非分離式測定方法

2023-10-08 10:45:34

專利名稱：：非分離式測定方法
技術領域：
：本發明涉及新穎的與特異性結合反應有關的測定方法，其與己知方法相比更簡單化。該測定方法被稱為非分離式測定法，因為在檢測步驟之前，它們不需要除去或者分離過量的檢測標籤。該方法適用於多種類型的測定，包括免疫測定、受體-配體測定和核酸雜交測定。
背景技術：
：人們在測定方法開發、尤其是免疫測定開發的領域己經付出了巨大的努力，以簡化^)定設計方案，同時保留它們在靈敏度、動態範圍、耐用性、較寬的應用性和自動化適用性方面主要的優點。已經有一種方法用於設計所謂的同質測定形式，無需對添加的可檢測地標i己的特異性結合伴侶進行分離。這類方法依賴於設計出結合反應的結果或者是開啟、或者是關閉的檢測原理。相反，異質測定形式依賴於在定量之前結合的和游離的可檢測地標記的特異性結合伴侶的物理分離。在同質酶免疫測定領域，已經公開了許多美國專利。許多專利開發了抗體-抗原結合反應來激活或抑制標記酶:美國專利Nos.3,817,837;3,852,157;3,875,011;3'966，556;3,905,871;4,065,354;4,043,872;4,040,907;4,039,385;4,046,636;4,067,774;4,191,613;4,171,244;以及4,785,080。其他的同質免疫測定涉及多種通過抗體或者其他的螢光猝滅劑的猝滅螢光方法美國專利Nos,3,998,943;3,996,345;4,174,384;4,161,515;4,208,479和4,160,016。在歸為免疫測定類型的領域還有其他的美國專利，包括美國專利Nos.3,935,074;4,130,462;以及4,193,983。美國專利No.4，160,645公開了一種使用電子傳遞催化劑作為標籤的測定方法。該催化劑(標籤)通過結合至抗體而失活。Campbell等(Biochem.J.，,，185-194(1983))公開了一種檢測方法，其以競爭性測定形式採用在偶聯於抗原(Ag-L)的化學發光供體與偶聯於抗體(Ab-F)的螢光受體之間的能量傳遞。複合抗原最終發射螢光劑的波長，同時游離抗原發射化學發光標籤的特徵波長。10接著，測量兩種波長的光強度，並且將兩種信號的比率與樣品中分析物的含量相聯繫。已知還有多種其他的同質免疫測定法Rubenstein等，美國專利No.3,817,837(同質酶免疫測定)；Ulman，美國專利No.3,996,345(螢光猝滅同質免疫測定)；Maggio，美國專利No.4,233,402(酶通道同質酶免疫測定)；以及Boguslaski等，加拿大專利1,082,577(半抗原-輔助因子同質酶免疫測定)。Ullman的美國專利6,406,913公開的測定方法包括在一定條件下處理疑似含有分析物的介質，使得該分析物可以引起光敏劑和化學發光的化合物獲得接近的近似性。該光敏劑產生單線態氧，當其處於接近的近似性時，其通過溶液擴散並且激活化學發光化合物。被激活的化學發光化合物隨後產生光。產生的光量與介質中分析物含量有關。在一個實施方式中，至少一種的光敏劑或者化學發光化合物與懸浮的粒子有關，並且特異結合性配對成員與其結合。McCapra的美國專利5,516,636公開的測定方法包括特異性結合測定，其利用敏化劑作為標籤。當通過輻射、電子傳遞、電解、電致發光或者能量傳遞而被激化時，該敏化劑達到激發態，其(a)剛一與分子氧相互作用就產生單線態氧，或者(b)剛一與無色染料相互作用就被氧還原，產生過氧化氫。與激發的敏化劑，連同外加的其他試劑一起，進行相互作用中的任何一種，皆可產生可檢測信號。Levison的美國專利6,911,305公開了一種方法，用於在第一薄膜上檢測結合于敏化齊l」、或用敏化劑標記的探針的多聚核苷酸分析物。使該薄膜與其上固定化有化學發光的前體成分的第二薄膜相接觸；該前體能夠產生可引發的化學發光化合物。在第二薄膜上，該敏化劑被激發而產生單線態氧，用於與化學發光前體進行反應，從而形成可引發的化學發光化合^;。然後可引發的化學發光化合物被引發，在所述第二薄膜上產生可檢測的光信號。美國專利6,994,980和6,723,851公開的方法用於通過使用在與酶反應後變成沉澱的或結合於分析物或分析物周圍區域的化合物來檢測分析物。該酶可以在測定方法中作為與可t寺異性地結合分析物的物質的結合物而被供應。在一個液體組合物的實施方式中，以游離的形式供應化合物，用於與酶進行反應。在酶促反應導致沉澱發生後，通過在鹼性pH下吖啶酯部分非酶催化的化學發光反應，檢測沉澱的化合物，所述吖啶酯部分被包含在具有過氧化氫的分子內部。在結合的酶和結合的化學發光化合物之間沒有酶促反應發生。儘管人們在設計同質的、或者非分離式的測定形式方面作了相當大的努力，但這些方法仍然未受到廣範的商業使用。異質測定法預料作為更簡單的測定法而被開發並大量生產，雖然操作上更複雜。特別地，在高容量的臨床免疫診斷的領域和較小的臨床核酸診斷領域，異質測定形式佔統治地位。在該應用領域內，測試形式將有利於方案可以簡單化、複雜度可以降低、並且兼容性可以提高、同時可以通過除去多餘步驟而提高自動化。
發明內容.在一個方面，本發明提供新穎的與特異性結合反應有關的測定方法，尤其是免疫測定法、受體測定法和核酸雜交測定法，其與己知方法相比更簡單化。該方法的特徵在於使用固定化化學發光化合物和結合於特異性結合伴侶的活化劑化合物，用於誘導化學發光反應。分^f物介導的共定位的化學發光標籤化合物和活化劑結合物引起隨後所發生的化學發光反應僅在被結合的分析物分子的位點處發生。未結合的過量活化劑結合物的存在不參與或者不妨礙it學發光反應。其結果是，發射的化學發光強度與分析物的數量成正比。在一個實施方式中，通過在檢測步驟之前除去分離和洗滌步驟而使測定方法簡單化，並且因此可以被認為是非^^離式測定法。圖1是根據本發明使用標記的捕獲抗體進行免疫測定的檢測步驟的示意圖。圖2是根據本發明使用標記的封閉蛋白質和未標記的捕獲抗體進行的另一種免疫測定法的檢測步驟的示意圖。圖3是根據本發明使用標記的固體表面和未標記的捕獲抗體進行的另一種免疫測定^^的檢測步驟的示意圖。圖4是一圖表，顯示了在使用固定在微孔板的孔中的標記的捕獲抗體和過量的用於檢測的抗IgG-HRP結合物的非分離式免疫測定法中的IgG抗原檢測。.圖5是一圖表，顯示了在使用標記的封閉蛋白質和固定在微孔板時孔中的未標記的捕獲抗體以及過量的用於檢測的抗IgG-HRP結合物而進行的根據本發明的非分離式免疫測定》去中的IgG抗原檢測。圖6是根據本發明使用標記的捕獲核酸進行的核酸雜交測定法的檢測步驟的示意圖。圖7是根據本發明使用標記的固相、固定化的捕獲抗體和標記的分析物或分析物類^i以物進行的競爭性免疫測定的檢測步驟示意圖。圖8是根據本發明進行的另一種免疫測定法中的檢測步驟示意圖，其利用生物素-抗生物素蛋白的結合而產生標記的固體表面，並且使標籤和捕獲抗體保持近似性。圖9是根據本發明進行的另一種免疫測定法中的檢測步驟示意圖，其也利用生物素-抗生物素蛋白的結合而產生標記的固體表面，並且使標籤和捕獲抗體保持近似性。1具體實施例方式定義垸基--含有卜20個碳的支鏈、直鏈或者環烴基團，其可以用1個以上除H之外的低級烷基取代基取代。在此使用的低級垸基是指含有8個以下碳的那些烷基。分析物-測定中在待檢測樣品中的物質。一種以上具有對分析物的特異性結合親合力的物質將被用於檢測分析物。該分析物可以是蛋白質、肽、抗體、或半抗原，與該半抗原結合的抗體可以被製備。該分析物可以是核酸或低聚核苷酸，該低聚核苷酸可以被互補的核酸或低聚核苷酸結合。該分析物可以是任何其他的形成特異結合性配對成員的物質。其他示例性的分析物類型包括藥物比如甾族化合物、激素、蛋白質、糖蛋白、粘蛋白、核蛋白、磷蛋白、可隨意使用的藥物、維生素、抗菌藥物、抗真菌藥物、抗病毒藥物、嘌呤、抗腫瘤藥試劑、安非他明、氮雜化合物、核苷酸、和前列腺素，以及所有這些藥物的代謝產物、殺蟲劑和殺蟲劑的代謝產物，以及受體。分析物還包括細胞、病毒、細菌和真菌。抗體--包括完全免疫的球蛋白以及天然的和改造的片段。芳烷基--用芳基取代的烷基。例子包括苯甲基、二苯甲基(benzyhydryl)、三苯甲基、和苯乙基。芳基--含有芳香環的基團，該基團含有1至5個碳環的芳香環，其可以用1個以上除H之外的取代基取代。生物材料—包括，例如全血、抗凝血的全血、血漿、血清、組織、動植物細胞、細胞內容物、病毒、以及真菌。化學發光化合物-經歷以下反應的化合物，該反應導致其被轉化為在電子激發態下形成的另一種化合物。該激發態可以是單線激態或三重激態。該激發態可以剛一衰減成基態就直接發光，或者可以將激發能傳遞至發射能受體，藉此返回到基態。在該過程中，能量受體躍遷至激發態並發光。雜垸基--一種垸基，其上至少一個環或非末端鏈中的碳原子被選自N、O、或S的雜原子取代。雜芳基-一種芳基，其上1至3個環中碳原子被選自N、O、或S的雜原子取代。例舉的基團包括吡啶基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、喹啉基和吖啶基。磁性粒子--在此使用磁性粒子包含具有磁性響應成分的顆粒材料。磁性響應包括強磁性、順磁性和超順磁性材料。一種示例性的磁性響應材料是磁鐵礦粉。粒子可以具有磁性響應、並且被一種以上非磁性響應層包圍的實心部分。另一方面，磁性響應部分可以是圍繞層，或者可以是設置在非磁性響應核內部的粒子。樣品-在測定中含有或者疑似含有待測分析物的混合物。分析物包括，例如蛋白質、肽、核酸、激素、抗體、藥物、和甾族化合物。可以在本發明方法中使用的典型樣品包括體液，比如血液，其可以是當收集血液標本時通常發現的抗凝血的血液、血漿、血清、尿液、精液、唾液、細胞培養物、組織提取液等等。其他類型的樣品包括溶劑、海水、工業用水樣品、食品樣品和環境樣品比如土壤或水、植物材料、真核生物、細菌、質粒、病毒、真菌、以及源於原核生物的細胞。固體支持物-具有測定成分被固定化在其表面上的材料。所述材料可以為如下形式顆粒、微粒、納米顆粒、金屬膠體、纖維、紙張、珠子、膜片、濾紙及其他支持物比如試管、微孔板、晶片、載玻片、和微陣列。特異結合性配對成員、特異性結合伴侶--一種分子，其包括對另一種物質具有特異性結合親合力的生物分子，所述另一種物質包括DNA、RNA、低聚核苷酸、抗體、抗體片段、抗體-DNA嵌合體、抗原、半抗原、蛋白質、肽、凝集素、抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白和生物素。特異性結合伴侶可以結合於一種以上分子的活化劑或化學發光化合物。取代--是指基團上至少一個氫原子被非氫基團置換。應該注意，關於取代基團，本文中指的是可以存在多個置換位點，除非另有明確說明。試驗設備--用於含有根據本發明測定法的樣品及其他成分的容器或裝置。其內包括，例如各種尺寸和形狀的試管、微孔板、晶片以及其上形成或印刷陣列的載玻片、測試條和膜片。本發明涉及快速而簡單的測定方法，其利用特異性結合配對反應來檢測物質的存在、位置或含量。該方法需要使用固定化的化學發光化合物、用於誘導化學發光反應的結合於4寺異性結合伴侶的活化劑化合物、以及引發劑溶液。該方法涉及一種以上用於檢測分析物的牛寺異性結合配對反應。標記的特異性結合伴侶結合於分析物的結果是，使活化劑成為近似於固定化化學發光化合物，以使得其可以有效激活剛一添加引發劑溶液就產生化學發光的反應。將被活化劑標記的特異性結合伴侶，以過量至結合所有的分析物所需要的量，提供給系統。在添加引發劑溶液和檢測之前，不必除去過量的未結合的活化劑結合物，因為其未參與反應。因此本發明的方法區別於常規試驗方法之處在於，化學發光化合物和活化劑兩者都被約束在固體支持物處，以可操作的近似於允許剛一添加引發劑溶液就進行化學發光反應。過量未固定化的活化劑的存在，如果不除去，不會消除其進行敏感的特異性結合測定的能力。這一現象是不希望有的或不可預測的。重要地，研究發現，使固定化化學發光化合物和活化劑的方法逆轉的測定形式不允許以無洗滌步驟的形式有效地進行測定。當活化劑被固定化在固體支持物上、並且化學發光化合物作為與特異性結合伴侶的結合物被提供(其中特異性結合伴侶用於直接或間接結合於分析物)、接著添加引發劑溶液時，不能將產生的光量與分析物含量相關聯。在不結合任何特殊的理論的情況下，人們相信至少一種對這些逆轉形式的失效做出貢獻的因素是過量的未結合於分析物的化學發光化合物-特異性結合伴侶結合物不能自由移動到測定溶液或混合物周圍，並且是可操作的近似於固定化的活化劑。;在一個實施方式中，提供了測定方法，尤其結合性測定方法，其中通過至少一種因分析物的存在而進行的特異性結合反應，使固定化化學發光化合物和活化劑結合物達到可操作的近似性。其中，被結合的活化劑結合物激活剛一添加引發劑溶液就產生化學發光的反應，用於檢測分析物的存在、位置或含量。在一個實施方式中，本發明的方法不同於常規試驗方法之處還在於，不除去以大大過量於特異性地與分析物相聯接的量所存在的未結合的活化劑結合物。可以將含有分析物、活化劑結合物、和引發劑溶液的樣品依序添加至試驗容器，無需洗滌或者分離、以及發光讀取。另一方面，在導入引發劑溶液之前，可以將樣品和活化劑結合物預混合併添加至試驗容器，所述試驗容器含有用於捕獲分析物的特異性結合伴侶並含有固定化的化學發光標籤。不需要洗滌或分離過量的未結合的活化劑結合物。另一個與本
