用於使活細胞中核與染色體成像的融合蛋白的製作方法

2023-10-17 14:10:44

專利名稱：：用於使活細胞中核與染色體成像的融合蛋白的製作方法
技術領域：
：本發明總體而言涉及細胞生物學、分子生物學和藥理學領域。
發明內容本發明的一個方面包括含有融合蛋白的成像劑(imagingagent),所述融合蛋白具有一個或多個DNA結合結構域和一個或多個螢光結構域，其中所述融合蛋白構建成定位在細胞核中。在一些實施方案中，所述細胞是活細胞。在一些實施方案中，所述DNA結合結構域選自HMGB1、HMGB2和組蛋白H1。在一些實施方案中，所述螢光結構域選白GFP、EGFP、YFP、EYFP、CFP、ECFP、BFP、EBFP、RFP和DsRed。在一個i兌明性實施方案中，所述DNA結合結構域是HMGB1，所述螢光結構域是EGFP。在一些實施方案中，所述融合蛋白還包含核定位結構域。在一個說明性實施方案中，所述細胞核定位結構域是來自SV40病毒的核定位序列。在一些實施方案中，所述融合蛋白在DNA結合結構域和螢光結構域之間還含有接頭肽。在一些實施方案中，所述融合蛋白還含有細胞穿透肽。在一些說明性實施方案中，所述細胞穿透肽選自觸角足基因蛋白ANTP、TAT、transportan和多聚精氨酸。本發明的另一方面包括含有所述成^f象劑的細胞。本發明的另一方面包括含有啟動子的核酸構建體，所述啟動子與一個或多個DNA結合結構域、一個或多個螢光結構域以及至少一個核定位結構域有效連接。在一些實施方案中，所述啟動子選自強組成型啟動子、弱組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導型啟動子。在一個說明性實施方案中，所述強組成型啟動子是CMV早期啟動子。在一個說明性的實施方案中，弱組成型啟動子是截短的CMV早期啟動子。本發明的另一個方面包括含有核酸構建體的載體，所迷核酸構建體包含與一個或多個DNA結合結構域、一個或多個螢光結構域和至少一個核定位結構域有效連接的啟動子。在一個說明性實施方案中，所述載體具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的序列。本發明還涉及轉化或轉染了核酸栽體的細胞，所述核酸載體包含與一個或多個DNA結合結構域、一個或多個螢光結構域和至少一個核定位結構域有效連接的啟動子。本發明的另一個方面包括成像方法，其包括以下步驟(a)將以下引入細胞中(i)本發明的成像劑，或(ii)核酸構建體，其中所述構建體能夠在細胞中表達本發明的成像劑；(b)檢測成像劑的螢光。在一些實施方案中，檢測步驟包括對細胞核成像。在一些實施方案中，檢測步驟包括對細胞的染色體成像。本發明的另一個方面包括在細胞中監測與核相關的一種或多種變化的方法，其包括下列步驟(a)將以下引入測試細胞中(i)本發明的成像劑，或(ii)核酸構建體，其中所述構建體能夠在細胞中表達本發明的成像劑；和(b)檢測該測試細胞中成像劑螢光的一種或多種變化，其中測試細胞中成像劑焚光與參考螢光相比的一種或多種變化可指示細胞中的一種或多種核相關變化。在一些實施方案中，所述一種或多種核相關變化包括一種或多種染色體異常。在一些實施方案中，所述一種或多種染色體異常選自缺失、重複、倒位和易位。在一些實施方案中，所述一種或多種核相關變化指示細胞凋亡或細胞分裂。在說明性實施方案中，所述一種或多種螢光變化包括螢光水平或分布的一種或多種變化。本發明的另一個方面包括觀察一種或多種分子對細胞的一種或多種影響的方法，其包括以下步驟(a)將以下引入測試細胞中(i)本發明的成像劑，或(ii)核酸構建體，其中所述構建體能夠在細胞中表達本發明的成像劑；(b)使測試細胞與一種或多種分子接觸；和(C)檢測測試細胞中成像劑螢光的一種或多種變化，其中測試細胞中成像劑螢光與參考焚光相比的一種或多種變化可指示一種或多種分子對測試細胞的一種或多種影響。在一些實施方案中，所觀察的一種或多種分子的影響是導致細胞死亡或染色體異常的毒性。在一些實施方案中，所述一種或多種分子包括選自下列組中的一種或多種分子治療劑、殺蟲劑、除草劑、化合物、小分子毒素、核酸、蛋白質和肽。本發明的另一個方面包括成像試劑盒，其包含本文所述的成像劑、編碼本發明成像劑的核酸構建體、載體和/或細胞中的一種或多種。圖1是pEGFP-lac載體中HMGB1-EGFP融合蛋白構建體的圖示。圖2是證明在HEK293FT和CHO細胞中HMGB1-EGFP融合蛋白均存在核定位的顯微照片。圖3是證明凋亡使細胞呈圓形並使HMGB1-EGFP擴散到整個細胞的顯微照片。圖4是ptrEGFP-HMGBl表達質粒的圖示。圖5A和圖5B是證明ptrEGFP-HMGBl表達質粒可以使染色體顯現的顯微照片。具體實施例方式本文公開了用於使活細胞的核及染色體顯現的蛋白質、核酸、細胞和方法。特別是本發明提供了可以發出螢光並結合DNA的融合蛋白。這些融合蛋白在活細胞中具有結合DNA的功能；因此它們可用於使核及染色體成像，從而觀察核及染色體的結構和動態過程。研究者經常需要了解細胞和細胞培養物的生長狀態。此狀態可以通過觀察細胞及其核的形狀與大小來確定，因為核結構是許多目的細胞事件的早期標誌。例如，核及染色體結構的顯著變化是開始發生凋亡、有絲分裂、減數分裂和細胞分裂的信號。觀察這些變化對於研究和診斷人類疾病的狀態是很重要的，所述疾病包括但不限於癌症。常使用Hoechst染料染色細胞，以進行這類觀察。但是，這些染料對細胞有毒性，經常用於已固定的細胞，即用於死細胞。本文描述可在活細胞中展示細胞核而不傷害細胞的蛋白質。而且，所述蛋白質能夠清晰地顯示凝聚染色體的形狀和位置。使凝聚染色體顯現的能力是很有意義的，例如在細胞準備分裂或正在凋亡時很有意義。在下面的描述中會頻繁使用許多術語。這裡對其進行解釋以有助於理解本發明。以下提供的術語參考說明書整體進行了更加全面的說明。單位、前綴和符號可以表示為其公認的SI形式。除非另作說明，核酸書寫從左到右為5，到3，方向；胺基酸序列書寫從左到右為氨基到羧基方向。胺基酸在本文中可以表示為公知的三字母代碼或IUPAC-IUBMB命名委員會推薦的單字母代碼。同樣，核苷酸也可以表示為其廣泛接受的單字母代碼。在本文中，當沒有數量詞修飾或以"一種(個)"表示時，相應的名詞應理解為"一或多種(個)"，除非明確指明或者上下文中確切顯示並非如此。本文所使用的"細胞穿透肽"指能夠在體內和/或體外將其他肽、蛋白質或核酸轉導進細胞中的肽。本文所使用的"DNA結合蛋白"指與DNA結合的蛋白質以及可能對DNA具有普遍親和力或對特定DNA序列有特異性親和力的蛋白質。本文所使用的"表達"指由結構基因產生多肽的過程。總體來說，此過程包括從基因轉錄成RNA和將這種RNA翻譯成多肽。本文所使用的"螢光蛋白"指受到合適波長的電磁波激發時會以特徵性發射波長發出螢光的蛋白質。本文所使用的"成像劑"表示任何可用於可視地報告細胞狀態或者亞細胞結構或細胞器的狀態而在其他方面通常不對細胞產生影響的物質。本文所使用的術語"連接"、"綴合"或"融合"可以互換使用。這8些術語表示通過任何手段(包括化學綴合或重組)將兩個或更多個元件或組分結合到一起。融合蛋白表示包含兩個或更多個區段的單個蛋白質，這些區段分別對應於在自然界中通常不會如此連接在一起的多肽。所述區段可以在物理上分開或在空間上分隔開，例如使用接頭肽序列分開。本文所使用的"誘導型啟動子"表示對刺激(如熱休克、化學物質等)的存在敏感的啟動子。該刺激使得有效連接的核酸序列的轉錄水平高於或低於不存在該刺激時有效連接的核酸序列的轉錄水平。本文所j吏用的"核定位序列"(nuclearlocalizationsequence,NLS)表示能夠指導蛋白質或多核苷酸定位於細胞核的多肽。