甘磷酸膽鹼中雜質的檢測方法

2023-10-17 09:35:29

甘磷酸膽鹼中雜質的檢測方法
【專利摘要】本發明以摩爾濃度為0.0005～0.002mol/L的甲酸銨溶液和乙腈的混合溶液作為流動相A，以摩爾濃度為0.03～0.05mol/L的甲酸銨溶液和乙腈的混合溶液作為流動相B，採用二元梯度洗脫程序，對甘磷酸膽鹼待測樣品溶液進行第一液相色譜檢測，得到雜質甘油、氯化膽鹼和甘油磷脂醯肌醇的含量；採用乙腈和水做為流動相，對甘磷酸膽鹼待測樣品進行第二液相色譜檢測，得到雜質甘油磷脂醯乙醇胺的含量。本發明提供的檢測方法可針對不同的雜質建立了不同的色譜條件進行檢測，從而得到全部已知雜質的含量，避免了僅測定部分雜質就判斷甘磷酸膽鹼質量的片面性，實現了全面、有效的監控甘磷酸膽鹼質量的目的。
【專利說明】甘磷酸膽鹼中雜質的檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於藥物分析領域，尤其涉及甘磷酸膽鹼中雜質的檢測方法。

【背景技術】
[0002] 老年痴呆症是一種漸進性神經退化性失調症，其主要表現為記憶功能衰減及識別 能力障礙，同時伴有各種神經症狀和行為障礙。研究發現，我國老年痴呆症發病率居高不 下，其中65歲老人中明顯痴呆者佔2%?5%，而85歲以上的老人中幾乎一半患有不同程 度的老年痴呆症。隨著世界人口老齡化速度的加快，老年痴呆症已成為危及老年人生命的 第四大病因，嚴重影響了老年人的身體健康和生活質量。因此，抗痴呆症藥物的研究與開發 引起了世界各國醫藥界的高度重視。
[0003] 研究表明，老年痴呆症的發病機制與神經遞質乙醯膽鹼的缺乏密切相關，如果能 夠提高腦內乙醯膽鹼的水平，就可以改善老年痴呆的症狀。甘磷酸膽鹼能夠穿過血腦屏障， 為乙醯膽鹼的合成提供必要的膽鹼源，促使乙醯膽鹼的合成，增加了腦內神經突觸間的乙 醯膽鹼的含量，從而將海馬區、腦皮質和杏仁體與基底前腦區相聯繫，延長膽鹼能受體的作 用，達到治療老年痴呆症的目的。甘磷酸膽鹼在治療老年痴呆症方面療效顯著，副作用少， 並且具有良好的耐受性和安全性，是一種非常具有市場前景的藥物。
[0004] 但是，甘磷酸膽鹼在生產及儲存的過程中，由於不同的工藝因素和環境因素（如 溫度、氧化和光照等）的影響，有可能會產生一些雜質，會直接影響藥品的質量，所以，需要 一種分析方法，能夠對甘磷酸膽鹼中各種雜質的種類及含量進行檢測，從而達到控制甘磷 酸膽鹼質量的目的。目前還沒有能夠有效檢測甘磷酸膽鹼中雜質的方法。


【發明內容】

[0005] 本發明目的在於提供甘磷酸膽鹼中雜質的檢測方法，本發明提供的甘磷酸膽鹼中 雜質的檢測方法能夠有效檢測出甘磷酸膽鹼中的雜質及其含量，實現控制甘磷酸膽鹼質量 的目的。
[0006] 本發明提供甘磷酸膽鹼中雜質的檢測方法，包括以下步驟：
[0007] 將甘磷酸膽鹼待測樣品溶液進行第一液相色譜檢測，得到甘磷酸膽鹼待測樣品溶 液的第一液相色譜圖；
[0008] 所述第一液相色譜檢測的流動相包括流動相A和流動相B;所述流動相A包括第 一甲酸銨溶液和乙腈，所述第一甲酸銨溶液的摩爾濃度為〇. 0005?0. 002mol/L，所述第一 甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（1?10) : (99?90);
[0009] 所述流動相B包括第二甲酸銨溶液和乙腈，所述第二甲酸銨溶液的摩爾濃度為 0? 03?0? 05mol/L，所述第二甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（35?45) : (65?55);
[0010] 根據所述第一液相色譜圖與預定的標準樣品溶液的第一標準曲線，得到甘磷酸膽 鹼待測樣品中第一雜質的含量，所述第一雜質包括甘油、氯化膽鹼和甘油磷脂醯肌醇；
[0011] 將甘磷酸膽鹼待測樣品溶液進行第二液相色譜檢測，得到甘磷酸膽鹼待測樣品溶 液的第二液相色譜圖，所述第二液相色譜的流動相包括乙腈和水，所述乙腈和水的體積比 為（72 ?78) : (28 ?22);
[0012] 根據所述第二液相色譜圖與預定的標準樣品溶液的第二標準曲線，得到甘磷酸膽 鹼待測樣品中第二雜質的含量，所述第二雜質包括甘油磷脂醯乙醇胺。
[0013] 優選的，所述第一液相色譜檢測中的色譜柱為陽離子交換柱；
[0014] 所述第一液相色譜檢測色譜柱的柱溫為20?30°C;
[0015] 優選的，所述第一液相色譜檢測中流動相A的流速為0. 95?1. 05mL/min;
[0016] 所述流動相B的流速為0? 95?1. 05mL/min。
[0017] 優選的，所述第一液相色譜檢測採用梯度洗脫程序；
[0018] 所述梯度洗脫程序為：
[0019] 在< 35min內，流動相A與流動相B的體積比為（93?97) : (7?3);
[0020] 在彡35且< 65min內，流動相A與流動相B的體積比為（45?55) : (55?45);
[0021] 在彡65且< 70min內，流動相A與流動相B的體積比為（35?44) : (65?56);
[0022] 在彡70且< 120min內，流動相A與流動相B的體積比為（0?5) : (100?95)。
[0023] 優選的，所述流動相A的pH值為2. 0?4. 0 ;
[0024] 所述流動相B的pH值為4. 0?6. 0。
[0025] 優選的，所述第二液相色譜檢測中流動相的流速為0. 95?1. 05mL/min。
[0026] 優選的，所述第二液相色譜檢測中流動相的pH值為2. 0?4. 0。
[0027] 優選的，所述第二液相色譜檢測中的色譜柱為氨基鍵合矽膠色譜柱；
[0028] 所述第二液相色譜檢測中色譜柱的柱溫為20?40°C。
[0029] 優選的，所述第一液相色譜檢測的檢測器為蒸發光散射檢測器；
[0030] 所述第一液相色譜檢測中蒸發光散射檢測器的噴霧器溫度為70?90°C;
[0031] 所述第一液相色譜檢測中蒸發光散射檢測器的載氣壓力為〇? 1?〇? 2MPa。
[0032] 優選的，所述第二液相色譜檢測的檢測器為蒸發光散射檢測器；