技術領域：
己知的常規化學發光測定法差別化的關鍵點在於該事實參與光產生的化學發光化合物和活化劑(例如過氧化物酶)都不能自由地擴散進入溶液。兩者都受空間制約。部分由於該結果，信號產生趨於短暫。使用化學發光底物和酶標記的結合物的常規測定法以大大過量於標籤酶的量提供底^;。通常，底物/酶的摩爾比率往往可以超過十的九次冪，即，過量十億倍。被認為有必要供應這樣極大過量的化學發光化合物，以確保充分的底物供應，用於連續的酶法轉化，並且該過程確保在測定中足夠的檢測靈敏度。申請人發現，有可能設計出高靈敏度的測定方法，其糹各化學發光化合物對活化劑的比率減小了幾個數量級。就這點來說，這些方法基本上不同於已知的方法。省去如上所述和如下所述示例性測定法顯示的洗滌和分離步驟，從而提供了使測定方案設計簡單化的機會。操作步驟數量的減少可以降低測定時間、由不完全的洗滌帶來的內測定變化性、以及成本。同時，增強了自動化和小型化測定性能的能力，以及自動化和小型化伴隨的所有固有優點。根據本發明的方法進行的測定包含四個步驟。在第一步，將固體支持物提供於試驗設備15中，用於特異性捕獲所研究的分析物。該固體支持物上設有固定化的用於直接或間接地結合待檢測的分析物的特異性結合伴侶。該固體支持物上進一步設有固定化於其上的化學發光標記性化合物。可以以如下詳述的許多不同方式提供化學發光標籤。在各個變體中，化學發光標籤都穩定地或者不可逆以使其固定不動的方式附著於物質或材料上。所謂"不可逆地"，意思是指，在想要進行的測定中，在使用條件下基本上不從固體支持物上除去化學發光標籤。在使用的條件下，預期提供被動的或非共價的連接方法，只要標籤穩定地被附接並保留在固體支持物上。在第二步，將含有分析物的樣品和活化劑結合物導入具有被固體支持物固定化的用於分析物的特異性結合伴侶的試驗設備，並且允許形成特異性結合複合物。樣品和活化劑結合物可以被分別地依序添加或同時添加，或者可以被預混合併作為組合添加。在此刻可以插入允許結合反應發生的任選滯後時間。而且，如有必要，可以包括任選的洗滌歩驟以便從樣品中除去無關的材料。在第三步，添加引發劑溶液以產生化學發光，用於檢測分析物。最後，檢測化學發光。典型地，測量峰值光強度水平或總的累積光強度。該光量可以根據通常已知的方法繪製校準曲線而與分析物含量相關聯。當剛一添加引發劑溶液就緊跟著發生光發射時，優選用用機械方法定時測量的開始來進行利用合適注射器的添加，或者用已暴露於檢測器的試驗設備進行添加。在該檢測中，第三和第四步基本上同時進行。通過參考進行特異性結合測定方法方面的標準文獻、並且利用作為指導的如下詳述的具體例子，通過常規實驗，可以輕易地確定最優的反應物的量、體積、稀釋度、特異性結合配對反應的培育時間、反應物的濃度等。測定形式和固體支持物在本發明的方法中，將化學發光標記性化合物固定化至測試體系的成分。-這可以以數種方式中的任一方式完成。在本發明的實施方式中，化學發光標籤變成被固定化至固體支持物的表面。提供一種方法用於將分析物吸引至表面，例如通過未標記的用於分析物的特異性結合伴侶來進行。藉助於可使活化劑接近附著於固體支持物的固定化的化學發光標籤的特異性結合反應，使該化學發光標籤變得與活化劑相關聯。然後，添加引發劑溶液並且測量化學發光。在一個實施方式中，化學發光標籤共價聯接至固定化的用於分析物的特異性結合伴侶。一個實施例系是固定化在微孔板的孔上或粒子上的標記的捕獲抗體或抗體片段。特異性結合伴侶的固定化可以通過共價連接或者通過吸附步驟進行。在這種圖1中描繪的方式中，藉助於以"夾心"形式結合分析物的兩種特異性結合伴侶，化學發光標籤變得與活化劑相關聯。在圖2中描繪的另一個實施方式中，化學發光標籤被共價連接於以任意方式固定化在固體支16持物上的輔助物質。輔助物質的固定化可以通過共價連接或者通過吸附步驟進行。因此該標籤被近乎均勻地分配在固體支持物表面的周圍。提供一種方法用於將分析物吸引至表面，例如通過未標記的用於分析物的特異性結合伴侶來進行。藉助於可使活化劑接近附著於輔助物質的化學發光標籤的特異性結合反應，該化學發光標籤變得與活化劑相關聯，該輔助物質被附接或者被動地塗到支持物表面上。在另一個實施方式中，化學發光標籤被共價連接至固定化的對分析物特異性捕獲抗體具有結合親合力的通用抗體。在另一個實施方式中，與化學發光標籤共價連接的輔助物質是蛋白質或肽。例舉的蛋白質包括白蛋白或鏈黴抗生物素蛋白。通過使用生物素-化學發光化合物結合物，可以提供化學發光化合物用於固定化。這類測定形式或者通過直接固定化至固體支持物、或者通過使用通用捕獲成分比如物種特異性抗免疫球蛋白的間接連接，可以提供作為生物素結合物的用於分析物的特異性結合伴侶。在另一個實施方式中，與化學發光標籤共價連接的輔助物質是合成聚合物。使用聚合的輔助物用於固定化化學發光化合物的測定形式，或者通過直接固定化至固體支持物、或者通過使用通用捕獲成分比如物種特異性免疫球蛋白的間接連接，可以提供作為生物素結合物的用於分析物的特異性結合伴侶。在另一個實施方式中，化學發光標籤被共價連接至固體支持物的表面。'如圖3所示，標籤因此被近乎均勻地分配在固體支持物表面的周圍。提供一種方法，用於將分析物吸引至表面，例如通過未標記的用於分析物的特異性結合伴侶來進行。藉助於可使活化劑接近直接附著於支持物表面的化學發光標籤的特異性結合反應，該化學發光標籤變得與活化劑相關聯。然後，無需洗滌或分離，添加引發劑溶液並且測量化學發光。在另一個實施方式中,使用分析物的類似物，包括活化劑-分析物類似物結合物。在另一個實施方式中，使用標記的分析物，包括活化劑-分析物結合物。活化劑-分析物類似物結合物或者活化劑-分析物結合物與分析物將競爭性地與用於分析物的特異性結合伴侶相結合。顯而易見，在這類測定方法中，在樣品中的分析物含量和化學發光強度之間將呈負相關性。(圖7)除通過用於結合抗原或其他蛋白質或其他抗體的抗體經由免疫測定法進行化學發光標籤的連接之外，本發明的方法可以使用化學發光標記的核酸，用於通過互補核酸的結合來檢測核酸。在這點上，該使用就核酸的大小而言沒有特別限定，僅有的標準是，互補伴侶有足夠的長度以允許穩定的雜交。在此使用的核酸包括基因長度的核酸、核酸的較短碎片、多聚核苷酸和低聚核苷酸，其中任何一種可以是單鏈的或者是雙鏈的。在本發明的使用核酸作為特異性結合伴侶的實施方式中，核酸被共價連接或者物理地固定化在固體支持物的表面上，以捕獲分析物核酸。可以將化學發光標籤附接於俘獲核酸，大略如圖6所示，或者可以按如上所述將標籤與支持物相關聯。該俘獲核酸將具有與分析物核酸的序列區域完全的或者基本上完全的序列互補性。當基本上互補時，俘獲核酸可以具有不與分析物互補的末端突出部分、末端環狀部分或內部環狀部分，只要其不會妨礙或者抑制與分析物的雜交。反向位置也可以出現在其中突出或環位於分析物核酸內部的位置。俘獲核酸、分析物核酸、活化劑結合物、以及第三核酸允許雜交。該第三核酸與分析物核酸的序列區域基本上互補，所述序列區i或不同於與俘獲核酸互補的區域。俘獲核酸和活化劑結合物核酸與分析物的雜交可以依序或者是同時地連續進行。該工藝的結果是，藉助於可使活化劑接近附接於支持物表面的化學發光標籤的特異性雜交反應，使該化學發光標籤變得與活化劑相關聯。按如上所述提供引發劑溶液並且檢測化學發光。另一個實施方式包括一種變化，其中，使用分析物與活化劑的結合物。該分析物核酸-活化劑結合物和分析物核酸將競爭性地與用於分析物核酸的特異性結合伴侶相結合。顯而易見，在這類測定方法中，在樣品中的分析物含量和化學發光強度之間將呈負相關性。除基於抗體和基於核酸的體系之外，其他特異性結合配對，例如通常為本領域的普通技術人員所熟知的結合測定法，可以用作根據本發明的試驗方法的基礎。也可以使用抗體-半抗原配對。示例性的配對有螢光素/抗螢光素配對、地高辛配基/抗地高辛配基配對、以及硝基苯基/抗硝基苯基配對。作為另一個例子，可以使用眾所周知的(鏈黴)抗生物素蛋白/生物素結合配對。為顯示其中可以使用該結合配對的一種方式，可以將鏈黴抗生物素蛋白-化學發光標籤結合物共價連接或者吸附到固體支持物上。然後添加用生物素標記的分析物和活化劑結合物，其中結合物被附接於抗生物素抗體或者抗分析物抗體。在複合物被形成後，添加引發劑溶液並且按上述方法進行檢測。在另一個實施方式中，抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白被沉積在固體支持物上。生物素-化學發光化合物結合物被結合於抗生物素蛋白，並且生物素化抗體也被結合。在另一個實施方式中，生物素被連接於固體支持物，並且被用於捕獲抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白。生物素化抗體也被結合。或者通過將生物素-化學發光化合物結合物結合於(鏈黴)抗生物素蛋白、或者通過將表面直接用化學發光化合物標記，可以將化學發光化合物附著於固體支持物。本
技術領域：
已知的附加的特異性結合伴侶包括抗體的Fab部分、凝集素-碳水化合物、蛋白質A-IgG、以及激素-激素受體。應理解，可以使用fh學發光化合物間接結合於固體支持物以服務於本發明。對於本領域的技術人員而言，這些例子及其他例子皆被認為在發明方法的範圍之內。在本發明的實施方式中有用的固體支持物可以是各種材料、各種孔隙度、各種形狀、和18各種尺寸。已經在結合測定法中使用的材料包括96孔微孔板、384孔微孔板或更多孔數的微孔板、試管、樣品杯、塑料微球、纖維素、紙質或塑料測試條、膠乳粒子、直徑為0.10-50)am的聚合物粒子、直徑為0.10-50)am的二氧化矽粒子、磁性粒子尤其是平均直徑為0.1-10)am的磁性粒子、各種材料的納米顆粒、以及金屬膠體。這些材料可以全部提供對於連接化學發光標籤和對於固定化特異性結合伴侶有用的固體支持物。磁性粒子可以包括磁性金屬、金屬氧化物或金屬硫化物核心，其通常被吸附性或共價性結合層包圍，以屏蔽磁性成分。磁性成分可以是鐵、氧化鐵或者硫化鐵、其中鐵是F^+或F^+或兩者混合物。該類可使用的材料包括，例如磁鐵礦、磁赤鐵礦、和黃鐵礦。其他磁性金屬氧化物包括MnFe204、NiFe204、和CoFe204。磁性成分可以，例如，是被非磁性殼包圍的實心，或者可以是分散有磁性和非磁性材料的核心，或者可以是包圍非磁性核心的層、其任選地被另一種非磁性的殼包圍。在這樣的磁性粒子中的非磁性材料可以是二氧化矽、合成聚合物比如聚苯乙烯、Merrifield樹脂、聚丙烯酸酯或苯乙烯-丙烯酸酯共聚物，或者其可以是天然聚合物比如瓊脂糖或葡聚糖。本發明公開教導了使這些材料功能化的方法，用於本發明的測定方法。特別地，公開了一些方法，用於將化學發光標記性化合物和特異性結合伴侶(例如抗體)，這兩者都附接至相同的表面、尤其附接至微孔板的孔或微粒。在測定中使用的合適支持物包括合成聚合物支持物，比如聚苯乙烯、聚丙烯、取代的聚苯乙烯(例如，胺化聚苯乙烯或羧基化聚苯乙烯)、聚丙烯醯胺、聚醯胺、聚氯乙烯，玻璃珠，二氧化矽粒子，功能化的二氧化矽粒子，金屬膠體，瓊脂糖，硝化纖維，尼龍，聚偏氟乙烯，表面改性的尼龍等等。化學發光標籤化合物在本發明的實施方式中用作化學發光標籤的化合物具有通式CL-L-RG，其中，CL代表化學發光部分，L代表連接化學發光部分和活性基團的連接部分，而RG代表用於偶聯於另一種材料的活性基團部分。術語"化學發光基團"和"化學發光部分"可互換地使用，如同術語"連接部分"和"連接基團"那樣。該化學發光部分CL包括經受與活化劑反應的化合物，該反應導致其被轉化為激活的化合物。激活的化合物與引發劑溶液的反應形成電子激發態化合物。該激發態可以是單線激態或三重激態。該激發態可以剛一衰減成基態就直接發光，或者可以將激發能傳遞至發射能受體，藉此返回到基態。在該過程中，能量受體躍遷至激發態並發光。優選，但並非必需，CL基團、活化劑和引發劑溶液的化學發光反應快速發生在非常短暫的時間間隔整個期間；在一個實施方式中，發光反應在幾秒內達到峰強度。在本發明的一個具體實施方式中，化學發光化合物能夠被氧化，從而當存在活化劑和引發劑溶液時產生化學發光。通過連接物和活性基團的結合可以用作化學發光標籤的化合物的19示例性種類包括芳香環狀二醯基醯肼，例如氨基苯二醯一肼(luminol，魯米諾)；以及在結構上相關的環狀醯肼，包括異氨基苯二醯一肼、氨基丁基乙基異氨基苯二醯一肼(ABEI)、氨基己基乙基異氨基苯二醯一肼(AHEI)、7-二甲基氨基萘-l,2-二羧酸醯肼、環取代的氨基鄰苯二甲醯肼、蒽-2,3-二羧酸醯肼、菲-1,2-二羧酸醯肼、芘二羧酸醯肼、5-羥基鄰苯二甲醯肼、6-羥基鄰苯二甲醯肼，以及在Masuya等的美國專利No.5,420,275和Yamaguchi的美國專利No.5,324,835中公開的其他2,3-二氮雜萘二酮類似物。據認為，任何己知可以在過氧化氫和過氧化物酶的作用下產生化學發光的化合物將具有本發明中使用的化學發光標籤化合物的化學發光部分的功能。本
