赤潮異灣藻半定量檢測試紙條及其製備使用方法
2023-10-06 18:55:09 1
專利名稱：赤潮異灣藻半定量檢測試紙條及其製備使用方法
技術領域：
本發明屬於基於膠體金免疫層析分析技術(gold immunochromato graphy assay，GICA)的浮遊藻類半定量免疫層析檢測分析技術領域，特別涉及赤潮異灣藻的半定量免疫層析檢測分析試紙條及其製備檢測方法領域，其屬於免疫學和浮遊生物學交叉技術領域。
背景技術：
浮遊植物的分類、鑑定和定量一直是藻類學和生態學研究中最基礎的課題之一。對生態動力學、赤潮發生機制與預警預報、海水養殖水域常規檢測等都有著重要意義。對於常規環境監測、漁業養殖水體檢測等應用領域來說，需要一種對主要赤潮藻進行現場半定量檢測的方法。本發明內容主要涉及海洋浮遊植物的檢測技術和膠體金免疫層析分析技術兩個技術領域。
現有的檢測方法主要有基於形態學特徵的分析方法、基於細胞色素的檢測方法、基於分子探針的檢測技術，以及不同技術的交叉如流式細胞術和FLOWCAM技術等。這些技術極大地豐富了浮遊植物觀測技術，推動了相關研究的發展，各項技術均有著突出的優勢也存在著難以克服的制約因素。現有的浮遊藻類檢測方法主要包括1、基於形態學特徵的分析方法傳統的基於形態學的光鏡和電鏡觀測技術是浮遊植物鑑定與定量的基礎，至今仍有著不可動搖的地位，發揮著很重要的作用。但其存在著耗時長，需要富有經驗的專家、專業儀器設備等限制性因素。FLOWCAM技術是形態學與流式細胞術的結合，利用計算機技術對捕獲的照片進行識別分類。相對傳統技術，這一技術加快了分析的速度，但是仍然存在需要專家幹預，形態相似的種類無法區分的缺點。同時由於技術的限制，該技術獲得的圖像解析度較差，更在一定程度上影響了識別的準確度。
2、流式細胞術該技術通過逐個測量細胞的散射光、細胞自體螢光、染色螢光和免疫標記螢光等來檢測其生理生化指標並對其分類、收集。現已成為環境微生物學中的十分有用的工具。該技術的限制主要是在環境變化的情況下，細胞的形態、大小及生理生化特性會發生顯著變化，而這正是流式細胞術的檢測基礎，這將影響該技術對於各種類的正確區分。同時儀器成本較高，對工作環境要求嚴格，需要良好訓練的專業技術人員等因素也限制了其應用。
3、基於細胞色素的檢測方法由於不同種屬的浮遊藻中含有不同的色素組成，或特徵色素，基於細胞色素的檢測方法就是藉由檢測樣品中各種色素的豐度(及特徵色素)對不同的浮遊植物類群加以區分和定量。依據對色素的檢測方法不同而有化學分類學方法、現場螢光、遙感反演等不同的技術。這些技術均可迅速的獲取結果，但由於藻類色素的相似性，這些技術僅能提供浮遊植物幾種類群的分類數據，難以提供精確到種屬結果。化學分類法是以分類對象各類群中化學成分的特徵為分類依據。可以在藻綱一級進行較好的分類，甚至於對於某些形態學上十分相近的種類在標誌化合物上也有著差異，可以藉助這一方法區分鑑定。但在屬或種之間的分類還不能完全實現。現場螢光方法是在光源的激發下，檢測藻類中色素髮出的螢光，藉助光譜的差異可以區分不同的浮遊植物類群。這一方法可以迅速測定，並可以在水下等現場環境連續測定，但此方法只能將浮遊植物根據其色素分為幾個類群。利用衛星遙感數據，對海域葉綠素含量進行測量。這一方法可以迅速提供廣大區域的數據，但往往只能反演葉綠素含量，估算浮遊植物總量，難以進一步提供浮遊植物的類群等信息。同時，由於環境因素的變化、不同的生長周期，浮遊植物的色素含量會發生變化，基於細胞色素的各種方法的檢測結果也會受到影響。
對於常規環境監測、漁業養殖水體檢測來說，需要一種對主要赤潮藻進行現場快速簡易低成本的檢測方法。在現有浮遊植物檢測方法中尚未有完全適用的方法。而臨床檢測中的GICA技術由於具有不需儀器，操作簡單，檢測快速，並且可以給出半定量的結果而成為滿足這一領域需求的最佳選擇。目前國際國內在應用免疫學方法檢測浮遊植物的研究，多以製備抗體和ELISA檢測居多，未有採用GICA技術檢測浮遊植物的研究。與ELISA不同處是GICA反應時間大大縮短，不需要儀器設備，僅需要數十分鐘就完成了ELISA需數小時才能顯示的結果。因為在GICA中，高濃度的抗體集中固定在纖維素的微孔中，待測抗原在層析時，流經微孔與固定的高濃度抗體緊密接觸，很快完成免疫結合反應。這就是以膜為基礎的膠體金快速免疫結合分析中的免疫濃縮作用(immunoconcentraiton)。在ELISA中，待測抗原要在液相中經過擴散作用，逐漸與吸附在固相表面的抗體結合。同時，標記抗體也需要同樣的擴散結合過程形成抗體-抗原-標記抗體複合物，故需時間較長。
