活性藥劑控制釋放的多泡脂質體的製備的製作方法

2023-10-17 20:32:24 1

專利名稱：活性藥劑控制釋放的多泡脂質體的製備的製作方法
發明的背景1.發明的所屬領域本發明涉及包裹生物活性物質之脂質體的多泡脂質體組合物。更具體地說，本發明涉及生產和使用被包裹物質具有可控制之釋放速率的多泡脂質體的方法。
2.相關現有技術用許多藥物進引最佳治療時常常要求長時間地保持藥物水平。例如，用細胞周期特異性抗代謝物進行最佳抗腫瘤治療時需要長時間地維持細胞毒性藥物的水平。阿糖胞苷是一種高療程依賴性抗腫瘤藥物。因為這種藥物只在細胞合成DNA時才殺傷之，所以為獲得最佳細胞殺傷效果，需要使細胞長時間暴露於治療濃度的藥物中。又鑑於這類藥劑在靜脈內或皮下給藥後的半壽期可能短至幾個小時，所以它們的治療效果也就很成問題。為了使象阿糖胞苷這樣的細胞周期特異性藥物達到最佳腫瘤細胞殺傷效果。有兩個主要要求首先，必須使腫瘤細胞接觸到對宿主沒有明顯不可逆損害的高濃度藥物；其次，必須使腫瘤長時間接觸到藥物，以保證有最大數目的腫瘤細胞處於細胞增殖的敏感性DNA合成期。
另一類療程依賴性藥物的實例是氨基糖苷類抗生素。例如，丁胺卡那黴素是一種對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌菌株有顯著臨床抑制活性的氨基糖苷類抗生素。按照現有治療程序，該藥物的給藥方法是每天靜脈內或肌肉內給藥一次或兩次。最常用的臨床使用劑量是15mg/kg/天，此相當於每天1克的最大推薦劑量。然而，這種給藥方法將導致病人對藥物的依賴，增加全身用藥的毒付作用。因此，用於治療感染的局部貯存慢釋放製劑，例如局限於軟組織或骨骼局部區域的藥物製劑，與全身治療用藥相比，在增加局部組織藥物水平，同時降低或避免游離藥物的全身毒性方面應是有其優點的。
特別有用的是受控制的釋放製劑，它可用於在幾小時，幾天、甚至幾周時間內釋放治療量的藥物。
已被用於提供控制藥物釋放之組合物的一個手段是脂質體包裹。在幾種主要類型的脂質體中，多泡脂質體(Kim，等，Biochim，Biophys.Acta；728339-348，1983)完全不同於單層脂質體(Huang，Biochemistry，8334-352，1969；Kim，等，Biochim，Biophys.Acta；6461-10，1981)、多層脂質體(Bangham，等J.Mol.Biol.，13238-252，1965)和穩定的多層脂質體(美國專利No.4,522,803)。與單層脂質體相反，多泡脂質體含有多個水性內腔。與多層脂質體不同，多泡脂質體的多個水性腔是不同心的。現有技術中描述了許多生產各種類型單層和多層脂質體的技術；例如，美國專利No.4,522,803(Lenk)；4,310,506(Baldeschwieler)；4,235,871(Papahadjopoulos)；4,224,179(Schneider)；4,078,052(Papahadjopoulos)；4,394,372(Taylor)；4,308,166(Marchetti)；4,485,054(Mezei)和4,508,703(Redziniak)；Szoka，等，1980，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，2465-508；Liposomes，Marc J.Ostro，Ed.，Marcel-Dekker，Inc.，New York.1983，第一章；Poznansky和Juliano.Pharmacol.Rev.，36277-236，1984。現有技術也描述了生產多泡脂質體的方法(Kim等，Biochim，Biophys.Acta；728339-348，1983)。
在Kim等人(Biochim，Biophys.Acta；728339-348，1983)的方法中，某些小分子例如阿糖胞苷(也簡寫為Ara-C)的包裹率相對較低，並且被包入囊泡內的分子在生物體液中的釋放速率較高。因此，發展了一種使用鹽酸化物來減慢被包裹分子在生物體液中之釋放速率的組合物(Kim的於1993年2月21日提交的申請序號為No.08/020,483的美國專利部分後讀申請)。
進一步的研究顯示，可以在製成多泡脂質體之前，藉助改變溶解有被封裝物質之酸性溶液的性質來控制這些物質在人血漿中從多泡脂質體內釋放的速率(Sankavam和Kim的1993年11月1 6日提交的美國專利申請序號No.08/153,657)。在這些研究工作中，發現某些無機酸例如鹽酸、硝酸和高氯酸產生了最慢的釋放速率，而其他一些酸例如乙酸、三氟乙酸和三氯乙酸則產生中等程度的釋放速率。使用二元和三元酸例如硫酸和磷酸可獲得最快的釋放速率。以這種方法產生的脂質體組合物具有必須使用酸來產生有預期之藥物釋放動力性質的多泡脂質體的缺點。此外，某些可能提供多泡脂質體中的預期藥物釋放速率的酸也存在有藥物加工方面的問題，例如腐蝕金屬容器和生產中所使用的部件。另外，如果不使用酸即可產生在體內環境下實際應用的多泡脂質體，將可能避免潛在的對酸不穩定物質之穩定性方面的問題。