技術領域：
己知有許多各^^結構分類的化合物在這些條件下可以產生化學發光，這樣的化合物包括P佔噸染料例如螢光素、曙紅、羅達明染色劑、或對甲氨基酚染料、芳香胺和雜環胺。另一個例子是化合物MCLA，即，2-甲基-6-(對甲氧苯基)-3,7-二氫化咪唑並[1,2-3]吡嗪-3-酮，其具有下述化學式另一個例子是B引哚基醋酸，另一個是異丁醛，後者的典型地附有用於提高可見光產出的螢光能量受體。三羥基芳香化合物焦性沒食子酸、間苯三酚和紅掊酚個別地或者其組合是其他的化合物例子，它們可以用作本發明的化學發光標記性化合物中的化學發光的部分。在一個實施方式中，在包括本發明方法中有用的9,10-二氫化吖啶乙烯酮二硫代縮二乙醇在內的化學發光標籤化合物組包括具有下述式I的9,10-二氫化吖啶類化合物formulaseeoriginaldocumentpage20其中，基團R'-R11中的至少一個是具有下式的標記性取代基-L-RG其中，L是連接基團，其可以是化學鍵或另一種二價或多價的基團；RG是反應基團，其使化學發光標記性化合物能夠被結合於另一種化合物；R1、f和W是含有1到50個非氫原子的有機基團，並且R、I^中的每一個是氫或無幹擾性的取代基。標記性取代基-L-RG可存在於R1或R2的一個上，雖然其還可以作為取代基存在於R3上或者存在於R、R11中的一個上。在式I的化合物中的基團R'和R"可以是含有1到約50個選自於C、N、O、S、P、Si和滷素原子的非氫原子的任何有機基團，其使光產生。所述使光產生是指，當式I的化合物經受本發明的反應時，激發態產物化合物被產生並且其可以涉及一種以上化學發光中間體的產生。激發態產物可以直接地發射光，或者可以通過能量傳遞而將激發能傳遞至螢光受體，引起光從螢光受體發出。在一種實施方式中，R'和W選自於含l-20個碳原子的取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的芳烷基。當R'或R"是取代基時，其可以用1-3個選自於以下的基團取代羰基、羧基、三(C廣Q烷基)甲矽烷基基團、S(V基團、OSO^基團、葡糖基基團、PCV基團、0PO3—2基團、滷素原子、羥基、硫醇基、氨基基團、季銨基團、以及季鱗基團。在一種實施方式中，R'或f用式-L-RG的標記性取代基取代，此處L是連接基團，而RG是反應基團。基團W是含有1到50個除滿足基團中原子的原子價所要求的必需數量的H原子之外的非氫原子的有機基團，所述非氫原子選自於C、N、O、S、P、Si和滷素原子。在一個實施方式中，W含有1到20個非氫原子。在另一個實施方式中，有機基團選自由含l-20個碳原子的烷基、取代垸基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的芳垸基所構成的組。在另一個實施方式中，用於W的基團包括取代或未取代的C,-C4烷基、苯基、取代或未取代的苯甲基、烷氧基烷基、羧基烷基和烷基磺酸基團。基團113可以被結合於117或118以構成5元環或6元環。在一個實施方式中，W用式-L-RG的標記性取代基取代。在式I的化合物中，基團R、R"中的每一個各自獨立地是H或取代基團，其允許產生激發態產物，並且通常含有1到50個選自於C、N、O、S、P、Si和滷素的原子。有代表性的取代基團可以包括，但不限於垸基、取代垸基、芳基、取代芳基、芳烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、滷素、氨基、取代氨基、羧基、垸氧羰基、氨甲醯、氰基、以及磺酸酯基團。相鄰基團的配對，例如R、RS或者RS-R6，可以被結合一起，從而形成包括至少一種融合於環中的附接有兩個基團的5元環或6元環的碳環或雜環體系。這樣融合的雜環可以含有N、O或S原子，並且可以如上所述含有除H之外的環取代基。基團R4-R"中有一個以上可以是式-L-RG的標記性取代基。在一個實施方式中，R"-R"選自氫、滷素和烷氧基比如甲氧基、乙氧基、叔丁氧基等等。在另一個實施方式中，所述化合物中的R5、R6、119或1111)基團之一為滷素，而R、R"中的其他基團皆為氫原子。取代基團可以以各種量併入、並且選擇在9,10-二氫化吖啶環上的環或者鏈位置，以改變化合物的特性或者便於合成。這些特性包括，例如，化學發光量子產率、酶反應速度、最大光強度、光發射持續時間、光的發射波長以及在反應介質中的溶解度。具體的取代基和它們的效果被顯示在下述具體的實施例中，然而，無論如何不應將其視為對本發明保護範圍的限制。為便於合成式I的化合物，優選其W至R"中每一個皆為氫原子。在另一個實施方式中，化合物組為下式II，其中，W至R"中的每一個都是氫。基團R1、f和W如以上所定義的。R3II式I或II的標記性化合物具有作為基團R1或R2上取代基的基團-L-RG。在一個實施方式中，標記性化合物為式HI。in有代表性的標記性化合物以及它們在連接於其他分子和固體表面的用途在下述具體的實施例中有描述。另一類化學發光部分包括在美國專利No.5,491,072、5,523,212、5,593,845和6,030,803中公幵的9,10-二氫化吖啶酯、硫酯和氨磺醯。在該類中，化學發光標記性化合物具有下式IV所示的化學發光部分CL，其中，Z是O、S或NRHS02八r，其中R"是烷基或芳基，其中Ar是芳基或垸基取代芳基，其中R'是C,-s烷基、滷素取代的d-8烷基、芳垸基、芳基、或者用下述基團取代的芳基垸基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、垸氧基、烷氧基烷基、滷素、羰基、羧基、氨甲醯、氰基、三氟甲基、三烷基銨、硝基、羥基、氨基和巰基；其中，W選自22於烷基、雜垸基、芳基、以及芳烷基；並且其中，113-1中每一個皆是氫或者1個或2個選自於烷基、垸氧基、羥基、以及滷素的取代基；並且R3—'o中的剩餘基團是氫。在一個實施方式中，RWG中每一個皆是氫並且Ri是標記性取代基。在另一個實施方式中，113—1中一個是標記性取代基並且R3—1Q中的其它基團是氫。另一類化學發光部分包括在美國專利No.5,922,558、6，696,569和6,891,057中公開的雜環化合物。在一個實施方式中，這些化合物包括雜環，該雜環包含其上可鍵合環外雙鍵的含氮、氧或硫的五元環或六元環或多元環基團，該雜環的末端碳原子可用選自氧和硫原子的兩種原子取代。在另一個實施方式中，化學發光標記性化合物具有下式V所示的化學發光的9,10-二氫化吖啶部分CL，其中，R'選自於含l-20個碳原子的垸基、烯基、炔基、芳基、以及芳烷基，其中的任何一個可以用l-3個選自於以下的基團取代羰基、羧基、三(CVCV烷基)甲矽垸基基團、SCV基團、OSO^基團、葡糖基基團、P03—基團、OPO^基團、滷素原子、羥基、硫醇基、氨基團、季銨基團或季鱗基團；其中，X選自於d-Cs烷基、芳基、芳垸基、具有l-20個碳原子的烷基或芳基羧基、三(d-Q烷基)甲矽烷基基團、S(V基團、葡糖基基團和化學式PO(OR')(OR")所示的磷醯基基團(其中R'和R"是獨立地選自於CrCV烷基、氰基垸基、芳基和芳烷基)、三垸基甲矽垸基基團、鹼金屬陽離子、鹼土金屬陽離子、鉸以及三烷基鱗陽離子；其中，Z'選自於0和S原子；其中，RS選自於取代或未取代的CrQ烷基、苯基、苯甲基、烷氧基烷基和羧基烷基基團；其中，R7—14中每一個是氫或者其中1個或2個是選自於烷基、垸氧基、羥基以及滷素的取代基，並且R7—"中的剩餘基團是氫。在一個實施方式中，Riw中每一個皆是氫並且Ri是標記性取代基。在另一個實施方式中，R7—14中的一個基團是標記性取代基並且R7—14中的其它基團是氫。R"R7在另一個實施方式中，化學發光標記性化合物具有下式VI所示的化學發光部分CL，其中，R'選自於含l-20個碳原子的垸基、烯基、炔基、芳基、以及芳垸基，其中的任何一個可以用l-3個選自於以下的基團取代羰基、羧基、三(d-Cs烷基)甲矽垸基基團、SCV基團、OS03—2基團、葡糖基基團、P(V基團、OPO^基團、滷素原子、羥基、硫醇基、氨基團、季銨基團或季鱗基團；其中，X選自於d-Q烷基、芳基、芳烷基、具有l-20個碳原子的垸基或芳基羧基、三(d-Cs烷基)甲矽烷基基團、S03—基團、葡糖基基團和化學式PO(ORl')(ORl")所示的鱗醯基基團(其中R鄰R"是獨立地選自於d-C8烷基、氰基烷基、芳基和芳垸基)、三烷基甲矽烷基基團、鹼金屬陽離子、鹼土金屬陽離子、銨以及三垸基鱗陽離子；其中，Z1和22中每一個選自O和S原子，並且其中112和R3獨立地選自氫和Q-CV烷基。連接基團(L)。在本發明中使用的任何化學發光化合物中的連接基團可以是鍵、原子、二價基團和多價基團、或者是直鏈或支鏈原子，其中一些可以是環狀結構的一部分。該奴代基通常含有1至約50個非氫原子、更通常含有1至約30個非氫原子。在另一個實施方式中，含有鏈的原子選自C、O、N、S、P、Si、B以及Se原子。在另一個實施方式中，含有鏈的原子選自C、O、N、P以及S原子。在鏈中除碳原子以外的原子的數量通常是1-10。滷素原子可以作為取代基存在於鏈或環上。典型的包含連接的取代基的官能團包括亞烷基，亞芳基，亞鏈烯基，醚，過氧化物，羰基例如酮、酉旨、碳酸酯、硫酯，或者醯胺基，胺，脒，氨基甲酸酯，脲，亞胺，醯亞胺，醯亞胺鹽，碳二亞胺，肼，重氮，磷酸二酯，磷酸三酯，磷酸酯，硫醚，二硫化物，亞碸，碸，磺酸酯，硫酸酯，以及硫脲基團。在另一個實施方式中，基團是含l-20個原子的亞垸基鏈，其末端為-CH2-、-O-、-S-、-NH-、-NR-、-SiO-、-C(=0)-、-OC(=0)-、-C(=O)0-、-SC(=0)-、-C(,S-、-NRC(=0)-、-NRC(=S)-、或者-C(-O)NR-基團，其中R是C^烷基。在另一個實施方式中，連接基團是含3-30個原子的聚(亞院氧基)鏈，其末端為-CH2-、-O-、-S-、-NH-、-NR-、-SiO-、-C(-O)-、-OC(=O)-、-C(=0)0-、-SC(=O)-、-C(=O)S-、-NRC(=O)-、-NRC(=S)-、或者-C(=O)NR-基團，其中R是C卜8垸基。反應基團。反應基團RG是原子或基團，其存在可以促進通過共價連接或者物理力而鍵合於另一種分子。在一些實施方式中，例如，當反應基團是離去基團比如滷素原子或甲苯磺酸鹽基團、並且化學發光標記性化合物被通過親核置換反應而共價連接於另一種化合物上時，本發明的化學發光標記性化合物連接至另一種化合物將涉及從反應基團上喪失一種以上原子。在其他實施方式中，當發生加成反應例如Michael加成時、或者當反應基團是異氰酸酯或者異硫氰酸酯基團時，化學發光標記性化合物通過形成共價鍵而連接至另一種化合物將涉及反應基團內部鍵的重組。在另一些其他的實施方式中，連接不會涉及共價鍵形成，但涉及物理力，而在這樣情況下反應基團保持不變。而物理力是指吸引力，比如氫鍵吸引力、靜電吸引力或者離子吸引力；疏水性吸引力比如鹼基堆積；以及特異性親合力相互作用比如生物素-鏈黴抗生物素蛋白相互作用、抗原-抗體相互作用、以及核苷酸-核苷酸相互作用。