雲南狗牙花總生物鹼和其鹽類以及製備方法和用途的製作方法
2023-10-18 04:36:19
專利名稱：雲南狗牙花總生物鹼和其鹽類以及製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，是用雲南狗牙花製備的總生物鹼和其鹽類以及用其製備防治阿片類物質依賴性藥物或食品或鎮痛藥物的用途。
背景技術：
雲南狗牙花(Ervatamia yunnanensis Tsiang)是夾竹桃科狗牙花屬植物，分布於我國雲南省和廣西自治區，生長於海拔1000～1700米山地林中，民間用其莖入藥，用於治療產後體虛、頭暈目眩、惡露淋漓、高血壓、腹痛、喉痛等疾病。雲南狗牙花的化學成分研究較少，Liu Gui等[Liu G，Liu X，Feng XZ.Ervayuninea new indole alkaloidfrom Ervatamia yunnanensis. Planta Med.1988，54(6)519-521]從其根部分離到9個吲哚生物鹼伏康京鹼(voacangine)，伊波加因鹼(ibogaine)，伏康京羥基吲哚利寧鹼(voacangine hydroxyindolenine)，(+)-米奴衛辛鹼((+)-minovicine)，伏卡絡丁鹼(voachalotin)，艾瓦雲寧鹼(ervayunine)，冠狗牙花鹼(coronaridine)，19-S-海泥山辣椒鹼(19-s-heyneanine)，依潑加木胺(ibogamine)。喻陽等[喻陽，高金明，劉吉開.雲南狗牙花成分研究。雲南植物研究1999，21(3)399]則從其地上部分的乙醇提取物中分離鑑定了8個吲哚生物鹼19-S-羥基塔卡明鹼(19-S-hydroxytacamine)，19-S-羥基-16-表-塔卡明鹼(19-S-hydroxy-16-epi-tacamine)，艾瓦它明鹼(ervatamine)，19，20-羥基艾瓦它明鹼(19，20-hydroervatamine)，19-表-艾瓦它明鹼(19-epi-ervatamine)，17-去甲氧基可瑞納辛鹼B(17-demethoxycorynoxine B)，17-去甲氧基氫化可瑞納辛鹼(17-demethoxyhydrocorynoxine)，塔波納目亭鹼(emaemontanine)。至今未見對上述化合物進行防治阿片類物質精神依賴性和身體依賴性及鎮痛作用研究的報導。
發明內容
本發明從雲南狗牙花的根和莖中提取了總生物鹼，並從中分離到11個生物鹼單體，它們的化學結構如下
苦參鹼(matrine)(1) 冠狗牙花鹼(coronaridine)(2) 19，20-二氫異斯替斯瑞克鹼(19，20-dihydroisostitsirikine)(3) 19-S-海泥山辣椒鹼(19-s-heyneanine)(4) 依潑加木胺(ibogamine)(5) 雲南辛鹼(yunnanensine)(6) 11』甲氧基-19-S-海泥山辣椒鹼 19，20-E-瓦來薩明鹼(11′-methoxyl-19s-heyneanine)(7)(19，20-E-vallesamine)(8) 雲南寧鹼(yunnanenine)(9) 10-羥基-19，20-二氫異斯替斯瑞克鹼(10-hydroxy-19，20-dihydroisositsirikine)(10)
榴花靈鹼(conodurine)(11)上述化合物中，化合物(2)、(4)、(5)與背景技術中所述的三個化合物相同；化合物(6)和(10)為新化合物；化合物(1)、(3)、(7)、(8)、(9)和(11)為該植物中首次發現。
本發明雲南狗牙花總生物鹼及其鹽類的製備方法有醇提取法或酸水提取法兩種。
具體製備方法為一、醇提取法1、雲南狗牙花總生物鹼的提取雲南狗牙花根和莖或全株粉碎後用8～l0倍量95％乙醇(W/W)分別回流提取三次，將乙醇提取液減壓濃縮至無乙醇，得醇提取物，提取物用2％鹽酸或2％硫酸等酸水溶解，除去酸水不溶物，酸水液用濃氨水或5％碳酸鈉或1％氫氧化鈉中和至pH 8～10，即產生沉澱，用氯仿或乙醚或苯萃取三次，萃取液中含生物鹼，回收氯仿或乙醚或苯即得雲南狗牙花總生物鹼。
2、雲南狗牙花總生物鹼鹽的製備將雲南狗牙花總生物鹼溶於氯仿，於氯仿溶液中滴加濃鹽酸或冰醋酸或2mol/L硫酸至不再產生沉澱，過濾得沉澱，用適量丙酮洗去多餘的酸，即得雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽或醋酸鹽或硫酸鹽。
二、酸水提取法1、雲南狗牙花總生物鹼的提取雲南狗牙花根和莖或全株粉碎後用8～10倍量(W/W)2％鹽酸或2％硫酸浸泡(或滲濾)24小時，濾出酸水液，同法浸提三次，合併酸水液，用濃氨水或5％碳酸鈉或1％氫氧化鈉中和至pH 8～10，產生沉澱，過濾得沉澱，即為雲南狗牙花總生物鹼的粗製品。
2、雲南狗牙花總生物鹼的純化將上述雲南狗牙花總生物鹼粗製品乾燥後，用適量乙醇或氯仿回流溶解，過濾除去不溶物，濾液減壓蒸乾即得純化的雲南狗牙花總生物鹼。
3、雲南狗牙花總生物鹼鹽的製備將雲南狗牙花總生物鹼溶於氯仿，於氯仿溶液中滴加濃鹽酸或冰醋酸或2mol/L硫酸至不再產生沉澱，過濾得沉澱，用適量丙酮洗去多餘的酸，即得雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽或醋酸鹽或硫酸鹽。
本發明用雲南狗牙花(Ervatamia yunnanensis Tsiang)製備的總生物鹼及其鹽(total Ervatamia yunnanensis alkaloids，簡稱TEYA)，經藥理活性研究，發現雲南狗牙花總生物鹼(TEYA)具有顯著鎮痛活性和戒毒作用，即對嗎啡、海洛因成癮都有脫毒和阻止復吸作用，且TEYA本身不具有身體依賴性和精神依賴性。因此，可用於製備防治阿片類物質依賴性的藥物或鎮痛藥或食品。為提高雲南狗牙花總生物鹼在水中的溶解度以便製成注射液，故將其製備成鹽。
具體實施例方式
下面通過實施例，對本發明作進一步說明。
實施例1醇提取法製備總生物鹼及其鹽類雲南狗牙花根和莖5kg，粉碎後用8倍量(W/W)95％乙醇分別回流提取三次，合併三次乙醇提取液，減壓濃縮至無乙醇，得醇提取物。提取物用2％鹽酸1000ml溶解，除去酸水不溶物，酸水溶液用濃氨水中和至pH8～10，即產生沉澱，加入400ml氯仿萃取三次，氯仿溶液含生物鹼，回收氯仿即得純化的雲南狗牙花總生物鹼。再將雲南狗牙花總生物鹼溶於200ml氯仿，於氯仿溶液中滴加濃鹽酸至不再產生沉澱，濾出沉澱並用適量丙酮洗去多餘的酸，即得雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽。
同法，若於總生物鹼氯仿溶液中滴加冰醋酸或2mol/L硫酸至不再產生沉澱，濾出沉澱並用適量丙酮洗去多餘的酸，即得雲南狗牙花總生物鹼醋酸鹽或硫酸鹽。