本發明通過免疫學技術，以藻細胞或提取物免疫實驗動物，製備浮遊藻的多抗，利用抗體，建立GICA的免疫分析方法。不需儀器，操作簡單，檢測快速，並且可以給出半定量的結果。
發明內容
膠體金標記技術(Immunogold labeling technique)是以膠體金作為示蹤標記物，應用於抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術；膠體金是由氯金酸在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金顆粒，並由於靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，故稱為膠體金。利用它在鹼性環境中帶負電荷的性質，與蛋白質分子的正電荷基團藉靜電吸引而形成牢固結合，除抗體蛋白外，膠體金還可與其他多種生物大分子結合。根據膠體金的一些物理特性，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物所具有的免疫-生物學特性，使其在免疫學、組織學、病理學及細胞生物學標記研究工作中得到廣泛應用。
本發明的內容是首先製備抗體金探針，以GICA(膠體金免疫層析技術)技術為基礎，通過精確控制膜上捕捉配體的量，使用多條不同濃度的平行捕捉配體線的方法，以顯色條帶的數目，判斷分析物的濃度區間，建立對赤潮異灣藻的半定量檢測試紙條。本發明主要分為九個部分1、抗體金探針(膠體金標記的抗體)的製備。採用常用的膠體金(如抗壞血酸還原法、鞣酸—檸檬酸三鈉還原法、乙醇超聲波還原法)製備方法，優化膠體金標記實驗條件，取得穩定高效的抗體金探針。透析純化目標藻抗體。檢驗製備的膠體金的顆粒直徑、均勻度等指標，選擇穩定的方法製備20～30nm的膠體金，4℃保存。
2、藻類半定量免疫層析分析技術的建立。以GICA技術為基礎，通過精確控制膜上捕捉配體的量，使用多條不同濃度的平行捕捉配體線的方法，通過顯色條帶的數目，判斷分析物的濃度區間，建立對目標藻的半定量GICA技術。
3、免疫原的製備。將生長旺盛的赤潮異灣藻細胞培養溶液用終濃度為2％的甲醛固定過夜，10000r/min離心10min，收集藻細胞沉澱。藻細胞團塊再用蒸餾水清洗一次，PBS清洗二次，每次均通過離心收集藻細胞，離心條件均為，10000r/min，10min。將收集的藻細胞分裝於1.5mlEppendorf管，甩去殘餘水分，-20℃保存備用。臨用前取出，用滅菌的5ml PBS重新懸浮均勻。將藻細胞標準溶液通過超聲波和冷熱交替處理(-75℃，15min；100℃，5min，三次循環)後得到已知細胞密度的破碎藻細胞標準溶液。
4、多克隆抗體的製備及純化。將處理好的藻細胞用0.5mlPBS重懸，混勻，與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，乳化程度儘量完全。家兔通過腹腔注射、肌肉注射和背部皮下多點注射的方式進行免疫。初次免疫劑量分別約為每隻家兔1×106、2×106和4×106個細胞，通過耳緣靜脈採血。採集的血液室溫放置2小時，然後離心(4000r/min，5min)分離血清。為提高測定的穩定性與專一性，需要對抗體純化。對兔抗血清進行親和層析柱純化處理後，可以去除大部分血清雜蛋白從而IgG得到富集，純化後抗血清效價有較大的提高，對於需要包被IgG抗體或者對抗體進行標記十分必要。
5、待標記抗體的預處理。透析除鹽，由於過高的鹽類物質會降低膠體金顆粒的Zeta電位，影響蛋白質的吸附，需要透析除去蛋白質溶液內多餘的電解質。去除沉澱，蛋白質的聚合物對標記過程及抗體金探針的穩定性有一定影響，標記之前須離心以除去這些聚合物。優化膠體金標記抗體的實驗條件調整pH值將膠體金溶液的pH值調至待標記蛋白質的等電點略偏鹼。通過實驗確定膠體金抗體最適用量比例。