研究已經表明，可以在脂質體中引入質子載體或離子載體以產生膜電位，以調節被包裹之生物學物質從脂質體中向水性環境中釋放的速率(美國專利No.5,077,056)。另外，歐洲專利申請EP 0126580中公開了控制藥物從囊泡組合物中釋放的速率的方法。在後一種方法中，所提供的組合物包括封裝在囊泡中的治療劑的溶液，囊泡則懸浮於含有足夠溶質以提供一定克分子滲壓濃度的溶液內。這一克分子滲壓濃度至少是基本上與囊泡內溶液的克分子滲壓濃度呈等滲的，其中溶液的克分子滲壓濃度大於生理鹽水。囊泡內溶液的克分子滲壓濃度保持恆定，而用來懸浮囊泡的溶液的克分子滲壓濃度則是可變的。在這些條件下，釋放速率隨著懸浮介質接近等滲，或者就囊泡內溶液來說仍處於高滲時即逐漸降低。但這種方法的缺點是為了控制釋放的速率必須改變向其中釋放治療劑之介質的克分子滲壓濃度。這樣，就使得這些組合物在實際應用中(例如在醫藥應用中)受到很大限制，因為在投用藥物釋放體系的部位，生物體液的克分子滲壓濃度實質上是固定的，並且是不能改變的。例如，生物體液如血漿的克分子滲壓濃度幾乎是與生理鹽水(0.9 wt％NaCl水溶液)等滲的，後者克分子滲壓濃度為310mOsm。因此，懸浮介質的克分子滲壓濃度在理論上應接近於310mOsm。
鑑於已有脂質體組合物及生產方法學的上述限制，有必要發展不依賴於使用酸即可生產穩定的多泡脂質體的技術。本發明旨在實現這一目的。
發明概要本發明提供生物活性物質控制釋放的多泡脂質體(MVL)。通過改變包裹在脂質體內之第一水性組分的克分子滲壓濃度來控制生物活性物質向生理環境例如人體內組織中釋放的速率。在這種情況下，本發明的MVL因當其被導入體內部位時能提供延遲的治療藥物釋放，從而可達到更好的治療效果。出乎意料的是，隨著包裹在脂質體內之第一水性組分的克分子滲壓濃度增加，其釋放速率則降低。
可通過增加生物學活性物質的濃度，或加入滲透間隔團(osmoticspacer)來增加第一水性組分的克分子滲壓濃度。
本發明還提供製造有控制釋放特徵之多泡脂質體的非酸性方法，從而延長了體內治療方面的應用。本發明的多泡脂質體具有很高的包裹效率，被包裹物質的受控制的釋放速率、明確限定的可再現的大小分布、球形形狀、易於調整的平均大小和可調整的內腔大小及數目。
本發明生產多泡脂質囊泡或多泡脂質體的方法包括(a)將至少含有一種兩親性脂質和一種中性脂質的脂質組分溶解在一種或多種有機溶劑中，(b)使脂質組分與含有將被包裹之一種或多種生物學活性物質的不混溶性第一水性組分相混合，(c)由兩種不混溶性組分形成油包水型乳劑，(d)將此油包水型乳劑轉移並浸沒在第二不混溶性水性組分中形成溶劑小球體，以及(e)例如藉助蒸發從溶劑小球中除去有機溶劑。可從帶有淨負電荷的兩親性脂質、甾醇、和兩性離子脂質中選擇兩親性脂質。可通過增加生物學活性物質的濃度、使用滲透間隔團或聯合使用這種兩種辦法來降低向生物體液中和體內釋放被包裹分子的速率。優選實施方案的描述本發明涉及可允許在生物體液中受控制地釋放治療活性物質的多泡脂質體(MVL)組合物。在這些組合物中，以新的方式控制被包裹之水相的克分子滲壓濃度，以在沒有氫氯化物或酸存在的情況下實現被包裹之治療活性物質的延遲釋放。通過利用本發明的方法，本領域技術人員可選擇性地產生有寬範圍治療活性物質釋放速率的MVL。
術語「多泡脂質體」是指人造的，包含多個非同心水性內腔的細微脂質囊泡。相反，以前描述的其他一些脂質體例如單層脂質體只有單一水性腔，而多層脂質體則有多個同心的「洋蔥皮」樣膜，膜之間是含有水性組分的空隙。
術語「溶劑小球」是指有機溶劑的細微球狀小滴，在這些小滴內是多個含有生物學活性藥劑之水性組分的更小的小滴。溶劑小球被懸浮並總體上浸沒在第二水性組分中。
術語「中性脂質」是指本身沒有形成囊泡能力的，並且缺少帶電荷的或親水的「頭部」基團的油或脂肪。中性脂質的例子包括但不只限於缺少帶電荷的或親水的「頭部」基團的甘油酯、二醇酯、生育酚酯、固醇酯，以及烷和鯊烷。
術語「兩親性脂質」是指那些具有親水「頭部」基團和疏水「尾部」基團，並可能具有膜形成能力的分子。本發明使用的兩親性脂質包括帶有淨的負電荷、淨的正電荷的兩親性脂質、兩性離子脂質及固醇。
術語「兩性離子脂質」是指處於其等電點時帶淨零電荷的兩親性脂質。
本文中使用的術語「生物學活性」，當用於描述存在於多泡脂質體之內腔中的物質時，包括如呈現於囊泡中這種形式的具有生物學活性的物質，以及當從囊泡腔中釋放後變為有活性的物質(即具有「靜止」生物學活性)，例如在與酶相互作用後轉變成有治療活性之活性部分的前體藥物。
