通過使用細菌ω-轉氨酶光學拆分外消旋胺混合物製備光學活性N-保護的3-氨基吡咯烷或...的製作方法

2023-10-08 13:13:29

專利名稱：：通過使用細菌ω-轉氨酶光學拆分外消旋胺混合物製備光學活性N-保護的3-氨基吡咯烷或...的製作方法
技術領域：
：本發明涉及光學活性手性胺的製備方法。
背景技術：
：手性胺在醫藥、農藥和化學產業中起到非常重要的作用。它們通常作為中間體或合成單體用於製備各種諸如藥物活性物質的生理活性物質，例如頭孢菌素或吡咯垸衍生物。在為數眾多的手性胺的各種應用中，只有一種特定的光學活性形式，目卩(R)或(S)對映體是有生理活性的。因此，需要提供一種光學活性形式的手性胺的製備方法。通過添加手性羧酸結晶非對映體鹽來製備手性胺，這些要求部分得到了滿足(Breueratal.,AngewandteChemie(2004)116,806-843)。其他的化學方法則是利用對映體選擇性拆分，通過分解具有C=N雙鍵的前手性的前體。此外，使用不同的酶，例如蛋白酶、醯胺酶和脂肪酶，進行立體選擇性裂解夕卜消旋體是已矢口的(BornscheureandKazlauskas,HydrolasesinOrganicSynthesis(2005)，Wiley-VCHWeinhdm)。特定的轉氨酶，即a-轉氨酶適合用於製備光學活性的胺基酸也是已知的(Bartschetal"Appl.Environm.Microbiol.(1996)62,3794-3799,Choetal"Biotechnol.Bioeng.(2003)83,226-234，JP01153084A2(1998)，JP63304986A2(1988),EP0248357A2andZiehretal"Biotechnol.Bioeng.(1987)29,482-487)。然而，這些現有技術的方法具有各種缺點。儘管相比傳統的方法，酶法通常使用更為溫和的條件，並且能夠獲得合理的立體選擇性，但是，它們通常使用的酶的底物特異性、對映體選擇性和/或轉化率對於工業化的生產過程還不夠高。另外，使用轉氨酶生產光學活性胺的一個最主要的缺陷是常常會發生底物和產物抑制現象。因此，本發明的一個目的就是提供一種用於製備光學活性的手性胺的改進的方法，特別是一種底物特異性、轉化率和/或對映體選擇性得到提到的方法。
發明內容通過提供一種光學活性手性胺的製備方法，本發明解決了潛在的技術問題，該方法包括轉化一種包含一個酮基的氨基受體化合物，以及一種3-氨基吡咯烷GAP)或3-氨基哌啶(3APi)的消旋混合物，每一種均在環氮原子上結合一個保護基團，加入(R)或(S)選擇性轉氨酶，以獲得3AP或3APi的對映體。這個氨基化合物對應於所述的氨基受體化合物，而N-保護的3-吡咯垸酮或N-保護的哌啶-3-酮則是酮產物。本發明的方法包括(a)提供一種氨基受體和一種l-N-保護的3AP或l-N-保護的3APi的消旋混合物，例如各個胺的兩種對映體的混合物，(b)用(R)-或(S)-選擇性轉氨酶轉化所述氨基受體以及各個胺的消旋混合物，(c)獲得一種光學活性的手性胺，一種胺產物和一種酮產物。根據本發明的一個優選實施例，在隨後的可選處理步驟中，步驟c)中獲得的光學活性的手性胺被從步驟c)獲得的反應混合物中分離並純化。本發明的反應根據以下反應式進行formulaseeoriginaldocumentpage5根據本發明，所述3-氨基吡咯烷(3AP)或3-氨基哌啶(3APi)的消旋混合物在環的第二個氮原子上都具有保護基團，也就是在胺的手性中心的一號位的氨基，參與轉氨反應的3號位沒有受到保護。