[0033] 所述第二液相色譜檢測中蒸發光散射檢測器的噴霧器溫度為70?90°C;
[0034] 所述第二液相色譜檢測中蒸發光散射檢測器的載氣壓力為0? 1?0? 2MPa。
[0035] 本發明以摩爾濃度為0. 0005?0. 002mol/L的甲酸銨溶液和乙腈的混合溶液作為 流動相A，以摩爾濃度為0. 03?0. 05mol/L的甲酸銨溶液和乙腈的混合溶液作為流動相B， 採用二元梯度洗脫程序，對甘磷酸膽鹼待測樣品溶液進行第一液相色譜檢測，得到甘磷酸 膽鹼中甘油、氯化膽鹼和甘油磷脂醯肌醇的含量；採用乙腈和水做為流動相，對甘磷酸膽鹼 待測樣品溶液進行第二液相色譜檢測，得到甘磷酸膽鹼中甘油磷脂醯乙醇胺的含量。本發 明提供的檢測方法可針對不同的雜質建立了不同的色譜條件進行檢測，從而得到全部已知 雜質的含量，避免了僅測定部分雜質就判斷甘磷酸膽鹼質量的片面性，實現了全面、有效的 監控甘磷酸膽鹼質量的目的，同時，也提高了甘磷酸膽鹼的質量監控標準。
[0036] 實驗結果表明，本發明提供的檢測方法能夠有效檢測出全部已知雜質的含量，並 且經過多次檢測後，同一物質的保留時間基本不變，說明本發明提供的檢測方法具有良好 的可重複性和穩定性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1為本發明實施例1得到的甘磷酸膽鹼混合溶液第一液相色譜圖；
[0038] 圖2為本發明實施例2得到的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0039] 圖3為本發明實施例3得到的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0040]圖4為本發明實施例4得到的輔料樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0041] 圖5為本發明實施例5得到的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0042]圖6為本發明實施例6得到的輔料樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0043] 圖7為本發明實施例7得到的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0044]圖8為本發明實施例8得到的輔料樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0045] 圖9為本發明實施例9得到的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0046]圖10為本發明實施例10得到的輔料樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0047] 圖11為本發明實施例11得到的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0048]圖12為本發明實施例12得到的輔料樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0049] 圖13為本發明實施例13得到的信噪比為3:1的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液第一次 進樣的第一液相色譜圖；
[0050] 圖14為本發明實施例13得到的信噪比為3:1的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液第二次 進樣的第一液相色譜圖；
[0051] 圖15為本發明實施例13得到的信噪比為3:1的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液第三次 進樣的第一液相色譜圖；
[0052] 圖16為本發明實施例14得到的甘磷酸膽鹼混合溶液在柱溫20°C下的第一液相色 譜圖；
[0053] 圖17為本發明實施例15得到的甘磷酸膽鹼混合溶液在柱溫25°C下的第一液相色 譜圖；
[0054] 圖18為本發明實施例16得到的甘磷酸膽鹼混合溶液在柱溫30°C下的第一液相色 譜圖；
[0055] 圖19為本發明實施例17得到的甘磷酸膽鹼混合溶液在流動相A和流動相B的流 速為0. 95mL/min時的第一液相色譜圖；
[0056] 圖20為本發明實施例18得到的甘磷酸膽鹼混合溶液在流動相A和流動相B的流 速為1. 05mL/min時的第一液相色譜圖；
[0057] 圖21為本發明實施例19得到的放置0小時後的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一 液相色譜圖；
[0058] 圖22為本發明實施例20得到的放置2小時後甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液 相色譜圖；
[0059] 圖23為本發明實施例21得到的放置4小時後的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一 液相色譜圖；
[0060] 圖24為本發明實施例22得到的放置8小時後的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一 液相色譜圖；
[0061] 圖25為本發明實施例23得到的甘磷酸膽鹼標準樣品溶液的第二標準液相色譜 圖；
[0062] 圖26為本發明實施例24得到的氯化膽鹼標準樣品溶液的第二標準液相色譜圖；
[0063] 圖27為本發明實施例25得到的甘油磷脂醯肌醇標準樣品溶液的第二標準液相色 譜圖；
[0064]圖28為本發明實施例26得到的甘油磷脂醯乙醇胺標準樣品溶液的第二標準液相 色譜圖；
[0065]圖29為本發明實施例27得到的輔料標準樣品溶液的第二標準液相色譜圖； [0066] 圖30為本發明實施例28得到的甘磷酸膽鹼混合溶液a的第二液相色譜圖； [0067]圖31為本發明實施例29得到的空白溶劑的第二液相色譜圖；