另外，可被摻入的生物學活性物質包括發揮間接作用的物質。這類物質也可以作為如本文中所述的滲透間隔團。例如，可以存在各種賦形劑和穩定劑。這類物質例如可用於增加特定藥物的貯存期限或生物利用度。有許多通常分為賦形劑一類的物質實際上可能具有從很小到相當明顯的直接生物學活性。例如，常用的賦形劑甘露糖醇也可以有利尿劑的生物學作用，甚至水也可發揮影響脫水的生物學作用。這些間接活性物質包括水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。非水性溶液的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，以及可注射的有機酯如油酸乙酯。水性載體包括水、醇的水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸道外載體包括氯化鈉溶液；林格氏葡萄糖溶液、右旋糖溶液以及乳酸化的林格氏溶液。靜脈內載體包括流體和營養補充劑。電解質補充劑(例如基於林格氏葡萄糖溶液的補充劑)等。也可以存在防腐劑和抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑等其他添加劑，以及惰性氣體等(參見RemingtonsPharmaceutical Sciences，16th Ed.，A.Oslo，ed.，Mark，Easton，PA.1980)。本領域普通技術人員可以在不經過過多實驗的情況下，能很容易地確定和預計可用於本發明囊泡中的化合物的各種組合。
克分子滲壓濃度定義為存在於水溶液中之溶質摩爾濃度的總和。如果溶質以解離的、離子化的或聚集的形式存在，則克分子滲壓濃度定義為這些解離的、離子化的或聚集形式的物質之摩爾濃度的總和。溶質包括但不只限於生物學活性物質和滲透間隔團。
術語「滲透間隔團」是指水溶液中的，不是生物學活性物質的，生物學上相容的溶質分子。電解質和非電解質均可發揮滲透間隔團功能。在確定某種特定的分子是有作為滲透間隔團的功能時，或者在確定包裹在多泡脂質體內之滲透間隔團的濃度時，必須考慮在多泡脂質體所處於條件(例如pH)下，分子是否完全或部分地離子化，以及是否這些離子會透過脂質膜(參見The Bimolecular Lipid Bilayer Membrane，MahendraK.Jain van Nostrand Reinhold Co.，1972，pp 470)。本領域技術人員將會理解到，為了能夠用於本發明，必須選擇適當的滲透間隔團以避免使用證明對使用本發明的MVL進行治療的病人有毒性或有損害的那些物質。本領域技術人員不須藉助過多的實驗即可很容易地估計用於本發明的給定之滲透間隔團的適用性。
術語「第一水性組分」是指用於製備多囊泡脂質體之方法中的含有生物學活性物質的水相，其中可存在有滲透間隔團。
術語「第一水性組分的克分子滲壓濃度」是指用於製備多囊泡脂質體的含生物學活性物質之水性組分的克分子滲壓濃度。
術語「生理上相關的水性環境」是指血漿、血清、腦脊髓液、肌肉內液、皮下液、腹腔液、眼內液或滑液等生物體液，以及與生物體液幾乎等滲的0.9％(重量)的鹽水或緩衝鹽水等儲存介質。
控制被包裹之生物學物質向水性環境中釋放速率的現有方法均依賴於1)脂質體內酸性溶液的性質，或2)相對於脂質體內水性組分的克分子滲壓濃度而言，增加導入了脂質體之外界水性環境的克分子滲壓濃度。對後一種方法的邏輯推論是，被包裹物質的釋放速率應隨著第一水性組分之滲壓濃度的增加而增加，同時保持其中導入了脂質體之水性介質克分子滲壓濃度的恆定。然而，本發明的令人驚奇地發現卻正好與基於現有技術所預期的情況相反，即儘管外部水性介質的克分子滲壓濃度仍保持恆定，但實際上被包裹物質的釋放速率隨著MVL內的內部水性組分之克分子滲壓濃度增加而降低。因此，本發明的方法利用被包裹在多囊泡脂質體內第一水性組分的克分子滲壓濃度來控制釋放速率，其中外部介質的滲透強度接近於生理狀態。
此外，當以給定的生物學活性物質濃度生產包含滲透間隔團的MVL時，增加滲透間隔團的濃度將出乎預料地降低所述物質的釋放速率。釋放速率隨著第一水性組分克分子滲壓濃度的增加而降低提高了用於各種治療之多泡脂質體的實用性，並因延長了治療劑的釋放而獲得治療益處。
為了降低被包裹的治療劑或其他活性藥劑從本發明多囊泡脂質體中釋放的速率，可通過增加活性物質的濃度或使用滲透間隔團，使MVL內第一水性組分的克分子滲壓濃度相對於儲存MVL之生理相關水性環境(如0.9％(重量)鹽水)或其中導入了MVL之水性環境(體內和體外)的克分子滲壓濃度有所增加。相反，可通過降低活性物質的濃度，或者降低滲透間隔團的濃度，甚或不使用滲透間隔團來提高釋放速率。第一水性組分的克分子滲壓濃度相對於生理相關水性環境也可以是高滲的，這樣可達到最適宜地降低脂質體中生物學活性物質之釋放速率，同時脂質體包裹方法比在等滲條件下有更大產率。因此，在本發明範圍內，就生物學活性劑將被釋放入的儲存介質或水性環境來說，第一水性組分可以是低滲壓、等滲壓的或高滲壓的。從而本領域技術人員可以常規生產出具有預選擇的最適於特定治療目的的生物學活性物質釋放速率的MVL。
