一種瓊脂凝膠微球的製備方法
2023-10-04 15:28:19 5
專利名稱：一種瓊脂凝膠微球的製備方法
技術領域：
本發明涉及生物工程的生化分離和細胞及其蛋白載體領域。更具體地說，本發明涉及一種瓊脂凝膠微球的製備方法。
背景技術：
高分子微球是指直徑在納米級至微米級，形狀為球形或其他幾何體的高分子材料。目前以天然高分子等為原料的凝膠微球主要有海藻酸鈉凝膠微球、殼聚糖凝膠微球、葡聚糖凝膠微球和瓊脂糖凝膠微球。其中瓊脂糖凝膠微球主要作為一種色譜介質，用於蛋白質、肽類、核酸、糖類的分離，同時也可作為活細胞或藥物載體。但目前瓊脂糖凝膠的市場價格較為昂貴，如s印harose 6B可售700元/IOOml左右，經過交聯修飾的CM Sepharose CL-6B可售2200 2500元，Superose系和Superdex系的價格更高，一般都上萬元。雖然目前瓊脂糖凝膠介質的製備已較成熟，但受到原料成本及設備要求的限制，所製得的凝膠介質只適用於實驗室小規模使用，無法實現工業化放大。而瓊脂作為提取瓊脂糖的原料，其市場價格只有瓊脂糖的2. 5 4%，如果能以瓊脂為原料製備一種凝膠微球，且能達到與瓊脂糖凝膠微球相當的效果，則可大大降低製備成本，使工業化製備瓊脂糖類凝膠微球成為現實。瓊脂是從海藻中提取的多糖體，含有碳水化合物、鈣與硫酸鹽，具有較好的凝固性和穩定性，並能與一些物質形成穩定的絡合物，是目前世界上用途最廣泛的海藻膠之一。瓊脂主要由瓊脂糖和硫瓊膠組成，瓊脂糖是由D-半乳糖和3，6-內醚-L-半乳糖組成的中性多糖，而硫瓊膠為含有帶負電的硫酸基和羧基的酸性多糖的酯，這些帶負電的基團使瓊脂凝膠微球可直接用於陽離子交換、重金屬離子吸附，以及一些不受電荷影響的產物分離。此外，瓊脂是一種天然多糖，具有生物相容性好，親水性好，可再生，易於修飾配基等優點。因此，瓊脂凝膠微球在酶固定化、細胞培養、藥物載體、蛋白分離、天然產物分離和重金屬離子吸附等方面具有廣泛的應用前景。以瓊脂為原料可以製成瓊脂凝膠裸球和瓊脂凝膠微球。瓊脂凝膠裸球是以瓊脂為原料，採用乳化-冷卻固化法直接製備，包括水相和油相的製備、分散乳化、冷卻固化、洗滌、乾燥幾個步驟。瓊脂凝膠裸球強度較弱，在層析柱內會使流速降低，影響分離速度和分離效能，因而不適合用作分離介質。目前，瓊脂凝膠裸球主要用於製備化妝品或藥物載體。瓊脂凝膠微球主要是以瓊脂凝膠裸球為原料，採用化學交聯法製備，包括瓊脂凝膠裸球的溶脹、化學交聯、洗滌、乾燥幾個步驟。該製備過程也可以直接以瓊脂為原料，將乳化-冷卻固化過程與化學交聯過程進行有機結合，用於製備瓊脂凝膠微球。交聯後製得的瓊脂凝膠微球的機械強度、熱穩定性得到顯著提高，可用於酶固定化、蛋白分離、天然產物分離和重金屬離子吸附等方面。實際應用和製備過程中，根據具體用途和性能要求，通常需要對瓊脂凝膠微球進一步進行功能化配基修飾，以便實現其應用。瓊脂凝膠微球的功能化修飾，可以在瓊脂凝膠裸球製備過程完成後，直接進行活化、交聯和配基修飾；也可以在瓊脂凝膠微球製備過程完
3成後，進行活化和配基修飾。專利US3959251主要是以溶脹的瓊脂凝膠裸球或顆粒為原料，在鹼性及50 90°C 條件下，以雙環氧化合物(如環氧丙烷)、表滷代醇(如環氧滷丙烷)以及二乙烯基碸等為交聯劑進行交聯，反應進行20min 2h，反應過程中持續攪拌，並通過添加硼氫化物等還原劑以及維持無氧環境來避免瓊脂在鹼性條件下發生變色和分解，所製得的瓊脂凝膠微球中瓊脂含量為2 6%。該專利還直接以6%的瓊脂為原料，以含乙酸乙酯的二氯乙烯作穩定劑，在有NaBH4存在的鹼性及75 °C的條件下，採用控制攪拌的方法製成粒徑為50 250 μ m 的瓊脂凝膠裸球，然後在60°C條件下繼續前述的交聯反應以完成瓊脂凝膠微球的製備。