保護基團的存在使得所述被保護的胺，即l-N-保護的3AP或3APi，更有效地轉化為所需的光學活性手性胺。因此，保護基團的存在，獲得了所需的光學活性手性胺的高得率。相比之下，環上的氮原子沒有保護基團的起始胺的效率較低。所以，本發明提供了一種酶解l-N-保護的胺的方法，通過使用至少一種(R)-或(S)-選擇性轉氨酶，將l-N-保護的手性胺的對映體混合物中一種特定的對映體上的一個氨基轉移到一種氨基受體上，從而形成所需的光學活性產物。在本發明的上下文中，術語"胺的酶解"或"消旋混合物的酶解"是指利用立體選擇性酶轉化消旋混合物的一種對映體的光學分解。根據(R)-或(S)-選擇轉氨酶的對映體偏好性，一種所需光學構型的光學活性手性胺，g卩(R)-或(S)-對映體就獲得了。因此，在本發明的一個實施例中，在酶解合成中使用一種(S)-選擇性轉氨酶，去除消旋混合物中的(S)-對映體，並生成手性胺的所需的光學活性的(R)-對映體；而在本發明的另一個實施例中，在酶解合成中使用(R)-選擇性轉氨酶，去除消旋混合物中的(R)-對映體，並生成所需的光學活性的(S)-對映體。除了所需的光學活性手性胺外，該反應還從消旋混合物的轉氨反應中產生了一種酮產物，來自所使用的氨基受體的一種胺產物，以及部分未分解的不需要的對映體和未轉化的氨基受體。在本發明的一個優選實施例中，所述保護基團是一個叔丁氧羰基(Boc)。在另一個優選實施例中，所述保護基團是一個苄基。在另一個優選實施例中，所述保護基團是一個苄氧羰基(Cbz)。在本發明的上下文中，一種轉氨酶是磷酸吡眵醛依賴性的轉氨酶，其催化氨基的轉移。轉氨酶被分類在E.C.2.6丄X。在本發明的一個特別優選的實施例中，所述轉氨酶是一種(R)-或(S)-選擇性的轉氨酶，在一個優選實施例中，特別的是一種"-轉氨酶。在本發明的上下文中，(R)_或(S)-選擇性轉氨酶是一種分類號為E.C.2.6丄18的酶。這些氨基轉氨酶的特徵在於，它們主要利用初級的胺作為底物。這些酶的進一步的特徵就是顯示出的(R)-或(S)-選擇性轉氨酶催化的反應的平衡常數大於1，本發明可以使用的(R)-或(S)-選擇性轉氨酶已有描述，例如在Iwasakietal.,Biotechnol.lett.(2003)25，1843-1846,Shinetal.,Biotechnol.Bioeng.(1997)55,348-358，ShinandKim,BookofAbstracts,217thACSNationalMeeting,Anaheim,Calif"March21-25,(1999)180,ShinandKim,Biosc.Biotechnol.Biochem.(2001)65，1782-1788和ShinandKim,Biotechnol.Bioeng.(1998)60,534-540。6所以，在本發明的一個優選實施例中，本發明的方法所使用的(R)-或(S)-選擇性轉氨酶是來源於河流弧菌(W6n'oywv/fl/^)、特別是菌株JS17，反硝化產鹼菌tfemYr訴cam)、特別是菌株Y2K-2，肺炎桿菌(《/eZw/e〃a/"e畫羅.cre)、特另ll是菌株YS2F，或者是蘇芸金桿菌(6鎖.〃w"/z訓'"g〖e腦's)、特別是菌株JS64(關於菌株的鑑定請見上述的ShinandKim，1998)。當然，本發明也可以理解為術語(R)-或(S)-選擇性轉氨酶是有機體的提取物，例如含有一種(R)-或(S)-選擇性轉氨酶的微生物或細胞，或者是自身包含有(R)-或(S)-選擇性轉氨酶的活體或死的細胞和微生物。