農用微生物製劑及其在防治瓜類根結線蟲和西瓜枯萎病方面的應用的製作方法
2023-10-08 11:41:59 2
本發明涉及微生物製劑，尤其是涉及一種農用微生物製劑，本發明還涉及該微生物製劑在防治瓜類根結線蟲和西瓜枯萎病方面的應用。
背景技術：
作物感染根結線蟲，尤其是對於保護地栽培和反季節栽培的瓜果、蔬菜來說是一種很普遍的病蟲害現象，如果根結線蟲病害不能被有效抑制和解決，便會導致瓜果、蔬菜葉片顏色變淡或者發黃，植株根系受損，導致植株吸收養分能力下降，從而致使植株矮小、生長勢弱、果子僵化、停止生長，降低產量，嚴重時會導致作物枯死和絕收。
目前，隨著人類生活水平的提高以及對綠色食品的需求不斷增加，生物農藥備受瓜果、蔬菜種植者的青睞。阿維菌素是阿佛曼鏈黴菌或灰色鏈黴菌的微生物發酵產物，是大環內酯化合物，施用阿維菌素防治土壤根結線蟲是當前生物農藥市場中最受歡迎和具有競爭力的產品，曾為農業生產作出了巨大貢獻。但是，一方面阿維菌素屬於一種新型抗生素類生物農藥，長期施用會導致作物出現抗藥性；另一方面，由於阿維菌素只對幼蟲或成蟲有觸殺作用，而對蟲卵並無作用；並且，其中沒有活菌存在，不能產生持續的抑制根結線蟲的作用。因此，在生產上阿維菌素必須進行階段性的使用或者同其他具有殺卵作用的農藥同時使用才能達到良好的殺蟲效果。然後，隨著阿維菌素與農藥的混合使用，又會對土壤微環境造成危害，降低土壤的可耕種性。
有一些地區的瓜果、蔬菜種植者為了防治根結線蟲，甚至直接使用殺蟲能力強的化學農藥，化學農藥不僅對土壤造成了汙染，對種植在土壤上的瓜果蔬菜也造成了汙染，因此才有了種瓜者不吃自己種的瓜，種菜者不吃自己種的菜的情景發生。
西瓜枯萎病俗稱死秧病，是一種維管束系統遭到破壞的土傳病害，是對西瓜危害最嚴重的病害之一。該病是由尖孢鐮刀菌西瓜專化型[fusariumoxysporumschlechlendahlf.sp.melon]侵染所致，病菌在土壤和未腐熟的帶菌肥料中越冬，在離開寄主情況下可存活5~6年，部分病菌可存活10年以上。該病主要靠含菌土壤傳播，病株率高達70%左右。西瓜枯萎病在各個時期均可發生，以結果期發病最重，嚴重時甚至可造成絕產。
目前，在西瓜枯萎病防治方面，瓜農普遍使用的仍然是農藥，雖然在防治西瓜枯萎病方面取得了一些成就，也為瓜農帶來不少的收益，但是，一方面隨著社會不斷的發展和進步，人們的健康意識也在不斷提高，對有機瓜果的需求越來越多，而農藥的強烈藥效在防治西瓜枯萎病的同時，會導致在瓜果上有所殘留，對人類身體健康造成危害；另一方面，農藥的大量使用不僅會產生抗藥性，同時會給土壤帶來嚴重的負擔，造成土壤環境汙染，使得土壤地力下降，增加能量消耗。
環境友好型微生物製劑的使用，不僅可以達到甚至超過農藥對西瓜枯萎病的防治效果，而且可以提高土壤酶活性，改善土壤微環境，促進根系生長，有利於植株生長發育、產量與質量的提高。
針對現有農業生產的需要，製備一種安全無毒的生物製劑以有效防治土壤根結線蟲和西瓜枯萎病對現代農業生產具有很好的現實意義。
技術實現要素：