表1.用於將標籤化學結合至有機分子和生物分子的反應基團a)胺反應基團。formulaseeoriginaldocumentpage264)羥基反應基團。,,C105)醛/酮反應基團。-NH2-ONH26)其他反應基團。-so2ciSQ2CH2CF3NHNH2R~~N3/R工NH『NH2在一個實施方式中，反應基團包括OH、NH2、ONH2、NHNH2、COOH、S02CH2CF3、N-羥基琥珀醯亞胺酯、N-羥基琥珀醯亞胺醚和順丁烯二醯亞胺基團。雙功能偶聯劑還可以用於用適度反應性的基團將標籤偶聯到有機分子和生物分子上(參見L.J.Kricka，配體-結合物測定法。MarcelDekker公司出版，紐約，1985年，第18-20頁、表2.2;和T.H.Ji，"雙功能試劑"，MethodsinEnz漏logy.91,580-609(1983))。有兩種類型的雙功能試劑:併入最終結構的雙功能試劑，以及不併入最終結構、並且僅起偶聯兩種反應物作用的雙功能試劑。活化劑結合物活化劑化合物成為活化劑-特異性結合伴侶結合物的一部分。結合物具有雙重作用1)在測定中，通過特異性結合伴侶部分直接地或者通過中間的特異性結合伴侶而經受與分析物含量成比例的特異性結合反應，和2)通過活化劑部分激活化學發光化合物。結合物的活化劑部分是具有活化化學發光化合物的效果的化合物，使得當存在引發劑溶液時產生化學發光。能夠用作活化劑的化合物包括具有類似過氧化物酶活性的含有過渡金屬鹽和複合物以及酶的化合物，尤其是含有過渡金屬的酶，更尤其是含有過氧化物酶。在活化劑化合物中有用的過渡金屬包括周期表中第3-12族的那些過渡金屬，尤其是鐵、銅、鈷、鋅、錳和鉻。應該注意，決定著信號產生的活化劑分子可以在物理上限制的半徑內起作用，並且僅與有限供應的化學發光化合物相接觸。如果活化劑具有這種潛力，這似乎阻止了較大的催化轉化。可以經受化學發光反應的過氧化物酶包括，例如乳過氧化物酶、微小過氧化物酶、髓過氧化物酶、滷素過氧化物酶、釩溴過氧化物酶、辣根過氧化物酶、真菌的過氧化物酶、木質素過氧化物酶和來源於Arthromycesramosus的過氧化物酶、以及在白腐真菌中產生的Mn依賴性過氧化物酶、以及大豆過氧化物酶。己知不是酶、但具有類似過氧化物酶活性的^i擬過氧化物酶的化合物包括鐵複合物，比如亞鐵原卟啉、以及Mn-TPPS4(Y,X.Ci等，MikrochemJ.，52，257-62(1995))。上述這些物質催化底物的化學發光氧化，並且應明確地認為包含於本發明所使用的過氧化物酶含義的範圍內。過氧化物酶和生物分子的結合物或者複合物還可以被使用於產生化學發光的方法中，僅有的附帶條件是結合物顯示出過氧化物酶活性或者類似過氧化物酶活性。可以結合於一個以上過氧化物酶分子的生物分子包括DNA、RNA、低聚核苷酸、抗體、抗體片段、抗體-DNA嵌合體、抗原、半抗原、蛋白質、肽、凝集素、抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白和生物素。還可以在本發明的方法中使用包含或者結合過氧化物酶的複合物，比如脂質體、膠束、囊泡和為連接生物分子而被功能化的聚合物。物質的組成在本發明的另一個實施方式中，提供包含在其上固定化有化學發光化合物的固體支持物的測試材料。在一個實施方式中，化學發光化合物選自如上所述化學發光化合物組。在另一個實施方式中，化學發光化合物是過氧化物酶的底物。固定化在固體支持物上的化學發光化合物的量可以在荷載密度範圍內變化。作為例子，當固體支持物是顆粒材料時，可以採用的荷載範圍為100-0.01pg化學發光化合物/每毫克粒子。在另一個實施例中，可以採用的荷載範圍為5-0.1)Ltg化學發光化合物/每毫克粒子。該化學發光化合物通常隨機或均勻地分布到固體支持物之上。其可以被固定化在固體支持物的表面上或者在可到達的孔內部。化學發光化合物可以通過共價連接而被固定化到固體支持物上。本實施方式中，具有反應基團的化學發光標記性化合物與存在於固體支持物上的官能團起反應，以便在化學發光化合物和固體支持物之間形成共價鍵。在一個可替代的實施方式中，可以利用一種以上中間物質將化學發光化合物固定到固體支持物上。在一個實施例中，生物素被共價附接於固體支持物，共價附接的生物素被結合於鏈黴抗生物素蛋白，並且生物素-化學發光化合物結合物然後被結合。在另一個實施例中，鏈黴抗生物素蛋白被吸附到固體支持物上，並且生物素-化學發光化合物結合物然後被結合。在另一個實施例中，結合於輔助蛋白質比如白蛋白的化學發光化合物被吸附或者共價連接到固體支持物上。在另一個實施例中，結合於抗體的化學發光化合物被吸附或者共價連接到固體支持物上。28固體支持物可以是各種材料、各種孔隙度、各種形狀、以及各種尺寸，例如96孔的微孔板、384孔的微孔板、或更高孔數的微孔板、試管、樣品杯、塑料微球、纖維素、紙質或者塑料測試條、膠乳粒子、直徑為0.10-50pm的聚合物粒子、直徑為0.10-50(im的二氧化矽粒子、磁性粒子、尤其是平均直徑為0.1-10pm的磁性粒子、以及納米顆粒。在一個實施方式中，固體支持物包括直徑為0.10-50pm的聚合物粒子或二氧化矽粒子，並且可以是如上定義的磁性粒子。:本發明的固定化化學發光化合物包括附著於固體支持物的化學發光標籤，其中，通過具有通式CL-L-RG的化學發光標記性化合物而提供化學發光標籤，其中，CL代表化學發光部分，L代表將化學發光部分連接至反應基團的連接部分，並且RG代表用於偶聯於另一種材料的活性基團部分。化學發光部分CL包括一種化合物，所述化合物經受與活化劑的反應而導致其被轉化為激活的化合物。激活的化合物與引發劑溶液的反應形成電子激發態化合物。化學發光部分包括在標題"化學發光標籤化合物"下的上述每一類化合物，其包括但不限於氨基苯二醯一肼、以及在結構上相關的環狀醯肼、9,10-二氫化吖啶酯、硫酯和氨磺醯、以及9，10-二氫化吖啶乙烯酮二硫代縮二乙醇類化合物。在本發明的另一個實施方式中，提供包含其上固定化有化學發光化合物的固體支持物的測試材料和至少一種特異性結合物質，所述特異性結合物質對於分析物有特異性結合親合力，或者對於另一種物質有特異性結合親合力，所述另一種物質對於分析物有特異性結合親合力。在這些實施方式中，固定化的化學發光化合物是如上剛剛描述的由於包含其上固定化有化學發光化合物的固體支持物的實施方式。固定化的特異性結合物質通過一種以上特異性親合力結合反應而直接或間接地結合分析物。該特異性的結合物質包括，但不限於抗體和抗體片段、抗原、半抗原和它們的同源抗體、生物素和抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白、蛋白質A和IgG、互補核酸或低聚核苷酸、凝集素和碳水化合物。本發明的另一個實施方式包括在測定中形成的信號系統，其包含其上固定化有下述物質的固體支持物1)化學發光化合物，2)至少一種特異性的結合物質，其對於分析物有特異性結合親合力或者對於另一種物質有特異性結合親合力，所述另一種物質對於分析物有特異性結合親合力，3)分析物，以及4)活化劑結合物。術語"固體支持物"、"化學發光化合物"和"特異性結合物質"的含意和包含這些術語的實施方式與如上所述被認為是本發明組成的測試材料的含意和實施方式相同。可以形成本發明信號系統的組成部分的分析物包括上述鑑別的任何分析物，其存在、位置或含量在測定中被確定。活化劑結合物包括被連接至分析物-特異性結合伴侶結合物的活化劑化合物。結合物具有雙重作用1)在測定中，通過特29異性結合伴侶部分直接地或者通過中間的特異性結合伴侶而特異性地結合至分析物上，和2)通過活化劑部分激活化學發光化合物。結合物的活化劑化合物部分是具有激活化學發光化合物的效果的化合物，使得當存在引發劑溶液時產生化學發光。能夠用作活化劑的化合物包括具有類似過氧化物酶活性的化合物，其含有過渡金屬鹽和複合物以及酶、尤其是含有過渡金屬的酶、更尤其是含有過氧化物酶。在活化劑化合物中有用的過渡金屬包括周期表中第3-12族的那些過渡金屬，尤其是鐵、銅、鈷、鋅、錳和鉻。可以經受化學發光反應的過氧化物酶包括，例如乳過氧化物酶、微小過氧化物酶、髓過氧化物酶、滷素過氧化物酶、釩溴過氧化物酶、辣根過氧化物酶、真菌的過氧化物酶、木質素過氧化物酶、來源於Arthromycesmmosus的過氧化物酶、在白腐真菌中產生的Mn依賴性過氧化物酶、以及大豆過氧化物酶。具有類似過氧化物酶活性的其他化合物包括鐵複合物，比如亞鐵原P卜啉、和Mn-TPPS4。引發劑溶液引發劑溶液提供了產生化學發光所需的激發態化合物所需要的反應物。該反應物可以是一種對於通過直接與化學發光標籤反應而進行化學發光反應所必需的反應物。其可以具有代替該功能或者除該功能之外的促進活化劑化合物功能的作用。例如，當活化劑是過氧化物酶時，將會發生這種情況。在一個實施方式中，引發劑溶液包含過氧化物化合物。該過氧化物成分是任何能夠與過氧化物酶反應的過氧化物或者垸基氫過氧化物。例舉的過氧化物包括過氧化氫、過氧化脲和過硼酸鹽。在引發劑溶液中使用的過氧化物濃度可以在一定數值範圍內變化，典型地，該範圍為約10"M至約3M、更通常為約10—3M至約10—1M。有代表性的實施方式使用作為活化劑的過氧化物酶結合物、被9，10-二氫化吖啶標記的分析物的特異性結合伴侶(其中，通過特異性結合伴侶與上述式III的化合物反應而提供9,10-二氫化吖啶標籤)、以及包含過氧化氫的引發劑溶液。該過氧化物與過氧化物酶反應，估計可能是在酶的活性部位將鐵的氧化態變成了不同的氧化態。這種改變了狀態的酶和保持與酶近似性的9,10-二氫化吖啶標籤反應。化學發光反應包含由化學發光化合物與過氧化物形成的中間體的進一步反應，以產生最終的反應產物和光。將某些增強化合物併入引發劑溶液可以促進的酶反應性或者減少背景信號，或者同時具有這兩種功能。這些增強劑中包括已知可增強其他的過氧化物酶反應的酚類化合物和芳香胺，如美國專利No.5,171,668和5,206,149所述，現將其引入本文作為參考。在美國專利5,512,451中公開了取代的和未被取代的芳基硼酸化合物和它們的酯和酐衍生物，將其引入本文作為參考，在此也考慮將其歸入在本發明中有用的增強劑範圍內。例舉的增強劑包括，但不限於對苯基苯酚、對碘苯酚、對溴苯酚、對羥基肉桂酸、對咪唑基苯酚、醋氨酚、2，4-二氯苯酚、2-萘酚以及6-溴-2-萘酚。還可以使用選自如上所述這些種類的一種以上增強劑的混合物。被發現有效增強由本發明的化合物產生化學發光的輔助增強劑是吩惡嗪和吩噻嗪的衍生物，它們具有下式。R禾[]R在吩惡嗪和吩噻嗪增強劑的氮原子上被取代的R基包括l-8個碳原子的烷基，以及用磺酸鹽或羧酸鹽基團取代的l-8個碳原子的垸基。例舉的增強劑包括3-(N-吩噻嗪基)-丙烷磺酸鹽、3-(N-吩惡嗪基)丙垸磺酸鹽、4-(N-吩惡嗪基)丁烷磺酸鹽、5-(N-吩惡嗪基(phenoxazinyl))-戊酸鹽、以及N-甲基吩惡嗪(N-methylphenoxazine)和相關同系物。在引發劑溶液中使用的增強劑濃度可以在一定數值範圍內變化，典型地，該範圍為約10—SM至約10"M、更通常為約10—4M至約If)—2M。檢測本發明的反應是用引發劑溶液進行的，該引發劑溶液是典型的緩衝水溶液。合適的緩衝液包括任何常用的能夠保持環境允許的化學發光反應進行的緩衝液。典型地，引發劑溶液將具有約5至約10.5的pH值。示例性的緩衝液包括磷酸鹽、硼酸鹽、醋酸鹽、碳酸鹽、三(羥基-甲基氨基)甲烷[tris]、甘氨酸、麥黃酮(Tricine)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、二乙醇胺MOPS、HEPES、MES等等。引發劑溶液還可以含有一種以上清潔劑或者聚合物表面活性劑，以增強產光反應的發光效率或者提高測定的信/噪比。在本發明的實施方式中有用的非離子表面活性劑包括，例如聚氧乙烯化垸基酚類、聚氧乙烯化醇類、聚氧乙烯化醚類和聚氧乙烯化山梨糖醇酯類。可以使用包括季銨鹽化合物比如CTAB和季轔鹽化合物在內的單體陽離子表面活性劑。還可以使用包括那些含有季銨和鱗鹽基團的陽離子表面活性劑的聚合型陽離子表面活性劑。在一個實施方式中，引發劑溶液是包括緩衝水溶液的組合物，過氧化物濃度為約10—5M至約1M，並且增強劑濃度為約10—SM至約10—1M。該組合物可以任選地含有包括表面活性劑、金屬螯合劑以及防腐劑在內的添加劑，以抑制或最小化微生物汙染。檢測通過任何合適的己知手段比如光度計、X射線膠片、高速感光膠片、CCD攝像機、閃爍計數器、化學光度計或可見光手段，可以檢測通過本發明的方法發射的光。每種檢測手段具有不同的光譜靈敏度。人眼是優選地對綠光靈敏，CCD攝像機顯示出對紅光的最高靈敏度，X射線膠片具有對紫外線、藍光或綠光的最大應答，這些都是可利用的。檢測裝置的選擇將取決於其應用和成本、方便性考慮、以及是否需要產生經常記錄。在那些光發射時程較快的實施方式中，優選進行引發劑反應以便在使用檢測裝置時產生化學發光。作為例子，可以在適合於接受試管或微孔板的殼體內，在放置於光度計中或者被置於CCD攝像機前的試管或微孔板中進行檢測反應。應用本發明的測定方法發現了在許多類型的特異性結合配對測定法中的應用性。在這些應用中，首要的應用是化學發光酶聯免疫測定法，比如ELISA。進行免疫化學步驟的各種測定形式和方案已為本領域技術人員所熟知，並且包括競爭性測定法試和夾心測定法。可以通過根據本發明的免疫測定法測試的物質種類包括蛋白質、肽、抗體、半抗原、藥物、甾族4七合物及其他通常在免疫測定