本文所使用的"核酸"表示單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核普酸或核糖核苷酸的多聚體或其嵌合體，除非另作限定，否則還包括具有天然核苷酸基本性質(即可通過與天然存在核苷酸相似的方式與單鏈核酸雜交)的已知類似物(如肽核酸)。本文所使用的"有效連接"表示兩序列之間的功能性連接。例如當啟動子與結構基因相連時，啟動子序列起始並介導結構基因的轉錄。術語"有效連接"還指被連接的核酸序列是鄰近的，並且當需要連接兩個或多個蛋白質編碼區(任選地包括連接肽)時指序列是連續的並且處在同一個讀碼框中。本文所使用的術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"可以互換使用，表示胺基酸殘基的多聚體。這些術語適用於其中一個或多個胺基酸殘基是相應天然存在胺基酸的人工化學類似物的胺基酸多聚體，以及僅含有天然存在胺基酸的多聚體。術語多肽、肽和蛋白質還包括但不限於以下修飾，如糖基化、脂質附著、硫酸化、羧基化、羥基化、ADP核糖基化以及添加其他複雜多糖。本文所使用的"啟動子"表示可以指導結構基因轉錄產生信使RNA(mRNA)的DNA序列。啟動子通常位於基因的5，區，接近起始密碼子。如果啟動子是誘導型啟動子，那麼應答於誘導劑時的轉錄水平會高於不存在誘導劑時的轉錄水平。相反，如果啟動子是組成型啟動子，則轉錄速率不會被誘導劑調控。本文所使用的"強組成型啟動子"表示在多數情況下有活性並指導與其有效連接的核酸序列以高水平轉錄的啟動子。"高水平轉錄"意為細胞中約1/10的轉錄產物到約1/100的轉錄產物到約1/1000的轉錄產物對應於所述有效連接的核酸序列。本文所使用的"截短的啟動子"表示通過去除其一部分正常序列而變短的啟動子，這通常使其活性降低，因此與該截短啟動子有效連接的核酸所表達的蛋白量低於相應的全長啟動子所表達的蛋白量。本文所使用的"載體"指能在宿主細胞中自主複製並用於轉化或轉染細胞以進行基因操作的DNA分子，例如質粒、粘粒、噬粒或噬菌體。表達栽體允許轉錄插入其中的核酸。本文所使用的"弱組成型啟動子"表示在多數情況下有活性並指導與其有效連接的核酸序列低水平轉錄的啟動子。"低水平轉錄"意為細胞中約1/10000的轉錄產物到約1/100000的轉錄產物到約1/500000的轉錄產物對應於所述有效連接的核酸序列。I.成像劑組合物A.融合蛋白一方面，本文提供可結合DNA的可檢測成像劑。特別地，本文提供可用於在生理條件下使活細胞顯現的蛋白質、核酸、細胞和方法。成像劑包括與螢光結構域結合的DNA結合結構域。成像劑可以進入活細胞的核中並結合DNA。成像劑含有DNA結合結構域。DNA結合結構域是對DNA具有特異性親和力或普遍親和力的蛋白質。在一些實施方案中，在成像劑中使用序列特異性DNA結合蛋白。序列特異性DNA結合蛋白通常識別和結合特定的核苷酸序列(如TATA結合蛋白)。在其他實施方案中，成像劑中使用非序列特異性DNA結合蛋白。非序列特異性DNA結合蛋白對DNA具有普遍親和力，即它們通常不對任何特定DNA序列具有顯著的偏好，而是通過總體結構和靜電相互作用與DNA雙螺旋相結合。因此非序列特異性DNA結合蛋白會與任何DNA分子結合。在一些實施方案中，蛋白質成像劑的DNA結合結構域是非序列特異性DNA結合蛋白。一些非序列特異性DNA結合蛋白包括人高速泳動族蛋白Bl(HMGB1)、人高速泳動族蛋白B2(HMGB2)、其他HMG1蛋白、其他HMG2蛋白、組蛋白Hl、Sso7d和上述蛋白的其他同源物。HMGB1和HMGB2通常在細胞核中表達。HMGB1存在於所有脊推動物的核中並且非常高度保守；例如，小鼠和大鼠HMGB1完全相同，並且與人HMGB1僅有2個位置不同(Anderson等，/Zewbc5,V/.2002Dec;72(6):1084-91)。因此，可以預計，任何特定的HMGB1變體在均大多數細胞類型中都具有功能。在另一些實施方案中，DNA結合蛋白可以是組蛋白。組蛋白是染色質的主要蛋白質成分，存在於細胞核中並且高度保守。在一個實施方案中，所述組蛋白為組蛋白H1。成像劑包含螢光蛋白結構域，以使活細胞中的核與染色體顯現。螢光蛋白質具有為蛋白質帶來螢光特性的特定的胺基酸排列。由於這些胺基酸，當蛋白質被特定波長的光子激發時，蛋白質發射波長更長的光子。一般來說，螢光蛋白被紫外區的光子激發並發射可見光區的光子。在一些實施方案中，所述螢光蛋白結構域是綠色螢光蛋白(GFP)。GFP的最大激發和發射光譜分別為約495nm和509nm。因此，GFP是一種受藍光照射時發出綠色螢光的蛋白質。GFP在室溫下不需要其他輔因子或試劑就可以摺疊和發出螢光，並在多種生物體和細胞類型中發揮功能，包括但不限於細菌、酵母、真菌、植物、昆蟲、蠕蟲、哺乳動物和人。具有特徵性激發和發射波諉的GFP變體及其他螢光蛋白也是有用的。在一些實施方案中，螢光蛋白可以是黃色螢光蛋白(YFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、珊瑚蟲紅色螢光蛋白(DsRed)、藍綠色螢光蛋白(CFP)、藍色螢光蛋白(BFP)、增強型綠色螢光蛋白(EGFP)、增強型黃色螢光蛋白(EYFP)、增強型藍綠色螢光蛋白(ECFP)或增強型藍色螢光蛋白(EBFP)。在另一些實施方案中，螢光蛋白質是優化過的螢光蛋白突變體。其他螢光蛋白質的實例為S65TGFP突變體、SuperfolderGFP、Azurite、mKalamal、Cerulean、CyPet、Citrine、Venus和YPet。在一個說明性實施方案中，HMGB1和EGFP的融合蛋白是使細胞顯現的成^^劑。螢光蛋白結構域和DNA結合結構域可以通過存在於同一多肽上而ii彼此結合。在這個實施方案中，DNA結合蛋白和螢光蛋白結構域融合在同一讀碼框中，從而使一個結構域的編碼序列直接鄰接另一個結構域的編碼序列或緊隨其後。在一些實施方案中，螢光結構域和DNA結合結構域可以通過連接這兩結構域的接頭而彼此相連。所述接頭可以是肽或者適當的化學基團。除了物理連接兩個蛋白質或多肽以外，接頭可以無其他功能。在另一些實施方案中，所述接頭是與螢光結構域和DNA結合結構域一起框內翻譯的肽。接頭部分應當足夠長和柔軟，以使DNA結合結構域與DNA結合而不受到螢光結構域的空間位阻。任選地，所述接頭部分是肽部分。任選地，接頭部分是長度為約1到30個胺基酸(任選地為約2到15個胺基酸)的肽。在一個說明性實施方案中，接頭部分是"-Gly-Gly-"接頭。連接性部分描述於例如Huston等，PNAS85:5879-5883,1988,Whitlow等,ProteinEngineering6:989-995，1993和Newton等,Biochemistry35:545-553，1996。在一些實施方案中，螢光結構域和DNA結合結構域可以是在體外或體內自髮結合(self-associate)的分開的多肽。自髮結合可以通過本領域技術人員熟知的任何一種有用的蛋白二聚化結構域或偶聯劑來介導。一個蛋白二聚化結構域的實例是亮氨酸拉鏈，其介導API轉錄因子的結合。可以用來介導自髮結合的偶聯劑實例是親和素-生物素、抗體-抗原對和受體-配體對。親和素-生物素複合物是本領域4支術人員熟知的兩分子之間最強的非共價結合之一。為了在體外或體內使用親和素-生物素來使成像劑自髮結合，可將親和素與DNA結合結構域或螢光結構域連接，而將生物素與另一結構域連接。在將修飾的結構域引入細胞之後，結構域由於親和素-生物素複合物而自髮結合，從而生成成像劑。化學接頭也可包括任何可以連接兩個多肽的化學基團，比如醯胺、酯、硫酯、磷酯、磷醯胺、酸酐、二硫化物、交聯劑和本領域寺支術人員熟知的其他連接。成像劑還可包括核定位結構域，其通過與合適的細胞器靶向信號或定位宿主蛋白融合而指導成像劑定位到細胞核。