本發明的目的在於針對現有技術存在的缺陷而提供一種綠色安全的農用微生物製劑，本發明還提供該微生物製劑在防治瓜類根結線蟲和西瓜枯萎病方面的應用。
為實現上述目的，本發明可採取下述技術方案：
本發明所述的農用微生物製劑，包括黴菌製劑或/和細菌製劑，其中：
黴菌製劑的配製方法為：
第一步，稱量去皮馬鈴薯20份，加適量去離子水100℃煮沸10min，過濾得到溶劑100份；添加葡萄糖2份攪拌均勻後封口121℃滅菌，冷卻後得到液體培養基；
第二步，取第一步配製的液體培養基在無菌操作臺上按8.33×102-1.25×103個/ml的接種量接種一接種環的黴菌孢子，封口包裝後放入28℃搖床內培養4天，得到黴菌發酵液，繼續放置5天，使液面形成一層孢子後待用，以便於後期接種菌劑製備培養基時形成更多的孢子；
第三步，準確稱量豆粕10份，玉米面40份，麩皮20份，鋸末30份，添加去離子水50~70份，攪拌均勻後，封口121℃滅菌，冷卻後得到黴菌菌劑製備培養基；
第四步，將第三步製備的黴菌菌劑製備培養基中加入第二步製備的黴菌發酵液20份，接種後攪拌均勻，封口放入28℃培養箱中培養一周，接種之後2天攪拌一次，待發酵完成（大約7天時間，固體菌劑中的孢子數達到1.5×1012~2.2×1012）後放在陰涼處風乾，之後粉碎成粉末狀，得到成品黴菌製劑
細菌製劑的配製方法為：
第一步，準確稱量牛肉膏0.5份，蛋白腖1份，氯化鈉0.5份，加去離子水100份，攪拌均勻後封口121℃滅菌，冷卻後得到液體培養基；
第二步，取第一步配製的液體培養基在無菌操作臺上按1.35×103-2.03×103個/ml的接種量接種一接種環的細菌，封口包裝後放入36℃搖床內培養24小時，得到細菌活菌數為5.5×108cfu/g的細菌發酵液；
第三步，準確稱量豆粕18份，玉米面30份，麩皮32份，鋸末20份，添加去離子水50~70份，攪拌均勻後，封口121℃滅菌，冷卻後得到細菌菌劑製備培養基；
第四步，將第三步製備的細菌菌劑製備培養基中加入第二步製備的細菌發酵液20份，攪拌均勻後封口放入36℃培養箱中培養24h（固體菌劑培養基中芽孢數達到1.0×1010~1.56×1010），發酵成功後將其放在陰涼處風乾，粉粹形成粉末狀，得到成品細菌製劑。
本發明所用的黴菌為淡紫擬青黴，米麴黴，康寧木黴，哈茨木黴，球孢白僵菌，綠色木黴,黑麴黴菌；細菌為枯草芽孢桿菌，螢光假單胞菌，多粘類芽孢桿菌。
本發明配製的黴菌製劑可以為單一菌種，也可以多菌種混合，同樣，本發明配製的細菌製劑也可以為單一菌種，也可以多菌種混合，效果均好；
而本發明配製的黴菌製劑和細菌製劑也可以單獨使用，同時也可以混合使用，當二者混合使用時，黴菌製劑和細菌製劑的混合比例為1~2:1。
當黴菌選用淡紫擬青黴，米麴黴，康寧木黴，哈茨木黴，球孢白僵菌，綠色木黴；細菌選用枯草芽孢桿菌或螢光假單胞菌時，本發明配製的農用微生物製劑（包括黴菌製劑和細菌製劑）可以在防治瓜類根結線蟲方面得以應用。
當黴菌選用黑麴黴，米麴黴，康寧木黴或哈茨木黴；細菌選用枯草芽孢桿菌或多粘類芽孢桿菌時，本發明配製的農用微生物製劑（包括黴菌製劑和細菌製劑）可以在防治西瓜枯萎病方面得以應用。