技術領域：
已知的物質。本發明的方法還可用於核酸檢測。在一個實施方式中，一種方法利用了酶標記的核酸探針。例舉的方法包括溶液雜交測定法、Southernblotting中的DNA檢測、通過Northernblotting的RNA檢測、DNA測序、DNA指紋圖譜法、集落雜交以及噬菌斑雜交法(plaquelift)，其進行過程對本領域的技術人員而言是眾所周知的。除上述的抗原-抗體、半抗原-抗體或者抗體-抗體配對之外，特異性結合配對還可以包括互補的低聚核苷酸或多聚核苷酸、抗生物素蛋白-生物素、鏈黴抗生物素蛋白-生物素、激素-受體、凝集素-碳水化合物、IgG-蛋白質A、結合蛋白-受體、核酸-核酸結合蛋白、以及核酸-抗核酸抗體。在篩選藥物候選對象中使用的受體測定法是本發明方法的另一應用領域。這些結合配對的任何一種皆可以適合於在本發明方法的三組分夾心技術或者如上所述的二組分競爭性技術中使用。本發明的目的還在於提供根據本發明的方法進行測定的試劑盒。試劑盒在包裝產品組合中可以包括化學發光標籤，其或者是游離的標籤化合物、化學發光標記的特異性結合伴侶、化學發光衍生的固體支持物比如顆粒或者微孔板，或者是化學發光標記的輔助物質比如圭寸閉性蛋白質；同時還有引發劑溶液和使用說明書。如果化學發光標記是由使用者進行的話，試劑盒還可以任選地含有活化劑結合物、分析物標準樣、對照物、稀釋劑和反應緩衝液。實施例實施例1.化合物1的合成32formulaseeoriginaldocumentpage33使用DCC作為偶聯劑，通過碘化羧酸與N-羥基琥珀醯亞胺反應，合成了碘化羧酸酯NHS酯。使用在美國專利申請公開2005/0158815中公開的方法製備化合物B。在氬氣保護下，向無水DMF(50mL)中二硫酯旦(1.808g，5.00mmol)的溶液中添加NaH(在礦物油中60%，0.200g，5.00mmol)。在室溫下反應後4h後，添加NHS3-碘化丙酸酯4(1.485g，5.00mmol)，並且將得到的混合物攪拌過夜。在真空中除去DMF。用CH2C12/EtOAc(40:l〉進行柱層析，得到1.770g的黃色固體化合物i(產率67%)。'HNMR(400MHz,CDC13):52.30(s,3H),2.74(t,2H),2.83(s，4H),3.01(t,2H),5.31(s,2H),6.88(t,2H),7.07(m，2H),7.11-7.18(m,3H),7.27(m,4H)，7.82(dd,1H),7.89(dd,1H)ppm。實施例2.化合物2的合成formulaseeoriginaldocumentpage34使用在美國專利申請公開2005/0158815中公開的方法製備化合物^。在氬氣保護下，將二硫酯G(0.692g，1.50mmol)和NaH(在礦物油中60%，0細g，1.50mmol)在無水DMF(20mL)中的混合物在室溫下攪拌4小時，得到稍混濁的溶液。然後添加5mL的DMF中的NHS6碘化己酸酯4(n=4)(0.661g，1.95mmol)。在16h後，於真空下除去DMF。向殘餘物添加10mL的丙酮，接著添加20mL的乙醚。傾析上清液。以相同的工序洗滌沉澱物三次。在真空乾燥後，得到了1.200g的黃色固體化合物2。'HNMR(400MHz,CD3OD):51.15(m,2H)，1.33-1.47(m,4H),2.01(p,2H),2.38(t,2H),2.67(t,2H),2.75(t，2H),2.82(s,4H),2.88(t,2H),5.32(s,2H)56.88-6.93(m，2H),7.00(t,2H),7.08-7.28(m,7H),7.83(d,1H),7.92(d，1H)ppm。實施例3.化合物3和4的合成在氬氣保護下,將二硫酯G(l.OOg，2.10mmol)和NaH(在礦物油中60%'0.087g'2.16mmol)在無水DMF(20mL)中的混合物在室溫下攪拌4小時，得到稍混濁的溶液。然後添加在DMF(5mL)中的N-6碘化己氧基琥珀醯亞胺2(0.82g，2.52mmol)。將混合物攪拌過夜，此後在真空下除去DMF。用30mL乙醚洗滌殘餘物四次，得到1.35g的化合物2。將化合物2(0.25g)溶於5mL甲醇中，向其內添加5.0mL的50%的NH2OH水溶液。溶液攪拌2天後，在真空下蒸去溶劑。用6x20mL的乙醚洗滌殘餘物，得到0.21g的化合物4。'HNMR(400MHz,CD3OD):51.14(m,4H),1.40(m,4H),1.94(p,2H)，2,65-2.71(m,4H),2.84(t,2H),3.55(t,2H),5.31(s，2H),6.88(d,2H)，6.98(q,2H),7.10(m，4H)，7.12-7.27(m，3H),7.85(t,2H)ppm。實施例4.化合物5和6的合成1^-^^NKCOCF3E在氬氣保護下，將二硫酯G(1.32g，2.78mmo1)和NaH(在礦物油中60%，0.114g,2.86mmol)在30mL無水DMF中的混合物於室溫下攪拌4小時。然後添加0mL的DMF中的化合物E(1.014g，3.61mmol)。將混合物攪拌過夜，此後在真空下除去DMF。用20mL乙醚洗滌殘餘物三次，得到2.10g的化合物￡。將化合物￡(2.25g)溶於15mL的在甲醇中7NNH3和10mL的28%氨水溶液的混合物中。攪拌3天後，在真空下除去溶劑。用乙醚(3x50mL)洗滌殘餘物，並且用&0/2-丙醇重結晶，得到1.20g的化合物5。向在9.0mL乾燥DMF中化合物》(0.300g的話，0.563mmol)的懸浮液中添加1.20mL的三乙胺。將混合物攪拌5min，得到稍混濁的溶液。向該溶液中添加6-馬來醯亞胺己酸NHS酯(化合物Q，0.260g，0.843mmol)。在5min內得到透明溶液。在16hrs後，在真空下除去DMF。用乙醚(4x30mL)洗滌殘餘物，然後溶於甲醇(2mL)，並且用乙醚(50mL)36沉澱。得到0.400g淺黃色泡沫狀固體化合物&'HNMR(400MHz,CD3OD):51.26(t,11H),1.49-1.58(m,6H),1,90(p,2H),2.08(t,2H)，2.68(m,4H),2.80(t，2H),3.00(t,2H),3.15(q,6H),3.42(t,2H),5.28(s，2H)，6.73(s,2H)，6.85(d，2H),6.96(m,2H),7.07(m,4H)，7.18-7.25(m，3H),7.83(m，2H)ppm。實施例5.輔助標記性化合物7-12在美國專利6,858,733中公開了下述所列其他示例性的標籤化合物的製備方法。實施例6.輔助的標記性化合物分別從N-甲基-9，10-二氫化吖啶和N-苯基-9,10-二氫化吖啶出發，按照類似於在製備^七合物1_中使用的反應步驟，製備出化合物l^和ii。在這些結構中，M代表帶正電荷的相反離子，比如Li+或Na+。實施例7.標記性化合物15的製備formulaseeoriginaldocumentpage38在用NaH於DMF中形成硫代丁酸陰離子(enethiolateanion)後，實施例4中的化合物被用碘代NHS酯tL進行S-烷基化。將產物通過用2-丙醇重結晶進行精製。formulaseeoriginaldocumentpage38實施例8.9,10-二氫化吖啶標記的抗體的製備實施例3中的9,10-二氫化吖啶標記化合物i被用於標記綿羊抗小鼠IgG(H+L)(JacksonImmunoresearch)。在0.1M硼酸鹽緩衝液、pH8.25中0.24mg抗體的溶液和在500(aLDMF中的化合物2(10:1摩爾比的化合物2:抗體)於在室溫下反應15min，然後在4。C下過夜。使溶液穿過脫鹽柱(BioRad)，用PBS緩衝液洗脫，以便除去未結合的標籤。通過收集500的組分，得到了混有任何未反應抗體的標記的抗體。通過化學發光測定法測試組分的標記抗體的含量。將1或10pL等分組分與50iaL的0.4MHC1+3.6%過氧化脲混合，接著在TurnerDesignsTD-20e光度計中在試管內注射50pL的0.5MNaOH。從注射時開始測量來自發光脈衝的總的累積強度。保留顯示化學發光的那些組分。組分8在產物中佔有最大含量。實施例9.用9,10-二氫化吖啶標記的BSA的製備實施例3中9，10-二氫化吖啶標記的化合物i被用於標記牛血清白蛋白(BSA)。使在500(iL的0.1M硼酸鹽緩衝液、pH8.25中的O.lgBSA溶液與42jiL的於100的DMF中23.4mg化合物U勺溶液(10:l摩爾比的化合物2:BSA)在室溫下反應15min，然後在4。C下過夜。使溶液穿過脫鹽柱(BioRad)，用PBS緩衝液洗脫，以便除去未結合的標籤。通過收集500組分，得到了混有任何未反應的BSA的標記的BSA。按實施例8中的化學發光測定法測試組分中標記的BSA的含量。保留顯示化學發光的組分。組分7在產物中佔有最大含量。實施例10.被9,10-二氫化吖啶功能化的微孔的製備通過使用EDC作為偶聯劑，使被羧基功能化的白色聚苯乙烯96孔微孔板(Biosystems)與化合物l偶聯。製備化今物i在DMF和0.1M的MES緩衝液(70:30(v/v))所組成的;'$液(pH4)中的原液。將0.2mL等分的原液添加至平板的各個孔，這些孔已經預先在MES緩衝液中洗滌。添加在MES緩衝液中的EDC，並且使混合物反應過夜。除去上清液，並且這些孔依序用水洗滌兩次、用甲醇洗漆六次。實施例ll.用9，10-二氫化吖啶標記的聚(甲基丙烯酸酯)微粒物的製備通過回流四個小時，使安伯來特樹脂(Amberliteresin,IRP-64，100-400目，2.50g)與SOCb反應。冷卻該反應，並且在真空下除去揮發物。然後將小球懸浮在50mL的CH2Cl2中，向其中添加17.0mL的三乙胺，接著添加15.0mL的1,2-乙二胺。在氬氣保護下將混合物攪拌過夜。通過添加100mL的甲醇分散顆粒物，然後過濾。用甲醇和CH2Cl2洗滌濾出的顆粒物，並且風乾。得到的顆粒物重2.80g，計算的NH2含量是2.86mmol/g。在氬氣保護下，將在10mL無水DMF中的用1,2-乙二胺修飾顆粒物(100mg)與10mg的化合物2_一起在室溫下攪拌過夜。將混合物過濾，並且用甲醇洗滌顆粒物。在風乾後，回收的功能化顆粒物重102mg。在可選的另一種方法中，通過按上述方法與SOCl2反應，將2.50g的安伯來特樹脂轉化為酸性氯化物形式，然後與4.32g的N-羥基琥珀醯亞胺在50mL的四氫呋喃和6.8mL的三乙胺中起反應，從而製備出被NHS酯功能化的顆粒物。這些顆粒物與含有游離末端NH2基團的化合物i起反應，達到偶聯效果。實施例12.被9，10-二氫化吖啶標記的微粒物與抗體的結合將20mg重量的、含有未反應的末端NH2基團的、實施例11中的用9,10-二氫化吖啶標記的安伯來特顆粒物，進一步在室溫下與在1mL無水DMF中的102mg二琥珀醯亞胺基辛二酸酯(約5當量)反應15min。通過離心分離顆粒物，並且用10x1mL的DMF洗滌。得到的游離NHS酯在0.1M硼酸鹽緩衝液、pH8.5、2mM的EDTA中被偶聯於綿羊抗小鼠IgG(0.5mL的1.8mg/mL原液)，在4。C下過夜。將反應混合物在13krpm下離心，並且除去上清液。