該專利在室溫及鹼性條件下，用溴化氰對溶脹的脫硫瓊脂凝膠微球活化處理6 9min，再在碳酸氫鈉溶液中與半刀豆球蛋白A、核糖核酸酶A等反應，將蛋白質固定在瓊脂凝膠微球上，實現瓊脂凝膠微球的功能化修飾。王為超等人，「瓊脂凝膠球載體吸附劑清除免疫球蛋白E的性能特徵，[J],中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(1) 90 94」，將制好的6%的瓊脂溶液，趁熱緩慢傾倒於由甲苯/三氯甲烷混合溶液及少量吐溫80製成的油相中，油相與水相的體積比為2 1， 持續攪拌，60°C條件下保溫3 5min，室溫下自然冷卻，將所製得的產物用水洗淨並篩選出 20 40目的瓊脂凝膠裸球，加入溼態瓊脂凝膠裸球體積0. 4倍量的環氧氯丙烷，在鹼性及 40°C條件下，恆溫震蕩2.證，用水洗淨，完成瓊脂凝膠裸球的交聯及活化，活化瓊脂凝膠微球鍵聯配基色氨酸及手臂製得免疫球蛋白E的免疫吸附劑。從國內外報導來看，關於瓊脂凝膠微球的研究，多數是將之作為一種吸附基質或載體材料，而將其用作分離介質則由於受到凝膠微球機械強度和粒徑的限制很難實現。目前提高瓊脂凝膠微球機械強度的方法主要是化學交聯法，交聯後的瓊脂凝膠微球機械強度有較大程度的提高，但是由於凝膠微球中瓊脂含量較低(一般為2 6wt% )，交聯後的瓊脂凝膠微球用作分離介質其強度仍然不夠理想，要進一步提高瓊脂凝膠微球的機械強度只能通過增大凝膠微球中瓊脂含量來實現。製備瓊脂凝膠裸球的乳化-冷卻固化過程是增大瓊脂凝膠微球中瓊脂含量的關鍵步驟。目前該過程主要是採用機械攪拌乳化-冷卻固化法，用該方法製備的瓊脂凝膠裸球中的瓊脂含量均低於6wt%，當微球中瓊脂含量大於6wt%時，由於濃度增大導致水相粘度遽增，致使水相很難均勻的分散到油相中形成均一的乳液，同時已形成的液滴也容易發生聚集使乳液不均勻，因此以目前的機械攪拌乳化-冷卻技術很難製得粒徑小且分布均一的瓊脂凝膠裸球。除上述問題外，現有的機械攪拌乳化-冷卻固化過程還存在乳化分散過程中不能控制液滴粒徑，致使最終固化後得到的瓊脂凝膠裸球粒徑不均一的問題。凝膠微球粒徑不均一，用作分離介質時，小的凝膠微球會進入大的凝膠微球之間的空隙中，致使分離壓力增大，嚴重時導致分離無法進行。為得到粒徑較為均一的分離介質，可以在瓊脂凝膠裸球交聯反應前後對其進行篩分，這不但會造成原材料的浪費和生產成本的提高，也會增加操作複雜性。採用超聲、機械攪拌、均質乳化等普通乳化-冷卻固化法以及噴射-冷卻固化法的瓊脂糖凝膠微球的製備過程也存在同樣的問題。專利CN1640539A採用膜乳化-冷卻固化法解決上述問題。該專利將加熱條件下配製成的0. 1 20wt%的瓊脂糖溶液作為水相用壓
4力通過微孔膜壓入油相中，並將所得到的尺寸均一的乳滴轉入到冷卻裝置中，在IOOrmp的機械攪拌條件下，採用程序降溫法冷卻到15°C以下固化製得瓊脂糖含量大於6%的尺寸均一的瓊脂糖凝膠微球，其粒徑在1 IOOym可控。該專利技術對膜要求很高，並需要增加若干配套設備，操作過程複雜，對設備要求高，生產成本也較高，難以實現工業化生產。因此，針對目前存在的問題，有必要開發一種製備過程簡單、對設備要求不高、耗能低，並且所製得的產品中瓊脂含量大於6%，機械強度高、凝膠微球粒徑均一，且粒徑可控的瓊脂凝膠微球製備方法，用以製備成本低廉，分離性能良好的色譜介質用瓊脂凝膠微球。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種瓊脂凝膠微球的製備方法，該方法以簡單的操作過程和工藝設備，製備出瓊脂含量為4 20wt%，呈規則球形，粒徑均一，且粒徑在1 900 μ m範圍內可控的瓊脂凝膠微球，該瓊脂微球機械強度好、熱穩定性高、可再生性強，且成本低廉，可用作分離介質。