本發明的優點在於綠色、安全，施加在土壤中後可對防治土壤根結線蟲發揮有效的作用，增強作物根系有益菌群的生長繁殖，克制有害菌群的生長，減少病蟲害發生；不施加農藥，不存在農藥殘留的問題，能實現生產綠色健康的農產品的要求；並且可以使作物生長旺盛，增產增收。
本發明根據微生物菌群能有利於活躍土壤中有益菌群的特性，並結合各種微生物之間的相互作用而研製的農用微生物製劑，能夠有效制約或減少土壤中的根結線蟲的生長；本發明使用的黴菌屬於內寄生性真菌，這些真菌侵入線蟲體內通常藉助於粘性孢子產生芽管，穿過線蟲角質膜，侵入後產生的菌絲分枝遍及整個蟲體，吸取線蟲體內物質，著生孢子的菌絲又從死亡的線蟲體內伸出，繼續侵染其他線蟲；本發明使用的細菌通常以內生孢子粘附於線蟲的體表，進而侵入線蟲體內，隨著線蟲的發育，細菌也不斷的在其體內增殖，發育到成蟲時，線蟲體內也充滿了細菌，從而導致線蟲被徹底的摧毀，釋放大量的細菌於土壤中繼續侵染其他線蟲；從而能有效、長期的防治瓜類根結線蟲。本發明使用的黴菌和細菌還能與植物根系建立互惠共生體，從而促進共生植物的生長，增強植株的抗逆性，提高作物產量。
同時，本發明使用的黴菌和細菌主要有重寄生、拮抗和競爭作用的生防機制，能與西瓜根系建立互惠共生體從而促進西瓜的生長，增強植株的抗逆性，抑制枯萎病病原菌的生存，從而有效防止西瓜枯萎病的發生。採用本發明生物製劑不僅不會對土壤環境造成危害，反而能夠增加土壤有機質含量，改善土壤微環境，提高土壤的理化性質和生物活性。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發明微生物製劑的製備方法及其使用方法進行詳細介紹。
一、本發明微生物製劑在防治瓜類根結線蟲方面的研究
實施例1
稱取200g去皮馬鈴薯切條放入1400ml去離子水中，100℃煮沸10分鐘，用三層紗布過濾並定容1000ml作為溶劑；稱取20g葡萄糖加入溶劑中攪拌均勻後，分裝於三角瓶中，封口包裝放入121℃的滅菌鍋內滅菌20分鐘，待冷卻後即為製備好的黴菌液體培養基；
將黴菌液體培養基於無菌操作臺上接種一接種環黴菌孢子——淡紫擬青黴，封口包裝放入28℃的搖床內培養4天，得到黴菌——淡紫擬青黴發酵液，放置5天，使液面形成一層孢子層後備用；
稱取豆粕100g，玉米面400g，麩皮200g，鋸末300g於發酵桶裡攪拌均勻，再加入600ml的去離子水混合均勻，封口包裝放入121℃的滅菌鍋滅菌40分鐘，即得黴菌菌劑製備培養基。
待黴菌菌劑製備培養基冷卻至室溫後，在無菌操作臺上接種200ml的黴菌—淡紫擬青黴發酵液，接種後攪拌均勻，封口包裝放入28℃的培養箱培養一周，接種之後2天攪拌一次，待發酵完成（一般需要經過7天）後放在陰涼處風乾並粉碎至粉末狀，得到黴菌——淡紫擬青黴生物製劑t1。
實施例2
稱取5g牛肉膏，10g蛋白腖，5g氯化鈉於量杯中，加去離子水至1000ml，攪拌均勻並將ph調至7.0~7.2，分裝於錐形瓶中，封口包裝放入121℃的滅菌鍋滅菌20分鐘，待冷卻即得細菌液體培養基；