[0068]圖32為本發明實施例30得到的甘油磷脂醯乙醇胺標準樣品溶液的第二液相色譜 圖；
[0069]圖33為本發明比較例1得到的甘磷酸膽鹼混合溶液的第二液相色譜圖；
[0070] 圖34為本發明比較例2得到的甘磷酸膽鹼混合溶液的第二液相色譜圖；
[0071] 圖35為本發明比較例3得到的甘磷酸膽鹼混合溶液的第二液相色譜圖；
[0072] 圖36為本發明比較例4得到的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0073] 圖37為本發明比較例5得到的氯化膽鹼樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0074] 圖38為本發明比較例6得到的甘油磷脂醯肌醇樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0075] 圖39為本發明比較例7得到的甘油磷脂醯乙醇胺樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0076] 圖40為本發明比較例8得到的輔料樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0077] 圖41為本發明比較例9得到的甘磷酸膽鹼混和樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0078] 圖42為本發明實施例31得到的放置0小時後甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第二液 相色譜圖；
[0079] 圖43為本發明實施例32得到的放置2小時後甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第二液 相色譜圖；
[0080] 圖44為本發明實施例33得到的放置4小時後的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第二 液相色譜圖；
[0081] 圖45為本發明實施例34得到的放置6小時後的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第二 液相色譜圖；
[0082] 圖46為本發明實施例35得到的放置8小時後的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第二 液相色譜圖；
[0083] 圖47為本發明實施例36得到的放置12小時後的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第 二液相色譜圖；
[0084] 圖48為本發明實施例37得到的空白溶劑的第二液相色譜圖；
[0085]圖49為本發明實施例38得到的輔料樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0086] 圖50為本發明實施例39得到的空白溶劑的第一液相色譜圖；
[0087] 圖51為本發明實施例40得到的甘磷酸膽鹼對照溶液a的第一液相色譜圖；
[0088] 圖52為本發明實施例40得到的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液a的第一液相色譜圖；
[0089] 圖53為本發明實施例40得到的甘磷酸膽鹼對照溶液a的第二液相色譜圖； [0090]圖54為本發明實施例40得到的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液a的第二液相色譜圖； [0091]圖55為本發明實施例41得到的甘磷酸膽鹼對照溶液b的第一液相色譜圖；
[0092]圖56為本發明實施例41得到的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液b的第一液相色譜圖；
[0093] 圖57為本發明實施例41得到的甘磷酸膽鹼對照溶液b的第二液相色譜圖；
[0094] 圖58為本發明實施例41得到的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液b的第二液相色譜圖；
[0095] 圖59為本發明實施例42得到的甘磷酸膽鹼對照溶液c的第一液相色譜圖；
[0096] 圖60為本發明實施例42得到的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液c的第一液相色譜圖；
[0097] 圖61為本發明實施例42得到的甘磷酸膽鹼對照溶液c的第二液相色譜圖；
[0098] 圖62為本發明實施例42得到的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液c的第二液相色譜圖； [0099]圖63為本發明實施例43得到的市售甘磷酸膽鹼對照溶液的第一液相色譜圖； [0100]圖64為本發明實施例43得到的市售甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖
[0101] 圖65為本發明實施例43得到的市售甘磷酸膽鹼對照溶液的第二液相色譜圖；
[0102] 圖66為本發明實施例43得到的市售甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第二液相色譜 圖。

【具體實施方式】
[0103] 本發明提供了甘磷酸膽鹼中雜質的檢測方法，包括以下步驟：
[0104] 將甘磷酸膽鹼待測樣品溶液進行第一液相色譜檢測，得到甘磷酸膽鹼待測樣品溶 液的第一液相色譜圖；
[0105] 所述第一液相色譜檢測的流動相包括流動相A和流動相B;所述流動相A包括第 一甲酸銨溶液和乙腈，所述第一甲酸銨溶液的摩爾濃度為〇. 0005?0. 002mol/L，所述第一 甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（1?10) : (99?90);