因為生理鹽水的克分子滲壓濃度相似於人血漿或其他體內環境，例如腦脊液、滑液及皮下和肌肉內間隙的，所以可使用鹽水作為MVL藥物在這樣的環境中釋放的預測模型。本發明的MVL的優選使用方法是體內注射或植入組織或體腔內(例如作為藥物貯庫)，並且最好是將其貯存於生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水等介質或其他克分子滲壓濃度相似的介質中。
在本發明的方法中，為了生產MVL，首先將兩親性脂質或中性脂質溶解在用於脂質組分的可揮發性有機溶劑中，向脂質組分中加入含有將被包裹之生物學活性物質的不混溶性第一水性組分，然後例如通過由混合、振蕩、聲處理、超聲波、噴嘴霧化或者合用這些方法所造成的渦流乳化該混合物。然後將整個乳液浸入第二水性組分中並進行機械攪拌，以形成懸浮於第二水性組分中的溶劑小球。所得到的溶劑小球由多個含有生物學活性物質的水性液滴組成(水包油包水型雙層乳劑(water-in-oil-water-double emulsion))。
例如使氣流通過懸浮液蒸發溶劑，以從小球中除去揮發性有機溶劑。當溶劑被完全蒸發時，即形成多泡脂質體。適用於蒸發溶劑的有代表性的氣體包括氮、氦、氬、氧、氫及二氧化碳。另外，也可以利用常用的溶劑排除系統除去有機溶劑，例如用上述氣體噴射、於減壓下蒸發及噴霧乾燥等。
可以使用包括但不只限於葡萄糖、蔗糖、海藻糖、琥珀酸鹽、環糊精、精氨酸、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、甘露糖醇、甘氨酸、賴氨酸、檸檬酸鹽、山梨醇、葡聚糖和其組合在內的滲透間隔團製成多泡脂質體，以控制被包裹之物質從多泡脂質體中釋放的速率。被包裹之生物學活性物質的濃度可以從大約幾個微微摩爾到大約幾百個毫摩爾。生物學活性物質的濃度將依據被治療的疾病、病人的年齡和一般狀況，以及物質的特定性質而不同。在活性物質與其毒性等付作用相關的情況下，生產有較低濃度活性物質的MVL，並利用較高濃度的滲透間隔團可能是合乎需要的。在選擇和生產特定的MVL組合物時，本領域技術人員無須進行過多實驗即可很容易地判定這些不同參數間的相互關係。
可以使用許多不同類型揮發性疏水溶劑，例如醚、烴、滷代烴、包括但不只限於CO2、NH3及氟利昂在內的超臨界液體作為脂質相溶劑。例如乙醚、異丙醚及其他醚、二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、滷化醚、酯及其組合均為適用的溶劑。
各種類型的脂質均可用於製造多泡脂質體，條件是至少包括一種中性脂質和至少一種兩親性脂質。可以從(1)帶有淨的負電荷的兩親性脂質，和(2)固醇，以及(3)兩性離子脂質中選擇兩親性脂質。例如，脂質組分可包括中性脂質和帶有淨的負電荷的兩親性脂質。在一個可替代的實施方案中，脂質組分還包括固醇。在另一個實施方案中，脂質還包括固醇和兩性離子脂類。
兩性離子脂類的例子是磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、鞘磷脂及其組合。中性脂質的例子是甘油三酯例如三油精、三辛精，植物油例如大豆油、豬脂、牛脂肪、生育酚、角鯊烯和其組合。帶淨負電荷兩親性脂質的例子是心磷脂、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇和磷脂酸。帶淨正電荷兩親性脂的例子是二醯基三甲銨丙烷、二醯基二甲銨丙烷和硬脂醯胺(stearylamine)。
經囊泡包裹將各種生物學活性物質摻入多泡脂質體內。這些物質包括藥物、以及其他類型的醫藥材料例如DNA、RNA、各種類型蛋白質、蛋白質激素例如胰島素、生長因子、細胞活素、單核因子、淋巴因子，以及作為疫苗接種之免疫原的蛋白質和碳水化合物。
也可以通過囊泡包裹將化妝品應用上有效的生物活性物質摻入到多泡脂質體中。這些活性物質包括潤溼劑、維生素、酶及香精。另外，也可以將除草劑、農藥、殺真菌劑等農業上應用的生物學活性物質包裹到多泡脂質體中。
表1中給出了可包裹在本發明多泡脂質體中的有代表性的幾類生物學活性物質。