實施例2 酸水提取法製備總生物鹼及其鹽類雲南狗牙花根和莖5kg，粉碎後用10倍量(W/W)2％鹽酸浸泡24小時，濾出酸水液。同法浸提三次，合併酸水液，用濃氨水中和至pH8～10，產生沉澱。過濾得沉澱，即為雲南狗牙花總生物鹼粗製品，置60℃乾燥後，用500ml氯仿回流溶解，過濾除去不溶物，氯仿溶液減壓蒸乾即得純化的雲南狗牙花總生物鹼。再將純化的總生物鹼溶於200ml氯仿，於氯仿溶液中滴加濃鹽酸至不再產生沉澱，過濾得沉澱，用適量丙酮洗去多餘的酸，得雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽。
同法，若於總生物鹼氯仿溶液中滴加冰醋酸或2mol/L硫酸至不再產生沉澱，濾出沉澱並用適量丙酮洗去多餘的酸，即得雲南狗牙花總生物鹼醋酸鹽或硫酸鹽。
下面用雲南狗牙花總生物鹼的藥理活性試驗及結果來說明其用途。
實施例3 TEYA對鹽酸嗎啡精神依賴性的影響及其本身的精神依賴性實驗3.1材料與方法3.1.1動物雄性Sprague-Dawley大鼠160～200g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。雄性昆明種小鼠18～22g，第二軍醫大學實驗動物中心提供。動物飼養於自然光照動物房(第二軍醫大學藥學院普通級或清潔級醫學實驗動物環境設施合格證書，上海市醫學實驗動物管理委員會醫動字第02-64號)，隨意進食和飲水。
3.1.2藥品與試劑鹽酸嗎啡(Morphine Hydrochloride，簡稱嗎啡，表中代號Mor)青海製藥廠產品，用pH 3.5～4的生理鹽水配成應用液。
鹽酸納洛酮(Naloxone Hydrochloride，簡稱納洛酮，表中代號NLX)北京四環製藥廠，用pH3.5～4的生理鹽水配成應用液。
雲南狗牙花總生物鹼(total Ervatamia yunnanensis alkaline，簡稱TEYA)按實施例1或實施例2製備的鹽酸鹽，用pH3.5～4的生理鹽水配成應用液。
氫化可的松上海信誼藥廠產品，用生理鹽水配成應用液。
3.2.給藥方法3.2.1鹽酸嗎啡的給藥方法上午皮下注射鹽酸嗎啡4mg·kg-1後放入白箱(伴藥箱)，下午皮下注射生理鹽水後放入黑箱(非伴藥箱)。每次在箱內停留50分鐘，連續5天。
3.2.2單次劑量給予TEYA的給藥方法小鼠隨機分組，即生理鹽水組、單獨鹽酸嗎啡組、鹽酸嗎啡+TEYA 20mg·kg-1(記作Mor+TEYA20)組、鹽酸嗎啡+TEYA 40mg·kg-1(記作Mor+TEYA40)組和鹽酸嗎啡+TEYA 80mg·kg-1(記作鹽酸嗎啡+TEYA80)組。前5天為每天給予鹽酸嗎啡。試驗於第6天觀察偏愛反應之前1小時分別給予TEYA 20mg·kg-1、TEYA 40mg·kg-1和TEYA80mg·kg-1。
3.2.3連續給予TEYA的給藥方法小鼠隨機分組，即生理鹽水組、單獨鹽酸嗎啡8mg·kg-1組、單獨TEYA 5mg·kg-1組、鹽酸嗎啡+TEYA2.5mg·gk-1組、鹽酸嗎啡+TEYA 5mg·kg-1組和鹽酸嗎啡+TEYA 10mg·kg-1組，於每次皮下注射鹽酸嗎啡後，立即腹腔內注射TEYA，連續5天。
3.3.實驗方法3.3.1嗎啡精神依賴模型，用小鼠條件性位置偏愛試驗[萬興旺，黃矛，李萬亥，談冶雄，陶學斌。N-硝基-L-精氨酸對小鼠嗎啡和二氫埃託啡精神依賴性的抑制作用.第二軍醫大學學報1999；20(2)105-107]條件性位置偏愛箱 本實驗採用的條件性位置偏愛箱為長方形木製穿梭箱，四壁光滑，中間用一活動擋板隔成兩箱，兩箱的顏色分別為黑色(以下簡稱黑箱)和白色(以下簡稱白箱)，每箱尺寸為L25cm×H35cm×W20cm。黑箱底面為金屬網的粗糙面，白箱底面為光滑面，兩箱之間的擋板下部正中留有一閘門(10cm×10cm)。木箱頂部用透明有機玻璃板蓋住，以觀察小鼠或大鼠在箱內的活動情況。實驗全過程均在安靜，溫度、溼度和光線相對恆定的房間裡進行。
選擇實驗動物選用雄性小鼠。打開兩室閘門，將小鼠放入中間閘門下，同時用秒表(金雀牌石英秒表，上海秒表廠)計時(準確到秒)，並允許探索黑白箱5分鐘，然後記錄小鼠15分鐘內在黑箱中的停留時間。連續試驗3天，選擇明顯偏愛黑箱的小鼠為實驗用動物。
訓練動物將實驗用小鼠按體重以隨機數字表隨機分組。上午皮下注射鹽酸嗎啡4mg·kg-1以後放入白箱(伴藥箱)，下午皮下注射生理鹽水後放入黑箱(非伴藥箱)。每次在箱內停留50分鐘，連續5天。
觀察動物將完成訓練的小鼠於第6天不給任何藥物，將其單只放於穿梭箱內，打開兩室門，允許探索黑白箱5分鐘，然後觀察小鼠15分鐘內在偏愛側(黑箱)的停留時間。
3.3.2小鼠嗎啡復吸模型利用上述條件性位置偏愛箱和方法，每天皮下注射鹽酸嗎啡4mg·kg-1，訓練小鼠7天。第8天停給嗎啡，用上述方法觀察小鼠在偏愛側(黑箱)的停留時間，可見小鼠明顯偏愛白箱(拌藥箱)。之後每隔1天觀察一次，直到第7天觀察到位置偏愛效應退去。再隔4天，於停給嗎啡的第11天對小鼠進行足底電擊或皮下注射氫化可的松20mg·kg-1後，馬上放入條件性位置偏愛箱內進行觀察。
電擊的方法用有蓋的尺寸為L35cm×H28cm×W23cm的箱子，將小鼠置於箱底的不鏽鋼柵(0.5cm間隔)，通過傳送直流電流電擊足部，受到電擊的小鼠發出吱吱叫聲或蹦跳。直流電流由CH-2型高壓恆流電刺激器輸出，恆定電壓為36V，起始直流電流為0.1mA，每10分鐘增加0.1mA，共電擊30分鐘。
3.3.3小鼠復吸模型及TEYA對嗎啡小鼠位置偏愛重現的阻斷作用3.4數據的統計學處理給藥組與生理鹽水對照組間或不同給藥組間比較採用Student t-test。所有數據均以平均值±標準差(x±s)表示。
3.5.實驗結果3.5.1 TEYA對鹽酸嗎啡條件性位置偏愛的影響及其本身的精神依賴性3.5.1.1單次給予TEYA對小鼠鹽酸嗎啡條件性位置偏愛的影響TEYA腹腔內注射40mg·gk-1和80mg·kg-1給藥後1小時，或TEYA灌胃80mg·kg-1給藥後3小時，可明顯增加鹽酸嗎啡小鼠在偏愛側(黑箱)所停留的時間，說明TEYA可阻斷鹽酸嗎啡的精神依賴性反應，並且這種作用可維持12小時。TEYA 20mg·kg-1對鹽酸嗎啡小鼠已形成的位置偏愛無顯著影響(結果見表1和表2)。
表1.單次給予TEYA對小鼠鹽酸嗎啡條件性位置偏愛的作用。x±s.aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01，與給藥前比較在偏愛側停留的時間(x±s，秒)劑量(mg·kg-1) 小*藥物鼠 給藥後Mor(sc)TEYA 給藥前數90分鐘 180分鐘 360分鐘 720分鐘生理鹽水-- -- 12 604±39604±66a604±41a604±35a604±35a鹽酸嗎啡8 -- 13 651±46322±79c365±75c393±72c360±65c鹽酸嗎啡8 20(ip) 11 618±70366±98c523±88c484±112c409±172c+TEYA20鹽酸嗎啡8 40(ip) 10 568±42475±98b579±160a598±133a489±177a+TEYA40鹽酸嗎啡8 80(ip) 10 597±27687±175a727±119c627±122a568±184c+TEYA80鹽酸嗎啡8 80(ig) 11 572±45443±182b468±174a675±220a656±209a+TEYA80*Mor為鹽酸嗎啡，TEYA20、TEYA40、TEYA80分別為雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽20mg·kg-1、40mg·kg-1或80mg·kg-1；括號內代號為給藥途徑，sc為皮下注射，ip為腹腔內注射。