6、抗體金探針的製備。採用上述選擇的條件標記抗體金探針；將標記好的抗體金探針在蔗糖或矽膠中濃縮保存。選用凝膠過濾法純化抗體金探針，用牛血清白蛋白作穩定劑，除去其中未標記的抗體，未反應的膠體金以及在標記過程中可能形成的各種聚合物。對純化後免疫金探針的特異性，敏感性進行鑑定，判斷其是否仍保持很好的生物學活性。
7、膠體金探針玻璃纖維素膜的製備。將玻璃纖維素膜在免疫金探針溶液中浸泡後晾乾。
8、固定捕獲抗體的硝酸纖維素膜(NC)的製備。取製備的赤潮異灣藻細胞破碎物、羊抗兔抗體用固定液稀釋。用赤潮異灣藻細胞破碎物固定溶液在硝酸纖維素膜上劃三條平行線作為捕獲抗原檢測線。再用羊抗兔抗體固定溶液在三條平行線後劃一條平行的作為二抗質控線。將固相抗體硝酸纖維素膜置封閉液中孵育後洗去未結合的抗體，晾乾備用。
9、半定量檢測及試紙製備。通過已知赤潮異灣藻濃度樣品試驗，確定檢測1010個/m3、108個/m3、106個/m3的藻細胞樣品需要的捕獲抗原(檢測線)濃度。據此在膜上劃三條平行的不同濃度的檢測線，對應於不同的檢測物濃度，製作半定量檢測試紙條。
本發明為一種赤潮異灣藻半定量檢測試紙條，包括塑料載體板，玻璃纖維膜樣品層、玻璃纖維膜抗體標記層、硝酸纖維膜檢測層、玻璃纖維膜吸水層。所述檢測試紙條玻璃纖維膜樣品層、玻璃纖維膜抗體標記層、硝酸纖維膜檢測層、玻璃纖維膜吸水層順式膠合固定在塑料載體板一側；所述檢測試紙條硝酸纖維膜檢測層上設有赤潮異灣藻抗原分級檢測線、二抗質控線；所述玻璃纖維膜吸水層膠合在硝酸纖維膜檢測層右端之上；所述塑料載體板中部設有硝酸纖維膜檢測層，在該檢測層與玻璃纖維膜樣品層交界處，設有載有膠體金標記的赤潮異灣藻抗體的玻璃纖維膜抗體標記層，該層一端置於玻璃纖維膜樣品層下，並與塑料載體板膠合，另一端設置在硝酸纖維膜檢測層之上，並與硝酸纖維膜檢測層膠合。
所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條硝酸纖維膜檢測層上的赤潮異灣藻抗原分級標記線由檢測濃度分別為1010個/m3、108個/m3、106個/m3的三條標記線組成。
所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條硝酸纖維膜檢測層上的二抗質控線包被有羊抗兔IgG；赤潮異灣藻半定量檢測試紙條玻璃纖維膜抗體標記層上載有膠體金標記的兔抗赤潮異灣藻抗體。
所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條玻璃纖維膜抗體標記層上的膠體金標記的兔抗赤潮異灣藻抗體製備方法如下膠體金的製備鞣酸—檸檬酸三鈉還原法製備20～30nm的膠體金，4℃保存；兔抗赤潮異灣藻抗體的製備將生長旺盛的赤潮異灣藻細胞培養溶液用終濃度為1～3％的甲醛固定過夜，8000～12000r/min離心10min，收集藻細胞沉澱；藻細胞團塊再用蒸餾水清洗一次，PBS清洗二次，每次均通過離心收集藻細胞，離心條件均為，8000～12000r/min，8～12min；將收集的藻細胞分裝於1.5ml Eppendorf管，將赤潮異灣藻藻細胞破碎物用滅菌的0.3～0.6mlPBS重懸，混勻，與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，乳化程度儘量完全；初次免疫劑量分別約為1×106、2×106和4×106個細胞每隻動物；靜脈採血，採集的血液室溫放置2小時，然後2000～6000r/min，離心5min，分離血清，4℃冷藏保存。
本發明的另一種應用為所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條硝酸纖維膜檢測層上的二抗質控線包被有羊抗雞IgG；赤潮異灣藻半定量檢測試紙條玻璃纖維膜抗體標記層上載有膠體金標記的雞抗赤潮異灣藻抗體。