將顆粒物在離心柱(spincolumn)上用PBS+0.05%吐溫-20洗滌若干次。通過在1.0mL的封閉性緩沖液(1xPBS中1%的BSA、1%蔗糖)中於37。C下培育1小時，用BSA封閉所得到的被抗體標記的顆粒物。該顆粒物用吐溫-PBS洗漆緩衝液進行洗滌，並且儲存於1.0mL的lXPBS中。實施例13.用9,10-二氫化吖啶標記的磁性微粒物的製備製備4mg化合物5在0.7mL的DMF和0.3mL的0.1MMES緩衝液所組成的溶液(pH4)中的原液。將0.1mL等分原液添加至50mg的己經在MES緩衝液中洗滌過的羧基化聚苯乙烯顆粒物(DynalDynabeadsM-270型羧酸)。混合物用0.67mL的MES緩衝液和0.23mL的DMF稀釋。添加EDC(23mg)，並且將混合物搖動過夜。除去上清液，並且顆粒物依序用2x1mL的水和6x1mL的甲醇洗滌，並且再懸浮於1mL的甲醇中。測試顆粒物的標記結合。將10nL等分的顆粒物(含有約0.5mg的顆粒物)添加至0.5mL的水中，製備出1mg/mL的原液。使100|aL等分原液與過量的HRP反應5min。用4x1mL的水洗滌顆粒物，然後懸浮在lmL的水中。注射含有25mMtris、pH8.0、8mM對羥基肉桂酸、lmMEDTA、0.2%吐溫-20和0.1M過氧化脲的引發劑溶液1(10pL)，在光度計中記錄化學發光的閃光。觀察到相比空白18RLU的6040RLU信號。將5mg份的顆粒物用2x200(_iL的0.1MMES緩衝液、pH4洗滌，然後再懸浮於117的MES緩衝液中。將綿羊抗小鼠IgG(0.15mg，來自1.8mg/mL原液)添加至顆粒物，並且將混合物搖動30分鐘。添加5mg的EDC，並且將混合物搖動4個小時。除去上清液，並且甩3x500的PBS-T(PBS+0.05%吐溫-20)洗滌小球。將顆粒物再懸浮於500(iL的封閉性緩衝液(PBS+1%BSA+1%蔗糖)和5mg的EDC中，在室溫下攪拌15min，並且在4。C下攪拌過夜。除去上清液，顆粒物用2x500(aL的PBS-T洗滌，並且再懸浮於1mL的PBS中。實施例14.使用標記的捕獲抗體進行微孔板免疫測定將來自實施例8中標記抗體製備的含有產物的組分以1:100的比例在PBS緩衝液中稀釋。將50^L等分稀釋液添加至白色聚苯乙烯96孔板上26個孔的每一個中。該平板在室溫下在軌道搖床上搖動5分鐘。除去溶液，並且將孔用PBS-T洗滌三次，在各個步驟後除去所有的洗滌緩衝液。將綿羊抗小鼠IgGF(ab，)2-HRP結合物(JacksonImmu畫esearch)在IXPBS中包含2.5°/。BSA和1%蔗糖的結合緩衝液中以1:1.2x10的比例稀釋。作為另一種選擇，結合物還可以在其他的基質比如FBS中稀釋。將等分的稀釋結合物分配入26個孔中。通過與抗IgGF(ab')2-HRP結合溶液中0ng/mL的溶液一起進行2倍稀釋，從而製備出含有100ng/mL-0.048ng/mL的IgG標準液。將標準液和零含量液分配入孔中，達到50^L/孔的終體積。將平板在平板搖床上室溫下培育1hr。將平板轉移至Luminoskan平板光度計。無需除去結合物溶液，通過依序注射100的引發劑溶液1產生發光，並且讀取各個孔中的累積強度5秒。繪製得到的測定結果如圖4所示。該測定法允許在全程測試的整個期間用超過零信號的零+2標準偏差的最低校準進行定實施例15.未標記的捕獲抗體和標記BSA微孔板免疫測定法添加50等分的未標記綿羊抗小鼠IgG(H+L)、40pg/mL的1XPBS，以便塗敷白色聚苯乙烯96孔板上26個孔的每一個。該平板在室溫下在軌道搖床上搖動5分鐘。除去、溶液，並且將孔用PBS-T洗滌三次，在各個步驟後除去所有的洗滌緩衝液。將來自實施例9中標記BSA的製備的含有產物的組分用PBS緩衝液+1%蔗糖稀釋至50pL/mL。將100等分稀釋液添加至白色聚苯乙烯96孔板的26孔的每一個。該平板在37。C下保溫lhr。除去溶液，並且將孔用PBS-T洗滌三次，在各個步驟後除去所有的洗滌緩7中液。將綿羊抗小鼠IgGF(ab')2-HRP結合物(JacksonImmunoresearch)在包含IXPBS中2.5%BSA和1。/。蔗糖的結合物緩衝液中以1:1.2x106稀釋。將等分的稀釋結合物分配入2641個孔中。通過與抗IgGF(ab')2-HRP結合溶液中0ng/mL的溶液一起進行2倍稀釋，製備出含有100ng/mL-0.048ng/mL的IgG標準液。將標準液和零含量溶液分配入孔中，達到50^L/孔的終體積。將平板在平板搖床上室溫下培育1hr。將平板轉移至Luminoskan平板光度計。無需除去結合溶液，通過依序注射100的引發劑溶液l，產生發光，並且讀取各個孔中的累積強度5秒。繪製得到的測定結果如圖5所示。該測定法允許在全程測試的整個期間用超過零信號的零+2標準偏差的最低校準進行定在對照實驗中，從孔中除去溶液，並且分析溶液，結果顯示，光發射來源於孔的表面而非來自溶液。實施例16.通過使用標記的磁性微粒物進行微粒物免疫測定用PBS-T將足以提供每次反應50pg的一定量實施例13中的9,10-二氫化吖啶和抗體共同標記的磁性微粒物洗滌三次，並且再懸浮於在含有1。/。BSA和1%蔗糖的1XPBS緩沖液中以1:1.2x106的比例稀釋的綿羊抗小鼠IgGF(ab')2-HRP結合物溶液中。將該顆粒物懸浮液分配入白色聚苯乙烯96孔板上26個孔中。通過在孔中進行2倍連續稀釋至終濃度100ng/mL-0.048ng/mL或0ng/mL，製備出綿羊抗小鼠IgGF(ab')2-HRP結合物溶液中的IgG標準試樣。將各個標準液和零含量溶液分配入孔中，使得最終反應體積為50pL/孔。將平板在搖床上室溫下培育1hr。將平板轉移至Luminoskan平板光度計。無需除去結合物溶液，通過依序注射100piL的引發劑溶液l產生發光，並且讀取各個孔的累積強度5秒。繪製得到的測定結果，使IgG定量。實施例17.通過使用標記的安伯來特微粒進^1微粒免疫測定用PBS-T將足以提供每個反應100pg的一定量實施例13中的9,10-二氫化吖啶和抗體共同標記的磁性微粒物洗滌三次，並且再懸浮於在含有1%BSA和1%蔗糖的1XPBS緩衝液中以1:1.2x1(^的比例稀釋的綿羊抗小鼠IgGF(ab')2-HRP結合物溶液中。將該顆粒物懸浮液分配入白色聚苯乙烯96孔板上26個孔中。通過在孔中進行2倍連續稀釋至終濃度100ng/mL-0.048ng/mL或0ng/mL,製備出綿羊抗小鼠IgGF(ab')2-HRP結合物溶液中的IgG標準液。將各個標準液和零含量溶液分配入孔中，使得最終反應體積為50pL/孔。將平板在搖床上室溫下培育1hr。將平板轉移至Luminoskan平板光度計。無需除去結合物溶液，通過依序注射100)_iL的引發劑溶液l產生發光，並且讀取各個孔中的累積強度5秒。繪製得到的測定結果，使IgG實施例18.製備用9,10-二氫化吖啶標記的用羧基修飾的微粒物根據實施例13中描述的所述程序，通過EDC偶聯將具有0.0282meq/g羧基荷載的羧酸修飾的聚苯乙烯1fim微粒物(Seradyn)結合於化合物5。用0.39mg的化合物5(0.74prniol)處理52.5mg份的微粒物(1.48iamolCOOH)，以確保保留一些未反應的COOH基團。通過在pH4的MES緩衝液中進行EDC偶聯，游離的COOH基團被偶聯於綿羊抗小鼠IgG(1.48(amol)。通過使用離心柱，用吐溫-PBS緩衝液洗滌除去未反應的抗體。實施例19.第U備用9,10-二氫化吖啶標記的修飾的磁性二氧化矽微粒物通過Stoeber方法用正矽酸四乙酯(27.0g)和3-氨基丙基-三乙氧基矽烷(3.0g)的混合物塗敷商業上得到的粒度範圍為1-5pm的磁鐵礦粉(10.0g)。隨後用3.75g的3-氨基丙基三乙氧基矽烷進行附加的塗敷。按如下方法使氨基丙基矽烷-修飾的磁性二氧化矽顆粒物與實施例2中的化合物2_起反應。在1.5mL離心管中，將25mg份的氨基丙基功能化的磁性顆粒物與lmL的DMF混合。將5等分的DMF中化合物2為1mg/mL的溶液添加至粒子懸浮液，並且將混合物在搖床上搖動過夜。在磁格柵(magneticrack)上除去上清液，並且依序用數份甲醇、接著數份DMF洗滌顆粒物。實施例20.通過使用9,10-二氫化吖啶標記的修飾的磁性二氧化矽微粒物進行TSH夾心免疫測定-通過用1.2mL的DMF中128mg同型雙功能(homobiftmctional)連接物二琥珀醯亞胺基氧化辛二酸酯(DSS)的溶液激活顆粒物25分鐘，使實施例19中用9,10-二氫化吖啶標記的顆粒物共價連接至小鼠抗TSH抗體。在磁格柵上除去上清液，並且用DMF洗滌顆粒物。通過添加在0.1m硼酸鹽緩沖液、pH8.25中0.225mg抗體的溶液，並且搖動混合物45分鐘，從而將活化粒子偶聯於抗體，然後在4。C下儲存過夜。用PBS-T洗滌得到的塗敷有抗體的顆粒物，然後在含有1%BSA和1%蔗糖的PBS緩衝液中於37。C下封閉1hr。在PBS-T緩衝液中洗滌顆粒物，接著用PBS洗漆，並且在PBS緩衝液中作為20mg/mL的懸浮液進行儲存。使用白色聚苯乙烯微孔板以容納顆粒物和規定的反應容器，進行免疫測定。所述孔在使用之前用含有1%BSA和1%蔗糖(1%封閉齊1」)的PBS緩衝液進行封閉，並且用PBS-T洗滌。在1%封閉劑中以1:15,000的比例稀釋1mg/mL的山羊抗TSH-HRP結合物(信號抗體)原;夜。將濃度為100|aIU/mL的TSH標準原液以1:2稀釋度的比例連續稀釋至0.00076|aIU/mL。從儲存緩衝液中分離出顆粒物並且再懸浮於HRP結合物溶液中。將等分的含有O.lmg顆粒物的顆粒懸浮液添加至足夠數量的孔中，以允許在所需濃度範圍、典型地為12.5-0.002|aIU/mL範圍內重複測定。將TSH標準試樣分配到孔中。將包含1%封閉劑或者胎牛血清(FBS)的空白樣添加至完全相同的孔中。該平板用平板密封器覆蓋，並且在37。C下搖動培育1小時。以依序的方式通過注射引發劑溶液2並且測量光來讀取發光2或5秒。引發劑溶液2含有25mMtris、pH8.0、8mM對羥基肉桂酸、1mMEDTA、0.2%吐溫-20和5mM過氧化脲。TSH濃度pIU/:mL信號-空白12,5196.56.25140,93,1388.31.5647.40.7824.10,39n.5(X206.390.0973.460.0482'02實施例21.製備用9,10-二氫化吖啶標記的修飾的聚苯乙烯微粒物按照在實施例19和20中描述的方法，用9,10-二氫化吖啶標記化合物L和小鼠抗TSH抗體使DynalM-270胺功能化的聚苯乙烯微粒物功能化。實施例22.通過使用9,10-二氫化吖啶標記的修飾的聚苯乙烯顆粒物進行TSH夾心免疫測定根據實施例20的一般方案，使用實施例21的顆粒物進行TSH夾心免疫測定。44tableseeoriginaldocumentpage45實施例23.製備用9,10-二氫化吖啶標記的修飾的聚苯乙烯微粒物按照如下方法，用9,10-二氫化吖啶標記化合物l使DynalM-270胺功能化的磁性聚苯乙烯微粒物功能化。除去等分的顆粒懸浮液，傾析上清液，並且依序用水、乙腈和DMF^t滌顆粒物。在1.5mL離心管中，將25mg份的顆粒物與1mL的DMF混合。將5|_iL等分的DMF中化合物2_的1mg/mL溶液添加至顆粒懸浮液，並且將混合物在搖床上搖動過夜。在磁格柵上除去上清液，並且依序用數份甲醇、接著數份DMF洗滌顆粒物。將250j_lL的DMF中生物素-NHS酯的1mg/mL溶液添加至1mL的DMF中12.5mg上述顆粒物中。將混合物旋轉振蕩30s，並且在搖床上搖動過夜。除去上清液，並且用DMF洗滌顆粒物，然後用PBS緩衝液洗滌。.將1mL的PBS中200pg鏈黴抗生物素蛋白添加至顆粒物，混合物旋轉振蕩1min，然後在搖床上於37。C下搖動lh。除去上清液，用PBS-吐溫緩衝液洗滌顆粒物，然後在含有1%BSA和1%蔗糖的PBS緩衝液中於37。C下封閉1hr。在PBS-吐溫緩衝液中洗滌顆粒物，接著用PBS洗滌。使PBS中的顆粒懸浮液與14嗎生物素化的綿羊抗小鼠TSH抗體於37。C下反應1h。除去上清液，用PBS-吐溫緩衝液洗滌顆粒物，接著用PBS洗滌。將得到的粒子再懸浮於濃度為20mg/mL的PBS中。實施例24.用9,10-二氫化吖啶標記的修飾的聚苯乙烯微粒物的另一種製備方法在上述實施例的方法，用9,10-二氫化吖啶標記化合物2J吏DynalM-270胺功能化的5茲性聚苯乙烯微粒物功能化。