一種滇黃精的組培快繁方法與流程
2023-10-24 15:24:32 3
本發明屬於植物組織培養技術領域，具體涉及一種滇黃精的組培快繁方法。
背景技術：
黃精為百合科多年生草本植物黃精、滇黃精或多花黃精的根莖，具有潤肺滋陰、補中益氣、益腎增精的作用。近代研究表明，黃精含有煙酸、醒類、豁液質、澱粉、二氨基丁酸、黃精多糖及低聚糖等成分，有麻醉及降低動物血壓的作用，對腎上腺素引起的血糖過高有抑制作用，對改善腎功能也有較好功效。黃精還是一味抗菌良藥，對傷寒桿菌、結核桿菌、金黃色葡萄球菌及皮膚癬菌等均有一定抑制作用。近年來，黃精已廣泛用於冠心病、高血壓、糖尿病、肺結核、再生障礙貧血、以及預防放療、化療引起的副作用等。由此可見，黃精的市場應用前景廣闊，然而隨著市場需求量的不斷增加和野生資源的不斷減少，黃精的人工栽培已成為市場供求的主體。目前，黃精的繁殖方式主要有性（種子）繁殖和無性（根莖）繁殖兩種方式。由於黃精種子難收集，種子發芽率低，而且種子繁殖時間長。不利於黃精的人工大面積種植，所以在當前黃精的人工栽培中，繁殖主要依靠根莖的無性繁殖，該方法繁殖係數低、根莖的用量大，既不經濟，又限制了黃精的產量潛力，不便於栽培管理推廣。因此，研製開發一種成本低、繁殖係數高、繁殖速度快、技術穩定、可在短時間內提供大量優質黃精種苗的滇黃精的組培快繁方法是客觀需要的。
技術實現要素：
為了解決背景技術中存在的問題，本發明的目的在於提供一種成本低、繁殖係數高、繁殖速度快、技術穩定、可在短時間內提供大量優質黃精種苗的滇黃精的組培快繁方法。
本發明的目的是這樣實現的，一種滇黃精的組培快繁方法，包括以下幾個步驟：
①外殖體的選擇與處理:選取成熟、新鮮、無病蟲害的滇黃精根莖，用刀切取帶芽的根莖置於洗潔精水溶液中浸泡，浸泡1～3min後將其用流水清洗乾淨，然後用體積分數為70～75%的酒精浸泡1～2min，用無菌水反覆衝洗2～3次，最後放入質量分數為0.1～0.3%的氯化汞中反覆浸泡滅菌3～5次，每次浸泡的時間為3～5min，每次浸泡後須用無菌水衝洗2～3次,衝洗乾淨後再用無菌濾紙將無菌水吸乾，用刀切去傷口壞死的部分即可進行接種；
②誘導培養：將步驟①中消毒處理後的根莖接種於誘導培養基上進行誘導培養，在培養溫度為23～28℃，光照強度為2000～2500Lux，光照時間為12～16h/天的條件下培養，培養20～30天後根莖部分膨大，根莖的切口處誘導出淡黃色緻密的愈傷組織，所述誘導培養基為：MS基本培養基+1.0～3.0mg/L6-BA+0.5～1.0mg/L2,4-D+1.0～2.0mg/L赤黴素+5.0～10.0g/L瓊脂+20.0～30.0g/L蔗糖；
③繼代培養：先將步驟②中誘導出的愈傷組織轉接於繼代培養基中進行繼代培養，在培養溫度為23～28℃，光照強度為2000～2500Lux，光照時間為12～16h/天的條件下培養，培養20～30天分化出新的幼芽；所述繼代培養基為：MS培養基+3.0～4.5mg/L6-BA+2.0～3.0mg/L62BA +3.0～5.0mg/L玉米素+0.2～1.0mg/LNAA+1.0～3.0g/L瓊脂+5.0～10.0g/L蔗糖；
④增殖培養：將步驟③中繼代培養成功的帶有幼芽的根莖切成0.4～0.8cm3的小塊，然後接種於增殖培養基中，在培養溫度為23～28℃，光照強度為2000～2500Lux，光照時間為12～16h/天的條件下培養20～30天後獲得分化苗；所述增殖培養基為：MS培養基+2.0～4.0mg/L6-BA+0.5～1.5mg/L2,4D+0.5～1.0 mg/L GA3 +6.0～8.0g/L瓊脂+20.0～25.0g/L蔗糖；
⑤生根培養：待步驟④中增殖培養得到的分化苗長至2～4cm時，先將分化苗轉接到生根培養基上誘導生根，在培養溫度為23～28℃，光照強度為2000～2500Lux，光照時間為12～16h/天的條件下培養20～30天後可觀察到分化苗長出3～6條根須，根須長度為2～4cm，然後將分化苗移至自然光下培養，培養10天後即可進行組培苗的移栽，所生根培養基為：1/2MS培養基 +0.2～1.0mg/LNAA +0.2～0.6mg/LIBA+0.2～0.5%活性炭+5～20%香蕉 +6.0～8.0g/L瓊脂+20.0～25.0g/L蔗糖；