表2.單次給予TEYA對小鼠鹽酸嗎啡條件性位置偏愛的作用(比較給予TEYA前、後的偏愛側停留的時間差值)。x±s.與生理鹽水組比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與鹽酸嗎啡組比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01。
*劑量(mg·kg-1) 小在偏愛側停留的時間(x±s，秒)藥物鼠Mor(sc)TEYA數90分鐘 180分鐘360分鐘 720分鐘生理鹽水-- -- 126±68f-5±46f2±60f8±50f鹽酸嗎啡8 -- 13328±84c285±72c258±85c291±80c鹽酸嗎啡8 20(ip) 11253±126c，d96±120b，d135±143b，d210±177c，d+TEYA20鹽酸嗎啡8 40(ip) 1093±121a，f-12±181a，f-30±129a，f79±192a，f+TEYA40鹽酸嗎啡8 80(ip) 10-90±188a，f-130±127b，f-30±127a，f229±178c，d+TEYA80鹽酸嗎啡8 80(ig) 11129±187a，f104±164a，f5±193a，f129±187a，e+TEYA80*Mor為鹽酸嗎啡，NLX納洛酮，TEYA20、TEYA40、TEYA80分別為雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽20mg·kg-1、40mg·kg-1或80mg·kg-1；括號內代號為給藥途徑，sc為皮下注射，ip為腹腔內注射，ig為灌胃(口服)。
3.5.1.2連續給予TEYA對小鼠鹽酸嗎啡條件性位置偏愛的影響及TEYA本身的精神依賴性單純TEYA 5mg·kg-1組小鼠給藥前後在偏愛側(黑箱)的停留時間有差異，但同生理鹽水組無差異。TEYA 2.5mg·kg-1、TEYA 5mg·kg-1不能增加嗎啡依賴小鼠在偏愛側(黑箱)的停留時間；TEYA 10mg·kg-1可顯著增加(P＜0.01)嗎啡依賴小鼠在偏愛側(黑箱)的停留時間(結果見表3)。
表3.連續給予TEYA對小鼠鹽酸嗎啡條件性位置偏愛的影響及TEYA本身的精神依賴性。x±s.aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01，與給藥前比較；dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01，與生理鹽水組比較；gP＞0.05，hP＜0.05，iP＜0.01，與鹽酸嗎啡組比較小在偏愛側停留的時間(x±s，秒)劑量(mg·kg-1)*藥物鼠給藥前、後的Mor(sc) TEYA給藥前 給藥後數變化生理鹽水-- --9 598±71 558±57a24±54i鹽酸嗎啡8 --9 604±53 422±117c181±130fTEYA5-- 5(ip) 10609±66 540±45b69±58d，h鹽酸嗎啡8 2.5(ip) 9 585±68 353±125c232±148f，g+TEYA2.5鹽酸嗎啡8 5(ig) 10616±71 467±111c149±115f，g+TEYA5鹽酸嗎啡8 10(ip)8 579±65 566±58a12±78d，i+TEYA10*Mor為鹽酸嗎啡，NLX鹽酸納洛酮，TEYA2.5、TEYA5、TEYA10分別為雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽2.5mg·kg-1、5mg·kg-1或10mg·kg-1；括號內代號為給藥途徑，sc為皮下注射，ip為腹腔內注射，ig為灌胃(口服)。
3.5.1.3單次給予TEYA對大鼠的嗎啡條件性位置偏愛的影響單次給予TEYA20mg·kg-1對大鼠已形成的位置偏愛無顯著性影響。TEYA 40mg·kg-1可明顯增加小鼠在偏愛側(黑箱)所停留的時間(P＜0.01)。連續單獨給予TEYA 5mg·kg-1不能使大鼠形成位置偏愛，與鹽酸嗎啡同時給予TEYA 10mg·kg-1可部分阻斷已形成的偏愛(結果見表4)。
表4.單次給予TEYA對大鼠的嗎啡條件性位置偏愛的影響。每組小鼠數＝8隻，x±s.與給藥前比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與生理鹽水組比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01；與鹽酸嗎啡組比較，gP＞0.05，hP＜0.05，iP＜0.01。
劑量(mg·kg-1) 在偏愛側的停留時間(x±s秒)*藥物Mor(sc) TEYA(ip) 給藥前 給藥後給藥前、後的變化生理鹽水-- --641±71 625±71a16±63i鹽酸嗎啡8--665±72 497±46c168±89fTEYA5-- 5 632±72 617±130a15±117d，i鹽酸嗎啡820648±91 514±64c533±96f，g+TEYA20鹽酸嗎啡840650±69 622±73a28±71d，i+TEYA40鹽酸嗎啡810652±74 555±52c110±53e，h+TEYA10*Mor為鹽酸嗎啡，TEYA5、TEYA10、TEYA20、TEYA20、TEYA40分別為雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽5mg·kg-1、10mg·kg-1、20mg·kg-1或40mg·kg-1；括號內代號為給藥途徑，sc為皮下注射，ip為腹腔內注射。
3.5.2 TEYA對嗎啡「復吸」的阻斷作用3.5.2.1嗎啡依賴小鼠條件性位置偏愛效應的消退在7天嗎啡訓練期結束後的1～3天，小鼠保持同樣強度的條件性位置偏愛效應；第5天條件性位置偏愛效應開始減弱，第7天基本消退(結果見表5)。因而選擇訓練結束後第11天的小鼠誘發條件性位置偏愛效應重現。
表5.同組小鼠嗎啡訓練期結束後在不同時間的位置偏愛反應。每組小鼠數＝9隻，x±s.與給嗎啡前比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與生理鹽水組比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01。