編碼定位序列或信號序列的多核苷酸可以連接或融合到編碼成像劑的多核苷酸的5，端，以使信號肽位於所得融合多核苷酸/多肽的氨基端。12例如，任何這些實施方案中的成像劑都可以含有核定位序列(NLS)。NLS使與其相連的蛋白質輸入細胞核中。因此，當成像劑包含NLS時，此成像劑主要定位於核中而不顯著滲漏到胞質中。NLS由帶正電賴氨酸或精氨酸一個或多個短序列組成，比如KKKRKV(SEQIDNO:19)或KRPAATKKAGQAKKKK(SEQIDNO:20)。這些信號被輸入蛋白結合，輸入蛋白通過核孔將含有NLS的蛋白質輸入核中。核定位序列可以來自例如SV40大T抗原、核質蛋白、Chelsky序列、C-myc、hnRNPAl的M9結構域、酵母轉錄抑制子Mata2以及UsnRNP的複合信號。任何這些實施方案中的成像劑還可以包含細胞穿透肽。細胞穿透肽有助於使與其連接的蛋白質穿過質膜進入細胞。細胞穿透肽可以包含多陽離子短序列，比如RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQIDNO:21)或GRKKRRQRRRPPQ(SEQIDNO:22)。細胞穿透肽的實例包括觸角足基因蛋白、穿透素(penetratin)、TAT、transportan、Pep-l、S413-PV和多聚精氨酸。B.核酸另一個方面，本文提供核酸構建體，所述核酸構建體編碼可以結合DNA並在活細胞中表達的成像劑。所述成像劑可以作為融合蛋白通過重組DNA技術產生。蛋白質的重組產生包括表達含有編碼所述蛋白質的序列的核酸。編碼成像劑的核酸可以用本領域公知的方法得到。例如，可以使用基於目的DNA序列的引物，通過聚合酶鏈式反應分離編碼蛋白質的核酸。以下文獻中描述了PCR方法，例如美國專利No.4,683,195;Mullis等，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.51:263,1987和Erlich編輯，PCRTechnology,(StocktonPress,NY，1989)。螢光蛋白的突變體形式可以通過編碼螢光蛋白質的其他核酸的定點誘變得到或者通過隨機誘變得到，隨機誘變是通過使用0.1mMMgCl2和不均衡的核苷酸濃度提高原始多核苷酸的PCR錯誤率而實現的。參見如1994年11月10日提交的美國專利申請No.08/337,915或者1995年11月10日提交的國際申請PCT/US95/14692。表達載體的構建和基因在轉染細胞中的表達涉及使用本領域中公知的分子克隆技術。參見Sambrook等，MolecularCloning—ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY，(1989)和CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel等編輯。任選地，用於將編碼目的多肽表達的序列轉染進細胞中的核酸可以是表達載體的形式，所述表達栽體中包括與編碼表達目的多肽的核酸序列有效連接的表達調控序列。本文所使用的術語"表達調控序列"表示可以調控與其有效連接的核酸序列表達的核酸序列。當表達調控序列控制和調節核酸序列的轉錄(並且適當時控制其翻譯)時，該表達調控序列即為與核酸序列有效連接。因此，表達調控序列可以包括適當的啟動子、增強子、轉錄終止子、蛋白質編碼基因前面的起始密碼子(即ATG)、內含子剪接信號、維持該基因的正確讀碼框以使mRNA正確翻譯和終止密碼子。包含成像劑編碼序列和合適的轉錄/翻譯調控序列的表達載體可以用本領域技術人員公知的方法來構建。這些方法包括體外重組DNA技術、合成4支術和體內重組/基因重組。(參閱如Maniatis等，MolecularCloningALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,N.Y"1989中描述的技術)。可以通過本領域技術人員公知的常規技術用重組DNA轉化宿主細胞。當宿主是原核細胞(如大腸桿菌)時，可以從在指數生長後收集並且隨後用本領域公知操作經CaCh方法處理的細胞製備具有吸收DNA能力的感受態細胞。或者，可以使用MgCl2或RbCl。轉化也可以在形成宿主細胞的原生質體後進行，或者通過電穿孔來實現。當宿主是真核生物時，可以使用下列DNA轉染方法例如DNA-脂質體複合體或磷酸鈣共沉澱、常規機械方法(如顯微注射)、電穿孔、插入脂質體包裹的質粒或者病毒載體。還可以用編碼成像劑的DNA序列和編碼可選擇表型(例如喋呤黴素、新黴素、潮黴素選擇標記和單純皰療病毒胸苷激酶基因)的另一種外源DNA分子共轉染真核細胞。另一種方法是使用真核病毒載體(如猴病毒40(SV40)或牛乳頭瘤病毒)來瞬時或穩、定地感染或轉化真核細胞並表達蛋白質。(EukaryoticViralVectors,ColdSpringHarborLaboratory,Gluzman編輯.，1982)。可通過任何常規方法分離和純化在微生物或真核細胞中表達的多肽，例如製備層析分離和免疫分離，例如涉及使用單克隆或多克隆抗體或抗原的分離技術。可以使用多種宿主表達載體系統來表達編碼成像劑的序列。包括但不限於微生物，例如轉化了重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體的細菌。取決於所使用的宿主/載體系統，在表達載體中可以使用多種適合的轉錄和翻譯元件中的任何一種，包括組成型和誘導型啟動子、轉錄增強子元件、轉錄終止子等(參見如Bitter等，MethodsinEnzymology153:516-544，1987)。例如，在細菌系統中克隆時，可以使用誘導型啟動子，例如X嗟菌體的pL、plac、ptrp和ptac(ptrp-lac雜合啟動子)等。在哺乳動物細胞系統中克隆時，可以使用來自哺乳動物細胞基因組的啟動子(如金屬硫蛋白啟動子)或來自哺乳動物病毒的啟動子(如逆轉錄病毒長末端重複、腺病毒晚期啟動子、痘苗病毒7.5K啟動子)。通過重組DNA或合成技術產生的啟動子也可以用來提供插入的螢光指示劑編碼序列的轉錄。在細菌系統中，可以根據所表達螢光指示劑的預期用途有利地選擇多種表達載體。例如，當需要產生大量螢光指示劑的時候，可以使用指導表達易於純化的高水平融合蛋白產物的載體。在酵母中，可以使用多個包含組成型或誘導型啟動子的載體。綜述可參考CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，Ausubel等編輯，GreenePublish.Assoc.&WileyInterscience,第13章,1988;Grant等,ExpressionandSecretionVectorsforYeast,MethodsinEnzymology,Wu&Grossman編輯，31987，Acad.Press,N.Y"第153巻，516-544頁，1987;Glover,DNACloning,第II巻，IRLPress,Wash.,D.C.,第3章，1986;Bitter,HeterologousGeneExpressioninYeast,MethodsinEnzymology，Berger&Kimmel編輯,Acad.Press,N.Y"第152巻，673-684頁，1987和TheMolecularBiologyoftheYeastSaccharomyces，Strathern等編輯，ColdSpringHarborPress,第I巻和第II巻,1982。可以使用組成型酵母啟動子如ADH或LEU2或者誘導型啟動子如GAL(CloninginYeast,第3章,R.RothsteinIn:DNACloning第11巻，APracticalApproach,DMGlover編輯,IRLPress,Wash.,D.C.,1986)。