這樣一種微生物或細胞或提取物或轉氨酶可以採用固定或非固定的形式，所述(R)-或(S)-選擇性轉氨酶也可以是重組產生、自然生成或遺傳修飾的(R)-或(S)-選擇性轉氨酶，這些酶部分或完全地由核酸序列編碼，或者是它們的衍生物，包含於一種上述的有機體和它們的等同物中。在本發明的上下文中，術語"光學活性手性胺"與術語"對映體活性手性胺"涉及同樣的主題。這些術語特別的是指一種製備物，在一個更為優選的實施例中，其基本上不含不需要的對映體。因此，光學活性手性胺主要是包含一種過量的對映體或者甚至是僅由一種對映體組成。特別的，在本發明的上下文中，光學活性手性胺的光學純度至少為70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8。％，特另ij是至少為99.9%。在本發明中，光學純度用一種對映體超過另一種對映體的百分比來表示，所以，光學純度的百分比是(R)-和(S)-對映體的濃度之差與兩種對映體的總濃度的商(八的光學純度％=([A]-[B]):([A]+[B])X100，其中A和B代表(R)-和(S)-對映體濃度，或相反)。在本發明中，優選的，所述手性胺的消旋混合物轉化成所需的光學活性手性胺的轉化率至少為30、40、45、46、47、48、49%，特別是50%,分析光學純度的濃度和轉化率可以通過使用例如HPLC、氣相色譜(GC)，光度或螢光的方法來確定。本發明顯示，保護基團對於轉化率有著積極的作用，因而使得使用(s)-特異性轉氨酶的(R)-3-氨基吡咯烷的得率得到提高。另外，保護基團還顯示了(雖然不明顯)對於3-氨基吡咯烷的轉化率的影響，並且對於酶的選擇性有積極作用。在本發明的上下文中，氨基受體是一種分子，其含有一個酮基，並且，通過(R)-或(S)-選擇性轉氨酶，能夠接受來自一個氨基供體的氨基，例如，在目前的情況下，來自胺的消旋混合物的一種胺。在本發明的一個特別優選的實施例中，所述氨基受體是一個a-酮酸。在本發明的一個更為優選的實施例中，所述氨基受體選自苯丙酮酸，其鹽，丙酮酸，其鹽，乙醛酸，其鹽，苯乙酮，2-酮戊二酸，其鹽，丙酮，3-氧代丁酸，其鹽，和2-丁酮。此外，在另一個實施例中，3-氧代吡咯垸(3-OP)，(3-吡啶基)甲酮(3-PMK)，3-氧代丁酸乙酯(3-OBEE)，或3-氧代戊酸甲酯(3-OPME)也可以用作氨基受體。根據本發明，由氨基受體苯丙酮酸轉化獲得的胺產物為苯丙氨酸。由氨基受體丙酮酸轉化獲得的胺產物為丙氨酸。由氨基受體乙醛酸轉化獲得的胺產物為甘氨酸。由氨基受體苯乙酮轉化獲得的胺產物為l-苯乙胺。由氨基受體2-酮戊二酸轉化獲得的胺產物為穀氨酸。由氨基受體丙酮轉化獲得的胺產物為異丙胺。由氨基受體3-氧代丁酸轉化獲得的胺產物為3-氨基丁酸。由氨基受體2-丁酮轉化獲得的胺產物為仲丁胺。由氨基受體3-氧代丁酸乙酯(3-OBEE)轉化獲得的胺產物為3-氨基丁酸。由氨基受體3-氧代戊酸乙酯(3-OPME)轉化獲得的胺產物為3-氨基戊酸甲酯。因此，在一個優選實施例中，所獲得的需要的光學活性手性胺依賴於所使用的(R)-或(S)-選擇性轉氨酶，或者是所述手性胺的(R)-或(S)-對映體。根據本發明，本方法所獲得的酮為l-N-保護的3-吡咯垸酮或者是l-N-保護的哌啶-3-酮。本發明的方法包括使用一種(S)-或(R)-選擇性轉氨酶以及一種氨基受體轉化l-N-保護的3AP的消旋混合物，以獲得光學活性(R)-或(S)-1-N-保護的3AP。本發明的方法也包括使用一種(R)-或(S)-選擇性轉氨酶以及一種氨基受體轉化l-N-保護的3APi的消旋混合物，以獲得光學活性(S)-或(R)-1-N-保護的3APi。根據本發明的方法，所獲得的l-N-保護的3AP或l-N-保護的3APi中的保護基團可以使用現有技術已知的任意去保護的方法去除。