在偏愛側停留時間(x±s，秒)藥物劑量停給嗎啡後不同時間(皮下注射) (mg·kg-1) 給嗎啡前第1天 第3天 第5天 第7天 第9天生理鹽水-- 601±46 554±44a546±66a563±65a544±65a548±63a鹽酸嗎啡4 558±42d 348±133c，f366±120c，f369±85c，f425±147b，d501±96a，d3.5.2.2TEYA對足底電擊誘發小鼠消退的位置偏愛重現的阻斷作用在嗎啡訓練結束的第11天，對位置偏愛已經消退的小鼠，足底電擊可使已經消退的4mg·kg-1嗎啡引起的位置偏愛效應再現，而生理鹽水對其位置選擇沒有改變。單次給予TEYA40mg·kg-1可阻斷這種位置偏愛重現(結果見表6)。
表6.單次TEYA對小鼠足底電擊誘發消退的位置偏愛重現的阻斷作用。每組小鼠數＝9隻，x±s.與足底電擊前比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與足底電擊後比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01與生理鹽水足比較gP＞0.05，hP＜0.05，iP＜0.01。
劑量 在偏愛側停留的時間(x±s，秒)藥物(mg·kg-1) 足底電擊前 足底電擊後 *TEYA40生理鹽水 - 548±63 546±61a553±66a鹽酸嗎啡 4 501±96g386±37c，i703±256f*TEYA 40為單次腹腔內注射雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽40mg·kg-1。
3.5.2.3單次給予TEYA對氫化可的松誘發小鼠消退的位置偏愛重現的阻斷作用在嗎啡訓練結束的第11天，對位置偏愛已經消退的小鼠，皮下注射氫化可的松20mg·kg-1，可使已經消退的4mg·kg-1嗎啡引起的位置偏愛效應再現，而生理鹽水對其位置選擇沒有改變。單次給予TEYA 40mg·kg-1可阻斷這種位置偏愛重現(結果見表7)。
表7.單次給予TEYA對氫化可的松(皮下注射，20mg·kg-1)誘發小鼠消退的位置偏愛重現的阻斷作用。每組小鼠數＝8隻，x±s.與氫化可的松激發前比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與氫化可的松激發後比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01；與生理鹽水組比較，gP＞0.05，hP＜0.05，iP＜0.01。
藥物劑量在偏愛側停留的時間(x±s，秒)(皮下注射) (mg·kg-1)氫化可的松激發前氫化可的松激發後*TEYA40生理鹽水 -- 531±73 588±87a561±78a鹽酸嗎啡 4586±96g331±148c，i761±151f*TEYA40為單次腹腔內注射雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽40mg·kg-1。
實施例4 TEYA對小鼠鹽酸嗎啡身體依賴的影響及TEYA本身的身體依賴性4.1材料與方法4.1.1動物雄性Sprague-Dawley大鼠160～200g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。雄性昆明種小鼠18～22g，第二軍醫大學實驗動物中心提供。動物飼養於自然光照動物房(第二軍醫大學藥學院普通級或清潔級醫學實驗動物環境設施合格證書，上海市醫學實驗動物管理委員會醫動字第02-64號，1999年2月10日頒發)，隨意進食和飲水。
4.1.2藥品與試劑鹽酸嗎啡(Morphine Hydrochloride簡稱嗎啡，表中代號Mor)青海製藥廠產品，用pH 3.5～4的生理鹽水配成應用液。
鹽酸納洛酮(Naloxone Hydrochloride，簡稱納洛酮，表中代號為NLX)北京四環製藥廠，用pH 3.5～4的生理鹽水配成應用液。
雲南狗牙花總生物鹼(total Ervatamia yunnanensis alkaloids，簡稱TEYA)按實施例1或實施例2自行製備的鹽酸鹽，用pH 3.5～4的生理鹽水配成應用液。
4.2給藥方法4.2.1採用劑量遞增法[Way EL，Loh HH，Shen FH.Simultaneous quantitativeassessment of morphine tolerance and physical dependence.J Pharmacol Exp Ther 1969；167(1)1-8；Wan XW，Li WH，Huang M，You ZD，Tan YX，Lu CL and Gong ZH.Dynamic changes of inmmunoreactive dynorphin A1-13 during the development ofmorphine dependence in rats.Acta Pharmacol Sin 1998；19(6)560-563]建立小鼠嗎啡身體依賴模型。即第一天下午14:00、晚上20:00和第二天早上8:00，皮下注射鹽酸嗎啡劑量為10mg·kg-1。第二天下午14:00開始增加鹽酸嗎啡劑量到15mg·kg-1，此後每天下午14:00增加5mg·kg-1，即每天3次共增加鹽酸嗎啡劑量15mg·kg-1，連續給藥6天，最後一天的鹽酸嗎啡劑量到達100mg·kg-1。最後一次注射嗎啡後6小時，進行納洛酮催癮試驗。
鹽酸嗎啡劑量遞增方案見表8。
表8.小鼠身體依賴性模型嗎啡劑量遞增方案每次皮下注射鹽酸嗎啡劑量(mg·kg-1)第x天8:00 14:00 20:001 --10102 1015153 1520204 2025255 2530306 3030357 350 04.2.2單次給予TEYA的給藥方法小鼠隨機分組，即生理鹽水組、單獨鹽酸嗎啡組、鹽酸嗎啡+TEYA 20mg·kg-1(記作Mor+TEYA20)組、鹽酸嗎啡+TEYA 40mg·kg-1(記作Mor+TEYA40)組和鹽酸嗎啡+TEYA 80mg·kg-1(記作鹽酸嗎啡+TEYA80)組。於第7天皮下注射鹽酸嗎啡後5小時30分腹腔內注射TEYA。
4.2.3連續給予TEYA的給藥方法小鼠隨機分組，即生理鹽水、單獨鹽酸嗎啡8mg·kg-1組、單獨TEYA 5mg·kg-1組、鹽酸嗎啡+TEYA 2.5mg·kg-1、鹽酸嗎啡+TEYA 5mg·kg-1和鹽酸嗎啡+TEYA 10mg·kg-1，於每次皮下注射鹽酸嗎啡後，立即腹腔內注射TEYA。