為了實現上述目的，一種瓊脂凝膠微球的製備方法，包括步驟A，將瓊脂溶於水製成水相W，其中水相中瓊脂的含量為4 20wt% ；步驟B，將油溶性表面活性劑溶於與水互不相容的有機溶劑中製成油相0，其中在油相中含有體積比為10 20%的油溶性表面活性劑；步驟C，將水相加入油相進行分散乳化得到W/0型乳滴，其中油相與水相的體積比為 1 1 10 1;步驟D，W/0型乳滴經冷卻固化得到瓊脂凝膠裸球；步驟E，瓊脂凝膠裸球經化學交聯得到瓊脂凝膠微球。在本發明的一個優選實施例中，步驟A所述的水相中瓊脂的含量為6 12wt %，優選為8 12wt%。步驟C中所述的油相與水相的體積比為1. 5 1 5 1。油相中與水互不相容的有機溶劑常溫下呈液態，如環己烷、庚烷、苯、甲苯、二甲苯等。油溶性表面活性劑為能迅速降低油水界面張力的非離子型共聚物，如失水山梨醇三油酸酯(司班85)、失水山梨醇單油酸酯(司班80)、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯(吐溫80)寸。步驟C通過均質乳化器進行分散乳化，其中均質乳化器的起始轉速為500 6000rpm，最終轉速為1000 IOOOOrpm，反應過程中均質乳化器的轉速維持穩定增長。乳化反應時間為1 30min。乳化反應溫度為50 80°C，優選為55 75°C。冷卻固化過程可根據所需孔徑的大小選擇自然冷卻或迅速冷卻的降溫方式。步驟 D中均質乳化器的轉速維持在1000 lOOOOrpm。步驟E包括在鹼性條件下，以環氧氯丙烷作交聯劑，將瓊脂凝膠裸球進行交聯，交聯反應溫度為25 60°C，濃度為20 60wt %的NaOH的加入量為瓊脂凝膠體積量的0. 3 0. 8倍，優選為0. 4 0. 7倍。環氧氯丙烷的加入量為瓊脂凝膠體積量的0. 45 0. 9倍，優選為0. 5 0. 8倍。為防止反應過程中瓊脂變色和水解，上述交聯反應是在0. 08 0. 25g/ ml Na2SO4和0· 005 0. 02g/ml NaBH4存在條件下進行的。在本發明的一個優選的實施例中，將用上述方法制好的瓊脂凝膠裸球用水和50% 乙醇交替洗淨後，與體積量是凝膠體積量0. 5 2倍的蒸餾水混合，加入0. 08 0. 25g/ml Na2SO4,在25 40°C條件下攪拌溶解，然後加入體積量是凝膠體積量0. 01 0. 05倍的20 60wt% NaOH 和 0. 005 0. 02g/ml NaBH4,接著以 0. 01 0. 5ml/min 的速率加入 20 60%NaOH，並同時以0. 05 0. 5ml/min速率加入環氧氯丙烷，持續攪拌1 2 後，增加水浴溫度至45 70°C，並持續攪拌10 30h後，冷卻至室溫，加入體積量是凝膠體積量0. 5 3 倍的蒸餾水後，用10 90% (體積比)醋酸調節pH至3 10。最後用去離子水和50%乙醇交替洗淨後，保存在20 %乙醇中。根據本發明的瓊脂凝膠微球的製備方法還包括步驟F，交聯後瓊脂凝膠微球的配基修飾，修飾瓊脂凝膠微球的配基為多糖類、烷基類、羥基類、胺基類、羧基類、磺酸基類物質中的一種或幾種。在一個本發明的實施例中，採用由加熱釜、乳化-固化反應釜、交聯修飾反應釜構成的乳化-固化反應裝置製備瓊脂凝膠微球，其中加熱釜可實現邊加熱邊放液，且放液的速度可控；乳化-固化反應釜具有高速乳化裝置，且其溫度在0 100°C溫度範圍內可控。根據本發明方法製備的瓊脂凝膠微球呈規則球形，以瓊脂凝膠微球總重量計，微球中瓊脂含量為4 20wt%，優選為6 12wt%，更優選為8 12wt%。所述的瓊脂凝膠微球的粒徑在1 900 μ m範圍內可控，且粒徑上下差值不超過150 μ m的瓊脂凝膠微球體積分數大於65%。