[0106] 所述流動相B包括第二甲酸銨溶液和乙腈，所述第二甲酸銨溶液的摩爾濃度為 0? 03?0? 05mol/L，所述第二甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（35?45) : (65?55);
[0107] 根據所述第一液相色譜圖與預定的標準樣品溶液的第一標準曲線，得到甘磷酸膽 鹼待測樣品中第一雜質的含量，所述第一雜質包括甘油、氯化膽鹼和甘油磷脂醯肌醇；
[0108] 將甘磷酸膽鹼待測樣品溶液進行第二液相色譜檢測，得到甘磷酸膽鹼待測樣品溶 液的第二液相色譜圖，所述第二液相色譜的流動相包括乙腈和水，所述乙腈和水的體積比 為（72 ?78):(28 ?22);
[0109] 根據所述第二液相色譜圖與預定的標準樣品溶液的第二標準曲線，得到甘磷酸膽 鹼待測樣品中第二雜質的含量，所述第二雜質包括甘油磷脂醯乙醇胺。
[0110] 本發明將甘磷酸膽鹼待測樣品溶液進行第一液相色譜檢測，得到甘磷酸膽鹼待測 樣品溶液的第一液相色譜圖。本發明優選將甘磷酸膽鹼待測樣品與水混合，得到甘磷酸膽 鹼待測樣品溶液。在本發明中，所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的質量濃度優選為40?60g/ L，更優選為50g/L。
[0111] 所述第一液相色譜檢測的進樣量優選為15?25yL，更優選為17?23yL，最優 選為20uL。
[0112] 在本發明中，所述第一液相色譜檢測的色譜柱優選為陽離子交換柱，所述色譜柱 的填料優選為矽膠，具體的，可以使用資生堂CAPCELLPAKSCX液相色譜柱；所述第一液相 色譜檢測的色譜柱柱溫優選為20?30°C，更優選為22?37°C，最優選為25°C;
[0113] 在本發明中，所述第一液相色譜檢測的流動相包括流動相A和流動相B。在本發 明中，所述流動相A包括第一甲酸銨溶液和乙腈，所述第一甲酸銨溶液的濃度為0. 0005? 0. 002mol/L，優選為0. 0008?0. 0015mol/L，更優選為0.OOlmol/L;所述第一甲酸銨溶液和 乙腈的體積比為（1?10) : (99?90)，優選為（1?5) : (99?95)，更優選為1 :99 ;所述流 動相A的pH值優選為2. 0?4. 0,更優選為2. 5?3. 5,最優選為3. 0 ;本發明優選採用酸 性介質對所述流動相A的pH值進行調節，所述酸性介質優選為甲酸；本發明優選採用酸性 溶液作為酸性介質，本發明對所述酸性溶液的濃度和用量沒有特殊的限制，能夠將所述流 動相A的pH值調節至上述範圍即可。
[0114] 在本發明中，所述流動相A的流速優選為0. 95?1. 05mL/min，更優選為0. 98? L02mL/min,最優選為lmL/min〇
[0115] 在本發明中，所述流動相B包括第二甲酸銨溶液和乙腈，所述第二甲酸銨溶液的 濃度為〇. 03?0. 05mol/L，優選為0. 035?0. 045mol/L，更優選為0. 04mol/L;所述第二 甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（35?45) : (65?55)，優選為（38?43) : (62?57)，更優 選為40 :60 ;所述流動相B的pH值優選為4. 0?6. 0,更優選為4. 5?5. 5,最優選為5. 0 ; 本發明優選採用酸性介質對所述流動相B的pH值進行調節，所述酸性介質優選為甲酸；本 發明優選採用酸性溶液作為酸性介質，本發明對所述酸性溶液的濃度和用量沒有特殊的限 制，能夠將所述流動相B的pH值調節至上述範圍即可。
[0116] 在本發明中，所述流動相B的流速優選為0. 95?1. 05mL/min，更優選為0. 98? L02mL/min,最優選為lmL/min〇
[0117] 在本發明中，所述第一液相色譜檢測優選採用梯度洗脫程序，所述梯度洗脫程序 優選為：
[0118] 在< 35min內，流動相A與流動相B的體積比為（93?97):(7?3);
[0119] 在彡35且< 65min內，流動相A與流動相B的體積比為（45?55):(55?45);
[0120] 在彡65且< 70min內，流動相A與流動相B的體積比為（35?44) : (65?56);
[0121] 在彡70且< 120min內，流動相A與流動相B的體積比為（0?5) : (100?95)。
[0122] 更優選為：
[0123] 在< 35min內，流動相A與流動相B的體積比為（94?96):(6?4);
[0124] 在彡35且< 65min內，流動相A與流動相B的體積比為（47?53):(53?47);
[0125] 在彡65且< 70min內，流動相A與流動相B的體積比為（47?53):(53?47);
[0126] 在彡70且< 120min內，流動相A與流動相B的體積比為（0?3) : (100?97);
[0127] 最優選為：
[0128] 在< 35min內，流動相A與流動相B的體積比為95 :5;
[0129] 在彡35且< 65min內，流動相A與流動相B的體積比為50 :50;
[0130] 在彡65且< 70min內，流動相A與流動相B的體積比為40 :60;
[0131] 在彡70且< 120min內，流動相A與流動相B的體積比為0 :100。
[0132] 所述第一液相色譜檢測的檢測器優選為蒸發光散射檢測器，所述第一液相色譜檢 測中蒸發光散射檢測器的漂移管溫度優選為60?100°C，更優選為70?90°C，最優選為 80°C;所述第一液相色譜檢測中蒸發光散射檢測器優選氮氣作為霧化氣；所述霧化氣的壓 力優選為〇. 1?〇. 2MPa，更優選為0. 13?0. 18MPa，最優選為0. 15MPa;所述霧化氣的流速 優選為2?3L/min，更優選為2. 5L/min;所述第一液相色譜檢測中蒸發光散射檢測器的噴 霧器溫度優選為70?90°C，更優選為80°C;。