4.3實驗方法小鼠跳躍試驗[Way EL，Loh HH，Shen FH.Simultaneous quantitative assessment ofmorphine tolerance and physical dependence.J Pharmacol Exp Ther 1969；167(1)1-8；Wan XW，Li WH，Huang M，You ZD，Tan YX，Lu CL and Gong ZH.Dynamic changesof inmmunoreactive dynorphin A1-13 during the development of morphine dependence inrats.Acta Pharmacol Sin 1998；19(6)560-563]採用上述劑量遞增法建立的小鼠身體依賴模型，於最後一次皮下注射鹽酸嗎啡後6小時、腹腔內注射TEYA後30分鐘，腹腔內注射納洛酮4mg·kg-1後，立即單只放入5000ml的玻璃燒杯內，記錄小鼠在15分鐘內跳躍的次數及1小時後的體重。
4.4數據的統計學處理給藥組與生理鹽水對照組間或不同給藥組間比較採用Student t-test。所有數據均以平均值±標準差(x±s)表示。
4.5.實驗結果4.5.1單次給予TEYA對小鼠鹽酸嗎啡身體依賴的影響TEYA 20mg·kg-1、TEYA40mg·kg-1和TEYA 80mg·kg-1均不能減少小鼠的跳躍次數(結果見表9)，但可部分阻斷鹽酸納洛酮催促後的體重丟失(結果見表10)。
表9. 單次給予TEYA對鹽酸納洛酮激發嗎啡依賴小鼠跳躍次數的作用。每組小鼠數＝8隻，x±s。與生理鹽水組比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與鹽酸嗎啡組比較，dP＞0.05，cP＜0.05，fP＜0.01。
*劑量(mg·kg-1) 平均跳躍次數*藥物跳躍發生率(％)Mor(sc) TEYA(x±s，次)生理鹽水 -- -- 0 0±0f鹽酸嗎啡 10 -- 100 21.50±13.74c鹽酸嗎啡10 20(ip) 87.5 11.25±9.70c，d+TEYA20鹽酸嗎啡10 40(ip) 75.0 14.12±12.69c，d+TEYA40*Mor為鹽酸嗎啡，TEYA20、TEYA40分別為雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽20mg·kg-1或40mg·kg-1；括號內代號為給藥途徑，sc為皮下注射，ip為腹腔內注射。
表10.單次給予TEYA對鹽酸納洛酮激發嗎啡依賴小鼠體重丟失的作用。每組小鼠數＝8隻，x±s.與生理鹽水組比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與鹽酸嗎啡組比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01。
體重(g)劑量(mg·kg-1)藥物Mor(sc) TEYA 鹽酸納洛酮鹽酸納洛酮丟失體重 丟失體重(％)激發前 激發後生理鹽水 ----26.20±1.4026.16±1.38 0.04±0.07f0.14±0.003f鹽酸嗎啡 10--20.85±0.8720.02±0.98 0.82±0.26c3.97±0.013c鹽酸嗎啡1020(ip)21.18±0.9020.8±0.86 0.38±0.16c，f1.76±0.007c，f+TEYA20鹽酸嗎啡1040(ip)21.32±1.6120.01±1.62 0.30±0.18c，f1.47±0.008c，f+TEYA40鹽酸嗎啡1080(ip)20.81±1.4320.55±1.47 0.30±0.18c，f1.28±0.010c，f+TEYA80鹽酸嗎啡1080(ig)20.11±1.2420.78±1.16 0.34±0.18c，f1.58±0.008c，f+TEYA80*Mor為嗎啡，TEYA20、TEYA40、TEYA80分別為雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽20mg·kg-1、40mg·kg-1或80mg·kg-1；括號內代號為給藥途徑，sc為皮下注射，ip為腹腔內注射，ig為灌胃(口服)。
4.5.2連續給予TEYA對小鼠鹽酸嗎啡身體依賴的影響和本身的身體依賴性單純TEYA 20mg·kg-1組小鼠跳躍次數和Naloxone 4mg·kg-1催促後體重丟失給藥前後無顯著差異。而鹽酸嗎啡+TEYA 5mg·kg-1(fP＜0.01)和鹽酸嗎啡+TEYA 10mg·kg-1(fP＜0.01)可以顯著減少小鼠跳躍次數並呈劑量依賴，但TEYA 2.5mg·kg-1未能減輕Naloxone催促後的體重丟失，而鹽酸嗎啡+TEYA 5mg·kg-1(eP＜0.05)和TEYA 10mg·kg-1(fP＜0.01)可以劑量依賴的減少Naloxone催促後的體重丟失(結果見表11)。
表11.連續給予TEYA對小鼠鹽酸嗎啡身體依賴的影響。每組小鼠數＝9隻。
與生理鹽水組比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與鹽酸嗎啡組比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01。
*劑量(mg·kg-1) 跳躍發生率 跳躍次數*藥物Mor(sc) TEYA(ip)(％) (x±s)生理鹽水---- 00±0f鹽酸嗎啡10-- 88.9 32.4±35.35cTEYA201020 22.2 0.22±0.67a，f鹽酸嗎啡102.5 55.6 12.40±20.09b，d+TEYA2.5鹽酸嗎啡105 44.4 4.56±7.21a，e+TEYA5鹽酸嗎啡10 10 33.3 5.88±8.40a，e+TEYA10*Mor為鹽酸嗎啡，TEYA2.5、TEYA5、TEYA10、TEYA20分別為雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽2.5mg·kg-1、5mg·kg-1、10mg·kg-1或20mg·kg-1；括號內代號為給藥途徑，
sc為皮下注射，ip為腹腔內注射。
4.5.2多次給予TEYA對小鼠鹽酸嗎啡身體依賴的影響TEYA20mg·kg-1、TEYA40mg·kg-1和TEYA 80mg·kg-1均不能減少小鼠的跳躍次數，但可部分的阻斷鹽酸納洛酮催促後的體重丟失(結果見表12)。
表12.多次給予TEYA對鹽酸納洛酮激發嗎啡依賴小鼠體重丟失的作用。每組小鼠數＝9隻，x±s.與生理鹽水組比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與鹽酸嗎啡組比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01。