一種使用濃縮的鹽酸和丙酮去除叔丁氧羰基(Boc)的方法例如在Coffeyetal.,Org.Proc.Res.Dev.,8(6)(2004),pages945-947中有報導。8在本發明的一個特別優選的實施例中，所述氨基受體和胺的消旋混合物在水介質、例如生理緩衝液中通過轉氨酶進行反應。在一個特別優選的實施例中，所述轉氨反應的pH控制在59，特別是78.5。在一個特別優選的實施例中，所述反應的溫度控制在1065°C，優選2050。C，特別是1825。C，優選室溫或3439°C，特別是37'C。在本發明的一個更為優選的實施例中，所述氨基受體和胺的消旋混合物的摩爾比為1:11:10，特別是l:11:4。在本發明的一個優選實施例中，所述酶活力可以是從120.000pmol/min。在一個優選實施例中，本發明涉及一種方法，用於製備如上所述的光學活性手性胺，根據該方法，在第一步a)提供一種氨基受體以及3-氨基吡咯烷(3AP)或3-氨基哌啶(3APi)的消旋混合物，每一種均在環氮原子上具有保護基團；在第二步b)使所述手性胺的消旋混合物和所述氨基受體通過至少一種co-轉氨酶轉化；在第三步c)獲得一種光學活性手性胺，一種胺產物，以及一種酮產物；在下一步d)在步驟c)獲得的酮產物和/或胺產物被從獲得的反應混合物中去除，也就是通過酶解，特別是使用選自於脫羧酶、合酶、脫氫酶中的一種酶酶解。在一個更為優選的實施例中，所述酮和/或胺產物可以利用蒸發或萃取去除。在一個更為優選的實施例中，所獲得的酮產物也可以通過自發的脫羧作用去除。在一個更為優選的實施例中，步驟c)中獲得的所述酮產物通過與一種乙醇脫氫酶(ADH)反應而被去除，所述乙醇脫氫酶例如乳酸菌發酵得到的酸乳酒ADH，能將苯乙酮降解為l-苯乙醇。在本發明的一個更為優選的實施例中，步驟c)中獲得的所述酮和/或胺產物被連續地從反應混合物中去除，優選的是通過連續萃取。在一個特別優選的實施例中，所述酮產物可以使用一種兩相系統或酶-膜反應器通過連續萃取的方式被去除。這些特別優選的實施例的優點是獲得了理想的轉化率，因為作為本方法的副產物的酮被從平衡反應中去除。這個反應由於受到產物導向的制約，因此可以高立體選擇性地轉化為所需的產物。去除酮產物是特別有利的，因為這使得產物抑制最小化。本發明的更優選的實施例是從屬權利要求的主題。具體實施例方式以下通過實施例對本發明作更為詳細的描述。實施例1:酶解(R,S)-B3AP本實施例中，來自河流弧菌(ra^/oyZwv/a/^)(JulichChemicalSolutions,德國)的(S)co-轉化酶(以下稱為TA7)，以及來自反硝化產鹼菌"/cd扭"Mflfe"/的ycww)(JulichChemicalSolutions,德國)的(S)co-轉化酶(以下稱為TA7)(以下稱為TA8)被用於反應混合物中，在pP^7的50mMTris-HCl中的終濃度為4U/ml。以10mM(終濃度)的(R,S)-B3AP(N-l叔丁氧羰基氨基吡咯烷)消旋混合物溶液(20nmol)作為起始反應物，使用TA7或TA8，以終濃度為10mM的丙酮酸鹽作為氨基受體，在反應混合物中於37T:轉化15小時。反應15小時後，使用TA7(S)(d-轉化酶得到的光學活性的胺(R)-B3AP的光學純度為62.5±0.5%，轉化率為39.0±5%。TA8(S)cd-轉化酶在15小時的反應時間後得到的光學活性的胺(S)-B3AP的光學純度為97.5±0.5%，轉化率為47.6±5%。很明顯，獲得的光學純度較高或者甚至是很高，而且接近於理想的立體選擇性酶的值。需要注意的是，對於TA7，光學純度相對較低主要是由於轉化率較低。