將滅完菌並冷卻好的液體培養基在無菌操作臺上接種細菌——枯草芽孢桿菌，封口包裝放入36℃的搖床內培養24小時，得到細菌——枯草芽孢桿菌發酵液；
稱取豆粕180g，玉米面300g，麩皮320g，鋸末200g於發酵桶裡攪拌均勻，再加入600ml的去離子水混合均勻，封口包裝放入121℃的滅菌鍋滅菌40分鐘，既得細菌菌劑製備培養基；
將冷卻至室溫的細菌菌劑製備培養基在無菌操作臺上接種400ml的細菌——枯草芽孢桿菌發酵液，攪拌均勻後封口包裝放入36℃的培養箱培養24小時，發酵成功後放在陰涼處風乾並粉碎至粉末狀既得細菌——枯草芽孢桿菌生物製劑t2。
實施例3
採用實施例2中的方法製備細菌液體培養基。將細菌液體培養基於無菌操作臺上接種細菌——螢光假單胞菌，封口包裝放入36℃的搖床內培養24小時，得到細菌——螢光假單胞菌發酵液；
採用採用實施例2中的方法製備細菌菌劑製備培養基。冷卻至室溫後的細菌菌劑製備培養基於無菌操作臺上接種400ml的細菌——螢光假單胞菌發酵液，攪拌均勻後封口包裝放入36℃的培養箱培養24小時，發酵成功後於陰涼處風乾並粉碎成粉末狀，得到細菌——螢光假單胞菌生物製劑t3。
實施例4
黴菌液體培養基製備方法同實施例1。將黴菌液體培養基於無菌操作臺上接種黴菌——康寧木黴，封口包裝放入28℃的搖床內培養4天，得到黴菌——康寧木黴發酵液，放置5天，使液面形成一層孢子後待接種黴菌菌劑製備培養基。
黴菌菌劑製備培養基製備方法同實施例1。冷卻至室溫後於無菌操作臺上接種200ml的黴菌—康寧木黴發酵液，攪拌均勻後封口包裝放入28℃的培養箱培養一周，接種後2天攪拌一次，發酵完成後放在陰涼處風乾並粉碎至粉末狀，得到黴菌—康寧木黴製劑。
在無菌操作臺上，往新製備的黴菌液體培養基（製備方法同實施例1）中接種黴菌——綠色木黴，封口包裝放入28℃的搖床內培養4天，得到黴菌——綠色木黴發酵液，放置5天，使液面形成一層孢子後待接種黴菌菌劑製備培養基。
在新製備的黴菌菌劑製備培養基（製備方法同實施例1）上接種200ml的黴菌——綠色木黴發酵液，攪拌均勻後封口包裝放入28℃的培養箱培養一周，接種後2天攪拌一次，發酵完成後放在陰涼處風乾並粉碎至粉末狀，得到黴菌——綠色木黴製劑。
將製備的黴菌——康寧木黴製劑和黴菌——綠色木黴製劑按1︰1之重量份混合均勻，得到生物製劑t4。
實施例5
將製備的細菌——枯草芽孢桿菌生物製劑t2和黴菌——綠色木黴製劑按1︰2之重量份混合均勻，得到生物製劑t5。
實施例6
將新製備的黴菌液體培養基（製備方法同實施例1）在無菌操作臺上接種黴菌——哈茨木黴，封口包裝放入28℃的搖床內培養4天，得到黴菌——哈茨木黴發酵液，放置5天，使液面形成一層孢子層後接種黴菌菌劑製備培養基。
在黴菌菌劑製備培養基（製備方法同實施例1）中接種200ml的黴菌—哈茨木黴發酵液，攪拌均勻後封口包裝放入28℃的培養箱培養一周，接種後2天攪拌一次，發酵完成後放在陰涼處風乾粉碎至粉末狀，得到黴菌——哈茨木黴製劑。
將製備的黴菌——哈茨木黴製劑、細菌——枯草芽孢桿菌生物製劑t2和細菌——螢光假單胞菌生物製劑t3按2︰0.5︰0.5之重量份混合均勻，得到生物製劑t6。