*劑量(mg·kg-1) 體重(x±s，g)*藥物鹽酸納洛酮 鹽酸納洛酮Mor(sc) TEYA(ip)體重丟失(g)體重丟失％激發前 激發後生理鹽水-- -- 27.26±1.1327.2±1.12 0.07±0.14f0.14±0.003f鹽酸嗎啡10 -- 21.5±1.22 20.77±1.15 0.73±0.24c3.87±0.012cTEYA20-- 20 22.13±1.7622.08±1.77 0.04±0.07a，f1.76±0.007a，f鹽酸嗎啡10 2.5 22.19±1.0320.56±1.01 0.52±0.25c，d1.40±0.008c，d+TEYA2.5鹽酸嗎啡10 522.56±1.6722.22±1.84 0.33±0.43a，e1.11±0.008a，e+TEYA5鹽酸嗎啡10 10 23.88±1.4523.61±1.25 0.26±0.34a，f1.52±0.008a，f+TEYA10*Mor為鹽酸嗎啡，TEYA2.5、TEYA5、TEYA10、TEYA20分別為雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽2.5mg·kg-1、5mg·kg-1、10mg·kg-1或20mg·kg-1；括號內代號為給藥途徑，sc為皮下注射，ip為腹腔內注射。
實施例5 TEYA的鎮痛作用及對鹽酸嗎啡鎮痛作用的影響5.1材料與方法5.1.1實驗動物雌性昆明種小鼠18～22g，第二軍醫大學實驗動物中心提供。動物飼養於自然光照動物房(第二軍醫大學藥學院普通級或清潔級醫學實驗動物環境設施合格證書，上海市醫學實驗動物管理委員會醫動字第02-64號)，隨意進食和飲水。
5.1.2試劑及其配製鹽酸嗎啡(Morphine Hydrochloride簡稱嗎啡，表中代號Mor)青海製藥廠產品，用pH 3.5～4的生理鹽水配成應用液。
鹽酸納洛酮(Naloxone Hydrochloride，簡稱納洛酮，表中代號NLX)北京四環製藥廠，用pH3.5～4的生理鹽水配成應用液。
雲南狗牙花總生物鹼(total Ervatamia yunnanensis alkaloids，簡稱TEYA)按實施例1或實施例2製備的鹽酸鹽，用pH 3.5～4的生理鹽水配成應用液。
氫化可的松上海信誼藥廠，用生理鹽水配成應用液。
5.2給藥方法5.2.1嗎啡5.2.2單次給予TEYA的給藥方法小鼠隨機分組，即生理鹽水組、單獨鹽酸嗎啡組、鹽酸嗎啡+TEYA20mg·kg-1組(記作Mor+TEYA20)、鹽酸嗎啡+TEYA 40mg·kg-1組(記作Mor+TEYA40)和鹽酸嗎啡+TEYA80mg·kg-1組(記作鹽酸嗎啡+TEYA80)。
5.3實驗方法鎮痛試驗——小鼠熱板(hot-plate)法，按照徐叔雲，卞如濂，陳修主編.藥理實驗方法學.第二版.北京人民衛生出版社，1991695用雌性昆明種小鼠。恆溫水浴箱和玻璃燒杯組成的熱板測痛儀測定小鼠痛閾。玻璃燒杯底(熱板)溫度維持在55℃±0.5℃。秒表(金雀牌石英秒表，上海秒表廠)記錄自小鼠足底接觸熱板至出現舔後足的時間(單位秒)，即熱板反應潛伏期(或稱為痛反應時間)作為痛閾指標。實驗選用熱板反應潛伏期(基礎痛閾)＞15秒但＜30秒的小鼠。每隻小鼠基礎痛閾為該小鼠3次痛反應時間的平均值，每次測定痛反應時間的間隔大於15分鐘；給藥後小鼠熱板反應潛伏期＞60秒者，為減輕燙傷程度將小鼠撤離熱板，並以60秒計。實驗時室溫維持在23℃～25℃。
5.4數據的統計學處理給藥組與生理鹽水對照組間或不同給藥組間比較採用Student t-test。所有數據均以平均值±標準差(x±s)表示。
5.5.實驗結果5.5.1 TEYA的鎮痛作用TEYA具有鎮痛作用，並隨劑量的增大而增強，與鹽酸嗎啡相比具有緩慢、持久的特點。與鹽酸嗎啡8mg·kg-1相比，可見灌胃TEYA 20mg·kg-1、TEYA 40mg·kg-1和TEYA 80mg·kg-1，以及腹腔內注射TEYA40mg·kg-1，均具有明顯的鎮痛作用，灌胃後的作用產生比腹腔內注射後的慢，但作用強度與腹腔內注射後的相當，表明灌胃給藥後吸收是比較完全的(結果見表13)。
表13.TEYA在小鼠熱板法上的鎮痛作用。每組小鼠數＝9隻，x±s.與生理鹽水組比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與鹽酸嗎啡組比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01。
撤後肢潛伏期(痛閾)(x±s，秒)劑量(mg·kg-1)*藥物給藥後Mor(sc) TEYA給藥前30分鐘60分鐘 120分鐘240分鐘生理鹽水----24.1±2.8d25.7±2.7f25.9±3.2f25.7±1.7d25.0±2.3d鹽酸嗎啡8 --24.2±1.8a59.4±1.3c36.6±5.9c28.6±7.4a28.9±5.6aTEYA40--40(ip)25.0±1.8a，d41.1±12.1c，f35.9±9.7c，d30.2±7.6a，d29.6±5.8b，dTEYA20--20(ig)25.3±1.6a，d34.9±7.4c，f34.9±1.4c，d34.8±3.2c，e30.6±3.3c，dTEYA40--40(ig)24.6±2.5a，d35.3±5.2c，f44.3±11.1c，d35.9±8.8c，d30.6±6.1b，dTEYA80--80(ig)24.0±3.8a，d37.9±7.2c，f49.3±9.3c，f36.8±8.5c，e31.7±6.9b，d*Mor為鹽酸嗎啡，TEYA20、TEYA40、TEYA80分別為雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽20mg·kg-1、40mg·kg-1或80mg·kg-1；括號內代號為給藥途徑，sc為皮下注射，ip為腹腔內注射，ig為灌胃(口服)。
5.5.2 TEYA對鹽酸嗎啡鎮痛作用的影響與鹽酸嗎啡4mg·k-1相比，TEYA 40mg·kg-1比鹽酸嗎啡的鎮痛作用明顯。同時給予阿片受體拮抗劑鹽酸納洛酮1mg·kg-1，鹽酸嗎啡的鎮痛作用可被取消。TEYA 40mg·kg-1的鎮痛作用可被腹腔內注射4mg·kg-1的鹽酸納洛酮部分地阻斷；當同時給予鹽酸嗎啡4mg·kg-1和TEYA 10mg·kg-1、鹽酸嗎啡4mg·kg-1和TEYA 20mg·kg-1時鎮痛作用出現協同。結果提示TEYA的鎮痛作用可能部分通過阿片受體來實現(結果見表14)。
表14.小鼠熱板法上TEYA對嗎啡鎮痛作用的影響。每組小鼠數＝9隻，x±s.與生理鹽水組比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與鹽酸嗎啡組比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01。