[0133] 得到甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖後，本發明根據所述甘磷酸膽鹼 待測樣品溶液的第一液相色譜圖與預定的標準樣品溶液的第一標準曲線，得到甘磷酸膽鹼 待測樣品中第一雜質的含量，所述第一雜質包括甘油、氯化膽鹼和甘油磷脂醯肌醇。本發明 優選對所述第一雜質進行定量檢測前，對所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液第一液相色譜圖中 的色譜峰進行定性，即對出峰位置進行定位；
[0134] 本發明優選將所述第一雜質的標準樣品溶液進行第一液相色譜檢測，得到第一雜 質的第一液相色譜圖，將所述第一雜質的第一液相色譜圖中色譜峰的保留時間與所述甘磷 酸膽鹼待測樣品溶液第一液相色譜圖中色譜峰的保留時間進行比對，實現所述甘磷酸膽鹼 待測樣品溶液第一液相色譜圖中色譜峰的定性。
[0135] 在本發明中，所述第一標準曲線為第一雜質的質量濃度與其對應的色譜峰面積之 間的線性曲線，所述第一標準曲線優選按照以下方法獲得：
[0136] 配製系列濃度的第一標準樣品溶液，所述第一標準樣品為第一雜質的標準樣品；
[0137] 將所述系列濃度的第一標準樣品溶液進行第一液相色譜檢測，得到系列的第一標 準液相色譜圖；
[0138] 將所述系列的第一標準液相色譜圖中第一雜質的色譜峰面積與其對應的第一雜 質標準樣品的濃度進行線性擬合，得到第一標準曲線。
[0139] 在本發明中，所述第一標準樣品溶液包括甘油標準樣品溶液、氯化膽鹼標準樣品 溶液和甘油磷脂醯肌醇標準樣品溶液。在本發明中，所述第一標準樣品溶液可以是各組分 獨立的標準樣品溶液，也可以是各組分的混合標準樣品溶液。本發明優選將甘油的純品溶 於水，配製得到系列濃度的甘油標準樣品溶液。本發明對所述甘油純品的來源沒有特殊的 限制，採用甘油純品的市售商品即可。在本發明中，所述甘油標準樣品溶液的質量濃度優選 為1?5mg/mL，更優選為2?4mg/mL，最優選為3mg/mL。
[0140] 得到所述系列濃度的甘油標準樣品溶液後，本發明優選將得到的系列濃度的甘油 標準樣品溶液進行第一液相色譜檢測，得到甘油標準樣品溶液的系列第一標準液相色譜 圖。
[0141] 得到所述甘油標準樣品溶液的系列第一標準液相色譜圖後，本發明優選以所述甘 油標準樣品溶液的系列第一標準液相色譜圖中的峰面積為縱坐標，以其對應的甘油標準樣 品溶液的質量濃度為橫坐標，得到峰面積和質量濃度的曲線，將所述曲線進行線性擬合，得 到甘油標準樣品溶液的第一標準曲線。在本發明中，所述峰面積優選採用積分得到，本發明 對所述積分的方法沒有特殊的限制，採用本領域技術人員熟知的計分方法即可。本發明對 所述線性擬合的方法沒有特殊的限制，採用本領域技術人員熟知的線性擬合的方法即可。
[0142] 本發明優選按照上述技術方案，得到所述第一標準樣品溶液中除甘油外的其他已 知雜質的標準樣品溶液的第一標準曲線，包括氯化膽鹼標準樣品溶液的第一標準曲線和甘 油磷脂醯肌醇標準樣品溶液的第一標準曲線，不同的是，在本發明中，所述氯化膽鹼標準樣 品溶液的質量濃度優選為〇. 05?0. 45g/L，所述甘油磷脂醯肌醇標準樣品溶液的質量濃度 優選為〇? 05?0? 45g/L。
[0143] 得到所述第一標準樣品溶液的第一標準曲線後，本發明根據所述第一標準曲線， 得到所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液中第一雜質的質量濃度；根據所述甘磷酸膽鹼待測樣品 的質量、所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的質量、與所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液中第一雜 質的質量濃度，得到所述甘磷酸膽鹼待測樣品中第一雜質的含量，所述第一雜質包括甘油。 氯化膽鹼和甘油磷脂醯肌醇。
[0144] 除了已知的甘油、氯化膽鹼和甘油磷脂醯肌醇以外，所述第一雜質中優選還包括 未知雜質。所述未知雜質包括在酸、鹼和光照等條件下產生的雜質。本發明優選將所述甘 磷酸膽鹼樣品進行第一主成分自身對照檢測，以得到所述甘磷酸膽鹼樣品中未知雜質的含 量，包括以下步驟：
[0145] 1)提供甘磷酸膽鹼待測樣品溶液和甘磷酸膽鹼對照溶液；
[0146] 2)將所述步驟1)中的甘磷酸膽鹼對照溶液注入液相色譜儀，調節色譜儀靈敏度；
[0147] 3)將所述步驟1)中的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液和甘磷酸膽鹼對照溶液分別進行 第一液相色譜檢測，得到所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖和甘磷酸膽鹼對 照溶液的第一液相色譜圖；
[0148] 4)根據所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖和甘磷酸膽鹼對照溶液 的第一液相色譜圖，得到甘磷酸膽鹼待測樣品溶液中未知雜質的含量。
[0149] 在本發明中，所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的來源與質量濃度與上述技術方案中 甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的來源和質量濃度一致，在此不再贅述。本發明優選將所述甘磷 酸膽鹼待測樣品溶液進行稀釋，得到甘磷酸膽鹼對照溶液。在本發明中，所述甘磷酸膽鹼對 照溶液與所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的質量濃度之比優選為1 :1〇〇。
[0150] 得到所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液和甘磷酸膽鹼對照溶液後，本發明將所述甘磷 酸膽鹼對照溶液注入液相色譜儀，調節靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10? 25 %，優選為20%。在本發明中，所述甘磷酸膽鹼對照溶液的進樣量優選為20yL。