或者，可以使用促進外源DNA序列整合進酵母染色體的栽體。另一種可用來表達成像劑的表達系統是昆蟲系統。在一個這樣的系統中，使用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus,AcNPV)作為表達夕卜源基因的載體。此病毒生長於沭地夜蛾(S/^o^cfl,w^m/fl)細胞中。螢光指示劑編碼序列可以克隆到病毒的非必需區域(例如多角體蛋白基因)中並置於AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)的調控之下。螢光指示劑編碼序列的成功插入會導致多角體蛋白基因失活，並產生非包含體型重組病毒(即缺乏由多角體蛋白基因編碼的蛋白外殼的病毒)。接著使用這些重組病毒感染草地夜蛾細胞，插入的基因在該細胞中表達。參見Smith等，J.Viol.46:584，1983;Smith,美國專利申請No.4，215，051。可以改造利用重組病毒或病毒元件指導表達的哺乳動物細胞系統。例如，當使用腺病毒表達載體時，成像劑編碼序列可與腺病毒轉錄/翻譯控制複合體連接，例如與後期啟動子和三聯前導序列連接。然後可以通過體外或體內重組將此嵌合基因插入到腺病毒基因組中。病毒基因組非必需區域(如El或E3區)中的插入會產生有活力並且能在感染宿主中表達成像劑的重組病毒(參見如Logan&Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:3655-3659,1984)。或者，也可以4吏用牛痘病毒7.5K啟動子(參見如Mackett等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79:7415-7419,1982;Mackett等,J.Virol.49:857-864,1984;Panicali等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:4927-4931，1982)。在一些實施方案中，可以改造基於牛乳頭瘤病毒的載體，所述牛乳頭瘤病毒具有作為染色體外元件進行複製的能力(Sarver等，Mol.Cell.Biol.1:486,1981)。此DNA進入細胞後不久，質粒即複製到大約每細胞100-200個拷貝。所插入cDNA的轉錄不需要質粒整合進宿主染色體，因此獲得高水平的表達。這些栽體可以通過在質粒中引入選擇標記(例如neo基因)而用於穩定表達。或者，可以修飾反轉錄病毒的基因組，以用作能夠將成像劑基因引入宿主並指導其表達的載體(Cone&Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6349-6353，1984)。高水平的表達可以通過使用誘導型啟動子來實現，包括但不限於金屬硫蛋白IIA啟動子和熱激啟動子。在一個說明性實施方案中，可以通過穩定表達來長期高產量地生產重組蛋白。可以使用適當表達調控元件(如啟動子、增強子、轉錄終止子、多腺苷酸化位點等)控制下的成像劑DNA和選擇標記轉化宿主細胞，而不是使用包含細菌複製起點的表達載體。重組質粒中的選擇標記賦予細胞對選擇的抗性，使細胞能夠將質粒穩定整合到其染色體中，並生長形成轉化灶，接著可將轉化灶克隆並擴大成細胞系。例如，在引入外源DNA之後，可使改造細胞在富集培養基中生長1-2天，接著換成選擇培養基。可以使用多種選擇系統，包括但不限於例如單純皰滲病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell,11:223,1977)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska&Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:2026,1962)以及腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Lowy等，Cell,22:817，1980)基因分別可用於tk-細胞、hgprt細胞或aprt細胞中。同樣，抗代謝物抗性也可以作為以下基因的選擇基礎賦予對氨甲喋呤的抗性的dhfr(Wigler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:3567，1980;O，Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8:1527，1981);賦予對黴酚酸的抗性的gpt(Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:2072，1981);賦予對氨基葡糖苷G-418的抗性的neo(Colberre畫Garapin等，J.Mol.Biol"150:1，1981)和賦予對潮黴素的抗性的hygro(Santerre等，Gene,30:147,1984)。近來還報導了其他選擇基因例如允許細胞利用丐l咮代替色氨酸的trpB;允許細胞利用組胺醇代替組氨酸的hisD(Hartman&Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8047，1988)，以及賦予對鳥氨酸脫羧酶抑制劑2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸(DFMO)的抗性的ODC(鳥氨酸脫羧酶)(McConlogueL.，In:CurrentCommunicationsinMolecularBiology,ColdSpringHarborLaboratory,1987年編輯)。本文描述的構建體還可以包含使成像劑分離簡化的標籤。例如，抗將多組氨酸標籤(如6個組氨酸殘基的標籤)插入螢光蛋白的氨基端。多組氨酸標籤允許通過鎳螯合色譜方便地一步式分離蛋白質。可將表達載體轉染到宿主細胞中，以表達重組核酸。可以選擇表達水平高的宿主細胞用於純化螢光指示劑融合蛋白。大腸桿菌可用於這一目的。或者，宿主細胞可以是選擇用成像劑進行成像的原核或真核細胞。這類細胞可以是如培養細胞或體內細胞。成像劑的一個優點是它們是通過正常的蛋白質合成產生的。構建體可以在大腸桿菌中大規模表達。當序列包含多組氨酸標籤以通過鎳螯合色譜一步式純化時，從細菌中純化蛋白質將是很簡單的。或者，可以在目的宿主細胞中直接表達底物，以用於原位檢測。特別地，可通過調控序列來控制轉錄，例如通過與功能性編碼核酸序列有效連接的啟動子和增強子來進行控制。啟動子中包含被轉錄因子和其他調節因子識別的特定DNA序列。轉錄因子起始與其有效連接的核酸的轉錄。調節因子可以是調控轉錄水平的蛋白質或其他化學物質。增強子是可以進一步調節核酸序列轉錄的順式調節元件。在一些實施方案中，編碼成像劑的核酸構建體包含與編碼成像劑的核酸有效連接的啟動子。該啟動子可以是強組成型啟動子、弱組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導型啟動子。強組成型啟動子活性很強，因此可表達大量蛋白質，使成像細胞發出強螢光。弱組成型啟動子具有最低限度的活性，因此所表達蛋白質的量可以清晰地顯示細胞中凝聚染色體的位置和形狀，而不會被螢光背景幹擾。誘導型啟動子應答於刺激，因此可在很大範圍內控制所編碼多肽的表達水平，以用於多種應用。在一些說明性實施方案中，強組成型啟動子是CMV早期啟動子。在一些說明性實施方案中，弱組成型啟動子是截短的CMV早期啟動子。誘導型啟動子的實例有可由IPTG誘導的lac啟動子、可由熱激誘導的hsp70啟動子、四環素誘導型啟動子、RSL1誘導型啟動子、糖皮質激素誘導型啟動子和其他激素誘導型啟動子。