實施例2:酶解(R,S)-l-N-Boc-3-哌啶對於酶解(R,S)-1-N-Boc-3-哌啶的消旋混合物，用丙酮酸(終濃度10mM)作為氨基受體；使用(S)co-轉化酶TA8於50mM的磷酸鈉緩衝液中，pH7.5。在TA8酶濃度為2U/ml的條件下，於37"C反應72小時後，獲得的光學活性的(R)-1-N-Boc-3-哌啶的光學純度為70±5%，轉化率為54±0.5%。在相同的反應條件下，使用20U/ml的TA8獲得的光學活性的(R)-1-N-Boc-3-哌啶的光學純度為98.5±0.5%，轉化率為72±5%。實施例3:通過消旋裂解製備光學活性的(R)-B3AP230mg(0.85mmo1)消旋(R,S)-B3AP，終濃度為10mM，用0.8U/ml的(S)。-轉化酶TA8處理。終濃度為lOmM的丙酮酸用作氨基受體。反應在pH=8的磷酸鉀緩衝溶液中進行，反應溫度37"C。過量的對映體通過氣相色譜法檢測。反應7小時反應後，獲得的89.4mg光學活性(R)-B3AP的光學純度為98.7±0.5%，得率為39±5%(0.33mmo1)。反應結束後，用5N的鹽酸調節pH值到5。生成的B30P4用二氯甲烷提取四次，每次75ml。薄板層析未在反應溶液中檢測到B30P。然後，用KOH調節pH值至13，用二氯甲烷提取3次，每次100ml。薄板層析只檢測到一條B3AP的條帶。合併含有B30P和B3AP的有機相，用無水硫酸鈉乾燥，隨後增溶劑被蒸發。然後進行'H和。C核磁共振譜檢測。得到103.6mg作為酮產物的Boc-3-吡咯烷酮，轉化率44±5%。另外還得到了胺產物丙氨酸。選擇性地除去胺產物丙氨酸，例如用丙氨酸脫氫酶的反應，被證實是非常有用的，因為這使得生成的丙氨酸所引起的產物抑制最小化，隨之而來的是，這也能使用更高濃度的胺作為起始反應物。使用丙酮的情況也是如此。使用丙酮作為氨基受體可以提高轉化率，丙酮在轉化為胺產物異丙胺後，可以在減壓條件下從反應產物中去除。實施例4:河流弧菌(W6n'o/m;/afo)轉氨酶光學拆分l-N-苄基-3-氨基吡咯烷(Be3AP)的消旋混合物在一個1.5ml的反應管中裝入lOpl(R,S)-Be3AP溶液於DMSO中(終濃度5mM)20磷酸吡口多醛，10mM(終濃度0.2mM)100pl丙酮酸鹽，100mM(終濃度10mM)830inl磷酸鈉緩衝液，50mM，pH8加入40pl的河流弧菌(W6n'oyZm^fo)轉氨酶啟動反應。對應的酶濃度為7U/ml。分別在反應開始後O分鐘，IO分鐘，30分鐘和60分鐘取樣。反應的進程和光學純度在表1中列出。tableseeoriginaldocumentpage12[%eeR]:(R)對映體過量的百分比。數據顯示，河流弧菌(W6n'oym^to)轉氨酶對轉化Be3AP有很高的活性。實施例5:河流弧菌(W6n'o/7m^fe)轉氨酶光學拆分(R，S)-Cbz-3-氨基吡咯垸(C3AP)的消旋混合物在一個1.5ml的反應管中裝入10jil(R，S)-C3AP溶液於DMSO中(終濃度5mM),20fil磷酸吡R^醛，10mM(終濃度0.2mM).100fil丙酮酸鹽，100mM(終濃度10mM)830pl的磷酸鈉緩衝溶液，50mM，pH8加入40iul的河流弧菌(f^n'o/7m^fc)轉氨酶啟動反應。對應的酶濃度為7U/ml。分別在反應開始後O分鐘，IO分鐘，30分鐘和60分鐘取樣。10分鐘後即在樣品中檢測到(R)-C3AP對應體過量，(R)對映體過量的百分比為97.3%eeR。30分鐘後已檢測不到(S)對映體。