本發明的再一種應用為所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條硝酸纖維膜檢測層上的二抗質控線包被有羊抗鼠IgG；赤潮異灣藻半定量檢測試紙條玻璃纖維膜抗體標記層上載有膠體金標記的鼠抗赤潮異灣藻抗體。
所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條的檢測範圍是藻細胞濃度檢出下限為106個/m3，在藻細胞濃度106-1010個/m3的範圍內提供三級區分的半定量檢測結果1010個/m3、108個/m3、106個/m3；檢測時間少於30分鐘。
本發明還包括一種赤潮異灣藻半定量檢測試紙條的使用方法，所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條的使用方法製備檢測樣品的過程是將被檢測樣品溶液過濾，濾膜對摺放入5ml離心管中，加3mlPBS將濾膜完全浸泡，超聲波破碎5分鐘，去所得溶液1ml，剩餘2ml溶液加入到2ml的離心管中，將赤潮異灣藻半定量檢測試紙條玻璃纖維膜樣品層插入離心管中，15分鐘後可觀察結果。
本發明為常規環境監測、漁業養殖水體檢測、以及赤潮生效過程監測的現場實驗，提供快速簡便的在現場對赤潮多發藻進行半定量的檢測方法，對於我國海洋環境資源、尤其是生物資源的評價和管理有極大的促進作用，為海洋環境管理和海水養殖提供最直接的技術基礎。在環境檢測、海洋養殖、港口檢疫等行業均有著對赤潮生物半定量檢測的需求，上述行業蘊藏著大量的潛在用戶。在國內各海洋科研和監測單位也有著實際的應用價值，可以更好地促進我國的海洋學研究和環境學研究。
圖1為赤潮異灣藻半定量檢測試紙條的立體結構示意圖。圖中標號分別為1、塑料載體板，2、玻璃纖維膜樣品層，3、附有抗體金標記的赤潮異灣藻抗體玻璃纖維膜抗體標記層，4、硝酸纖維膜檢測層，5、玻璃纖維膜吸水層，6、三種濃度的抗原檢測線，7、二抗質控線。
圖2為赤潮異灣藻半定量檢測試紙條的側視圖。圖中標號分別為1、塑料載體板，2、玻璃纖維膜樣品層，3、附有抗體金標記的赤潮異灣藻抗體玻璃纖維膜抗體標記層，4、硝酸纖維膜檢測層，5、玻璃纖維膜吸水層，6、三種濃度的抗原檢測線，7、二抗質控線。
圖3為赤潮異灣藻半定量檢測試紙條梯度實驗檢測結果照片。梯度實驗中，按量取100ml藻溶液計算，各藻溶液的梯度濃度分別為1、陰性對照2、9×106個/立方米3、3×108個/立方米4、1×1010個/立方米圖4為赤潮異灣藻半定量檢測試紙條特異性實驗檢測結果照片。異性實驗檢測中，按量取100ml藻溶液計算，各編號分別代表A1、中肋骨條藻A2、角毛藻A3、裸甲藻A4、原甲藻圖5為赤潮異彎藻抗體產生曲線。對兔1、兔2分次採血抗血清的效價測定結果顯示第一、二次免疫後未見明顯的IgG抗體產生，效價測定值為0；第三次免疫後開始有相當數量的IgG抗體產生，效價達到1510和1420；第四次免疫後有大量抗體產生，效價為9200和11000；第五次免疫後抗體產生達到一個峰值，效價高達15300和25200；第六次免疫後抗體的產生量未見有明顯的增加，效價只增加到17500和26800；但抗體的數量在未有加強免疫的情況下三周內維持在18000和27000左右。由此可見，在免疫4-5次之後，實驗動物體中即存在有大量的IgG類抗體，已基本可以滿足試驗的需要；在免疫5次之後，血清中IgG抗體的數量即達到一個相對穩定的水平，並且可以在機體中維持較長的時間。
具體實施例方式
實施方式一免疫原的製備將生長旺盛的赤潮異灣藻細胞培養溶液用終濃度為2％的甲醛固定過夜，10000r/min離心10min，收集藻細胞沉澱。藻細胞團塊再用蒸餾水清洗一次，PB S清洗二次，每次均通過離心收集藻細胞，離心條件均為，10000r/min，10min。將收集的藻細胞分裝於1.5ml Eppendorf管，甩去殘餘水分，-20℃保存備用。臨用前取出，用滅菌的5ml PBS重新懸浮均勻。將藻細胞標準溶液通過超聲波和冷熱交替處理(-75℃，15min；100℃，5min，三次循環)後得到已知細胞密度的破碎藻細胞標準溶液。
實施方式二抗體效價的測定。