可將編碼蛋白質成像劑的核酸構建體引入載體中。栽體便於對核酸構建體進行克隆、分離和操作。一些載體還包含用於特殊用途(例如控制多肽在細胞內的表達水平)的序列。在一些實施方案中，所述載體包括但不限於pGEM陽TEasy、pBluescript、TOPO克隆載體、pCR-Script和pT7Blue-T。在一些說明性實施方案中，包含成像劑的栽體具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的序列。另一方面，本文提供細胞，其包含成像劑、表達成像劑的核酸構建體和/或包含表達螢光蛋白質成像劑的核酸構建體的栽體。在一些實施方案中，成像劑可以存在於多種人類癌細胞系中。人類癌細胞系的實例包括但不限於A549、H1299、HeLa、HL60、K562、KG-1、Jurkat、Lncap、MCF-7、MDA國MB誦438、T47D、THP-1、U87、SHSY5Y、MCF-10A、T84、Peer和BxPC3。也可以使用其他本領域技術人員公知的人和非人細胞系。表達螢光蛋白質成像劑的細胞可以用來評估藥物18和其他藥劑在例如癌細胞和其他細胞類型中對細胞分裂、生長和凋亡的影響。在一個說明性的實施方案中，核酸構建體是pHMGBl-EGFP，其含有下文所示的SEQIDNO:1的序列特徵位置CMV早期啟動子1..589HMGB1639.1286EGFP1326,.2045SV40/polyA2199..2249Kana/Neo3276..4070PUC複製起點4655..52981TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCG61CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATT121GACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCA181ATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCC241AAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTA301CATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTAC361CATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGG421ATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACG481GGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGT541ACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTA601CCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCGATTATGGGCAAAGGAGATCCTAAGA661AGCCGAGAGGCAAAATGTCATCATATGCATTTTTTGTGCAAACTTGTCGGGAGGAGCATA721AGAAGAAGCACCCAGATGCTTCAGTCAACTTCTCAGAGTTTTCTAAGAAGTGCTCAGAGA781GGTGGAAGACCATGTCTGCTAAAGAGAAAGGAAAATTTGAAGATATGGCAAAAGCGGACA841AGGCCCGTTATGAAAGAGAAATGAAAACCTATATCCCTCCCAAAGGGGAGACAAAAAAGA901AGTTCAAGGATCCCAATGCACCCAAGAGGCCTCCTTCGGCCTTCTTCCTCTTCTGCTCTG961AGTATCGCCCAAAAATCAAAGGAGAACATCCTGGCCTGTCCATTGGTGATGTTGCGAAGA1021AACTGGGAGAGATGTGGAATAACACTGCTGCAGATGACAAGCAGCCTTATGAAAAGAAGG1081CTGCGAAGCTGAAGGAAAAATACGAAAAGGATATTGCTGCATATCGAGCTAAAGGAAAGC1141CTGATGCAGCAAAAAAGGGAGTTGTCAAGGCTGAAAAAAGCAAGAAAAAGAAGGAAGAGG1201AGGAAGATGAGGAAGATGAAGAGGATGAGGAGGAGGAGGAAGATGAAGAAGATGAAGATG1261AAGAAGAAGATGATGATGATGAATCGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCG1321CCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGC1381TGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCA1441CCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGC1501CCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACA1561TGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCA1621TCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACA1681CCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGG1741GGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGA1801AGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGC1861TCGCCGACCACTACCAG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路徑長度，從而提高量子效率。光子放大設備在光子擊中檢測屏之前對其進行放大。這類設備包括帶有增強器(例如微通道增強器)的CCD照相機。微通道增強器可以包括金屬通道的陣列，它與照相機的檢測屏垂直，截面與其大小相同。所述微通道陣列置於待成像的樣品、對象或動物與照相機之間。多數進入陣列通道的光子會在射出通道前接觸通道的側壁。加在陣列上的電壓使得每次光子碰撞時釋放許多電子。這些碰撞中產生的電子以"鳥槍"模式射出通道，並通過照相機進行檢測。圖像處理器對光電探測裝置通過光子計數所產生的信號進行處理，以生成例如可在顯示器上顯示或在圖像印表機上列印的圖像。當圖像轉換成數字文件形式後，它們可通過多種圖像處理程序來處理並列印。在一個實施方案中，對成像劑發射的光子進行計數。如果採用光子計數法，則對光子發射的測量會產生一個數值陣列，代表圖像處理器中每個像素位置所檢測到的光子數。使用這些數值生成圖像將光子計數標準化(對預選的固定值標準化，或者對任一像素上檢測到的最大數值標準化)，並將標準化的數值轉換成顯示器上顯示的亮度(灰度)或顏色(假色)。在假色的表示法中，典型的顏色分配如下。o光子計數的像素定為黑色，低計數的為藍色，並隨計數的增加而提高顏色的波長，最高的光子計數值為紅色。顏色在顯示器上的位置代表光子發射的分布，相應地也代表發光成像劑的位置。