根據本發明方法，以價格低廉的瓊脂為原料製備瓊脂凝膠裸球，可以通過調節溫度、油相中表面活性劑的濃度、油相與水相的體積比、起始轉速、最終轉速和乳化時間，實現對所製備的瓊脂凝膠微球的粒徑及其均一性的控制；在轉速控制過程中，維持轉速的穩定增長，可以很好的改善瓊脂凝膠微球的均一性，使所製得的瓊脂凝膠微球的粒徑分布在較窄的範圍內；在降溫過程中採取不同的降溫方式可以獲得不同孔徑的微球，採用自然冷卻的方式可得到孔徑較大的微球，採用迅速冷卻的方式可得到孔徑較小的微球。與現有製備瓊脂糖凝膠微球的技術相比，根據本發明方法製得的瓊脂凝膠微球， 其明顯的優點是凝膠微球呈規則球形，具有較窄的粒徑分布，粒徑在1 900 μ m範圍內可控；同時，以本發明方法製得的瓊脂凝膠微球中瓊脂的濃度為4 20wt%，該凝膠微球具有機械強度好、熱穩定性強、可再生等優點，可作為一種色譜介質，用於生化分離。瓊脂本身帶有負電基團，使其可直接用於陽離子交換或重金屬離子吸附，同時可用於一些不受電荷影響的產物分離；此外，瓊脂目前的市場價格只有瓊脂糖價格的2. 5 4%，因此採用本發明方法製備瓊脂凝膠微球，生產成本大大降低，且製備過程簡單，對設備要求不高，耗能低，易於實現工業化生產。瓊脂凝膠微球的製備方法可採用由加熱釜、乳化-固化反應釜、交聯修飾反應釜構成的乳化-固化反應裝置進行製備。
圖1為實施例1中製備的瓊脂凝膠裸球的光學顯微照片(放大倍數為400倍)。圖2為實施例1中製備的瓊脂凝膠裸球的粒徑分布曲線。圖3為實施例1中製備10%瓊脂凝膠微球的壓力-流速曲線。圖4為實施例10中用寡聚環糊精修飾後的瓊脂凝膠柱分離葛根粗品的色譜圖。
具體實施例方式下面將結合實施例和附圖來詳細說明本發明，這些實施例和附圖僅起說明性作用，並不局限於本發明的應用範圍。
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實施例實施例1 通過加熱的方式製備200ml IOwt%的瓊脂水溶液，在溫度為70°C，初始攪拌轉速為4500rpm的條件下，將瓊脂水溶液趁熱緩慢加入到600ml由84v%的環己烷和16v%司班 85按混合組成的油相中。在乳化過程中，調節增加攪拌轉速，使最終攪拌轉速為SOOOrpm， 持續攪拌15min，然後採用程序降溫的方式使乳液冷卻至室溫，冷卻過程中保持最終攪拌速度。將製得的瓊脂凝膠裸球先後用水、50%乙醇、水洗淨，採用OLYMPUS CX41(奧林巴斯有限公司,日本)光學顯微鏡觀察產品形態，結果如圖1所示；採用MASTERSUER 2000雷射粒度分析儀(馬爾文儀器公司，英國)分析產品的粒度，結果如圖2所示。從圖1中的光學顯微照片(放大倍數為400倍)可以看出，按上述方法製備出的10%瓊脂凝膠裸球球形規則， 粒徑分布均一；圖2中的粒徑分布曲線顯示按上述方法製備出的10%瓊脂凝膠裸球粒徑範圍在45 160 μ m的凝膠裸球的體積分數為88. 5%。取200ml凝膠裸球，加入MOml蒸餾水後，放入35°C的水浴中，在160rpm的攪拌轉速下，加入 28. Og Na2SO4,溶解 l.Oh，然後加入 anl 50% NaOH 和 2. 8g NaBH4,接著以 0. Iml/ min的速率加入96ml 50%的氫氧化鈉和140ml環氧氯丙烷。增加水浴溫度至50°C，並持續攪拌20h後，冷卻至室溫，再加入400ml蒸餾水，用60%醋酸調節pH至5 6。最後先後用水、50%乙醇、水洗淨凝膠微球，保存在20%乙醇中，所製得的10%瓊脂凝膠微球粒徑分布與對應的瓊脂凝膠裸球相同。將瓊脂凝膠微球放入高壓蒸汽滅菌鍋內進行高溫處理(121°C，25min)後，凝膠微球的球形不發生任何破壞。將製得的10%瓊脂凝膠微球粒裝入300X IOmm的凝膠色譜柱中，考察其壓力與流速的關係，結果如圖3所示。從圖3中的壓力-流速曲線可以看出，當流速從0. lml/min增加到0. 