使用稱作生物素-PEG4-NHS和生物素-PEG12-NHS的商品化合物，使生物素結合於顆粒物。formulaseeoriginaldocumentpage46按照上述實施例所述的方法，進行所有後面的步驟，即，鏈黴抗生物素蛋白和生物素化綿羊抗小鼠TSH抗體的結合。實施例25.通過使用實施例24的聚苯乙烯顆粒物進行TSH夾心免疫測定將通過使用生物素-PEG12-NHS而製備的實施例24的顆粒物用於進行TSH夾心免疫測定。使用白色聚苯乙烯微孔板以容納顆粒物和規定的反應容器，進行免疫測定。在使用前用1%封閉劑將孔封閉，並且用PBS-T洗滌。在1%封閉劑中以1:15,000的比例稀釋1mg/mL的山羊抗TSH-HRP結合物(信號抗體)原液。將濃度為100(aIU/mL的TSH標準原液以1:2的稀釋度在FBS中連續稀釋至0.00076fiIU/mL。從儲存緩衝液中分離出顆粒物並且再懸浮於HRP結合物溶液中。將等分的含有0.05mg顆粒物的顆粒懸浮液添加至足夠數量的孔中，以允許在所需濃度範圍、典型地在12.5-0.002)alU/mL範圍內重複測定。將TSH標準試樣分配到孔中。將包含1。/。封閉劑或FBS的空白樣添加至完全相同的孔中。用平板密封器覆蓋平板，並且於37°C下搖動培育1小時。以依序的方式通過注射引發劑溶液2並且測量光來讀取發光2或5秒。.tableseeoriginaldocumentpage46得到了幾乎與實施例24中使用生物素-PEG4-NHS製備的顆粒物進行測定的相同結果。實施例26.根據文中描述的合成方法、但是具有下述變化，製備實施例19中描述的其它i午多類型的顆粒物:1.以正矽酸四乙酯對3-氨基丙基三乙氧基矽烷的下述比率塗敷磁鐵礦粉97.5:2.5、95:5、90:10、80:20、以及60:40，沒有附加的3-氨基丙基三乙氧基矽烷塗層。2.使25mg塗敷的磁鐵礦粉與下述荷載的化合物l反應125嗎、12.5叫、5叫、以及2.5嗎。3.將通過使用5叫和2.5嗎化合物2_製備的顆粒物用0.45mg、0.225mg、或0.1125mg抗小鼠TSH抗體塗敷。4.使25mg塗敷的磁鐵礦粉與5昭的化合物iL反應。根據如上所述方法，所有的顆粒物被成功地用於進行TSH夾心免疫測定。實施例27.生物素-9，10-二氫化吖啶結合物的製備在室溫下，在100mL圓底燒瓶中加入430mg(0.82mmo1)的9,10-二氫化吖啶化合物和250mg(mmo1)的生物素、15mL的DMS0、以及0.45mL的4-甲基-嗎啉(NMM)。將混合物攪拌30min，直到所有固體溶解。然後添加1份380mg的HATU(Aldrich產品目錄No.44,546-0)，並攪拌持續過夜。用30mL乙醚稀釋DMSO,引起凝膠分離。傾析出溶劑，並且用乙醚洗滌凝膠若干次。將得到的膠狀混合物溶於甲醇，並且通過閃光色譜法(flashchromatography)、用10%甲醇/0"12(:12洗脫來進行純化，得到250mg(產率32%)。'HNMR(400MHz，DMSO-d6):57.85-7.81(m，2H)，7.28-6.83(m，IIH)，5.26(s,2H),4,4(m1H),4.2(s,1H),3.2-3.0(m,4H),2.82-2.76(m,3H),2.70-2.55(m，5H)，2.15(m,2H),1.88-1.82(m,2H),1.63-1.50(m,6H),1,41-1.38(m,2H)ppm。實施例28.使用鏈黴抗生物素蛋白和生物素-9,10-二氫化吖啶結合物進行微孔板免疫測定根據圖8中描述的方式進行測定。添加100等分的濃度為IXPBS中15嗎/mL的鏈黴抗生物素蛋白以塗敷白色聚苯乙烯96孔板的孔。在室溫下將平板在軌道搖床上搖動1h。除去溶液，並且將孔用PBS-T洗滌三次，在各個步驟後除去所有的洗滌緩衝液。將200)aL等分含有1%BSA和1%蔗糖(IX封閉劑)的PBS緩沖液添加至白色聚苯乙烯96孔板的孔。平板於37°C下保持1hr。除去溶液，並且將孔用PBS-T洗滌三次，在各個步驟後除去所有的洗滌緩衝液。:將多份在含有1.5當量生物素的1X封閉劑中的實施例27的生物素-9,10-二氫化吖啶化合物溶液添加至每個孔中。在室溫下將平板在軌道搖床上搖動1h。除去溶液，並且將孔用PBS-T洗滌三次，在各個步驟後除去所有的洗滌緩衝液。結合生物素的小鼠抗人TSH結合物(2.45mg/mL)以1:20,000的比例在IX封閉劑中稀釋。將IO(H丄的等分稀釋結合物分配入孔中。在室溫下將平板在軌道搖床上搖動1h。除去溶液，並且將孔用PBS-T洗滌三次，在各個步驟後除去所有的洗滌緩衝液。通過與抗TSH-HRP結合物溶液中0(alU/mL的溶液一起進行4倍稀釋，製備出含有12.5pIU/mL-0.048jalU/mL的TSH標準液。將標準液和零含量溶液分配入孔中，達到終體積50|aL/孔。在1%封閉劑中以1:30,000的比例稀釋山羊抗人TSH-HRP結合物(信號抗體)。將50)liL等分的信號抗體和TSH稀釋液添加至各個孔，並且將平板於37。C下培育1h。將平板轉移至Luminoskan平板光度計。無需除去結合物溶液，通過依序注射100|aL的引發劑溶液2產生發光，同時讀取各個孔的累積強度5秒。TSH濃度pIU/mL信號-空白12,5535,953.13181.650.7869,570.2040.580.04833.600,0123〗、460.029,82實施例29.排除信號抗體的對照試驗通過排除結合HRP的信號抗體，改變實施例28的免疫測定方案。48TSH濃度pIU/mL信號-空白12.50.7273.130，0.780.0790.200.0230.0480.0270,0120.023被檢測出的化學發光水平基本上為測試背景信號的水平，所述測試背景信號的水平顯示了具有被結合在近似於固定化化學發光化合物的活化劑結合物所必要的。實施例30.其它的引發劑溶液組合物的研究在模型免疫測定體系中評價不同引發劑溶液的效果。通過使用含有6.25pIU/mL(信號)或OnIU/mL(空白)的TSH的樣品，進行實施例20的方案。增強劑濃度過氧化物濃度S/B對羥基肉桂酸8mM過氧化脲5mM6.5對羥基肉桂酸80岸過氧化脲5mM8,1對羥基肉桂酸32jiM過氧化脲5mM9.6對羥基肉桂酸16/iM過氧化脲5mM10.9對羥基肉桂酸11(iM過氧化脲5mM10.2對羥基肉桂酸8[aM過氧化脲5mM9.8上述數據顯示，在本發明的引發劑溶液中可以使用各種濃度的增強劑。-實施例31.其它的引發劑溶液組合物的研究在模型免疫測定體系中評價不同引發劑溶液的效果。通過使用含有6.25pIU/mL(信號)或OpIU/mL(空白)的TSH的樣品，迸行實施例20的方案。增強劑濃度過氧化物濃度S/B對羥基肉桂酸8一過氧化脲10mM5.3對羥基肉桂酸8pM過氧化脲25mM5.3對羥基肉桂酸8|aM過氧化脲37.5mM5.0對羥基肉桂酸8一過氧化脲50mM5.1對羥基肉桂酸8nM過氧化脲訓mM4.149上述數據顯示，在本發明的引發劑溶液中可以使用各種濃度的過氧化物。實施例32.其它的引發劑溶液組合物的研究:在模型免疫測定體系中評價不同引發劑溶液的效果。通過使用含有6.25MlU/mL(信號)或0ialU/mL(空白)的TSH的樣品，進行實施例20的方案。增強劑濃度過氧化物濃度S/B:對苯基苯酚8岸過氧化脲1mM7.9對苯基苯酚8一過氧化脲2.5mM6.2對苯基苯鼢8)aM過氧化脲5mM7.3對苯基苯船100一過氧化脲1mM6.0對碘代苯酚100過氧化脲2.5mM8.4對苯基苯酚100(iM過氧化脲5mM10.6上述數據顯示，在本發明的引發劑溶液中可以使用各種濃度的增強劑和過氧化物。實施例33.其它的引發劑溶液組合物的研究在模型免疫測定體系中評價不同引發劑溶液的效果。通過使用含有6.25nlU/mL(信號)或0)AlU/mL(空白)的TSH的樣品，進行實施例20的方案。增強劑濃度過氧化物濃度S/B對羥基肉桂酸8[_iM過氧化脲5mM3.4d-螢光素-8岸過氧化脲5mM5.76-溴代-2-萘酚8HM過氧化脲5mM9.62-萘酚8—過氧化脲5mM7.5對碘代苯酚8一過氧化脲5mM5.3對苯基苯酚8一過氧化脲5mM8.5上述數據顯示，在本發明的引發劑溶液中可以使用各種不同的增強劑。可以對上述利用不同含量的顆粒物、信號抗體、不同的培育條件、發光讀出時間、以及附加的洗漆和分離步驟的所有具體方案做出改進，皆在本發明的保護範圍內。50權利要求1.一種用於檢測含有或者疑似含有分析物的樣品中的分析物的特異性結合測定法，其特徵在於，提供固體支持物，所述固體支持物上固定有化學發光化合物和用於所述分析物的第一特異性結合伴侶，其中，所述分析物和一種活化劑化合物結合物中的至少一種結合到所述經固定的特異性結合伴侶固體支持物，使得所述活化劑化合物可操作地近似於所述固定的化學發光化合物，其中所述活化劑化合物結合物包含結合於第二特異性結合伴侶的活化劑化合物，以及，添加引發劑溶液使得所述固定的化學發光化合物和所述結合的活化劑化合物之間因發生反應而產生化學發光，從而用於檢測所述分析物在樣品中的存在、位置或含量。2.如權利要求1所述的測定法，其特徵在於，所述活化劑化合物結合物包含結合於第二特異性結合伴侶的活化劑化合物，所述第二特異性結合伴侶結合於所述分析物。3.如權利要求1所述的測定法，其特徵在於，所述活化劑化合物結合物包含結合於分析物或分析物類似物的活化劑化合物，其中所述化學發光的含量與所述樣品中的分析物含量反向相關。4.如權利要求l所述的測定法，其特徵在於，所述活化劑化合物是過氧化物酶，其中所述化學發光化合物是過氧化物酶的底物，所述引發劑溶液是包含過氧化物化合物的水溶液。5.如權利要求1所述的測定法，其特徵在於，所述活化劑化合物選自於過渡金屬鹽及複合物、過氧化物酶和含有過渡金屬的酶中的至少一種，其中所述過渡金屬選自於鐵、銅、鈷、鋅、錳和鉻中的至少一種，所述引發劑溶液是包含過氧化物化合物的水溶液，以及當存在所述活化劑化合物和所述引發劑溶液時，所述化學發光化合物被氧化而產生化學發光。6.如權利要求1所述的測定法，其特徵在於，所述經固定的用於所述分析物的第一特異性結合伴侶是抗體。7.如權利要求6所述的測定法，其特徵在於，其為夾心免疫測定法。8.如權利要求6所述的測定法，其特徵在於，其為競爭性免疫測定法。9.如權利要求l所述的測定法，其特徵在於，所述經固定的用於所述分析物的第一特異性結合伴侶是結合蛋白。10.如權利要求1所述的測定法，其特徵在於，所述化學發光化合物共價連接於所述固體支持物。11.如權利要求1所述的測定法，其特徵在於，所述化學發光化合物共價連接於固定在所述固體支持物上的輔助物質。12.如權利要求1所述的測定法，其特徵在於，所述化學發光化合物共價連接於固定在所述固體支持物上的特異結合性配對成員。13.如權利要求1所述的測定法，其特徵在於，所述分析物是靶核酸，所述經固定的第一特異性結合伴侶是與所述耙的第一區域互補的核酸，所述活化劑化合物結合物是結合於與所述靶的第二區域互補的核酸的活化劑化合物。14.如權利要求1所述的測定法，其特徵在於，使用過量的所述活化劑化合物結合物，使得一部分所述活化劑化合物結合物的保持未結合，以及在添加所述引發劑溶液之前不除去所述未結合的活化劑化合物結合物。15.如權利要求1所述的測定法，其特徵在於，所述經固定的第一特異性結合伴侶共價連接於所述固體支持物。16.如權利要求1所述的測定法，其特徵在於，所述經固定的第一特異性結合伴侶間接地連接於所述固體支持物。17.