實施例6:河流弧菌^)n'o/7im'flfe)轉氨酶光學拆分(R,S)-1-N-boc-3-氨基哌啶(B3APi)的消旋混合物在一個1.5ml的反應管中裝入lOO[il(R,S)-B3APi鹽酸溶液於水中(終濃度5mM)20磷酸卩比眵醛，10mM(終濃度0.2mM)100(il的丙酮酸鹽，pH8，100mM(終濃度10mM)580pl的磷酸鈉緩衝液，50mM，pH8加入200)til的河流弧菌(W^/oyZwv/afe)轉氨酶啟動反應。對應的酶濃度為35U/ml。分別在反應開始後IO分鐘，30分鐘，60分鐘，2小時，4小時和18小時取樣。4小時後獲得的對應體過量的百分比為96.3%ees。轉化率為55±5%。儘管需要使用大量的酶，但足以證明河流弧菌(附Woy7謂》fe)轉氨酶可以用於光學拆分(R,S)-B3APi。權利要求1、一種製備光學活性手性胺的方法，其特徵在於包括a)提供一種氨基受體以及一種3-氨基吡咯烷(3AP)或3-氨基哌啶(3APi)的消旋混合物，每一種均在環氮原子上具有一個保護基團；b)以(R)-或(S)-選擇性轉氨酶轉化所述氨基受體以及所述胺的消旋混合物；c)獲得光學活性手性胺，一種胺產物以及一種酮產物。2、如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述保護基團是苄基、叔丁氧羰基(Boc)或苄氧羰基(Cbz)。3、如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述氨基受體選自苯丙酮酸，其鹽，丙酮酸，其鹽，乙醛酸，其鹽，苯乙酮，2-酮戊二酸，其鹽，丙酮，3-氧代丁酸，其鹽，2-丁酮，3-氧代吡咯垸(3-OP)，(3-吡啶基)甲酮(3-PMK)，3-氧代丁酸乙酯(3-OBEE)，和3-氧代戊酸甲酯(3-OPME)。4、如前述任一項權利要求所述的方法，其特徵在於所述獲得的胺產物是一種初級胺或胺基酸。5、如前述任一項權利要求所述的方法，其特徵在於所述(R)-或(S)-選擇性轉氨酶是來自河流弧菌(yim'"/")，反硝化產鹼菌(力cfl"ge""dem'fr訴co/M)，月市炎桿菌(A7efe/e〃apwewmom'ae)，或蘇芸金桿菌(tec/〃MSAwn'"g/e"^)的(R)-或(S)-選擇性轉氨酶。6、如前述任一項權利要求所述的方法，其特徵在於在步驟c)獲得的所述胺產物和/或酮產物進一步在步驟d)中，通過酶反應、自發的脫羧反應、萃取或蒸發被從反應混合物中去除。7、如權利要求6所述的方法，其特徵在於在步驟d)中使用的所述酶是脫羧酶、合酶或脫氫酶。8、如權利要求6或7所述的方法，其特徵在於所述酶是乙醇脫氫酶(ADH)。9、如前述任一項權利要求所述的方法，其特徵在於在步驟c)或d)獲得的所述光學活性手性胺被從在步驟c)或d)獲得的反應混合物中去除。10、如前述任一項權利要求所述的方法，其特徵在於在步驟C)或d)獲得的所述l-N-保護的3AP或l-N-保護的3APi的保護基團通過去保護的方法被去除。11、一種使用權利要求110中任一項所述的方法製備生理活性化合物的方法，所述生理活性化合物選自3-氨基吡咯烷衍生物，頭孢菌素，頭孢菌素的衍生物，雜環硼酸，L-二羥基苯丙氨酸(L-多巴)，a-甲基多巴，D-苯甘氨酸，(3-羥基苯甘氨酸，草胺磷，氨基比林衍生物，以及吡咯烷酮衍生物。全文摘要本發明涉及光學活性胺的製備方法，所述光學活性胺可以用作合成例如藥用產品的中間體。文檔編號C12P17/10GK101512005SQ200780032912公開日2009年8月19日申請日期2007年9月6日優先權日2006年9月6日發明者烏韋·博恩朔伊爾,卡倫·羅賓斯,馬蒂亞斯·赫內申請人:龍沙股份有限公司