9ml/min時，柱壓僅增加了約0. IMPa，說明根據本發明方法製得的瓊脂凝膠微球球形規則，分布均一，在分離過程中產生的柱壓較小，有利於工業化放大分離。實施例2 製備與實施例1相同的瓊脂水溶液，在溫度為72°C，初始攪拌轉速為5000rpm的條件下，將瓊脂水溶液趁熱緩慢加入到800ml由82v%的環己烷和18v%司班85混合組成的油相中。在乳化過程中，調節增加攪拌轉速，使最終攪拌轉速為9500rpm，持續攪拌20min， 製得的產品採用與實施例1相同的方法冷卻、洗淨，並觀察產品形態、分析產品粒度。結果表明，按此方法製備出的10%瓊脂凝膠裸球球形規則，粒徑範圍在30 90 μ m的凝膠裸球的體積分數為81.2%。瓊脂凝膠裸球的交聯過程與實施例1不同的是攪拌轉速為180rpm，Na2SO4用量為 32g，NaBH4用量為3. 2g，50% NaOH總加入量為130ml，環氧氯丙烷加入量為160ml，其他反應條件與實施例1相同，所製得的10%瓊脂凝膠微球粒徑分布與對應的瓊脂凝膠裸球相同。將瓊脂凝膠微球放入高壓蒸汽滅菌鍋內進行高溫處理(12rC，25min)後，凝膠微球的球形不發生任何破壞。實施例3 製備與實施例1相同的瓊脂水溶液，在溫度為68°C，初始攪拌轉速為1 IOOrpm的條件下，將瓊脂水溶液趁熱緩慢加入到400ml由86v%的環己烷和14v%司班85混合組成的油相中。在乳化過程中，調節增加攪拌轉速，使最終攪拌轉速為ISOOrpm，持續攪拌25min， 製得的產品採用與實施例1相同的方法冷卻、洗淨，並觀察產品形態、分析產品粒度。結果表明，按此方法製備出的10%瓊脂凝膠裸球球形規則，粒徑範圍在450 600 μ m的凝膠裸球的體積分數為80.5%。瓊脂凝膠裸球的交聯過程與實施例1不同的是攪拌轉速為140rpm，Na2SO4用量為 24g, NaBH4用量為2. 4g，50 % NaOH總加入量為90ml，環氧氯丙烷加入量為120ml，其他反應條件與實施例1相同，所製得的10%瓊脂凝膠微球粒徑分布與對應的瓊脂凝膠裸球相同。將交聯後的瓊脂凝膠微球放入高壓蒸汽滅菌鍋內進行高溫處理(12rC，25min) 後，凝膠微球的球形不發生任何破壞。實施例4 採用與實施例1相同的方式製備12%的瓊脂水溶液，在溫度為75°C，初始攪拌轉速為6000rpm的條件下，將瓊脂水溶液趁熱緩慢加入到IOOOml由80v %的環己烷和 20v%司班85混合組成的油相中。在乳化過程中，調節增加攪拌轉速，使最終攪拌轉速為 IOOOOrpm，持續攪拌30min，製得的產品採用與實施例1相同的方法冷卻、洗淨，並觀察產品形態、分析產品粒度。結果表明，按此方法製備出的12%瓊脂凝膠裸球球形規則，粒徑範圍在150 250 μ m的凝膠裸球的體積分數為80. 2%。瓊脂凝膠裸球的交聯過程與實施例1不同的是將凝膠裸球加入蒸餾水後，放入 30°C水浴中，攪拌轉速為200rpm，Na2SO4用量為36g，NaBH4用量為3. 6g,50% NaOH總加入量為140ml，環氧氯丙烷加入量為160ml，增加水浴溫度至70°C，其他反應條件與實施例1相同，所製得的12 %瓊脂凝膠微球粒徑分布與對應的瓊脂凝膠裸球相同。將交聯後的瓊脂凝膠微球放入高壓蒸汽滅菌鍋內進行高溫處理(12rC，25min) 後，凝膠微球的球形不發生任何破壞。實施例5 採用與實施例1相同的方式製備15%的瓊脂水溶液，在溫度為80°C，初始攪拌轉速為6000rpm的條件下，將瓊脂水溶液趁熱緩慢加入到1600ml由80v %的環己烷和 20v%司班80混合組成的油相中。在乳化過程中，調節增加攪拌轉速，使最終攪拌轉速為 IOOOOrpm，持續攪拌20min，製得的產品採用與實施例1相同的方法冷卻、洗淨，並觀察產品形態、分析產品粒度。