Pal(VA1061) 顯示出對溶藻弧菌較高的免疫保護作用。其相對免疫保護率(RPS)為93.7%， 此外還顯示出對螢光假單胞菌的交叉免疫原性，其免疫保護率(RPS)達到63.2 %。這些結果說明Pal可作為疫苗組分。

發明內容
外膜蛋白具有良好的免疫原性，對細胞免疫和體液免疫均有刺激作用。本發 明涉及通過對表達的溶藻弧菌外膜蛋白Pal (VA1061)免疫保護性以及免疫交叉 性的分析，發現免疫鯽魚後可以顯著提高對重要致病菌溶藻弧菌以及螢光假單胞 菌的抵制力。初步評價其作為候選疫苗的可行性，對水產疾病的防治具有重要意 義。


圖l.Pal (VA1061)基因PCR產物0.8X瓊脂糖凝膠電泳分析
圖2. pET-28a-Pal重組子的雙酶切鑑定
圖3.克隆子BL21-pET-28a-Pal在￡.co/z-BL21中的誘導表達
圖4. SDS-PAGE回收包涵體中的重組蛋白.lane 1:包涵體超聲破碎上清； lane 2: SDS-PAGE切膠純化蛋白
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明 本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法， 通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1
溶藻弧菌外膜蛋白Pal (VA1061)基因的克隆和鑑定
1. 溶藻弧菌Pal (VA1061)基因的擴增
由於溶藻弧菌基因的全序列還未測定，目前也無該菌的Pal (VA1061)基因 序列報導。鑑於副溶血弧菌已完成全序列測定，並於2006年3月在資料庫 GenBank (BA000031)公布，我們按其資料庫上己公布的Pal (VA1061)序列 設計了Pal (VA1061)基因引物，用於溶藻弧菌PaI (VA1061)的PCR擴增。 所設計的引物是上遊引物5'-ATAfiQ^CQATGAAAAAACTAGCAGCGGT-3'; 下遊引物5'-CGCAAGCTTTTATTGCTGAACTTGGTA陽3':橫線所示為酶切位 點，上遊引物引入^aw/Z/酶切位點，下遊引物引入五a^/酶切位點。使用細菌 基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司)，按照試劑盒內的使用說明書提取溶 藻弧菌的全基因組DNA作為模板，採用的引物進行PCR擴增，圖1所示PCR 擴增結果。從圖可見，基因擴增產物為單一特異條帶，Pal(VA1061)基因約525bp， 與預計的片段大小相當。
2、 溶藻弧菌Pal (VA1061)基因的克隆、篩選和鑑定 將基因PCR產物使用0.8。/。瓊脂糖/溴化乙錠凝膠進行電泳，通過新配置的瓊
脂糖凝膠電泳純化，按購自TIANGEN公司的凝膠回收試劑盒(DNA Gel Extraction Kit)的說明書進行回收。用乾淨的、鋒利的刀片，在短波長紫外燈下， 切下目的PCR擴增片段，儘可能地切除多餘的膠，置於乾淨、已稱重的離心管中， 稱重並記錄切下目的膠的重量；然後按照說明書的步驟，依次加入各種溶液、離 心、過柱、洗脫等，最後得到基因PCR回收產物，置於-20。C保存。取少量進行 回收效果電泳檢測。
待基因PCR擴增產物回收後，分別採用相應的限制性內切酶B"w^/和 歷w^Z7(Takara公司)進行雙酶切，同時對載體pET-28a (Novagen公司)進行 雙酶切(37。C酶切過夜)，酶切後使用乙醇沉澱回收。方法如下向酶切體系加 入1/10體積的NaAc (3M， pH 5.2)和2.5倍體積的無水乙醇，經-2(TC靜置60min 後，12000rpm離心15min，棄上清，加500 Nl 70%的乙醇洗滌，12000rpm離心 5min，棄上清，重複洗滌一次，洗滌完後小心地倒盡液體，用濾紙吸盡乙醇，置 超淨臺中自然風乾，風乾後直接溶於適量的去離子無菌水。
將兩者回收後加入連接酶(Takara公司)，調節水溫16'C，之後連接過夜。 將連接產物與約100^1 Z)/^5a感受態細胞混合，冰浴30min後42'C熱激90s,並 立即冰浴5min，加新鮮LB培養基補足體積至lml，置於37。C搖床150rpm緩慢 培養45min，取培養液10000rpm離心30s，棄85(^1上清，餘下菌液重懸均勻， 塗布含卡那黴素(100、g/ml) LB平板，待轉化液被平板完全吸收後，於37'C倒 置培養12 16小時。
從轉化平板中隨機挑取6個單菌落，接種到5ml按1:500比例添加卡那黴素