[0151] 靈敏度調節完畢後，本發明將所述步驟1)中的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液和甘磷 酸膽鹼對照溶液分別進行第一液相色譜檢測，得到所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液 相色譜圖和甘磷酸膽鹼對照溶液的第一液相色譜圖。在本發明所述的第一主成分自身對照 檢測中，所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖的記錄時間優選為主成分色譜峰 保留時間的2倍；所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖中如有甘油、甘油磷脂 醯肌醇和氯化膽鹼雜質峰，其峰面積不得大於所述甘磷酸膽鹼對照溶液的第一液相色譜圖 中主峰面積的一半，即不得大於所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖中主峰面 積的0. 5% ;其他任一雜質峰峰面積不得大於所述甘磷酸膽鹼對照溶液的第一液相色譜圖 中主峰面積的1/5,即不得大於所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖中主峰面 積的0. 2% ;各雜質峰面積之和不得大於所述甘磷酸膽鹼對照溶液的第一液相色譜圖中主 峰面積的兩倍，即不得大於所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖中主峰面積的 2. 0%。
[0152] 本發明優選按照上述獲得甘油標準樣品溶液的第一標準曲線的技術方案，得到甘 磷酸膽鹼標準樣品溶液的第一標準曲線。本發明根據得到的甘磷酸膽鹼標準樣品溶液的第 一標準曲線和所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色譜圖中甘磷酸膽鹼對應的峰面 積，得到所述甘磷酸膽鹼待測樣品中甘磷酸膽鹼的含量。
[0153] 得到所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液和甘磷酸膽鹼對照溶液的第一液相色譜圖後， 本發明根據所述甘磷酸膽鹼待測樣品中甘磷酸膽鹼的含量、所述甘磷酸膽鹼對照溶液與所 述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的質量濃度之比、所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第一液相色 譜圖中未知雜質的峰面積和所述甘磷酸膽鹼對照溶液第一液相色譜圖中甘磷酸膽鹼的峰 面積，得到所述甘磷酸膽鹼待測樣品中未知雜質的含量。
[0154] 本發明將甘磷酸膽鹼待測樣品溶液進行第二液相色譜檢測，得到甘磷酸膽鹼待測 樣品溶液的第二液相色譜圖。本發明優選將甘磷酸膽鹼待測樣品與水混合，得到甘磷酸膽 鹼待測樣品溶液。在本發明中，所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的質量濃度優選為40?60g/ L，更優選為50g/L。
[0155] 在本發明中，所述第二液相色譜檢測的進樣量優選為15?25yL，更優選為17? 23iiL，最優選為20iiL。
[0156] 在本發明中，所述第二液相色譜檢測的色譜柱優選為氨基鍵合矽膠色譜柱；所述 第二液相色譜檢測的色譜柱柱溫優選為20?40°C，更優選為30°C。
[0157] 在本發明中，所述第二液相色譜檢測的流動相包括乙腈和水，所述乙腈和水的體 積比為（72?78) : (28?22)，優選為（73?77) : (27?23)，更優選為75 :25 ;所述第二液 相色譜檢測中流動相的pH值優選為2. 0?4. 0,更優選為2. 5?3. 5,最優選為3. 0 ;本發明 優選採用酸性介質對所述第二液相色譜檢測的流動相的pH值進行調節，所述酸性介質優 選為冰醋酸；本發明優選採用酸性溶液作為酸性介質，本發明對所述酸性溶液的濃度和用 量沒有特殊的限制，能夠將所述第二液相色譜檢測中流動相的pH值調節至上述範圍即可。
[0158] 在本發明中，所述第二液相色譜檢測中流動相的流速優選為0. 95?1. 05mL/min， 更優選為〇. 98?1. 03mL/min，最優選為lmL/min。
[0159] 在本發明中，所述第二液相色譜檢測的檢測器優選為蒸發光散射檢測器，所述第 二液相色譜檢測中蒸發光散射檢測器的漂移管溫度優選為60?100°C，更優選為70? 90°C，最優選為80°C;所述第二液相色譜檢測中的蒸發光散射檢測器優選氮氣作為霧化氣； 所述霧化氣的壓力優選為〇. 1?〇. 2MPa，更優選為0. 13?0. 18MPa，最優選為0. 15MPa;所 述霧化氣的流速優選為2?3L/min，更優選為2. 5L/min;所述第二液相色譜檢測中蒸發光 散射檢測器的噴霧器溫度優選為70?90°C，更優選為80°C;
[0160] 得到甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第二液相色譜圖後，本發明根據所述甘磷酸膽鹼 待測樣品溶液的第二液相色譜圖與預定的第二標準樣品溶液的第二標準曲線，得到甘磷酸 膽鹼待測樣品溶液中第二雜質的含量，所述第二雜質包括甘油磷脂醯乙醇胺。本發明優選 對所述第二雜質進行定量檢測前，對所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液第二液相色譜圖中的色 譜峰進行定性，即對出峰位置進行定位；
[0161] 本發明優選將所述第二雜質的標準樣品溶液進行第二液相色譜檢測，得到第二雜 質的第二液相色譜圖，將所述第二雜質的第二液相色譜圖中色譜峰的保留時間與所述甘磷 酸膽鹼待測樣品溶液第二液相色譜圖中色譜峰的保留時間進行比對，實現所述甘磷酸膽鹼 待測樣品溶液第二液相色譜圖中色譜峰的定性。