⑥煉苗移栽：將步驟⑤中培養得到的組培苗從生根培養基中取出，洗淨根部的培養基後，將組培苗移栽至苗床的育苗基質中，移栽初期需搭建小拱棚，覆蓋透明塑料布，適當遮蔭，保持環境溫度20～25℃，空氣溼度70～80%，每隔7天噴施1次營養液，15天後除去塑料布，逐漸通風，增加光照，轉入常規管理，30～40天即可進行大田移栽。
本發明利用植物組培方法建立了滇黃精的快速繁殖體系，通過將黃精的根莖反覆多次短時滅菌清洗，減少了汙染，降低了滅菌劑對外殖體的損傷，經消毒處理後的外殖體經過組培培育，及可產生大量的種苗，從塊莖到生根苗只需要6～8個月的時間。本發明在繁殖的過程中通過對各種的培養基、用量和培養條件的優化，不僅不僅有效的縮短了種苗培育的時間和成本，提高快繁的速度，而且有效的提高了黃精的繁殖係數，能較好的保持黃精的遺傳穩定性，利用本方法的繁殖體系，其黃精幼芽的發芽率可達到99%以上，增殖培養後的成苗率達到96%以上，生根培養後生根率為99%以上，移栽後的成活率可達到98%以上，一個不定芽的根莖一次就可以繁殖出百萬株的無性後代，該方法既可以為黃精的商品化生提供一套可行的生產技術路線，能為植物轉基因的研究提供了理想的材料，又能創造較好的社會效益和經濟效益。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基於本發明教導所作的任何變換或替換，均屬於本發明的保護範圍。
實施例1：
本實施例的具體步驟如下：
①外殖體的選擇與處理:選取成熟、新鮮、無病蟲害的滇黃精根莖，用刀切取帶芽的根莖置於洗潔精水溶液中浸泡，浸泡1min後將其用流水清洗乾淨，然後用體積分數為70%的酒精浸泡1～2min，用無菌水反覆衝洗2次，最後放入質量分數為0.1%的氯化汞中反覆浸泡滅菌3次，每次浸泡的時間為5min，每次浸泡後須用無菌水衝洗2～3次, 所述氯化汞中含有質量分數為0.02%的土溫20，衝洗乾淨後再用無菌濾紙將無菌水吸乾，用刀切去傷口壞死的部分即可進行接種；
②誘導培養：將步驟①中消毒處理後的根莖接種於誘導培養基上進行誘導培養，在培養溫度為23℃，光照強度為2500Lux，光照時間為12h/天的條件下培養，培養25天後根莖部分膨大，根莖的切口處誘導出淡黃色緻密的愈傷組織，所述誘導培養基為：MS基本培養基+3.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D+1.0mg/LKT+0.1mg/LNAA +1mg/L赤黴素+5g/L瓊脂+20g/L蔗糖；
③繼代培養：先將步驟②中誘導出的愈傷組織轉接於繼代培養基中進行繼代培養，在培養溫度為28℃，光照強度為2000ux，光照時間為16h/天的條件下培養，培養30天分化出新的幼芽；所述繼代培養基為：MS培養基+4.5mg/L6-BA+2mg/L62BA +3mg/L玉米素+0.2mg/LNAA+1.0g/L瓊脂+10g/L蔗糖；
④增殖培養：將步驟③中繼代培養成功的帶有幼芽的根莖切成0.4cm3的小塊，然後接種於增殖培養基中，在培養溫度為23℃，光照強度為2000Lux，光照時間為12h/天的條件下培養20天後獲得分化苗；所述增殖培養基為：MS培養基+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4D+1.0 mg/L GA3 +6.0g/L瓊脂+20g/L蔗糖；
⑤生根培養：待步驟④中增殖培養得到的分化苗長至2～4cm時，先將分化苗轉接到生根培養基上誘導生根，在培養溫度為23℃，光照強度為2000Lux，光照時間為16h/天的條件下培養30天後可觀察到分化苗長出3～6條根須，根須長度為2～4cm，然後將分化苗移至自然光下培養，培養10天後即可進行組培苗的移栽，所生根培養基為：1/2MS培養基 +0.2mg/LNAA +0.2mg/LIBA+0.3mg/LCA+0.2%活性炭+5%香蕉 +6.0g/L瓊脂+20g/L蔗糖；