(50mg/ml)的LB液體培養基中，37'C培養8h,採用鹼裂解法小量提取質粒。方 法如下將菌液轉入1.5mL微量離心管中，4'Cl0000g離心l min，吸出培養液， 加IOO (iL冰預冷的溶液I (50 mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl pH 8.0， 10 mmol/LEDTA)劇烈振蕩至細菌沉澱完全重懸。室溫下靜止2 min，力卩200^現配 的溶液II (0.2mmol/LNaOH， 1%SDS)，蓋緊管口，快速上下輕微顛倒幾次混勻， 冰浴5 min，力口150^L冰預冷的溶液m (60mL 5mol/L乙酸鉀，11.5mL冰乙酸， 2S.5mL H20)，反覆顛倒幾次使粘稠的細菌裂解物分散均勻，冰浴5min。 4'C下 12000g離心7min，轉移350pL上清到另一離心管，用等量體積的酚/氯仿抽提2次， 加2倍體積的冰冷無水乙醇，上下顛倒混勻。室溫靜置2min， 4'C12000g離心5 min。小心去上清，75%乙醇洗滌2次，棄上清，再將附於管壁上的液滴除盡，用 30^L含RNA酶的TE (pH8.0)溶解質粒DNA，稍加振蕩，貯存於-2(TC。用相應 的限制性內切酶進行雙酶切進一步鑑定。如圖2所示，重組質粒？￡1-28&-Pal可酶 切出與PCR產物大小相當片段大小一致的片段，表明基因已成功地插入到 pET-28a載體中。運用Beckman CEQ末端標記循環測序將已經克隆的重組質粒Pal
(VA1061)進行序列測定。 實施例2
溶藻弧菌Pal (VA1061)蛋白的表達 1預測胺基酸序列
基因Pal (VA1061)為中等長度片段，並運用DNAssist軟體分析，獲得其 完整的開放閱讀框ORF 2重組子的原核表達
挑取重組質粒的單菌落接種於lml按1:500比例添加卡那黴素(50mg/ml)的
LB液體培養基中37'C過夜培養至飽和，按l:100接種量接種飽和培養物到5mL的 LB培養基中，於37'C培養約2h至OD6。o約等於0.6左右。在培養物中加入IPTG至 終濃度為lmmol/L， 37'C繼續培養3h。取出經過誘導的培養物室溫高速離心lmin， 收集菌體。同時設立對照組，沉澱重懸於100pL2xSDS凝膠加樣buffer中，IO(TC 加熱5min。 12000rpm，離心10min。取適量上請樣品上樣於12°/。 SDS聚丙烯醯胺 凝膠，電泳至溴酚蘭遷移到分離膠底部。考馬斯亮藍染色，掃描輸出照片。結果 表明Pal (VA1061)基因重組子已轉入五.co//萬￡"並獲得陽性表達如圖3。其重 組蛋白大小約為19kD。因此重組蛋白的分子量在表達圖譜上與預期相符。 實施例3
1.溶藻弧菌PaI (VA1061)蛋白的純化
挑取重組質粒轉化大腸桿菌5L2/(DE3)，塗布於含有100pg/mL卡那黴素的 LB培養基中，37'C培養過夜。隨即挑取單菌落，加入5mLLB液於37'C振蕩過 夜，按1:100的比例轉接至含抗生素的液體LB培養基200mL， 37'C振蕩培養約 2.5-3h， 00600=0.6時，於瓶中加入IPTG (終濃度為1 mmol/L)進行誘導，30°C 200 rpm/min搖3h。 6000g， 4"C離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體2次， 稱菌體溼重。
用緩衝液(50mmol/LTrisHCL、 lmmol/LEDTA、 pH8.0)洗滌3次，超聲破 碎菌體後，先6000 rpm/min離心5min，棄沉澱物；12000 rpm/min離心10min， 回收沉澱。然後將包涵體用buffer D(8M尿素；0.1MNaH2PO4 ; lOmmTris-HC1， pH 8.0)懸浮，超聲破碎，輸出功率60%， 5s/次，間隔9s，超聲10min。超聲破 碎後的溶液，9000g， 4。C離心15min，收集上清。
包涵體超聲破碎後的上清經SDS-PAGE分離，分離膠12%，濃縮膠4%。電 泳條件為濃縮膠，80V;分離膠，120V。電泳結束後用考馬斯亮藍染色液(0.1% 考馬斯亮藍R-250， 50%乙醇，10%冰乙酸)染色，用脫色液脫色至背景乾淨後 切下目的蛋白條帶，放於研缽中。加入蛋白浸提液(pH7.9Tris-HCl， 0.05M; EDTA O.lmM; NaC10.15M; SDSO.1%)並磨碎，並放入1.5ml離心管中4。C過夜，第 二天高轉速離心12000rpm， 10min，吸取上清進行丙酮沉澱，沉澱溶解後電泳分 析結果見圖4， Bradford蛋白定量法定量，低溫保存備用。 實施例4
溶藻弧菌外膜蛋白Pal (VA1061)對溶藻弧菌以及螢光假單胞菌的免疫保 護作用
純化外膜蛋白Pal (VA1061)共I.Omg，對鯽魚進行腹腔注射，每次免疫的 抗原量為25、g/尾，每組共20尾。首次免疫使用弗氏完全佐劑乳化，隔兩周加強 免疫一次，加強免疫用弗氏不完全佐劑乳化。同時對照組則注射生理鹽水。並且 對健康的鯽魚進行溶藻弧菌以及螢光假單胞菌半數致死劑量LD5o的測定，根據等 對數間距選擇試驗濃度。在加強免疫後第10天，使用5倍LD5o劑量的溶藻弧菌 (5xl07cfU/mL)及螢光假單胞菌(5xl07cfU/mL)進行攻毒保護性實驗。腹腔注 射攻毒後的第2天，對照組魚的遊動開始變得遲緩，並不斷死亡，而具有免疫保 護作用的Pal (VA1061)實驗組無異常反應。5天後魚不再陸續死亡，觀察記錄實 驗組和對照組對死亡情況，注射溶藻弧菌以及螢光假單胞菌的^]"照組存活率分別 為20%和5%，而實驗組Pal (VA1061)的免疫保護效果有明顯的差別，對溶藻弧 菌的免疫保護率(RPS)高達93. 7%，具有顯著性差異(P〈0. 01)。同時Pal(VA1061) 還顯示出對螢光假單胞菌的交叉保護作用，其免疫保護率(RPS)為63.2%。經 統計學計算表明Pal (VA1061)具有顯著的免疫保護作用。說明Pal (VA1061)可 以刺激機體產生保護性抗體，提高宿主免疫保護能力，是一個很好的免疫保護原。