[0162] 在本發明中，所述第二標準曲線為第二雜質的質量濃度與其對應的色譜峰面積之 間的線性曲線，所述第二標準曲線優選按照以下方法獲得：
[0163] 配製系列濃度的第二標準樣品溶液，所述第二標準樣品為第二雜質的標準樣品；
[0164] 將所述系列濃度的第二標準樣品溶液進行第二液相色譜檢測，得到第二標準樣品 溶液的系列第二液相色譜圖；
[0165] 將所述第二標準樣品溶液的系列第二標準液相色譜圖中第二雜質的色譜峰面積 與其對應的第二雜質標準樣品的濃度進行線性擬合，得到第二標準曲線。
[0166] 在本發明中，所述第二標準樣品溶液包括甘油磷脂醯乙醇胺標準樣品溶液。在本 發明中，所述甘油磷脂醯乙醇胺標準樣品溶液的來源和質量濃度與上述技術方案中甘油磷 脂醯乙醇胺標準樣品溶液的來源和質量濃度一致，在此不再贅述。
[0167] 得到所述系列濃度的第二標準樣品溶液後，本發明優選將得到的系列濃度甘油磷 脂醯乙醇胺樣品溶液進行第二液相色譜檢測，得到甘油磷脂醯乙醇胺樣品溶液的系列第二 標準液相色譜圖。
[0168] 得到所述甘油磷脂醯乙醇胺的系列第二標準液相色譜圖後，本發明優選以所述甘 油磷脂醯乙醇胺標準樣品溶液的系列第二標準液相色譜圖中的峰面積為縱坐標，以其對應 的甘油磷脂醯乙醇胺標準樣品溶液的質量濃度為橫坐標，得到峰面積和質量濃度的曲線， 將所述曲線進行線性擬合，得到甘油磷脂醯乙醇胺的標準曲線。在本發明中，所述峰面積優 選採用積分得到，本發明對所述積分的方法沒有特殊的限制，採用本領域技術人員熟知的 計分方法即可。本發明對所述線性擬合的方法沒有特殊的限制，採用本領域技術人員熟知 的線性擬合的方法即可。
[0169] 得到所述甘油磷脂醯乙醇胺的標準曲線後，本發明根據所述甘磷酸膽鹼待測樣品 溶液的第二液相色譜圖與所述甘油磷脂醯乙醇胺的標準曲線可得到所述甘磷酸膽鹼待測 樣品溶液中甘油磷脂醯乙醇胺的質量濃度；根據所述甘磷酸膽鹼待測樣品的質量、所述甘 磷酸膽鹼待測樣品溶液的質量與所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液中甘油磷脂醯乙醇胺的質 量濃度，得到所述甘磷酸膽鹼待測樣品中第二雜質的含量，所述第二雜質包括甘油磷脂醯 乙醇胺。
[0170] 除了已知雜質甘油磷脂醯乙醇胺外，所述第二雜質還包括未知雜質。所述未知雜 質包括在酸、鹼和光照等條件下產生的雜質。本發明優選將所述甘磷酸膽鹼樣品進行第二 主成分自身對照檢測，以得到所述甘磷酸膽鹼樣品中未知雜質的含量，包括以下步驟：
[0171] I)提供甘磷酸膽鹼待測樣品溶液和甘磷酸膽鹼對照溶液；
[0172] II)將所述步驟I)中的甘磷酸膽鹼對照溶液注入液相色譜儀，調節色譜儀靈敏 度；
[0173] III)將所述步驟I)中的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液和甘磷酸膽鹼對照溶液分別進 行第二液相色譜檢測，得到所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液和甘磷酸膽鹼對照溶液的第二液 相色譜圖；
[0174] IV)根據所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第二液相色譜圖和甘磷酸膽鹼對照溶 液的第二液相色譜圖，得到甘磷酸膽鹼待測樣品溶液中未知雜質的含量。
[0175] 本發明按照上述技術方案得到甘磷酸膽鹼待測樣品溶液和甘磷酸膽鹼對照溶液， 並按照上述技術方案將所述甘磷酸膽鹼對照溶液注入液相色譜儀，調節靈敏度。
[0176] 靈敏度調節完畢後，本發明將所述步驟I)中的甘磷酸膽鹼待測樣品溶液和甘磷 酸膽鹼對照溶液分別進行第二液相色譜檢測，得到所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第二液 相色譜圖和甘磷酸膽鹼對照溶液的第二液相色譜圖。在所述第二主成分自身對照檢測中， 所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第二液相色譜圖中如有甘油磷脂醯乙醇胺雜質峰，其峰 面積不得大於所述甘磷酸膽鹼對照溶液的第二液相色譜圖主峰面積的〇.5倍，即不得大於 所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第二液相色譜圖主峰面積的〇. 5%。
[0177] 本發明優選按照上述獲得第二標準曲線的技術方案，得到甘磷酸膽鹼標準樣品溶 液的第二標準曲線。本發明根據得到的甘磷酸膽鹼標準樣品溶液的第二標準曲線和所述甘 磷酸膽鹼待測樣品溶液的第二液相色譜圖中甘磷酸膽鹼對應的峰面積，得到所述甘磷酸膽 鹼待測樣品中甘磷酸膽鹼的含量。
[0178] 得到所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液和甘磷酸膽鹼對照溶液的第二液相色譜圖後， 本發明根據所述甘磷酸膽鹼待測樣品中甘磷酸膽鹼的含量、所述甘磷酸膽鹼對照溶液與所 述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的質量濃度之比、所述甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的第二液相色 譜圖中未知雜質的峰面積和所述甘磷酸膽鹼對照溶液第二液相色譜圖中甘磷酸膽鹼的峰 面積，得到所述甘磷酸膽鹼待測樣品中未知雜質的含量。
[0179] 本發明提供的檢測方法不僅能檢測出甘磷酸膽鹼中已知雜質甘油、氯化膽鹼、甘 油磷脂醯肌醇和甘油磷脂醯乙醇胺的含量，還能檢測出在酸、鹼和光照等條件下可能產生 的未知雜質的含量，避免了僅測定部分雜質就判斷甘磷酸膽鹼質量的片面性，實現了全面、 有效的監控甘磷酸膽鹼質量的目的。
[0180] 為了進一步說明本發明，以下結合實施例對本發明提供的甘磷酸膽鹼中雜質的檢 測方法進行詳細描述，但不能將它們理解為對本發明保護範圍的限定。