⑥煉苗移栽：將步驟⑤中培養得到的組培苗從生根培養基中取出，洗淨根部的培養基後，將組培苗移栽至苗床的育苗基質中，所述育苗基質為：樹皮20份、鋸末10份、蛭石30份、黑土10份、珍珠巖5份、草木灰0.2份，移栽初期需搭建小拱棚，覆蓋透明塑料布，適當遮蔭，保持環境溫度20～25℃，空氣溼度70～80%，每隔7天噴施1次營養液，15天後除去塑料布，逐漸通風，增加光照，轉入常規管理， 40天即可進行大田移栽。
本實施例1的繁殖係數高、繁殖速度快、繁殖的周期短，培育得到種苗質量好、長勢強，利用本實施例1的培育方法，其幼芽的發芽率可達到99.35%，增殖培養後的成苗率達到97.4%，生根培養後生根率為99.8%，生根苗移栽後的成活率達到97.8%，一個地下根莖經滅均誘導成功後，55天後能切成5塊帶芽的組織塊，經過20天的增殖培養可得到30塊以上的帶芽塊，在經過4～5代的增殖培養即可得到百萬株種苗。
實施例2
本實施例的具體步驟如下：
①外殖體的選擇與處理:選取成熟、新鮮、無病蟲害的滇黃精根莖，用刀切取帶芽的根莖置於洗潔精水溶液中浸泡，浸泡2min後將其用流水清洗乾淨，然後用體積分數為72.5%的酒精浸泡2min，用無菌水反覆衝洗3次，最後放入質量分數為0.2%的氯化汞中反覆浸泡滅菌4次，每次浸泡的時間為4min，每次浸泡後須用無菌水衝洗2～3次,衝洗乾淨後再用無菌濾紙將無菌水吸乾，用刀切去傷口壞死的部分即可進行接種，所述氯化汞中含有質量分數為0.06%的土溫20；
②誘導培養：將步驟①中消毒處理後的根莖接種於誘導培養基上進行誘導培養，在培養溫度為25℃，光照強度為2200Lux，光照時間為14h/天的條件下培養，培養25天後根莖部分膨大，根莖的切口處誘導出淡黃色緻密的愈傷組織，所述誘導培養基為：MS基本培養基+2mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D+1.5mg/L赤黴素+8g/L瓊脂+25g/L蔗糖；
③繼代培養：先將步驟②中誘導出的愈傷組織轉接於繼代培養基中進行繼代培養，在培養溫度為25℃，光照強度為2200Lux，光照時間為14h/天的條件下培養，培養25天分化出新的幼芽；所述繼代培養基為：MS培養基+4.0mg/L6-BA+2.5mg/L62BA +3.0mg/L玉米素+0.2mg/LNAA+3.0g/L瓊脂+8.0g/L蔗糖；
④增殖培養：將步驟③中繼代培養成功的帶有幼芽的根莖切成0.6cm3的小塊，然後接種於增殖培養基中，在培養溫度為28℃，光照強度為2500Lux，光照時間為16h/天的條件下培養25天後獲得分化苗；所述增殖培養基為：MS培養基+3.0mg/L6-BA+1.0mg/L2,4D+0.8 mg/L GA3 +8.0g/L瓊脂+22.0g/L蔗糖；
⑤生根培養：待步驟④中增殖培養得到的分化苗長至2～4cm時，先將分化苗轉接到生根培養基上誘導生根，在培養溫度為25℃，光照強度為2200Lux，光照時間為16h/天的條件下培養25天後可觀察到分化苗長出3～6條根須，根須長度為2～4cm，然後將分化苗移至自然光下培養，培養10天後即可進行組培苗的移栽，所生根培養基為：1/2MS培養基 +0.8mg/LNAA +0.4mg/LIBA+0.3%活性炭+10%香蕉 +0.5mg/LCA +7.0g/L瓊脂+22.0g/L蔗糖；
⑥煉苗移栽：將步驟⑤中培養得到的組培苗從生根培養基中取出，洗淨根部的培養基後，將組培苗移栽至苗床的育苗基質中，所述育苗基質為：樹皮30份、鋸末25份、蛭石35份、黑土20份、珍珠巖3份、草木灰0.2份，移栽初期需搭建小拱棚，覆蓋透明塑料布，適當遮蔭，保持環境溫度20～25℃，空氣溼度70～80%，每隔7天噴施1次營養液，15天後除去塑料布，逐漸通風，增加光照，轉入常規管理，30～40天即可進行大田移栽。