結果表明，按此方法製備出的15%瓊脂凝膠裸球球形規則，粒徑範圍在300 400 μ m的凝膠裸球的體積分數為65. 4%。瓊脂凝膠裸球的交聯過程與實施例1不同的是將凝膠裸球加入蒸餾水後，放入 30°C水浴中，攪拌轉速為200rpm，Na2SO4用量為40g，NaBH4用量為4. Og,50% NaOH總加入量為160ml，環氧氯丙烷加入量為180ml，增加水浴溫度至70°C，其他反應條件與實施例1相同，所製得的15 %瓊脂凝膠微球粒徑分布與對應的瓊脂凝膠裸球相同。將交聯後的瓊脂凝膠微球放入高壓蒸汽滅菌鍋內進行高溫處理(12rC，25min) 後，凝膠微球的球形不發生任何破壞。實施例6 採用與實施例1相同的方式製備20%的瓊脂水溶液，在溫度為80°C，初始攪拌轉速為6000rpm的條件下，將瓊脂水溶液趁熱緩慢加入到2000ml由80v %的環己烷和 20v%司班80混合組成的油相中。在乳化過程中，調節增加攪拌轉速，使最終攪拌轉速為IOOOOrpm，持續攪拌15min，製得的產品採用與實施例1相同的方法冷卻、洗淨，並觀察產品形態、分析產品粒度。結果表明，按此方法製備出的20%瓊脂凝膠裸球球形規則，粒徑範圍在500 μ m以上的凝膠裸球的體積分數為65. 3%。瓊脂凝膠裸球的交聯過程與實施例1不同的是將凝膠裸球加入蒸餾水後，放入 30°C水浴中，攪拌轉速為200rpm，Na2SO4用量為50g，NaBH4用量為4. Og,50% NaOH總加入量為160ml，環氧氯丙烷加入量為180ml，增加水浴溫度至70°C，其他反應條件與實施例1相同，所製得的20 %瓊脂凝膠微球粒徑分布與對應的瓊脂凝膠裸球相同。將交聯後的瓊脂凝膠微球放入高壓蒸汽滅菌鍋內進行高溫處理(12rC，25min) 後，凝膠微球的球形不發生任何破壞。實施例7 採用與實施例1相同的方式製備8%的瓊脂水溶液，在溫度為65°C，初始攪拌轉速為IOOOrpm的條件下，將瓊脂水溶液趁熱緩慢加入到300ml由86v%的環己烷和14v%司班85混合組成的油相中。在乳化過程中，調節增加攪拌轉速，使最終攪拌轉速為1500rpm， 持續攪拌lOmin，製得的產品採用與實施例1相同的方法冷卻、洗淨，並觀察產品形態、分析產品粒度。結果表明，按此方法製備出的8%瓊脂凝膠裸球球形規則，粒徑範圍在100 250 μ m的凝膠裸球的體積分數為80. 2%。瓊脂凝膠裸球的交聯過程與實施例1不同的是將凝膠裸球加入蒸餾水後，放入 25°C水浴中，攪拌轉速為120rpm, Na2SO4用量為20g, NaBH4的用量為2. Og, 50% NaOH總加入量為80ml，環氧氯丙烷加入量為100ml，增加水浴溫度至45°C，其他反應條件與實施例1 相同，所製得的8 %瓊脂凝膠微球粒徑分布與對應的瓊脂凝膠裸球相同。 將交聯後的瓊脂凝膠微球放入高壓蒸汽滅菌鍋內進行高溫處理(121°C，25min) 後，凝膠微球的球形不發生任何破壞。實施例8 採用與實施例1相同的方式製備6 %的瓊脂水溶液，在溫度為55°C，初始攪拌轉速為800rpm的條件下，將瓊脂水溶液趁熱緩慢加入到300ml由88v%的環己烷和12v%吐溫80混合組成的油相中。在乳化過程中，調節增加攪拌轉速，使最終攪拌轉速為1200rpm， 持續攪拌5min，製得的產品採用與實施例1相同的方法冷卻、洗淨，並觀察產品形態、分析產品粒度。結果表明，按此方法製備出的6%瓊脂凝膠裸球球形規則，粒徑範圍在150 250 μ m的凝膠裸球的體積分數為76. 8%。瓊脂凝膠裸球的交聯過程與實施例1不同的是將凝膠裸球加入蒸餾水後，放入 25°C水浴中，攪拌轉速為120rpm, Na2SO4用量為16. Og, NaBH4的用量為1. 6g,50% NaOH總加入量為60ml，環氧氯丙烷加入量為90ml，增加水浴溫度至45°C，其他反應條件與實施例1 相同，所製得的6%瓊脂凝膠微球粒徑分布與對應的瓊脂凝膠裸球相同。將交聯後的瓊脂凝膠微球放入高壓蒸汽滅菌鍋內進行高溫處理(12rC，25min) 後，凝膠微球的球形不發生任何破壞。實施例9 採用與實施例1相同的方式製備4%的瓊脂水溶液，在溫度為50°C，初始攪拌轉速為500rpm的條件下，將瓊脂水溶液趁熱緩慢加入到200ml由90v%的環己烷和10v%吐溫80混合組成的油相中。在乳化過程中，調節增加攪拌轉速，使最終攪拌轉速為lOOOrpm，