*劑量(mg·kg-1)撤後肢潛伏期(痛閾)(x±s，秒)*藥物給藥後Mor NLX TEYA給藥前(sc) (ip) (ip)30分鐘60分鐘120分鐘240分鐘生理鹽水------ 21.8±3.2d22.5±3.0f21.4±3.8f21.2±2.7f20.5±2.3d鹽酸嗎啡4 ---- 22.1±1.9a39.4±8.7c33.0±4.0c28.0±5.3c22.8±4.5a鹽酸嗎啡4 1 -- 22.8±2.6a，d22.8±3.5a，f22.1±3.2a，f22.6±5.0a，d21.8±4.5a，d+NLXTEYA40--40 21.8±2.4a，d55.4±8.6c，f56.4±7.3c，f37.1±10.1c，e21.0±3.7a，dTEYA40+4 40 22.9±3.7a，d54.4±9.4c，f34.2±7.9c，d32.4±10.2b，d23.4±3.6a，dNLX鹽酸嗎啡4 --10 21.2±2.4a，d40.1±10.3c，d31.8±7.1c，d28.0±8.8a，d22.4±8.4a，d+TEYA10鹽酸嗎啡4 --20 22.2±2.2a，d41.5±12.0c，d40.0±9.1c，d35.1±11.9c，d30.9±7.5c，f+TEYA20*Mor為嗎啡，NLX鹽酸納洛酮，TEYA10、TEYA20、TEYA40分別為雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽10mg·kg-1、20mg·kg-1或40mg·kg-1；括號內代號為給藥途徑，sc為皮下注射，ip為腹腔內注射。
由於阿片類的成癮及其治療，在許多方面與其鎮痛的機制都有密切聯繫。周身肌肉關節疼痛是海洛因成癮脫毒後的主要稽延性症狀之一，也是促使吸毒者復吸的重要原因之一。因此，非成癮性鎮痛藥在減少復吸的治療中具有相當重要的意義。狗牙花在我國民間就用於風溼骨痛、跌打損傷或蛇咬傷。
以上鎮痛實驗結果表明TEYA具有明顯的鎮痛作用，且呈劑量依賴關係，並與鹽酸嗎啡有協同作用；TEYA的這種作用可被阿片受體拮抗劑Naloxone部分地阻斷，這表明TEYA的鎮痛作用可能部分通過阿片系統來實現。TEYA的鎮痛作用，對於減輕吸毒病人脫毒後的稽延性症狀將會有積極的輔助治療作用。
實施例6 TEYA對嗎啡依賴小鼠腦內一氧化氮(NO)含量的影響6.1材料與方法6.1.1動物雄性昆明種小鼠18～22g，第二軍醫大學實驗動物中心提供。動物飼養於自然光照動物房(第二軍醫大學藥學院普通級或清潔級醫學實驗動物環境設施合格證書，上海市醫學實驗動物管理委員會醫動字第02-64號)，隨意進食和飲水。
6.1.2藥品與試劑鹽酸嗎啡(Morphine Hydrochloride，簡稱嗎啡，表中代號Mor)青海製藥廠產品，用pH3.5～4的生理鹽水配成應用液。
雲南狗牙花總生物鹼(total Ervatamia yunnanensis alkaloids，簡稱TEYA)按實施例1或實施例2自行製備的鹽酸鹽，用pH3.5～4的生理鹽水配成應用液。
氫化可的松上海信誼藥廠，用生理鹽水配成應用液。
N-乙醯半胱氨酸上海化學試劑公司進口分裝(美國)小牛血清白蛋白上海化學試劑公司進口分裝(日本)硫酸奎寧上海試劑二廠亞硝酸鈉上海振興試劑廠Comassie G-250，NA上海華舜生物工程有限公司進口分裝6.2給藥方法6.2.1嗎啡精神依賴模型同實施例3。嗎啡身體依賴模型同實施例4。
6.2.2連續給予TEYA的給藥方法小鼠隨機分組，即生理鹽水、單獨鹽酸嗎啡、鹽酸嗎啡+TEYA 20mg·kg-1(記作Mor+TEYA20)、鹽酸嗎啡+TEYA 40mg·kg-1(記作Mor+TEYA40)和鹽酸嗎啡+TEYA 80mg·kg-1(記作鹽酸嗎啡+TEYA80)。前5天為每天給予鹽酸嗎啡。試驗於第6天觀察動物之前1小時分別給予TEYA 20mg·kg-1、TEYA 40mg·kg-1和TEYA 80mg·kg-1；身體依賴性試驗於第7天皮下注射鹽酸嗎啡後5小時30分鐘給予TEYA。
6.2.3連續給予TEYA的給藥方法小鼠隨機分組，即生理鹽水、單獨鹽酸嗎啡8 mg·kg-1組、單獨TEYA 5mg·kg-1組、鹽酸嗎啡+TEYA 2.5mg·kg-1、鹽酸嗎啡+TEYA 5mg·kg-1和鹽酸嗎啡+TEYA 10mg·kg-1，於每次皮下注射鹽酸嗎啡後，立即腹腔內注射TEYA。
6.3實驗方法6.3.1 NO含量測定參考衛國，張均田.螢光分析法測定大鼠腦組織一氧化氮和一氧化氮合成酶.藥學學報1996；31(7)530-534；鍾慈聲，孫安陽主編.一氧化氮的生物醫學.上海上海科技大學出版社，1997361-3626.3.1.1硝基-N-乙醯半胱氨酸(NACNO)的製備將0.2mol·L-1硫酸配製的1.6mmol·L-1N-乙醯半胱氨酸1ml與4mmol·L-1的亞硝酸鈉等體積混合，反應生成硝基-N-乙醯半胱氨酸。反應產物於日立F-4000螢光分光光度計進行最大發射波長掃描。利用硝基-N-乙醯半胱氨酸對硫酸奎寧螢光強度的內濾作用測定硝基-N-乙醯半胱氨酸含量。
6.3.1.2 NO的標準曲線將0.3ml不同濃度的硝基-N-乙醯半胱氨酸與1μmol·L-1硫酸奎寧溶液3ml混合後加1mol·L-1HCl 0.1ml及0.1mol·L-1磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)0.3ml搖勻後於激發波長334nm，發射波長445nm，狹縫寬度均為5nm測定螢光強度。以硝基-N-乙醯半胱氨酸的濃度為橫坐標，所測螢光強度為縱坐標，繪製NO的標準曲線。
6.3.1.3蛋白質標準曲線和樣品蛋白質濃度測定依考馬斯亮藍G-250法[張均田主編.現代藥理實驗方法(上冊).北京北京醫科大學/中國協和醫科大學聯合出版社，199863]測定。
製備蛋白質標準曲線取試管編號，依次分別加入0，5，10，15，20，25，30，35，40，45和50μl的100μgml-1標準小牛血清白蛋白溶液，用重蒸餾水補足到50μl，加100μl考馬斯亮藍G-250染色液，立即混勻，室溫(20℃～25℃)放置5分鐘，以752型分光光度計(上海分析儀器廠)於595nm處比色測定。
樣品蛋白質濃度測定另取樣品如製備蛋白質標準曲線，從其A595值從蛋白質標準曲線推算出其濃度。每次樣本的測定以同一時間所作的標準曲線為準。
6.3.1.4一氧化氮(NO)含量測定觀察完條件性位置偏愛後，大鼠斷頭取腦稱重，冰浴下用0.1mol·L-1磷酸緩衝液(pH＝7.4)製成20％腦勻漿，用TGL-16G型冷凍臺式高速離心機(上海醫用分析儀器廠)4℃下10 000g離心30分鐘，取上清適量與1μmol·L-1硫酸奎寧(pH＝1)3ml混勻，加入1mol·L-1硫酸0.10ml及16mmo1·L-1N-乙醯半胱氨酸0.30ml，搖勻後於F-4000螢光分光光度儀(日本HITACHI公司)激發波長334nm，發射波長445nm處測定螢光強度，根據NO的標準曲線計算NO的含量。
6.4數據的統計學處理給藥組與生理鹽水對照組間或不同給藥組間比較採用Student t-test。所有數據均以平均值±標準差(x±s)表示。