序列表
中山大學
^20溶藻弧菌外膜蛋白Pal (VA1061)的表達和作為疫苗組份的應用
2
1
525
DNA
溶藻弧菌
1
atgcaactgaacaaggttctaaaagggctactaatcgcgcttcctgtaatggctgttaca60
gcgtgtagttcgctgcttctaacactggtgcaac朋tggc120
caacagtagctgcgccaattgatcaaagcggtcagttgac180
aagcgctacgtgaaa^tcaaacaatctact,ttgcttttga240
attgcagcaggatgctagcggctcacgcttcttacctaag300
gcacttaacgtaactatcgaaggtcacgctgatgagcgcggtacacctgagtacaacatt360
gctctaggtgagcgtcgtgcgcgaactacct.a.caagcactaggtgttcaa420
gctgaccaaatctcaa.tcgttagctacggtcacttcttctaggtcaatca480
gatgaagtttccgtcgcgcggttctagtat,525
2
144
PRT
溶藻弧菌
2Met Gin Leu Asn Lys Val Leu Lys Gly Leu Leu lie Ala Leu Pro Val
15 10 15
Met Ala Val Thr Ala Cys Ser Ser Ser Asp Asp Ala Ala Ser Asn Thr
20 25 30
Gly Ala Ala Thr Asn Asn Asn Gly Ala Val Glu Thr Thr Val Ala Ala
35 40 45
Pro lie Asp Gin Ser Gly Gin Leu Thr Glu Gin Glu Leu Lys Glu Gin
50 55 60
Ala Leu Arg Glu Thr Gin Thr lie Tyr Phe Ala Phe Asp Asn Ser Tlir 65 70 75 80
lie Ala Ala Asp Tyr Glu Glu Met Leu Ala Ala. His Ala Ser Tyr Leu
85 90 95
Ser Lys Asn Pro Ala Leu Asn Val Thr lie Glu Gly His Ala Asp Glu
100 105 110
Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn lie Ala Leu Gly Glu Arg Arg Ala Gin
115 120 125
Ala Val Ala. Asn Tyr Leu Gin Ala Leu Gly Val Gin Ala Asp Gin lie 130 135 140
Ser lie Val Ser Tyr Gly Glu Glu Lys Pro Leu Leu Leu Gly Gin Ser
145 150 155 160
Asp Glu Val Tyr Ala Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Val Tyr 165 170
權利要求
1. 一種溶藻弧菌外膜蛋白Pal(VA1061)，其胺基酸序列序列表400所示。
2. 編碼權利要求1所述的溶藻弧菌外膜蛋白Pal (VA1061)的DNA，其核 苷酸序列如序列表400所示。
3. 權利要求1所述的溶藻弧菌外膜蛋白Pal(VA1061)作為疫苗組份的應用。
4. 權利要求1所述的溶藻弧菌外膜蛋白PaKVA1061)免疫保護作用的應用。
5. 權利要求l所述的溶藻弧菌外膜蛋白Pal (VA1061)作為提高宿主免疫功 能製劑的應用。
全文摘要
本發明涉及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的一種重組外膜蛋白(outermembrane proteins)Pal(VA1061)的表達和疫苗組份的作用功能。本發明通過克隆溶藻弧菌重組外膜蛋白Pal(VA1061)基因、表達及純化，純化產品可以顯著地提高魚類對溶藻弧菌、螢光假單胞菌等病原菌的抵抗力。可作為亞單位疫苗的候選靶位，且對控制弧菌感染的免疫學防治具有十分重要的意義。
文檔編號C12N15/31GK101386643SQ20081002983
公開日2009年3月18日 申請日期2008年7月29日 優先權日2008年7月29日
發明者彭宣憲, 惠 李, 熊莜鵬 申請人:中山大學