實施例7
將製備的黴菌——淡紫擬青黴生物製劑t1和細菌——枯草芽孢桿菌生物製劑t2按2︰1之重量份混合均勻，得到生物製劑t7。
實施例8
將製備的細菌——枯草芽孢桿菌生物製劑t2和細菌——螢光假單胞菌生物製劑t3按1︰1之重量份混合均勻，得到生物製劑t8。
實施例9
在新製備的黴菌液體培養基（製備方法見實施例1）中接種一接種環黴菌—球孢白僵菌，封口包裝放入28℃的搖床內培養4天，得到黴菌——球孢白僵菌發酵液，放置5天，使液面形成一層孢子層後接種黴菌菌劑製備培養基。
在新製備的黴菌菌劑製備培養基（製備方法見實施例1）中接種200ml的黴菌——球孢白僵菌發酵液，攪拌均勻後封口包裝放入28℃的培養箱培養一周，接種後2天攪拌一次，發酵完成後放在陰涼處風乾並粉碎成粉末狀，即得黴菌——球孢白僵菌製劑；
將製備的黴菌——淡紫擬青黴生物製劑t1和黴菌—球孢白僵菌製劑按1︰1之重量份混合均勻，得到生物製劑t9。
實施例10
1、選用重茬多年的保護地，根結線蟲危害嚴重的瓜果大棚為實驗用地和易感染的根結線蟲的南瓜苗作為實驗對象。
2、將試驗地分成小區，每小區面積為10m2：設2個對照，不施加任何藥劑的為陰性對照ck1，施加質量分數為0.2%阿維菌素乳油的為陽性對照ck2；其餘9小區施加本發明實施例1~9製備的生物製劑t1~t9。實驗重複3次。
3、育苗定植時分別施加10ml的質量分數為0.2%阿維菌素乳油和5g的本發明微生物製劑，與南瓜苗周圍的土壤充分混勻，定植後兩周在南瓜根系周圍20釐米左右追加一次0.2%阿維菌素乳油和本發明微生物製劑分別100ml和100g，與根系周圍的土壤充分混勻。
4、試驗過程中對照和處理採取相同田間管理，緩苗後，每隔一段時間測量不同處理的蔓長、莖粗及株高，瓜果中可溶性固形物含量，發病率、根上單位釐米的根結數，根際土壤中（50克）根結線蟲的數量及蟲口密度減少率以評價微生物製劑對根結線蟲的田間防治效果。
本發明生物製劑防治根結線蟲的防治效果見下表1和表2。
表1施用本發明製劑對南瓜生長的影響（栽後32天）
根據表1可以得出：從莖粗、株高和蔓長來看，施加本發明製備的微生物製劑促進南瓜的生長能力高於ck2（質量分數為0.2%阿維菌素乳油）。
表2施用本發明製劑對南瓜根結線蟲防治效果和南瓜生長以及品質的影響（栽後78天）
註：表2中計算公式：發病率（%）=（有根結的鬚根數/總鬚根數）×100
蟲口密度減少率(%)=(對照區蟲口密度一處理區蟲口密度)／對照區蟲口密度×100
由表2可以得出：從莖粗、株高和蔓長來看，施加本發明製備的微生物製劑可以促進南瓜的生長，其主要生長指標均高於質量分數為0.2%阿維菌素乳油（ck2）；施加本發明製備的微生物製劑的各個處理的南瓜中可溶性固形物含量不低於施加質量分數為0.2%阿維菌素乳油的。可溶性固形物含量的高低決定著南瓜中乾物質的多少，甜度的高低，南瓜的甜度是南瓜品質的指標之一。說明施加本發明製劑不僅能夠更好地促進南瓜的生長而且也利於其品質的提高。從單位釐米南瓜根系形成的根結數、50克根際土壤中根結線蟲的數量、發病率以及蟲口密度減少率來看，施加本發明製劑的各個處理（t1~t9）對於南瓜防治根結線蟲的效果高於施加質量分數為0.2%阿維菌素乳油（ck2）。