為了給細胞中的核和/或染色體提供參照標準，可以生成從中測量光子發射的細胞的全彩圖或全灰度圖，例如在微光下打開成像室或成像盒的門並測量反射的光子。所述全彩圖或全灰度圖可以在測量光子發射之前或之後生成。將光子發射圖與所述全彩圖或全灰度圖疊加，產生相對於細胞的光子發射合成圖。如果需要隨時間跟蹤成像劑的定位和/或信號，例如記錄一種處理對成像劑分布和/或定位的影響，那麼可以按選定的時間間隔重複進行光子發射測量或成像，以生成一系列圖像。間隔可以短至數分鐘或長至數天或數星期。可以通過多種方法分析通過本文所述方法產生的圖像和/或4吏用本文所述成像劑產生的圖像。包括從簡單的肉眼觀察、腦力評估和/或列印硬拷貝到複雜的數字圖像分析等。對分析中所得信息的解讀取決於意圖觀察的事件和所使用的實體。在一些實施方案中，含有成像劑的細胞中的螢光水平與參照螢光水平相比的差異可指示所研究的細胞事件。所述參照水平可以是對照細胞。本領域技術人員能夠根據研究的類型來選擇合適的對照。在一個說明性實施方案中，當細胞事件導致細胞的核或染色體失去完整性時，螢光水平的差異可能是相對於參考螢光水平的螢光強度降低。在另一個說明性實施方案中，當細胞事件導致細胞的核或染色體失去完整性時，螢光水平的差異可以是螢光定位相對於參考細胞內螢光定位的改變。B.篩選分子藥劑的方法該方法可在體內實施，其中測試化合物(如生物效應分子)和成像胞樣;口接觸。因此，本文也涉及預測醫學領域，該領域是將i斷測i、預後測定、藥物基因組學和對臨床試驗的監測用於預後(預測)目的，來分析生物效應分子對得自受試者的細胞樣品的影響。在一些實施方案中，對存在或不存在生物效應分子(藥物或其他分子藥劑)時核與染色體的狀態進行比較。在一個實施方案中，所述方法可監測藥劑對細胞中一種或多種核相關特徵的影響。這些測定可用於基礎藥物篩選和臨床試驗。例如，藥劑增強(或減弱)一種或多種核相關特徵的效力可在患有與所述核相關特徵有聯繫的疾病的受試者中進行監測。可以通過施用藥劑並觀察應答(如螢光在量和定位上的改變)來鑑定影響一種或多種核相關改變的藥劑。這樣，所述一種或多種核相關改變能夠作為標記，指示受試者對該藥劑的生理應答。相應地，可以在用該藥劑治療個體之前和治療過程中的任何時間點測定這種應答狀態。在一個實施方案中，可以在引入成像劑或編碼成像劑的核酸之前、同時或之後對細胞或細胞群施用藥劑。然後可對所述細胞或細胞群進行成像，以確定螢光的總體水平和/或螢光的定位。在任何一種情況中，數據均可通過計數圖像中(或圖像中特定的位置中)的像素來量化。可將圖像和/或量化的像素數據與參照或對照細胞進行比較。參照細胞可以是未接觸該藥劑的相同細胞類型。在一個實施方案中，成像劑被用來觀察生物效應分子對癌細胞的影響。例如，癌症細胞通常喪失進行凋亡和受控細胞分裂及生長的能力，這些事件可通過成像劑所示核與染色體的位置和特徵來進行追蹤。在另一些實施方案中，使用本文公開的成像劑觀察化合物(包括但不限於殺蟲劑、除草劑、小分子、毒素、核酸和多肽)對細胞的影響。可進行測試的生物效應分子的詳細種類在下文提供。本文還提供用於在樣品的細胞中測試化合物生物活性的方法。所述方法(本文也稱為"篩選測定")可以用來鑑定促進實現一種或多種細胞狀態(如凋亡、能量情況、代謝、染色體結構或動態或者細胞骨架的組裝)的調節劑，即候選物或測試化合物或藥劑(如肽、擬肽、小分子或其他藥物)。本文還包括本文所述篩選測定中鑑定的化合物。在一個實施方案中，將測試化合物的組合文庫與成像劑聯合使用，來評估化合物對一種或多種細胞的影響。所述測試化合物可使用本領域公知的任何多種組合文庫法獲得，這些方法包括生物文庫、空間可尋址並行(spatiallyaddressableparallel)固相或液相文庫、需要解巻積的合成文庫法、"一珠一化合物"文庫法和利用親和色譜篩選的合成文26庫法。生物文庫法僅限於肽文庫，而其他四種方法可以應用到肽，非肽寡聚體或小分子化合物文庫。參閱如Lam,1997.AnticancerDrugDesign12:145。化合物和/或生物混合物(例如真菌、細菌或藻類提取物)的文庫是本領域已知的，並可使用本文描述的任何測定來進行篩選。合成分子文庫的方法實例可以在本領域找到，比如DeWitt等，1993.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6卯9;Erb等，1994.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9111422;Zuckermann等，1994.J.Med.Chem.37:2678;Cho等，1993.Science261:1303;Carrell等，1994.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carell等,1994.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061和Gallop等，1994.J.Med.Chem.37:1233。化合物文庫可存在於溶液(如Houghten,1992.Biotechniques13:412-421)或珠子(Lam，1991.Nature354:82-84)、晶片(Fodor,Nature364:555-556,1993)、細菌(Ladner，美國專利No.5,223,409)、孢子(Ladner,U.S.Pat.No.5,233,409)、質粒(Cull等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1865-1869,1992)或噬菌體(Scott和Smith,Science249:386國3卯,19卯)中；Devlin,Science249:404-406，19卯；Cwirla等，Proc.Natl.AcadSci.U.S.A.87:6378-6382,19卯；Felici,J.Mol.Biol.222:301-310，1991;Ladner,美國專利No.5,233,409.)。本發明方法中使用的測試化合物可以由任何已知的文庫提供，比如包含無機和有機化合物、肽、蛋白質、激素、抗體等的小分子文庫。或者，測試化合物可來自任何生物來源，例如植物、組織、體液(如血、淋巴)等。如果分析生物來源的測試化合物的調控潛力，則可以在加入細胞中之前將這些來源勻漿。因此，測試化合物是以確定並且可再現的形式加入細胞中的。這樣的勻漿來源可以是細胞懸液，並可包含細胞、細胞部分等。如果不這樣加入勻漿的材料，則可以在加入細胞中之前(或在加入之後)通過常規生化方法(例如色鐠，如親和色鐠(HPLC、FPLC等)、尺寸排阻色鐠等)或者細胞分選測定、抗體檢測等方法從這些勻漿來源中分離或提取。在一個實施方案中，僅有一種測試化合物與細胞接觸。但是，可以向樣品中加入一種以上的測試化合物加入，例如2-10、2-50、2-100或27更多種測試化合物。這類實施方案允許同時篩選幾種測試化合物。對宿主細胞中成像劑的(改變的)螢光信號的檢測是通過任何一種前述的螢光檢測方法實現的。可以觀察與未接觸測試化合物相比，接觸了這種化合物的細胞中螢光信號強度或定位的變化，從而顯示測試化合物對細胞的影響。在某些實施方案中，可以用本文描述的成像劑來確定化療劑對一種或多種細胞的影響。藥劑或因子可以包括在對細胞應用時引起DNA損傷的任何化學物質。化療劑包括但不限於5-氟尿嘧啶、博來黴素、白消安、喜樹鹼、卡鉑、苯丁酸氮芥、順鉑(CDDP)、環磷醯胺、放線菌素D、柔紅黴素、多柔比星、雌激素受體結合劑、依託泊苷、(VP16)、法尼基蛋白轉移酶抑制劑、吉西他濱、異環磷醜胺、雙氯乙基甲胺、美法侖、絲裂黴素、長春瑞濱、亞硝基脲、普卡黴素、丙卡巴肼、雷洛昔芬、他莫昔芬、紫杉醇、替莫唑胺(DTIC的水性形式)、反鉑、長春鹼和氨甲喋呤、長春新鹼或前述物質的任何類似物或衍生變體。