表1抗心絞痛藥 抗心律不齊劑 抗哮喘劑抗生素 抗糖尿病劑抗真菌劑抗組胺劑抗高血壓藥抗寄生蟲劑抗腫瘤劑抗病毒劑 強心苷除草劑 激素 免疫調節劑單克隆抗體 神經遞質 核酸及類似物農藥蛋白質和糖蛋白放射對比劑放射性核酸金屬化物 鎮靜劑和鎮痛劑類固醇安神藥 疫苗 血管加壓劑香料化妝品潤溼劑殺真菌劑在本發明的多泡脂質體中，適於人體內使用的生物學活性物質的劑量範圍包括每平方米體表面積0.001-6,000mg這一範圍。當劑量範圍超出所給定的範圍時，這一範圍包括所有生物學活性物質的實際上使用寬度。但對於特定治療劑來說，可按照前述的易確定其優選濃度。
可按任何一種所期望的途徑投用多泡脂質體，例如腫瘤內、關節內、肌肉內、鞘膜內、腹腔內、皮下、靜脈內、淋巴內、口腔和黏膜下。可使用本領域已知的方法對多泡脂質體進行修飾，例如藉助間隔團分子或肽、靶特異性配體例如抗體和其他受體特異性蛋白質配體直接地或間接地與之連接，以賦予器官或細胞靶特異性(Malone，等，Proc.Nat』l.Acad.Sci，USA，866077，1989；Gregoriadis，Immunology Today，11(3)89，1990；兩文獻均列為本文參考文獻)。
下列實施例舉例說明可實踐本發明的方式。但應明確的是，這些實施例旨在舉例說明本發明，而不是將本發明限制到任何特定材料和其中所用的條件上。
實施例1A.多泡脂質體的製備步驟1在乾淨的玻璃量筒(內徑2.5cm×高10.0cm)中加入5mL含有溶於氯仿的46.5微摩爾二油醯磷脂醯膽鹼(Avanti Polar Lipids，Birmingham，AL)、10.5微摩爾二棕櫚醯磷脂醯甘油(Avanti Polar Lipids，Birmingham，AL)、75微摩爾膽固醇(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)、9.0微摩爾三油精((Avanti Polar Lipids，Birmingham，AL)的溶液。該溶液稱為脂質組分。
步驟2將溶解於水中的5mL第一水性組分，阿糖胞苷(Upjohn，Kalamazoo，MI)，或硫酸丁胺卡那黴素(Bristol Myers Squibb，Syracuse，NY)加入上述含有脂質組分的玻璃量筒中。所加入的阿糖胞苷濃度為41mM、82mM、164mM、246mM、369mM和410mM。就硫酸丁胺卡那黴素來說，所用的濃度為13mM、26mM、52mM和88mM。硫酸丁胺卡那黴素中，每個丁胺卡那黴素分子相當於含1.8個硫酸根離子。因此，濃度乘上2.8即得到克分子滲壓濃度。
步驟3為了製得油包水型乳劑，用勻漿器(AutoHomoMixer，ModelM，Tokushu Kika，Osaka，Japan)將步驟2的混合物以9000rpm的速度攪拌8分鐘。
步驟4為了製得懸浮於水中的氯仿小球，將20mL含有4％右旋糖和40mM賴氨酸的溶液鋪敷在油包水乳液的頂層上，然後以4000rpm的速度混合60秒鐘，以形成氯仿小球。
步驟5為了得到多泡脂質體，將玻璃量筒中的氯仿小球混懸液倒入含有30mL水，葡萄糖(3.5g/100mL)和游離鹼賴氨酸(40mM)的1000mL Erlenmeyer燒瓶中。使氮氣流以7L/分鐘的速度通過燒瓶中的懸液，以於37℃下用20分鐘緩慢蒸發氯仿。向燒瓶內加入60mL生理鹽水(0.9％氯化鈉)。然後以600×g離心10分鐘分離脂質體，棄去上清，並將沉澱物再懸浮於50mL生理鹽水中。以600×g離心10分鐘分離脂質體。棄去上清液，並將沉澱物重新懸浮在鹽水中。B.多泡脂質體平均直徑的檢測使用Horiba公司(Irvine，CA)的LA-500型粒度大小分析儀，以雷射衍射法檢測按上述方法製備的多泡脂質體的平均直徑。所得脂質體的平均直徑為5至20μm。C.阿糖胞苷的血漿釋放檢測法本實施例證明隨著第一水性組分中藥物濃度的增加，37℃人血漿中阿糖胞苷和丁胺卡那黴素的釋放速率降低。
將500μL含有阿糖胞苷的多泡脂質體懸液加到1.2mL經過篩選的O型人血漿中，將混合物於37℃保溫。以預定的時間間隔取出等分樣品，以600×g離心分離作為沉澱物的多泡脂質體，將沉澱物溶解在異丙醇中，並以高壓液相層析法檢測沉澱部分中阿糖胞苷的量(例如參見U.S.Pharmacopeia XXII，p.376，1 990)。D.丁胺卡那黴素的血漿釋放檢測法將500μL含有丁胺卡那黴素的多泡脂質體懸液加到1.2mL篩選的O型人血漿中。37℃保溫該混合物並以預期的間隔時間取樣。以600×g離心分離作為沉澱物的多泡脂質體。將沉澱物溶解在異丙醇中，並以聚苯乙烯球基螢光免疫檢測法(Varma-Nelson，等，Therapeutic DrugMonitoning 13260-262，1991)檢測沉澱部分中的丁胺卡那黴素量。根據按此方法測量的量計算餘留的丁胺卡那黴素百分含量。