6.5實驗結果嗎啡精神依賴小鼠腦內NO的含量顯著升高。單純連續給予TEYA 5mg·kg-1對NO的含量無影響。單次給予TEYA 40mg·kg-1可以使NO的含量降至正常水平。連續給予嗎啡+TEYA10mg·kg-1可使NO含量低於正常水平，說明TEYA的抗嗎啡依賴作用與降低嗎啡依賴小鼠腦內NO的含量有關。結果見表15。
表15.單次或連續給予TEYA對嗎啡精神依賴小鼠腦NO含量的影響。每組小鼠數＝7隻，x±s.與生理鹽水組比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與鹽酸嗎啡組比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01。
*劑量(mg·kg-1) NO*藥物Mor(sc)TEYA(ip) (nmol·mg蛋白-1)生理鹽水 -- -- 127±41鹽酸嗎啡 8 -- 184±26b連續TEYA5-- 5 116±36a，f鹽酸嗎啡+8 40 115±20a，f單次TEYA40鹽酸嗎啡+8 10 95±17b，f連續TEYA10*TEYA5、TEYA10、TEYA40分別為雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽5mg·kg-1、10mg·kg-1或40mg·kg-1；括號內代號為給藥途徑，sc為皮下注射，ip為腹腔內注射。
伴隨鹽酸嗎啡單次給予TEYA10mg·kg-1(eP＜0.05)和TEYA40mg·kg-1(fP＜0.01)，均可降低小鼠腦內NO的水平(結果見表16)，說明TEYA的抗嗎啡依賴作用與降低嗎啡依賴小鼠腦內NO的含量有關。
表16.連續或單次給予TEYA對嗎啡身體依賴小鼠腦NO含量(nmol·mg蛋白-1)的影響。每組小鼠數＝9隻，x±s.aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01，與生理鹽水組比較；dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01，與鹽酸嗎啡組比較劑量(mg·kg-1) NO含量*藥物鹽酸嗎啡(sc)TEYA(ip) (nmol·mg蛋白-1)生理鹽水-- -- 78±18鹽酸嗎啡10 -- 117±40b單次TEYA20-- 20 125±21c，d鹽酸嗎啡8 10 75±14a，e+TEYA10鹽酸嗎啡8 40 66±6a，f+TEYA40*TEYA10、TEYA20、TEYA40分別為雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽10mg·kg-1、20mg·kg-1或40mg·kg-1；括號內代號為給藥途徑，sc為皮下注射，ip為腹腔內注射。
結論以上實施例3～6的試驗結果表明在所試驗的劑量範圍內，TEYA在不具有身體依賴和精神依賴的同時，單次大劑量和多次小劑量均能顯著地抑制嗎啡誘導的條件性位置偏愛；多次小劑量給予TEYA，還可明顯的抑制納洛酮催促後嗎啡小鼠的跳躍次數及體重丟失。可以阻斷由應激刺激和給予外源性糖皮質激素引起的小鼠對嗎啡的「復吸」行為。TEYA具有明顯的鎮痛作用。灌胃和腹腔內注射給予TEYA的藥效試驗提示，TEYA在胃腸道內吸收比較完全而迅速，適合口服給藥。其抗阿片成癮的機制部分涉及阿片肽系統和一氧化氮(NO)系統等。從目前積累的研究資料看，TEYA已初步具備作為有效防治海洛因成癮脫毒治療後減少復吸的藥物的基本條件。因此，本發明雲南狗牙花總生物鹼及其鹽類可用於製備防治阿片類物質依賴性藥物或食品或製備鎮痛藥物。
權利要求
1.雲南狗牙花總生物鹼和其鹽類的製備方法，包括醇提取法和酸水提取法，其特徵在於所說的醇提取法按如下步驟操作雲南狗牙花根和莖或全株粉碎後用8～10倍量95％乙醇(W/W)回流提取，將乙醇提取液減壓濃縮至無乙醇，得醇提取物，提取物用酸水溶解，酸水可為2％鹽酸或2％硫酸，除去酸水不溶物，酸水液用濃氨水或5％碳酸鈉或1％氫氧化鈉中和至pH8～10，即產生沉澱，用氯仿或乙醚或苯萃取，有機溶劑萃取液中含生物鹼，回收氯仿或乙醚或苯即得雲南狗牙花總生物鹼；將雲南狗牙花總生物鹼溶於氯仿，於氯仿溶液中滴加濃鹽酸或冰醋酸或2mol/L硫酸至不再產生沉澱，過濾得沉澱，用適量丙酮洗去多餘的酸，即得雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽或醋酸鹽或硫酸鹽；所述的酸水提取法按下列步驟操作雲南狗牙花根和莖或全株粉碎後用8～10倍量(W/W)2％鹽酸或2％硫酸浸泡或滲濾，濾出酸水液，酸水液用濃氨水或5％碳酸鈉或1％氫氧化鈉中和至pH8～10，產生沉澱，過濾得沉澱，即為雲南狗牙花總生物鹼的粗製品；將雲南狗牙花總生物鹼粗製品乾燥後，用適量乙醇或氯仿回流溶解，過濾除去不溶物，濾液減壓蒸乾即得純化的雲南狗牙花總生物鹼；再將雲南狗牙花總生物鹼溶於氯仿，於氯仿溶液中滴加濃鹽酸或冰醋酸或2mol/L硫酸至不再產生沉澱，過濾得沉澱，用適量丙酮洗去多餘的酸，即得雲南狗牙花總生物鹼鹽酸鹽或醋酸鹽或硫酸鹽。
2.權利要求1所述方法製備的雲南狗牙花總生物鹼和其鹽類。
3.按權利要求2所述的雲南狗牙花總生物鹼和其鹽類，其特徵在於含有如下化合物苦參鹼(matrine)(1)，冠狗牙花鹼(coronaridine)(2)，19，20-二氫異斯替斯瑞克鹼(19，20-dihydroisostitsirikine)(3)，19-S-海泥山辣椒鹼(19-s-heyneanine)(4)，依潑加木胺(ibogamine)(5)，雲南辛鹼(yunnanensine)(6)，11』甲氧基-19-S-海泥山辣椒鹼(11′-methoxyl-19s-heyneanine)(7)，19，20-E-瓦來薩明鹼(19，20-E-vallesamine)(8)，雲南寧鹼(yunnanenine)(9)，10-羥基-19，20-二氫異斯替斯瑞克鹼(10-hydroxy-19，20-dihydroisositsirikine)(10)，榴花靈鹼(conodurine)(11)。
4.權利要求2或3所述的雲南狗牙花總生物鹼和其鹽類在製備防治阿片類物質依賴性藥物或鎮痛藥或食品中的應用。
全文摘要
本發明涉及醫藥技術領域，是用雲南狗牙花製備的總生物鹼和其鹽類以及用其製備防治阿片類物質依賴性藥物或食品或鎮痛藥物的用途。製備方法包括醇提取法和酸水提取法。製得的總生物鹼按常規製成鹽酸鹽、醋酸鹽或硫酸鹽。經藥理活性研究，雲南狗牙花總生物鹼具有鎮痛和戒毒作用，即對嗎啡和海洛因成癮都有脫毒和阻止復吸作用，且本身不具有身體依賴性和精神依賴性，因此，可用於製備防治阿片類物質依賴性藥物或食品或鎮痛藥物。
文檔編號C07D401/00GK1554656SQ20031012268
公開日2004年12月15日 申請日期2003年12月24日 優先權日2003年12月24日
發明者黃矛, 陳海生, 周麗華, 羅新根, 張曉東, 張衛東, 李萬亥, 譚興起, 黃 矛 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學