如權利要求1所述的測定法，其特徵在於，所述化學發光化合物包含化學發光部分和連接部分，其中所述化學發光部分選自於下述化合物芳香環狀二醯基醯肼、MCLA、吲哚基醋酸、異丁醛、三羥基芳香化合物、咕噸染料、9,10-二氫化吖啶酯、9,10-二氫化吖啶硫酯、9,10-二氫化吖啶氨磺醯、9,10-二氫化吖啶乙烯酮二硫縮醛類化合物、具有下述化學式的9,10-二氫化吖啶類化合物其中，R'選自於烷基、烯基、炔基、芳基以及含l-20個碳原子的芳烷基，其中所述碳原子中的任何一個可以被1-3個選自於羰基、羧基、三(d-Q垸基)甲矽烷基基團、S03—基團、0S03—2基團、葡糖基基團、P03—基團、OPO^基團、滷素原子、羥基、硫醇基、氨基團、季銨基團或季鱗基團的基團取代；X選自於C,-Q烷基、芳基、芳烷基、具有l-20個碳原子的烷基或芳基羧基、三(C,-Cs烷基)甲矽烷基基團、S(V基團、葡糖基基團和化學式PO(OR')(OR")所示的磷醯基基團、三甲矽烷基團、鹼金屬陽離子、鹼土金屬陽離子、銨以及三垸基轔陽離子，其中R'和R"獨立地選自於C,-C8垸基、氰基烷基、芳基和芳垸基Z'選自於0和S原子；W選自於取代或未取代的C,-C4烷基、苯基、苯甲基、垸氧基烷基和羧基烷基基團；所述取代基117-14中的0個或1個或2個選自於烷基、烷氧基、羥基以及滷素，而R^"中剩餘基團是氫、以及具有下述化學式的化合物其中，R'選自於垸基、烯基、炔基、芳基、以及含l-20個碳原子的芳垸基，所述碳原子中的任何一個可以被卜3個選自於羰基、羧基、三(Q-Cs烷基)甲矽垸基基團、S(V基團、OSOf2基團、葡糖基基團、PCV基團、OPO^基團、滷素原子、羥基、硫醇基、氨基團、季銨基團或季轔基團的基團取代X選自於C,-CV烷基、芳基、芳烷基、具有l-20個碳原子的垸基或芳基羧基、三(C,-C8垸基)甲矽烷基基團、S03—基團、葡糖基基團和化學式PO(OR')(OR")所示的磷醯基基團、三甲矽垸基基團、鹼金屬陽離子、鹼土金屬陽離子、銨以及三烷基鱗陽離子，其中R'和R"獨立地選自於d-C8烷基、氰基烷基、芳基和芳垸基；Z'和ZZ各自選自於O原子和S原子；112和113獨立地選自於氫和C,-C8烷基。18.如權利要求18所述的測定法，其特徵在於，所述連接部分包含具有l-20個原子的末端為-CH2-、-O-、-S墨、-NH-、-NR-、-SiO-、-C(=0)-、-OC(=O)-、-C(=0)0-、-SC(=O)-、-C(=0)S-、-NRC(=0)-、-NRC(=S)-或-C(=O)NR-基團的亞烷基鏈、或具有3-30個原子的末端為-CH2-、-O-、-S-、-NH-、-NR-、-SiO-、-C(=0)-、-OC(=0)-、-C(=0)O-、-SC(=0)-、-C(=0)S-、-NRC(=0)陽、-NRC(二S)-或陽C(=0)NR-基團的聚(亞烷基-氧)鏈，其中R是C^烷基。19.如權利要求1所述的測定法，其特徵在於，所述固體支持物選自於微孔板、試管、樣品杯、塑料微球、纖維素測試條、紙測試條、塑料測試條、膠乳粒子、聚合物粒子、二氧化矽粒子、金屬膠體以及磁性粒子。20.—種特異性結合測定法，用於檢測含有或者疑似含有分析物的樣品中的所述分析物，該測定法包括a)提供1)樣品，2)在其上固定有化學發光化合物和用於所述分析物的第一特異性結合伴侶的固體支持物，以及3)包含活化劑化合物的活化劑化合物結合物，所述活化劑化合物結合於用於所述分析物的第二特異性結合伴侶；b)使所述固體支持物與所述樣品和所述活化劑化合物結合物相接觸，以引起所述樣品中的分析物結合於所述固定的特異性結合伴侶，並且引起所述活化劑化合物結合物結合於所述分析物，其中所述分析物與所述固定化的特異性結合伴侶和所述活化劑化合物結合物這兩者的結合使得所述活化劑化合物近似於所述固定的化學發光化合物；c)提供引發劑溶液，以使所述固定化化學發光化合物與所述結合活化劑化合物之間因發生反應而產生化學發光；d)檢測所述產生的化學發光；以及e)使所述產生的化學發光與所述樣品中所述分析物的存在、位置或含量相關聯。21.—種特異性結合測定法，用於檢測含有或者疑似含有分析物的樣品中的所述分析物，該測定法包括a)提供.1)樣品，'2)在其上固定有化學發光化合物和用於所述分析物的第一特異性結合伴侶的固體支持物，以及3)包含活化劑化合物的活化劑化合物結合物，所述活化劑化合物結合於用於分析-物或者分析物類似物；b)使所述固體支持物與所述樣品和所述活化劑化合物結合物相接觸，以引起所述樣品中的所述分析物和所述活化劑化合物結合物競爭性地結合於所述固定的特異性結合伴侶，其中所述活化劑化合物結合物與所述固定化的特異性結合伴侶的結合使得所述活化劑化合物近似於所述化學發光化合物；c)提供引發劑溶液，以使所述畫定化化學發光化合物與所述結合活化劑化合物之間因發生反應而產生化學發光；d)檢測所述產生的化學發光；以及e)使所述產生的化學發光與所述樣品中所述分析物的存在、位置或含量相關聯。22.—種包含在其上固定有化學發光化合物的固體支持物的材料，所述化學發光化合物包含化學發光部分和連接部分，其中所述化學發光部分選自於下述化合物芳香環狀的二醯基醯it、MCLA、吲哚基醋酸、異丁醛、三羥基芳香化合物、咕噸染料、9，10-二氫化吖啶酯、9,10-二氫化吖啶硫酯、9，10-二氫化吖啶氨磺醯、9,10-二氫化吖啶乙烯酮二硫縮醛類化合^)、具有下述化學式的9，10-二氫化吖啶類化合物其中，R'選自於垸基、烯基、炔基、芳基以及含l-20個碳原子的芳烷基，所述碳原子中的任何一個可以被1-3個選自於羰基、羧基、三(C,-C8烷基)甲矽垸基基團、S(V基團、OSO/2基團、葡糖基基團、P03—基團、OPO戶基團、滷素原子、羥基、硫醇基、氨基團、季銨基團或季鱗基團的基團取代；X選自於C,-C8烷基、芳基、芳垸基、具有l-20個碳原子的烷基或芳基羧基、三(C,-Q垸基)甲矽烷基基團、S03—基團、葡糖基基團和化學式PO(OR')(OR")所示的磷醯基基團、三甲矽烷基團、鹼金屬陽離子、鹼土金屬陽離子、銨以及三垸基轔陽離子，其中R'和R"獨立地選.自於CVQ垸基、氰基烷基、芳基和芳烷基Z'選自於O原子和S原子；W選自於取代或未取代的C,-Q垸基、苯基、苯甲基、烷氧基烷基和羧基烷基基團；所述取代基R7—14中的0個或1個或2個選自於垸基、垸氧基、羥基以及滷素，而R、"中剩餘基團是氫、以及具有下述化學式的化合物其中，R'選自於垸基、烯基、炔基、芳基、以及含l-20個碳原子的芳垸基，所述碳原子中的任何一個可以被1-3個選自於羰基、羧基、三(C廣C8烷基)甲矽烷基基團、S03—基團、OS(V2基團、葡糖基基團、P(V基團、OP03—2基團、滷素原子、羥基、硫醇基、氨基團、季銨基團或季鱗基團的基團取代；X選自於C,-C8垸基、芳基、芳烷基、具有l-20個碳原子的烷基或芳基羧基、三(C,-Cs垸基)甲矽烷基基團、S03—基團、葡糖基基團和化學式PO(OR')(OR")所示的磷醯基基團、三甲矽垸基基團、鹼金屬陽離子、鹼土金屬陽離子、銨以及三烷基轔陽離子，其中R'和R"是獨立地選自於d-C8垸基、氰基烷基、芳基和芳烷基；Z'和？各自選自於O原子和S原子；R^和R獨立地選自幹氫和C;-Cg烷基。23.如權利要求22所述的材料，其特徵在於，所述連接部分包含具有l-20個原子的末端為，CH2-、-O-、-S-、-NH-、-NR-、-SiO醫、-C(=0)-、-OC(=0)-、-C(=0)0-、陽SC(=0)-、-C(=0)S-、-NRC(=0)-、或-C一O)NR-基團的亞烷基鏈、或具有3-30個原子的末端為-CH2-、-O-、-S-、-NH-、-NR-、-SiO-、-C(二O)-、-OC(=0)-、-COO)O-、-SC(=0)-、-C(=0)S-、-NRC(=0)-或-C(=0)NR-基團的聚(亞烷基-氧)鏈，其中R是Cm院基。24.如權利要求22所述的材料，其特徵在於，所述固體支持物選自微孔板、試管、樣品杯、塑料微球、纖維素測試條、紙測試條、塑料測試條、膠乳粒子、聚合物粒子、二氧化矽粒子、金屬膠體以及磁性粒子。25.如權利要求22所述的材料，其特徵在於，所述化學發光化合物共價連接於所述固體支持物。26.如權利要求22所述的材料，其特徵在於，所述化學發光化合物被共價連接於固定在所述固體支持物上的輔助物質。27.如權利要求26所述的材料，其特徵在於，所述輔助物質選自於蛋白質、肽、血清白蛋白、抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、抗體、免疫球蛋白以及合成聚合物。28.如權利要求27所述的材料，其特徵在於，所述輔助物質共價連接於所述固體支持物。29.如權利要求22所述的材料，其特徵在於，還包括至少一種經固定的用於分析物的特異性結合伴侶。30.如權利要求22所述的材料，其特徵在於，還包括至少一種經固定的用於分析物的特異性結合伴侶，其中所述結合伴侶選自於抗體、結合蛋白以及核酸。31.如權利要求22所述的材料，其特徵在於，所述化學發光化合物共價連接於所述固體支持物，所述材料還包括至少一種經固定的用於分析物的特異性結合伴侶，其中所述結合伴7侶選自於抗體、結合蛋白以及核酸。32.—種包含固體支持物的化學發光標記的固體支持物，所述固體支持物被固定在化學發光的9,10-二氫化吖啶乙烯酮二硫縮醛化合物上，其中所述化學發光標記的固體支持物通過固體支持物與具有下述化學式的化合物進行反應而製備其中M是鹼金屬離子。33.如權利要求32所述的化學發光標記的固體支持物，其特徵在於，還包括至少一種經定的用於分析物的特異性結合伴侶，其中所述結合伴侶選自於抗體、結合蛋白以及核酸。34.如權利要求32所述的化學發光標記的固體支持物，其特徵在於，所述固體支持物選自微孔板、試管、樣品杯、塑料微球、纖維素測試條、紙測試條、塑料測試條、膠乳粒子、聚合物粒子、二氧化矽粒子、金屬膠體以及磁性粒子。35.—種包含固體支持物的材料，所述固體支持物上共價固定有化學發光化合物，所述化學發光化合物是過氧化物酶的底物。36.如權利要求35所述的材料，其特徵在於，所述固體支持物選自微孔板、試管、樣品杯、塑料微球、纖維素測試條、紙測試條、塑料測試條、膠乳粒子、聚合物粒子、二氧化矽粒子、金屬膠體以及磁性粒子。37.如權利要求35所述的材料，其特徵在於，所述固體支持物選自微孔板、試管、樣品杯、塑料微球、纖維素測試條、紙測試條、塑料測試條、膠乳粒子、聚合物粒子、二氧4^矽粒子、金屬膠體以及磁性粒子，所述材料還包括至少一種經固定的用於分析物的特異性結合伴侶，其中所述結合伴侶選自於抗體、結合蛋白以及核酸。38.—種固體支持物，其上固定有下述物質1)化學發光化合物，2)對於分析物有特異性結合親合力的特異性結合伴侶；3)特異性地結合於所述特異性結合伴侶的分析物，以及4)活化劑化合物結合物，其包含結合於第二特異性結合伴侶的活化劑化合物，所述第二特異性結合伴侶對於所述分析物具有特異性結合親合力，其中所述活化劑化合物結合物特異性地結合於所述分析物，並且所述結合的活化劑化合物可操作地近似於所述固定化化學發光化合物。39.—種固體支持物，其上固定有下述物質1)化學發光化合物，2)對於分析物有特異性結合親合力的特異性結合伴侶；3)特異性地結合於所述特異性結合伴侶的分析物類似物-活化劑化合物結合物或分析物-活化劑化合物結合物，其中所述結合的活化劑化合物可操作地近似於所述經固定的化學發光化合物。40.如權利要求38所述的固體支持物，其特徵在於，所述固體支持物選自微孔板、試管、樣品杯、塑料微球、纖維素測試條、紙測試條、塑料測試條、膠乳粒子、聚合物粒子、二氧化矽粒子、金屬膠體以及磁性粒子，所述化學發光化合物是過氧化物酶的底物，所述結合伴侶選自抗體、結合蛋白以及核酸，所述活化劑化合物是過氧化物酶，並且當添加包含過氧化物化合物的引發劑溶液時，所述結合的活化劑化合物與所述經固定的化學發光化合物發生反應而產生化學發光。41.如權利要求39所述的固體支持物，其特徵在於，所述固體支持物選自微孔板、試管、樣品杯、塑料微球、纖維素測試條、紙測試條、塑料測試條、膠乳粒子、聚合物粒子、二氧化矽粒子、金屬膠體以及磁性粒子，所述化學發光化合物是過氧化物酶的底物，所述結合伴侶選自抗體、結合蛋白以及核酸，所述活化劑化合物是過氧化物酶，並且當添加包含過氧化物化合物的引發劑溶液時，所述結合的活化劑化合物與所述經固定的化學發光化合物發生反應而產生化學發光。全文摘要公開了與特異性結合反應有關的測定方法，其與已知方法相比更簡單化。能夠產生化學發光的化合物被固定化在固體支持物上，作為用於捕獲樣品中分析物的特異結合性配對成員。可以激活所述化學發光化合物並且被結合於特異結合性配對成員的活化劑化合物被過量地與樣品一起添加至所述固體支持物。在活化劑結合物已經被特異性地結合的位點，引發劑溶液的添加引起化學發光反應。該測定方法被稱為非分離式測定法，因為在檢測步驟之前，不需要除去或者分離過量的檢測標籤(活化劑結合物)。該方法適用於多種類型的測定，包括免疫測定、受體-配體測定和核酸雜交測定。文檔編號G01N21/76GK101490536SQ200780025965公開日2009年7月22日申請日期2007年5月9日優先權日2006年5月9日發明者H·阿哈萬-塔夫狄申請人:貝克曼考爾特公司