如可從表2中看到的，以用於第一水性組分中之總藥物的百分比表示的包裹率，對藥物從在人血漿中保溫的多泡脂質體中釋放的速率(以半衰期表示)具有顯著的影響。採用簡單指數衰變模型計算藥物釋放的半衰期。表2中所示的數據是三次實驗的平均值±標準差。相對於等滲條件來說，在高滲條件下阿糖胞苷向人血漿中釋放的半衰期基本上沒有改變。數據還表明，在生產過程中約高達246mOsm的情況下，隨著包裹在多泡脂質體中的生物學活性物質濃度(以mOsm表示)的增加，阿糖胞苷和丁胺卡那黴素的半衰期也在增加。隨著包裹在多泡囊泡內的第一水性組分之克分子滲壓濃度的增高，不可預見地生產出可在人血漿中長時間內緩慢釋放藥物的，提高了實用性的脂質體。
表2藥物克分子滲平均直徑包裹產率半衰期壓濃度 (μm) (天)(mOsm)阿糖胞苷419.1±0.718±31.0±0.382 10.9±1.137±21.8±0.3164 13.3±1.651±44.6±1.9246 14.7±1.861±5 14.1±1.5369 16.1±2.462±3 12.1±2.7410 l3.4±2.357±2 13.0±3.6硫酸丁胺367.0±1.235±56.4±2.7卡那黴素737.1±1.242±523.9±1.4146 7.6±1.150±639.6±2.9246 8.3±1.766±647.3±4.0實施例2本實施例證明在一個固定的生物學活性物質濃度下，阿糖胞苷在血漿中的釋放速率隨著第一水性組分克分子滲壓濃度的增加而降低。按照實施例1步驟1至步驟5中所述的方法製備多泡脂質體，但其中步驟2作了如下改動。
步驟2將5ml水性組分，即以82mM的濃度溶解於水、或3％(重量)葡萄糖或5％(重量)葡萄糖中的阿糖胞苷加到上述含有脂質組分的玻璃量筒中。計算的所得溶液的克分子滲壓濃度分別為82、220和335mOsm。
於37℃在人血漿中保溫後，檢測在不同葡萄糖濃度下，作為保溫時間之函數的仍保留在多泡脂質體中的阿糖胞苷百分比。表3中顯示含有0、3和5％(重量)葡萄糖的組合物的平均直徑、阿糖胞苷的包裹率及在37℃血漿中釋放的半衰期。所示數據均為三次實驗的平均值±標準差。在生物學活性物質保持固定混度時混入不同濃度的滲透間隔團，葡萄糖，對在人血漿中保溫的多泡脂質體釋放活性物質的速率產生顯著地影響。從表3中所示數據可以看出，阿糖胞苷從多泡脂質體中向人血漿中釋放的半衰期隨著第一水性組分之克分子滲壓濃度的增加而增加。隨著第一水性組分的克分子滲壓濃度增加到高達約248mOsm，包裹率也得以增加。
表3[葡萄糖] 克分子滲壓 平均直徑包裹率半衰期(wt％)濃度a(μm)(天)(mOsm)0 82 10.9±1.137±2 1.8±0.33 24816.5±1.655±318.6±5.75 35917.9±1.157±417.9±4.3a克分子滲壓濃度包括阿糖胞苷和葡萄糖兩者。
實施例3本實施例證明可在使用生理鹽水溶液作為第二水性組分時製備多泡脂質體。按下述步驟製備多泡脂質體。
步驟1在潔淨的玻璃量筒(內徑2.5cm×高10.0cm)中放入5mL含有溶於氯仿之46.5微摩爾二油醯基磷脂醯膽鹼(Avanti Polar Lipids，Birmingham，AL)、10.5微摩爾二棕櫚醯基磷脂醯甘油(Avanti PolarLipids，Birmingham，AL)、75微摩爾膽固醇(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)、9.0微摩爾三油精(Avanti Polar Lipids，Birmningham，AL)的溶液。該溶液稱為標準脂質組分。
步驟2將5mL第一水性組分，以246mM的濃度溶解於水中的阿糖胞苷(Upjohn，Kalamazoo，MI)加入到上述含有標準脂質組分的玻璃量筒中。
步驟3為了製取油包水型乳液，使用勻漿器(AutoHomoMixer，Model M，Tokushu Kika，Osaka，Japan)將上述混合物以9000rpm的速度混合8分鐘。
步驟4為了製得懸浮於水中的氯仿小球，將20mL生理鹽水(0.9％氯化鈉)鋪敷在油包水乳液的頂層上，然後以4000rpm的速度混合60秒鐘，以形成氯仿小球。如此構成水包油包水型雙層乳劑。
步驟5將玻璃量筒中的氯仿小球混懸液倒入含有30mL生理鹽水(0.9％氯化鈉)的1000mL Erlenmeyer燒瓶中。使氮氣流以7L/分鐘的速度通過燒瓶中的懸液，以於37℃下經20分鐘蒸發掉氯仿。通過50μm濾器過濾脂質體。以600×g離心10分鐘從懸浮液中分離脂質體，棄去上清液，將沉澱物重新懸浮在鹽水中。
阿糖胞苷從使用246mOsm阿糖胞苷水溶液和用生理鹽水作為第二水性組分製備的多泡脂質體中釋放的半衰期為15.7±4.8天。這一數值相似於從使用246mOsm阿糖胞苷水溶液和以葡萄糖-賴氨酸溶液作為第二水性組分製備的多泡脂質體中釋放的半衰期(14.1±1.5天，參見表2)。
實施例4用小鼠進行藥物動力學研究，以試驗本發明多泡脂質體的體內慢釋放性能。