本實施例2的繁殖係數高、繁殖速度快、繁殖的周期短，培育得到種苗質量好、長勢強，利用本實施例2的培育方法，其幼芽的發芽率可達到99.56%，增殖培養後的成苗率達到98.67%，生根培養後生根率為99.45%，生根苗移栽後的成活率達到99.2%，一個地下根莖經滅均誘導成功後，50天後能切成5塊帶芽的組織塊，經過25天的增殖培養可得到30塊以上的帶芽塊，在經過4～5代的增殖培養即可得到百萬株種苗。
實施例3：
本實施例的具體步驟如下：
①外殖體的選擇與處理:選取成熟、新鮮、無病蟲害的滇黃精根莖，用刀切取帶芽的根莖置於洗潔精水溶液中浸泡，浸泡3min後將其用流水清洗乾淨，然後用體積分數為75%的酒精浸泡2min，用無菌水反覆衝洗3次，最後放入質量分數為0.3%的氯化汞中反覆浸泡滅菌5次，每次浸泡的時間為3min，每次浸泡後須用無菌水衝洗2～3次,衝洗乾淨後再用無菌濾紙將無菌水吸乾，用刀切去傷口壞死的部分即可進行接種，所述氯化汞中含有質量分數為0.1%的土溫20；
②誘導培養：將步驟①中消毒處理後的根莖接種於誘導培養基上進行誘導培養，在培養溫度為28℃，光照強度為2500Lux，光照時間為16h/天的條件下培養，培養30天後根莖部分膨大，根莖的切口處誘導出淡黃色緻密的愈傷組織，所述誘導培養基為：MS基本培養基+3.0mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D+2.0mg/LKT+0.2mg/LNAA +2.0mg/L赤黴素+5.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖；
③繼代培養：先將步驟②中誘導出的愈傷組織轉接於繼代培養基中進行繼代培養，在培養溫度為28℃，光照強度為2000Lux，光照時間為12h/天的條件下培養，培養30天分化出新的幼芽；所述繼代培養基為：MS培養基+4.5mg/L6-BA+3.0mg/L62BA +5.0mg/L玉米素+0.2mg/LNAA+3.0g/L瓊脂+10.0g/L蔗糖；
④增殖培養：將步驟③中繼代培養成功的帶有幼芽的根莖切成0.8cm3的小塊，然後接種於增殖培養基中，在培養溫度為28℃，光照強度為2500Lux，光照時間為12h/天的條件下培養30天後獲得分化苗；所述增殖培養基為：MS培養基+4.0mg/L6-BA+1.5mg/L2,4D+1.0 mg/L GA3 +6.0g/L瓊脂+25.0g/L蔗糖；
⑤生根培養：待步驟④中增殖培養得到的分化苗長至2～4cm時，先將分化苗轉接到生根培養基上誘導生根，在培養溫度為28℃，光照強度為2500Lux，光照時間為12h/天的條件下培養30天後可觀察到分化苗長出3～6條根須，根須長度為2～4cm，然後將分化苗移至自然光下培養，培養10天後即可進行組培苗的移栽，所生根培養基為：1/2MS培養基 +1.0mg/LNAA +0.6mg/LIBA+0.5%活性炭+20%香蕉 +8.0g/L瓊脂+25.0g/L蔗糖；
⑥煉苗移栽：將步驟⑤中培養得到的組培苗從生根培養基中取出，洗淨根部的培養基後，將組培苗移栽至苗床的育苗基質中，所述育苗基質為：樹皮40份、鋸末30份、蛭石40份、黑土20份、珍珠巖5份、草木灰0.3份，移栽初期需搭建小拱棚，覆蓋透明塑料布，適當遮蔭，保持環境溫度20～25℃，空氣溼度70～80%，每隔7天噴施1次營養液，15天後除去塑料布，逐漸通風，增加光照，轉入常規管理，30～40天即可進行大田移栽。
本實施例3的繁殖係數高、繁殖速度快、繁殖的周期短，培育得到種苗質量好、長勢強，利用本實施例3的培育方法，其幼芽的發芽率可達到99.21%，增殖培養後的成苗率達到99.45%，生根培養後生根率為99.95%，生根苗移栽後的成活率達到98.2%，一個地下根莖經滅均誘導成功後，60天後能切成5塊帶芽的組織塊，經過30天的增殖培養可得到30塊以上的帶芽塊，在經過4～5代的增殖培養即可得到百萬株種苗。