實施例11
1、從南瓜根系根結上挑取卵囊，卵囊用0.2%次氯酸鈉溶液消毒30s後，用無菌水衝洗，將卵囊置於無菌水中孵化，把第2天孵出的2齡幼蟲配置成200條/ml左右的線蟲懸浮液供試。
2、製備實施例1~9中的細菌、黴菌發酵液各50ml，配製質量分數為0.2%的阿維菌素50ml。
3、本實驗選用24k孔板作為培養皿，並且每5格分為一組；本實驗設9個處理，為2個對照。其中，施加本發明實施例1~9中的細菌、黴菌發酵液的為t1-t9，不施加任何藥劑的為陰性對照ck1，施加質量分數為0.2%阿維菌素乳油的為陽性對照ck2。
4、使用移液槍吸取1ml的線蟲懸浮液於24k的孔板中，分別吸取2ml的t1-t9和質量分數為0.2%的阿維菌素於孔板中。
5、在條件為25°c的培養箱下培養2天，分別於培養24小時，48小時後，在倒置顯微鏡下觀察根結線蟲的死亡數量。
6、各處理重複三次，以根結線蟲死亡率的平均數作為評價依據。
表3施用本發明製劑對根結線蟲死亡率的影響
由表3可以得出：施用本發明製劑對根結線蟲致死率高於質量分數為0.2%阿維菌素乳油。
總上所述，從表1、表2和表3各指標數據得出：本發明製備的微生物製劑能夠有效抑制土壤中根結線蟲的發生，對根結線蟲的擊倒率（致死率）明顯高於農業生產上常用的阿維菌素。
本發明配製的微生物製劑也曾在山東濰坊壽光的反季節銷售的蔬菜保護地裡進行過西瓜、甜瓜、苦瓜、絲瓜的田間實驗，實驗證明，本發明製備的微生物製劑對土壤中的根結線蟲均有較好地防治效果。
二、本發明微生物製劑在防治西瓜枯萎病方面的研究
實施例1
稱取200g去皮馬鈴薯切條放入1400ml去離子水中，100℃煮沸10分鐘，用三層紗布過濾並定容1000ml作為溶劑；稱取20g葡萄糖加入溶劑中攪拌均勻後，分裝於三角瓶中，封口包裝放入121℃的滅菌鍋內滅菌20分鐘，待冷卻後即為製備好的黴菌液體培養基；
將黴菌液體培養基於無菌操作臺上接種一接種環黴菌孢子——康寧木黴，封口包裝放入28℃的搖床內培養4天，得到黴菌——康寧木黴發酵液，放置5天，使液面形成一層孢子層後備用；
稱取豆粕100g，玉米面400g，麩皮200g，鋸末300g於發酵桶裡攪拌均勻，再加入600ml的去離子水混合均勻，封口包裝放入121℃的滅菌鍋滅菌40分鐘，即得黴菌菌劑製備培養基。
待黴菌菌劑製備培養基冷卻至室溫後，在無菌操作臺上接種200ml的黴菌——康寧木黴發酵液，接種後攪拌均勻，封口包裝放入28℃的培養箱培養一周，接種之後2天攪拌一次，待發酵完成（一般需要經過7天）後放在陰涼處風乾並粉碎至粉末狀，得到黴菌——康寧木黴生物製劑t11。
實施例2
採用實施例1中的方法製備黴菌液體培養基。將黴菌液體培養基於無菌操作臺上接種黴菌——黑麴黴，封口包裝放入28℃的搖床內培養4天，得到黴菌——黑麴黴發酵液，放置5天，使液面形成一層孢子後待接種黴菌菌劑製備培養基。；