多數化療劑歸入下列種類烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、皮質類固醇激素、有絲分裂抑制劑和亞硝基脲類、激素劑、混雜劑(miscellaneousagent)及其任何類似物或衍生變體。化療劑和給藥方法、劑量等為本領域技術人員熟知(參閱如"PhysiciansDeskReference,"Goodman&Gilman，s"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics"和"Remington'sPharmaceuticalSciences,"，相關部分通過參考併入本文)，並可與本文所述的成像劑結合。根據所分析細胞的情況或類型，一些劑量改變將是必要的。在任何情況下，負責給藥的人員將確定合適的劑量。本文描述了具體化療劑的實例。當然，所有這些藥劑均用於說明而非限制，技術人員可以對特定的病人或用途使用其他藥劑。技術人員可參考"Remington'sPharmaceuticalSciences"第15版，第33章，特另'J是624-652頁。根據受治個體的情況，一些劑量變化將是必要的。在任何情況下，負責給藥的人員將確定合適的劑量。烷化劑是直接與基因組DNA相互作用以阻止癌細胞增殖的藥物。這類化療藥物代表了影響細胞周期中所有階段的藥劑，也就是說，他們不是階段特異性的。烷化劑可包括但不限於氮芥、氮丙啶、甲基三聚氰胺、烷基磺酸酯、亞硝基脲或三喚。它們包括但不限於白消安、苯丁酸氮芥、順鉑、環磷醯胺(cytoxan)、達卡巴喚、異環磷醯胺、雙氯乙基甲胺(氮芥)和美法侖。抗代謝物破壞DNA和RNA的合成。與烷化劑不同，他們特異性地在S期中影響細胞周期。抗代謝物可以分為多個種類，例如葉酸類似物、嘧啶類似物和噪呤類似物和相關的抑制性化合物。抗代謝物包括但不限於5氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、氟達拉濱、吉西他濱和氨曱喋呤。天然產物通常指最早從天然來源分離得到並已鑑定為具有藥理學活性的化合物。這些化合物、其類似物和衍生物可以從天然來源分離、化學合成或用任何本領域技術人員公知的技術重組產生。天然產物包括下列種類，例如有絲分裂抑制劑、抗肺瘤抗生素、酶和生物應答調節劑。有絲分裂抑制劑包括植物鹼和其他能夠抑制細胞分裂或有絲分裂所需的蛋白質合成的天然藥劑。它們在細胞周期的特定時期發生作用。有絲分裂抑制劑包括如多西紫杉醇、依託泊苷(VP16)、替尼泊苷、紫杉醇、泰素、長春鹼、長春新鹼和長春瑞濱。紫杉烷是一類從紅豆杉(Taxusbrevifolia)的樹皮中分離的相關化合物。紫杉烷包括但不限於諸如多西紫杉醇和紫杉醇的化合物。紫杉醇與微管蛋白結合(其位點不同於長春花鹼類的結合位點)並促進微管的組裝。長春花鹼類是一類已經鑑定為具有藥物活性的植物鹼。它們包括諸如長春花鹼(VLB)和長春新鹼。抗腫瘤抗生素同時具有抗微生物活性和細胞毒素活性。這些藥物通過對酶和有絲分裂進行化學抑制或改變細胞膜來幹擾DNA。這些試劑不是階段特異性的，因此它們在細胞周期的所有時期中都發揮作用。抗腫瘤抗生素的例子包括但不限於博來黴素、放線菌素D、柔紅黴素、多柔比星(阿黴素)、普卡黴素(光輝黴素)和伊達比星。當皮質類固醇激素用於殺死癌細胞或延緩其生長時，則認為它們是化療藥物。皮質類固醇激素能夠增強其他化療劑的效用，因而他們通常在聯合治療中使用。潑尼松和地塞米松是皮質類固醇激素的實例。黃體酮類例如己酸羥孕酮、醋酸甲羥孕酮和醋酸甲地孕酮已經用於子宮內膜癌和乳腺癌。雌激素類例如己烯雌酚和乙炔基雌二醇已經用於諸如乳腺癌和前列腺癌的癌症。抗雌激素類例如他莫昔芬已經用於諸如乳腺的癌症。雄激素類例如丙酸睪酮和氟甲睪酮已經用於治療乳腺癌。抗雄激素類例如氟他胺已經用於治療前列腺癌。促性腺素釋放激素的類似物例如亮丙瑞林已經用於治療前列腺癌。根據其活性，一些化療劑並不屬於前述種類。它們包括但不限於鉑配位絡合物、蒽二酮、取代脲、甲肼衍生物、腎上腺皮質激素抑制劑、安吖啶、L-天冬醯胺酶和維A酸。它們也可用於本文描述的組合物和方法之中。蒽二酮(例如米託蒽醌)已經用於治療急性粒細胞性白血病和乳腺癌。取代脲(例如羥基脲)已經用於治療慢性粒細胞性白血病、真性紅細胞增多、自發性凝血細胞增多和惡性黑素瘤。甲基肼衍生物(例如丙卡巴肼(N-甲基肼，MIH)已經用於治療霍奇金病。腎上腺皮質激素抑制劑(例如米託坦)已經用於治療腎上腺皮質癌，而氨魯米特已經用於治療霍奇金病。凋亡(或稱為程序性細胞死亡)是對於正常胚胎發育、保持成體組織的內穩態和抑制癌症發生非常重要的過程(Kerr等，1972)。在其他系統中，已經證明Bcl-2家族的蛋白質和ICE樣蛋白酶是非常重要的凋亡的調節劑和效應物。發現與濾泡性淋巴瘤相關的Bcl-2蛋白在應答於多種凋亡刺激而控制凋亡和提高細胞存活方面發揮重要作用(Bakhshi等，1985;Cleary和Sklar，1985;Cleary等，1986;Tsujimoto等，1985;Tsujimoto和Croce，1986)。現在認為，在進化上保守的Bcl-2蛋白是一個相關蛋白質家族的成員，這個家族可以歸類為死亡激動劑或死亡拮抗劑。已經顯示，這些不同的家族成員具有和Bcl-2類似的功能，或者與Bcl-2功能相反而促進細胞死亡(如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。促凋亡劑的非限制性實例包括短桿菌肽、爪蟾抗菌肽、二甲雙胍、防衛素和殺菌肽。在某些實施方案中，所述分子藥劑是血管發生劑，例如血管緊張素、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原活化劑的抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、幹擾素、白介素12、血小板因子IV、IP-IO、Gro-p、血小板反應素、2-曱氧基雌二醇、增殖蛋白相關蛋白、羧氨三唑、CM101、馬立馬司他、戊聚糖多硫酸酯、血管生成素2(Regeneron)、幹擾素-a、除莠黴素A、PNU145156E、16K促乳素片段、利諾胺、沙利度胺、己酮可可鹼、染料木黃酮、TNP-470、內皮抑制素、紫杉醇、accutin、制管張素、西多福韋、長春新鹼、博來黴素、AGM-1470、血小板因子IV或米諾環素。具體實施例方式下列實施例進一步說明本公開內容，這些實施例不應視為任何形式的限制。實施例1-HMGB1-EGFP融合蛋白構建體的製備HMGBlcDNA序列是使用以下引物通過"基因組DNA剪接，，策略(An等，PLoSONE2(11):e1179(2007))從基因組DNA中裝配的。表i.pcr引物tableseeoriginaldocumentpage31將HMGB1克隆到pGEM-TEasy(Promega)之後，對3個克隆進行測序並與GenBank提供的野生型序列(NM—002128)進行比較。將一個野生型克隆亞克隆進真核表達載體pEGFP-lac，得到5380bp的構建體pHMGBl-EGFP，其中HMGB1基因與EGFP融合，並通過CMV早期啟動子和增強子表達(圖1)。實施例2-使活細胞的核成像用如實施例1所述製備的pHMGBl-EGFP質粒轉染人胚腎細胞(HEK293FT)和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在平行的對照實驗中，用僅表達EGFP的質粒轉染細胞。48小時之後，使用螢光顯微鏡觀察細胞。如圖2的螢光顯微鏡圖像所示，HMGB1-EGFP融合蛋白在兩種細胞中均定位到核中，從而使其成像。