按實施例1所述方法製備多泡脂質體。使用濃度為82mM或246mM的阿糖胞苷水溶液作為第一水性組分。用生理鹽水將所得到的多泡脂質體洗兩次，以600×g離心l0分鐘，並以每mL懸浮液10mg阿糖胞苷的濃度將脂質體貯存於生理鹽水中。
小鼠(CDlICR，遠親交配，雌性)腹腔內注射含有2.55±0.25mg阿糖胞苷的多泡脂質體。注射前，取準備注射的含有同樣量阿糖胞苷的多泡脂質體懸液等分樣品作為0時間樣品。
注射後，在長達108小時的不同時間點上斷頸處死動物。從腹腔內收集20μL未稀釋的腹腔液，加入含有200μL生理鹽水的樣品試管中。在Eppendorf微量離心機(Brinkman Instruments Westbury，NY)中以最大速度將樣品試管離心1分鐘。分離上清液和沉澱物。在按上述方法回收20μL腹腔液後，用2～3mL 0.9％NaCl溶液徹底清洗腹腔。所有樣品均貯存於-20℃下以備分析用。
用異丙醇溶解沉澱物和上清液部分，以及洗出部分。用高壓液相層析法檢測各溶解的部分中的阿糖胞苷量(例如參見U.S.Pharmacopeia，XXII376，1990)。表4中給出沉澱部分中的阿糖胞苷濃度(μg/mL)。將沉澱物和20μL未稀釋腹腔液樣品之上清液部分中的量，以及腹腔洗出部分中的量加在一起，得到腹腔中阿糖胞苷的總量(μg)，這一數值也在表4中給出。
使用單間格模型和零稱重，以RSTRIP程序(MicroMath ScientificSoftware，Salt Lake City，Utah)分析藥物動力學數據，即沉澱部分和上清液部分中阿糖胞苷濃度及總量的時間依賴性降低。表4中給出了衰變半衰期。
將表4中所示的82mM(初始阿糖胞苷濃度)製劑與246mM(初始阿糖胞苷濃度)製劑的數據進行比較，表明82mM製劑的阿糖胞苷總量降低比246mM製劑更加迅速。82mM製劑的沉澱部分中的濃度降低也比246mM製劑的更為迅速。因此，這一研究顯示，阿糖胞苷釋放速率不僅在生理相關環境即如實施例1中所示的人血漿中，而且也在體內隨著第一水性組分的克分子滲壓濃度增加降低。
表4在腹腔注射使用含有82mM阿糖胞苷或246mM阿糖胞苷的溶液製備的製劑後不同時間腹腔液的沉澱物部分中阿糖胞苷的濃度，以及腹腔中阿糖胞苷的總量。每組3隻動物。腹腔內沉澱部分中的濃度 總量注射後 (μg/mL) (μg)小時數 82mM 246mM82mM246mM製劑 製劑 製劑製劑0 9,380 9,685 2,3722,7910.5 9,925±3716,896±1,0831，108±67 1,202±484 1,115±1,108 13,360±761 150±14 1,493±132151,015±92211,493 76±58 790±41964ND1,493±132 ND 388±191108 ND634±518ND 58±34t1/2(r2)1.7(0.974) 29.6(0.904) 0.64(0.989) 13.6(0.892)ND，未測；t1/2，衰變半衰期(小時)。
雖然為了描述目的給出了本發明的優選實施方案，但可以作出屬於本發明待批權利要求範圍內的各種改動。
權利要求
1.生產多泡脂質體的方法，該方法包括以下步驟(a)從兩種不相混溶的組分，即包含至少一種有機溶劑，至少一種兩親性脂質和中性脂質的脂質組分，和包含至少一種生物學活性物質的第一水性組分，形成油包水型乳液；(b)使此油包水型乳液分散到第二水性組分中以形成溶劑小球；(c)從溶劑小球中除去有機溶劑，以形成多泡脂質體；其中選擇第一水性組分的克分子滲壓濃度以調節從多泡脂質體向生理相關水性環境中釋放的速率。
2.權利要求1的方法，其中兩親性脂質是帶有淨的負電荷的兩親性脂質。
3.權利要求2的方法，其中兩親性脂質選自心磷脂、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇和磷脂酸。
4.權利要求2的方法，其中脂質組分還包含固醇。
5.權利要求4的方法，其中脂質組分還包含兩性離子脂質。
6.權利要求1的方法，其中兩親性脂質是兩性離子脂質。
7.權利要求5的方法，其中兩性離子脂質選自磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、鞘磷脂及溶血磷脂醯膽鹼。
8.權利要求1的方法，其中兩親性脂質帶有淨正電荷。
9.權利要求8的方法，其中兩親性脂質選自二醯基三甲銨丙烷、二醯基二甲銨丙烷和硬脂醯胺。
10.權利要求1、2、4、6或8的方法，其中第一水性組分還包含滲透間隔團，藉以提高第一水性組分的克分子滲壓濃度。
11.權利要求1、2、4、6或8的方法，其中脂質組分選自磷脂和磷脂的混合物。
12.權利要求1或6的方法，其中生理上相關的水性環境是貯存介質。