採用實施例1中的方法製備黴菌菌菌劑製備培養基。冷卻至室溫後的黴菌菌劑製備培養基於無菌操作臺上接種400ml的黴菌——黑麴黴發酵液，攪拌均勻後封口包裝放入28℃的培養箱培養一周，接種後2天攪拌一次，發酵完成後放在陰涼處風乾並粉碎至粉末狀，得到黴菌——黑麴黴製劑t21。
實施例3
黴菌液體培養基製備方法同實施例1。將細菌液體培養基於無菌操作臺上接種黴菌——米麴黴，封口包裝放入28℃的搖床內培養4天，得到黴菌——米麴黴發酵液，放置5天，使液面形成一層孢子後待接種黴菌菌劑製備培養基。；
黴菌菌劑製備培養基製備方法同實施例1。冷卻至室溫後的黴菌菌劑製備培養基於無菌操作臺上接種400ml的黴菌——米麴黴發酵液，攪拌均勻後封口包裝放入28℃的培養箱培養一周，接種後2天攪拌一次，發酵完成後放在陰涼處風乾並粉碎至粉末狀，得到黴菌——米麴黴製劑t31。
實施例4
黴菌液體培養基製備方法同實施例1，將細菌液體培養基於無菌操作臺上接種黴菌——哈茨木黴，封口包裝放入28℃的搖床內培養4天，得到黴菌——哈茨木黴發酵液，放置5天，使液面形成一層孢子後待接種黴菌菌劑製備培養基。；
黴菌菌劑製備培養基製備方法同實施例1，冷卻至室溫後的黴菌菌劑製備培養基於無菌操作臺上接種400ml的黴菌——哈茨木黴發酵液，攪拌均勻後封口包裝放入28℃的培養箱培養一周，接種後2天攪拌一次，發酵完成後放在陰涼處風乾並粉碎至粉末狀，得到黴菌——哈茨木黴製劑t41。
實施例5
稱取5g牛肉膏，10g蛋白腖，5g氯化鈉於量杯中，加去離子水至1000ml，攪拌均勻並將ph調至7.0~7.2，分裝於錐形瓶中，封口包裝放入121℃的滅菌鍋滅菌20分鐘，待冷卻即得細菌液體培養基；
將滅完菌並冷卻好的液體培養基在無菌操作臺上接種細菌——枯草芽孢桿菌，封口包裝放入36℃的搖床內培養24小時，得到細菌——枯草芽孢桿菌發酵液；
稱取豆粕180g，玉米面300g，麩皮320g，鋸末200g於發酵桶裡攪拌均勻，再加入600ml的去離子水混合均勻，封口包裝放入121℃的滅菌鍋滅菌40分鐘，既得細菌菌劑製備培養基；
將冷卻至室溫的細菌菌劑製備培養基在無菌操作臺上接種400ml的細菌——枯草芽孢桿菌發酵液，攪拌均勻後封口包裝放入36℃的培養箱培養24小時，發酵成功後放在陰涼處風乾並粉碎至粉末狀既得細菌——枯草芽孢桿菌生物製劑t51。
實施例6
將製備的黴菌——黑麴黴製劑t21和細菌——枯草芽孢桿菌製劑t51按2:1之重量份混合均勻，得到生物製劑t61。
實施例7
將製備的黴菌——康寧木黴製劑t11和黴菌——黑麴黴製劑t21按1:1之重量份混合均勻，得到生物製劑t71。
實施例8
採用實施例5中的方法製備細菌液體培養基。將細菌液體培養基於無菌操作臺上接種細菌——多粘類芽孢桿菌，封口包裝放入36℃的搖床內培養24小時，得到細菌——多粘類芽孢桿菌發酵液；
採用實施例5中的方法製備細菌菌劑製備培養基。冷卻至室溫後的細菌菌劑製備培養基於無菌操作臺上接種400ml的細菌——多粘類芽孢桿菌發酵液，攪拌均勻後封口包裝放入36℃的培養箱培養24小時，發酵成功後於陰涼處風乾並粉碎成粉末狀，得到細菌——多粘類芽孢桿菌生物製劑。