9持續攪拌lmin，製得的產品採用與實施例1相同的方法冷卻、洗淨，並觀察產品形態、分析產品粒度。結果表明，按此方法製備出的4%瓊脂凝膠裸球球形規則，粒徑範圍在100 200 μ m的凝膠裸球的體積分數為75. 8%。瓊脂凝膠裸球的交聯過程與實施例1不同的是將凝膠裸球加入蒸餾水後，放入 25°C水浴中，攪拌轉速為IOOrpm, Na2SO4用量為16. 0g, NaBH4的用量為1. Og,50% NaOH總加入量為60ml，環氧氯丙烷加入量為90ml，增加水浴溫度至45°C，其他反應條件與實施例1 相同，所製得的4%瓊脂凝膠微球粒徑分布與對應的瓊脂凝膠裸球相同。將交聯後的瓊脂凝膠微球放入高壓蒸汽滅菌鍋內進行高溫處理(12rC，25min) 後，凝膠微球的球形不發生任何破壞。實施例10 (1)寡聚環糊精(poly-β-Ο))的製備。將95ml 50%的NaOH,95ml水和0. 2g NaBH4混合後加入90g β -環糊精，在轉速為500rpm條件下持續攪拌12h。然後加入30ml水，以降低反應液的黏度，接著加入62. 5ml 環氧氯丙烷，在30°C，IOOOrpm條件下攪拌4h。接著加入IOOml丙酮以終止反應，然後用 6mol/L的HCl調節pH至12左右。然後升高溫度至50°C，攪拌6h後，用lmol/L的HCl調節PH至7。將反應液過夜後，加入3倍體積蒸餾水稀釋後，用分子量為3000和10000的超濾膜除去反應液中分子量大於10000的大分子和分子量小於3000的小分子，將剩餘的溶液乾燥、粉碎，製得寡聚環糊精。(2) poly- β -CD-agar 凝膠柱的製備將實施例1中製備的10%瓊脂凝膠用100目和250目的金屬篩篩選後，得到60 150 μ m範圍內的瓊脂凝膠微球。取出25ml篩選後的瓊脂凝膠微球，用上述過程製備的寡聚環糊精對其進行修飾，其方法如下在25ml瓊脂凝膠微球中加入2g寡聚環糊精和35ml水，在35°C，200rpm條件下加 Λ 3. 875g Na2SO4攪拌溶解lh，然後加入Iml 50% NaOH和0. 3g NaBH4,接著分別以7ml/h 和9ml/h的速率加入50% NaOH和環氧氯丙烷，持續滴加105min後，升高溫度至50°C，攪拌 18h後，加入50ml水，用60% HAc調節pH至5 6。最後用50%乙醇和水交替洗淨後，將製得的poly- β -CD-agar凝膠裝入300 X IOmm的凝膠色譜柱中。(3)將上述poly- β -⑶-agar凝膠柱用於葛根粗品的分離。分離結果如圖4，其分離條件為流動相-0 68min :0. 5%醋酸，68 Iianin 體積比為1 1的甲醇和0. 5%醋酸的混合溶液，112min以後0. 5%醋酸；流速-lml/min ；樣品-2mg/ml的葛根粗品；上樣量-300 μ L。從圖4可以看出，採用10% poly- β -CD-agar凝膠柱對葛根粗品中的葛根素能實現很好的分離。對比例1 與實施例1不同的是，將瓊脂水溶液趁熱緩慢加入到200ml由94v%的環己烷和 6v%司班85混合組成的油相中，反應過程中的初始攪拌轉速為SOOrmp，最終攪拌轉速為 1500rmp，其他反應條件與實施例1相同，製得的產品採用與實施例1相同的方法洗淨，並觀察產品形態、分析產品粒度。結果表明，按此方法進行製備，瓊脂凝膠不成球，產品大小分布不均勻。對比例2:
與實施例1不同的是，將瓊脂水溶液趁熱緩慢加入到400ml由92v%的環己烷和 8v%司班85混合組成的油相中，反應過程中維持攪拌轉速為1500rmp，其他反應條件與實施例1相同，製得的產品採用與實施例1相同的方法洗淨，並觀察產品形態、分析產品粒度。 結果表明，按此方法製備，瓊脂凝膠部分成球，球形不規則，分布不均一。由實施例1、對比例1和對比例2可以看出，當增加油相與水相的體積比、油相中表面活性劑濃度以及起始轉速等條件時，可以增加瓊脂凝膠的成球率。
權利要求
1.一種瓊脂凝膠微球的製備方法，包括步驟A，將瓊脂溶於水製成水相W，其中水相中瓊脂的含量為4 20wt % ；步驟B，將油溶性表面活性劑溶於與水互不相容的有機溶劑中製成油相0，其中在油相中含有體積比為10 20%的油溶性表面活性劑；步驟C，將水相加入油相進行分散乳化得到W/0型乳滴，其中油相與水相的體積比為1 1 10 1;步驟0， W/0型乳滴經冷卻固化得到瓊脂凝膠裸球；步驟E，瓊脂凝膠裸球經化學交聯得到瓊脂凝膠微球。
2.根據權利要求1所述的瓊脂凝膠微球的製備方法，其特徵在於步驟A所述的水相中瓊脂的含量為6 12wt%，優選為8 12wt%。
3.根據權利要求1或2所述的瓊脂凝膠微球的製備方法，其特徵在於步驟C中油相與水相的體積比為1.5 1 5 1。
4.根據權利要求1 3中任意一項所述的瓊脂凝膠微球的製備方法，其特徵在於 步驟C中水相與油相通過均質乳化器進行乳化，其中均質乳化器的起始轉速為500 6000rpm，最終轉速為1000 lOOOOrpm，反應過程中均質乳化器的轉速維持穩定增長。
5.根據權利要求4所述的瓊脂凝膠微球的製備方法，其特徵在於乳化反應時間為 1 30mino
6.根據權利要求1所述的瓊脂凝膠微球的製備方法，其特徵在於步驟D中均質乳化器的轉速維持在1000 lOOOOrpm。
7.根據權利要求1所述的瓊脂凝膠微球的製備方法，其特徵在於步驟E包括在鹼性條件下，以環氧氯丙烷作交聯劑，將瓊脂凝膠裸球進行交聯，交聯反應溫度為25 60°C，濃度為20 60wt%的NaOH的加入量為瓊脂凝膠體積量的0. 3 0. 8倍，環氧氯丙烷的加入量為瓊脂凝膠體積量的0. 45 0. 9倍。
8.根據權利要求1所述的瓊脂凝膠微球的製備方法，其特徵在於瓊脂凝膠微球的製備方法還包括步驟F，交聯後瓊脂凝膠微球的配基修飾，修飾瓊脂凝膠微球的配基為多糖類、烷基類、羥基類、胺基類、羧基類、磺酸基類物質中的一種或幾種。
9.一種根據權利要求1 7中任意一項所述的製備方法製備的瓊脂凝膠微球，其特徵在於所述瓊脂凝膠微球呈規則球形，以瓊脂凝膠微球總重量計，微球中瓊脂含量為4 20wt%，優選為6 12wt%，更優選為8 12wt%。
10.根據權利要求8或9所述的瓊脂凝膠微球，其特徵在於所述的瓊脂凝膠微球的粒徑在1 900 μ m範圍內可控，且粒徑上下差值不超過150 μ m的瓊脂凝膠微球體積分數大於 65%。
全文摘要
本發明涉及一種瓊脂凝膠微球的製備方法，該方法以瓊脂為原料，經油相和水相的製備、分散乳化、冷卻固化、交聯以及配基修飾過程製得瓊脂含量為4～20wt％的呈規則球形，粒徑均一，且在1～900μm範圍內可控的瓊脂凝膠微球，該瓊脂凝膠微球機械強度好、熱穩定性高、可再生性強，且成本低廉，可用作分離介質。該方法操作過程簡單，對設備要求低，耗能少，能實現工業化製備。
文檔編號B01J13/02GK102389755SQ20111022032
公開日2012年3月28日 申請日期2011年8月2日 優先權日2011年8月2日
發明者楊自信, 胡瑜, 譚天偉, 陳豔敏, 魏軍 申請人:北京化工大學