13.權利要求1或6的方法，其中生理上相關的水性環境選自包括但不只限於生理鹽水、緩衝鹽水、人血漿、血清、腦脊液、皮下液、滑液、眼內液、腹腔內液、肌肉內液，或其組合的物組。
14.權利要求1的方法，其中至少一種兩親性脂質帶有淨負電荷。
15.權利要求1的方法，其中兩親性脂質是以與膽固醇的混合物的形式提供的。
16.權利要求1的方法，其中親脂性生物學活性材料是以與脂質組分的混合物的形式提供的。
17.權利要求11的方法，其中中性脂質選自三油精、三辛精、大豆油、豬脂、牛油、生育酚、角鯊烯，及其組合。
18.權利要求1的方法，其中有機溶劑選自醚、烴、滷代烴、滷代醚、酯、CO2、NH3、氟利昂及其組合。
19.權利要求1的方法，其中生物學活性材料是親水的。
20.權利要求1的方法，其中使用選自機械攪拌，超聲供能和噴嘴霧化的方法進行兩種所述組分的乳化。
21.權利要求20的方法，其中在選用的乳化方法的不同時間和期間測定囊泡內水性腔的平均大小和數目。
22.權利要求1的方法，其中第一水性組分基本上是由水和生物學活性物質組成的。
23.權利要求1的方法，其中第二水性組分包含選自游離鹼賴氨酸、游離鹼甘氨酸、及游離鹼組氨酸和其組合的物質；以及選自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、琥珀酸鹽、環糊精、精氨酸、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、甘露糖醇、甘氨酸、賴氨酸、檸檬酸鹽、山梨醇、葡聚糖、氯化鈉及其組合物的物質。
24.權利要求1的方法，其中第二水性組分包含選自單糖、二糖、多糖及其他聚合物的物質。
25.權利要求1的方法，其中使用選自噴射、蒸發、使氣體通過溶劑小球、噴霧乾燥及其組合的溶劑去除系統除去有機溶劑。
26.權利要求1或6的方法，其中生物學活性物質選自抗心絞痛藥、抗生素、抗組胺劑、抗腫瘤劑、單克隆抗體、放射性核酸金屬化物、安神劑、抗心律不齊劑、抗糖尿病藥、抗高血壓藥、抗病毒劑、激素、神經遞質、抗哮喘劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、強心苷、免疫調節劑、核酸及類似物、放射對比劑、類固醇、血管加壓劑、疫苗、鎮靜劑和鎮痛劑，及其組合的治療類物質。
27.權利要求1或6的方法，其中生物學活性物質是阿糖胞苷。
28. 權利要求1或6的方法，其中生物學活性物質是丁胺卡那黴素。
29.權利要求1或6的方法，其中生物學活性物質選自治療用蛋白質和肽。
30.權利要求1或6的方法，其中生物學活性物質選自除草劑、農藥、殺真菌劑、殺昆蟲劑及其組合。
31.權利要求1或6的方法，其中生物學活性物質選自核酸。
32.權利要求1或6的方法，其中生物學活性物質選自化妝品、香料、潤溼劑及其組合。
33.帶有連接的靶特異性配體或親水塗層的權利要求1或6的多泡脂質體。
34.用生物學活性化合物治療病人的方法，該方法包括給病人投用包裹在權利要求1或2的多泡脂質體中的所說的化合物。
35.用生物學活性化合物治療病人的方法，該方法包括給病人投用權利要求25、26、29或30的多泡脂質體。
36.具有第一水性組分的多泡脂質體，其包含為遲延釋放而包裹在其中的生物學活性物質，其中多泡脂質體是在生理上相關的水性環境中，並且其中增加第一水性組分的克分子滲壓濃度以降低活性物質向生理上相關的水性環境中釋放的速率，或者其中降低第一水性組分的克分子滲壓濃度以增加所說的釋放速率。
37.權利要求34的多泡脂質體，其中第一水性組分包含足夠的生物學活性物質以達到所需的克分子滲壓濃度。
38.權利要求35的多泡脂質體，其中第一水性組分進一步包含足夠的滲透間隔團以達到所需的克分子滲壓濃度。
39.控制活性劑從多泡脂質體中向生理上相關的水性環境中釋放之速率的方法，其包括調整第一水性組分的克分子滲壓濃度，以便降低活性劑從脂質體中釋放的速率，隨著克分子滲壓濃度的增加，釋放速率降低。
40.權利要求39的方法，其中將滲透間隔團導入第一水性組分中以提高其克分子滲壓濃度。
全文摘要
公開了含有生物學活性物質的多泡脂質體(MVL)，該多泡脂質體具有限定的大小分布，可調整的平均大小、可調整的內腔大小和數目，以及受控制的和可變的生物學活性物質的釋放速率。製備方法包括將至少一種生物學活性物質封裝入囊泡內，並且可以任選地將第一水性組分中的滲透間隔團包入脂質體內。活性物質向引入了脂質體的周圍環境中釋放的速率可隨著第一水性組分之克分子滲壓濃度的增加而降低，或隨其克分子滲壓濃度的降低而增加。
文檔編號B01J13/12GK1166136SQ95196186
公開日1997年11月26日 申請日期1995年9月13日 優先權日1994年9月13日
發明者M·沙卡蘭姆, S·金 申請人:迪普技術公司