將製備的細菌——枯草芽孢桿菌製劑t51和細菌——多粘類芽孢桿菌製劑按1:1之重量份混合均勻，得到生物製劑t81。
實施例9
1、選用連種西瓜4年的溫室大棚地塊作為試驗用地，選用易感病的216蜜寶西瓜苗作為試驗對象。
2、將試驗地分成小區，每小區面積為30m2。其中2個小區作為對照地塊，不施加任何藥劑的的陰性對照ck1，和施加多菌靈藥劑的陽性對照ck2；其餘8個小區為施加本發明實施例1~8製備的生物製劑t11~t81。
3、在育苗定植時，陽性對照ck2地塊中每株定植穴中施加6g多菌靈藥劑，微生物製劑小區每穴分別施加6g生物製劑t11、t21、t31、t41、t51、t61、t71、t81，與西瓜苗周圍的土壤充分混勻，定植後每兩周在西瓜苗根系周圍20cm左右範圍內追加一次，用量每株100g，並與土壤充分混勻，共施加兩次。
4、實施過程中對照小區和微生物製劑小區採用相同的管理措施。緩苗後，每隔一段時間測量不同處理地塊瓜秧的蔓長、莖粗及葉長葉寬，枯萎病發病情況及西瓜品質，生長周期結束時測土壤中主要酶活性和土壤中各大類微生物數量。
5、對照小區和微生物製劑小區各重複三次，每小區種植10株西瓜苗，以發病率的平均數、西瓜生長指標、瓜中可溶性固形物含量、土壤主要酶活性、微生物數量等作為評價防治效果指標。
本發明生物製劑對西瓜枯萎病的防治效果及對西瓜生長、品質的影響見表2-1。
表2-1施用本發明製劑對西瓜枯萎病防治效果和西瓜品質以及生長的影響
從表2-1可以得出：施加本發明的微生物製劑的各個處理，西瓜防治枯萎病的發病率均低於施加多菌靈藥劑的；施加本發明製劑的各個處理的瓜果中可溶性固形物含量高於施加多菌靈藥劑，可溶性固形物含量的高低決定著西瓜甜度的高低，西瓜的甜度是西瓜品質的重要指標之一，說明施加本發明製劑能夠提高西瓜的品質；從莖粗、根長、株高、蔓長和根系活力來看，均優於施加多菌靈藥劑的，說明施加本發明製劑能促進西瓜植株的生長，可以使瓜蔓健壯。
表2-2使用本發明製劑對西瓜根際土壤中微生物數量的影響cfu/g108
由表2-2可以看出：施加本發明製劑對增加西瓜根際微生物細菌、放線菌、酵母菌的數量，減少黴菌的數量，比施加多菌靈藥劑效果好。土壤中細菌、放線菌和酵母菌有利於豐富土壤有益菌群的數量，而黴菌多為致病菌。通過施加本發明的製劑，能有效減少黴菌數量和增加細菌、放線菌及酵母菌數量，從而使土壤中有益菌增加，抑制有害菌西瓜枯萎病病原菌的存活而起到預防西瓜枯萎病的發生作用。
表2-3施加本發明微生物製劑對土壤理化指標的影響
根據表2-3可以看出：施加本發明製劑對於增加土壤中各種酶活性以及有機質的含量，各項指標均高於施加多菌靈藥劑的。
綜上所述：施加本發明實施例1-8製備的微生物生物製劑的小區在抑制西瓜枯萎病方面效果都優於施加多菌靈地塊。
從上述指標（表2-1、2-2、2-3）對比可以看出，本發明的微生物製劑能預防西瓜枯萎病病害、改善土壤微生物菌群，抑制土壤病原菌的繁殖，對作物的根腐、立枯等病害也能發揮有效的作用，同時在提高土壤活力、活化土壤有機與無機養分、提高肥效、促進土壤營養循環、長效吸收利用、增根壯苗，提高果實質量等方面也有幫助。