[0181] 在下述實施例中，所用乙腈購自MREDATECHNOLOGYINC公司，純度為色譜純，甲酸 銨購自國藥集團化學試劑有限公司，純度為分析純，甲酸購自北京化工廠，純度為分析純， 乙酸購自北京化工廠，純度為分析純。
[0182] 實施例1
[0183] 將甘磷酸膽鹼、氯化膽鹼、甘油磷脂醯肌醇、空膠囊殼和甘油與水混合，混合均 勻後進行過濾，得到甘磷酸膽鹼混合溶液A，每lmL甘磷酸膽鹼混合溶液中含甘磷酸膽鹼 50mg、氯化膽鹼0. 25mg、甘油磷脂醯肌醇0. 25mg、空膠囊殼50mg、甘油3mg。
[0184] 取20L所述甘磷酸膽鹼混合溶液A，注入島津液相色譜儀，採用Alltech2000ES 型蒸發光散射檢測器進行檢測。
[0185] 島津液相色譜儀採用LC-lOATvp型泵，CBM-20A型控制器，CLASS-VP型色譜工作 站；
[0186]Alltech2000ES型蒸發光散射檢測器的漂移管溫度為，噴霧器溫度為80°C，霧化 氣為氮氣，霧化氣流速為2. 5L/min，載氣壓力為0? 15MPa;
[0187] 色譜條件為：資生堂CAPCELLPAKSCX色譜柱，色譜柱填料顆粒大小5iim，色譜柱 尺寸為4. 6X250mm;採用二元梯度洗脫程序，如表1所示，表1為本發明實施例1採用的二 元梯度洗脫程序。流動相A為體積比為99:1的乙腈和摩爾濃度為0. 001m〇l/L甲酸銨溶液， 流速為1.OmL/min，用甲酸調節pH值為3. 0 ;流動相B為體積比為60:40的乙腈和摩爾濃度 為0. 04mol/L甲酸銨溶液，流速為1.OmL/min，用甲酸調節pH值為5. 0 ;
[0188] 表1本發明實施例1採用的二元梯度洗脫程序
[0189]

【權利要求】
1. 甘磷酸膽鹼中雜質的檢測方法，包括以下步驟： 將甘磷酸膽鹼待測樣品溶液進行第一液相色譜檢測，得到甘磷酸膽鹼待測樣品溶液的 第一液相色譜圖； 所述第一液相色譜檢測的流動相包括流動相A和流動相B ;所述流動相A包括第一甲 酸銨溶液和乙腈，所述第一甲酸銨溶液的摩爾濃度為〇. 0005?0. 002mol/L，所述第一甲酸 銨溶液和乙腈的體積比為（1?10) : (99?90); 所述流動相B包括第二甲酸銨溶液和乙腈，所述第二甲酸銨溶液的摩爾濃度為0. 03? 0.05mol/L，所述第二甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（35?45) :(65?55); 根據所述第一液相色譜圖與預定的標準樣品溶液的第一標準曲線，得到甘磷酸膽鹼待 測樣品中第一雜質的含量，所述第一雜質包括甘油、氯化膽鹼和甘油磷脂醯肌醇； 將甘磷酸膽鹼待測樣品溶液進行第二液相色譜檢測，得到甘磷酸膽鹼待測樣品溶液 的第二液相色譜圖，所述第二液相色譜的流動相包括乙腈和水，所述乙腈和水的體積比為 (72 ?78) : (28 ?22); 根據所述第二液相色譜圖與預定的標準樣品溶液的第二標準曲線，得到甘磷酸膽鹼待 測樣品中第二雜質的含量，所述第二雜質包括甘油磷脂醯乙醇胺。
2. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述第一液相色譜檢測中的色譜柱 為陽離子交換柱； 所述第一液相色譜檢測色譜柱的柱溫為20?30°C。
3. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述第一液相色譜檢測中流動相A的 流速為 〇? 95 ?1. 05mL/min ; 所述流動相B的流速為0. 95?1. 05mL/min。
4. 根據權利要求1?3任意一項所述的檢測方法，其特徵在於，所述第一液相色譜檢測 採用梯度洗脫程序； 所述梯度洗脫程序為： 在< 35min內，流動相A與流動相B的體積比為（93?97) : (7?3); 在彡35且< 65min內，流動相A與流動相B的體積比為（45?55) : (55?45); 在彡65且< 70min內，流動相A與流動相B的體積比為（35?44) : (65?56); 在彡70且< 120min內，流動相A與流動相B的體積比為（0?5) : (100?95)。
5. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述流動相A的pH值為2. 0?4. 0 ; 所述流動相B的pH值為4. 0?6. 0。
6. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述第二液相色譜檢測中流動相的 流速為 〇? 95 ?1. 05mL/min。
7. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述第二液相色譜檢測中流動相的 pH值為2. 0?4. 0。
8. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述第二液相色譜檢測中的色譜柱 為氨基鍵合矽膠色譜柱； 所述第二液相色譜檢測中色譜柱的柱溫為20?40°C。
9. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述第一液相色譜檢測的檢測器為 蒸發光散射檢測器； 所述第一液相色譜檢測中蒸發光散射檢測器的噴霧器溫度為70?90°C ; 所述第一液相色譜檢測中蒸發光散射檢測器的載氣壓力為〇. 1?〇. 2MPa。
10.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述第二液相色譜檢測的檢測器為 蒸發光散射檢測器； 所述第二液相色譜檢測中蒸發光散射檢測器的噴霧器溫度為70?90°C ; 所述第二液相色譜檢測中蒸發光散射檢測器的載氣壓力為〇. 1?〇. 2MPa。
【文檔編號】G01N30/02GK104458942SQ201410698223
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月27日 優先權日:2014年11月27日
【發明者】傅超婷, 雲衝, 劉五生, 李錦雲, 朱峰, 王玉娟, 李富志 申請人:海南通用三洋藥業有限公司