但是，在對照實驗中，單獨的EGFP擴散到整個細胞，而無法提供可區分的核成像。因此，本文描述的融合蛋白構建體可用於活細胞中核的成像。實施例3-在活細胞中監測凋亡用如實施例1所述製備的pHMGBl-EGFP質粒轉染人胚腎細胞(HEK293FT)和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在平行的對照實驗中，用僅表達EGFP的質粒轉染細胞。24小時之後，從細胞培養基中除去胎牛血清(FBS)來誘導凋亡。對照培養基中不除去FBS。再孵育48小時之後，通過螢光顯微鏡觀察細胞。如圖3的螢光顯微圖像所示，FBS的除去導致明顯的細胞形狀變圓(與凋亡相關)，以及因核的凋亡性破壞導致的螢光擴散到整個細胞中。對照細胞保持其正常形狀，螢光局限在核內。因此，本文描述的融合蛋白構建體可用於在活細胞中監測凋亡。實施例4-構建ptrEGFP-HMGBl表達質粒如實施例1所述從基因組DNA中裝配HMGB1cDNA序列，並克隆進真核表達載體pEGFP-lac，其中HMGB1基因與EGFP融合，並通過截短的CMV早期啟動子和增強子表達(圖4，SEQIDNO:2)。實施例5-使活細胞中的染色體成像用如實施例4所述製備的ptrEGFP-HMGBl質粒轉染細胞(如HEK293FT或中國倉鼠卵巢細胞)。48小時之後，使用秋水仙素通過標準核型分析步驟觀察染色體。通過螢光顯微術使細胞成像。結果示於圖5A和圖5B，顯示用ptrEGFP-HMGBl轉染的細胞可提供可區分的染色體成像。實施例6-使接觸生物效應分子的細胞成像在此實施例中，用如實施例1所述製備的編碼成像劑的核酸構建體來轉染培養的癌細胞系(例如選自表2的癌細胞系)。表2.人類癌細胞系tableseeoriginaldocumentpage33接著將轉染細胞分成兩份培養物。在一份培養物中，使細胞與適當劑量的生物效應分子(如化療劑或其他小分子，或者基於DNA或RNA的藥物)接觸。第二份培養物中的細胞不進行處理。一段時間(l分鐘、30分鐘、l小時、1天、l周等)之後，用螢光顯微術使細胞成4象。可以觀察核的完整性以及染色體的結構和動態。對處理細胞的染色體結構和動態進行觀察，並與未處理的細胞進行比較。通過測量圖像中的像素和/或螢光強度來量化數據。與未處理對照培養物相比，經處理的培養物中細胞的螢光量減少或位置改變(如擴散)可用於評估生物效應分子在癌細胞系中誘導凋亡或其他核相關改變的效力。等同方案本發明不僅限於本申請中所述的具體實施方案，這些實施方案僅旨在闡述本發明的單個方面。對於本領域技術人員而言顯而易見的是，可以進行許多修改和改變，而不偏離其構思和範圍。結合上文的描述，本發明範圍內除本文所列舉以外的功能等同的實施方案對於本領域技術人員而言將是很明顯的。這些修改和改變旨在與權利要求書所述等同方案的完整範圍一起落入權利要求書的範圍內。應當理解，本發明不受限於具體的方法、試劑、化合物組合物或生物體系，它們當然是可以變化的。還應當理解，本文使用的術語僅用於描述具體的實施方案，而不旨在限制。對於本文中基本上任何單數和/或複數形式的術語而言，普通技術人員可以將單數形式解釋為複數形式和/或將複數形式解釋為單數形式，只要該上下文和/或應用中允許即可。為清楚起見，本文中也可能明確表示了各種單數/複數形式的變換。另外，當以馬庫什組的形式描述本發明的特徵或方面時，本領域技術人員會明白，本文也涵蓋了該馬庫什組的任何個體成員或成員亞組而言的描述。就像本領域技術人員可以理解的那樣，對於任何及全部目的，特別是就提供書面描述而言，本文公開的所有範圍還包括任何及全部可能的小範圍及其小範圍的組合。任何列出的範圍可以很容易地認為是對同一範圍分成相等的至少兩部分、三部分、四部分、五部分、十部分等而進行了描述。作為非限制性的實例，本文討論過的每個範圍可以容易地分為前三分之一、中間三分之一和後三分之一等。本領域技術人員還會理解，詞語例如"多至"、"至少"、"多於"、"少於"等包括所提到的數值，並指可以如上所述分成小範圍的範圍。最後，本領域技術人員會理解，範圍包括每個個體成員。因此，例如，含有1-3個細胞的組是指含有1個、2個或3個細胞的組。類似的，含有1-5個細胞的組是指含有1個、2個、3個、4個或5個細胞的組，依此類推。儘管本文公開了多個方面和實施方案，但其他方面和實施方案對於本領域技術人員來說也是顯而易見的。本文公開的多個方面和實施方案僅用於說明目的而非限制，真正的範圍和構思由以下的權利要求進行說明。序列表童貽剛安小平張昕用於使活細胞中核與染色體成像的融合蛋白091619-0125-012622Patentlnversion3-315380DNA人工序列人工序列描述合成構建體1tagttattaatagtaatcaattacggggtc汰ttagttcatagcccatatatggagttccg60cgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccatt120gacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtca180atgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgcc2<40aagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagta300catgaccttatgggactttcctaettggcagtacatctacgtattagtcatcgctattac360catggtg邁tgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacgggg420atttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacg480gg汪ctttccaaaatgtcgtaaca汪ctccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgt540acggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgcta600ccggactcagatctcgagctcaagcttcgaattcgattatgggcaaaggagatcctaaga660agccgagaggcaaaatgtcatcatatgcattttttgtgcaaacttgtcgggaggagcata720agaagaagcacccagatgcttcagtcaacttctcagagttttctaagaagtgctcagaga780ggtggaagaccatgtctgctaaagagaaaggaa肌tttgaagatatggcaaaagcggaca840aggcccgttatgaaagagaaatgaaaacctatatccctcccaaaggggagacaaaaaaga900agttcaaggatcccaatgcacccaagaggcctccttcggccttcttcctcttctgctctg960agtatcgcccaaaaatcaaaggagaacatcctggcctgtecattggtgatgttgcgaaga1020aactgggagagatgtggaataacactgctgcagatgacaagcagccttatgaaaagaagg1080ctgcgaagctgaaggaaaaatacgaaaaggatattgctgcatatcgagctaaaggaaagc1140ctg汪tgcagcaaaaaagggagttgtcaaggctgaaaaaagca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