採用間接ELISA法測定抗體的效價，主要步驟如下(1)海藻或海藻粗提液包被(105-106個細胞/ml)，100μl/孔，4℃溼盒過夜；(2)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸餾水衝2次，甩幹殘存液體；(3)封閉，用1％的BSA，包被緩衝溶液稀釋，120μl/孔，37℃，3h或者4℃過夜；(4)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸餾水衝2次，甩幹殘存液體；(5)加入海藻的多克隆抗體梯度稀釋溶液，100μl/孔，37℃，1.5h；(6)洗板，0.5％PBST洗6次，蒸餾水衝2次，甩幹殘存液體；(7)加入酶標二抗的稀釋溶液，100μl/孔，37℃，1.5h；(8)洗板，0.5％PBST洗6次，蒸餾水衝2次，甩幹殘存液體；(9)加入底物TMB溶液，100μl/孔，37℃，15min；(10)2mol/L H2SO4終止反應，50μl/孔；(11)酶標儀讀取A450值。
將滿足條件P(待檢血清)/N(陰性對照血清)≥2.1，且P(待檢血清)＞0.2的顯色孔判為陽性，並將抗血清的效價定義為與50％固相抗原結合時抗血清的稀釋倍數。如圖5所示，兔抗血清的效價從初始免疫後第3-4周開始顯著增加，第7周達基本達到高峰值，之後維持在這一高水平，不再有明顯的上升趨勢。免疫過程結束後，抗血清效價維持在較高水平一段時間，至第16周時開始有下降趨勢。兔抗血清的最高效價約為16000。
實施方式三抗體特異性的測定。
採用間接ELISA法測定抗體的特異性，具體步驟為(1)a類海藻或海藻粗提液包被(105-106個細胞/ml)，100μl/孔，4℃溼盒過夜；
(2)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸餾水衝2次，甩幹殘存液體；(3)封閉，用1％的BSA，包被緩衝溶液稀釋，120μl/孔，37℃，3h或者4℃過夜；(4)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸餾水衝2次，甩幹殘存液體；(5)加入b類海藻的多克隆抗體稀釋溶液，100μl/孔，37℃，1.5h；(6)洗板，0.5％PBST洗6次，蒸餾水衝2次，甩幹殘存液體；(7)加入酶標二抗的稀釋溶液，100μl/孔，37℃，1.5h；(8)洗板，0.5％PB ST洗6次，蒸餾水衝2次，甩幹殘存液體；(9)加入底物TMB溶液，100μl/孔，37℃，15min；(10)2mol/L H2SO4終止反應，50μl/孔；(11)酶標儀讀取A450值。
將滿足條件P(待檢海藻)/N(陰性對照)≥2.1，且P(待檢海藻)＞0.2的顯色孔判為陽性，根據陽性信號的強弱判斷交叉反應的強弱。
實施方式四抗體特異性測定的另一方法。
採用間接競爭ELISA法測定抗體特異性，具體步驟為(1)海藻或海藻粗提液包被(105-106個細胞/ml)，100μl/孔，4℃溼盒過夜；(2)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸餾水衝2次，甩幹殘存液體；(3)封閉，用1％的BSA，包被緩衝溶液稀釋，120μl/孔，37℃，3h或者4℃過夜；(4)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸餾水衝2次，甩幹殘存液體；(5)加入各類海藻細胞的梯度稀釋溶液50μl/孔和海藻的多克隆抗體稀釋溶液50μl/孔，100μl/孔，37℃，1.5h；(6)洗板，0.5％PBST洗6次，蒸餾水衝2次，甩幹殘存液體；(7)加入酶標二抗的稀釋溶液，100μl/孔，37℃，1.5h；(8)洗板，0.5％PBST洗6次，蒸餾水衝2次，甩幹殘存液體；(9)加入底物TMB溶液，100μl/孔，37℃，15min；
(10)2mol/LH2SO4終止反應，50μl/孔；(11)酶標儀讀取A450值。
根據各孔的吸光值繪製競爭抑制曲線，交叉反應率通過計算抑制率50％時抗原量與近似抗原量的比值獲得。硅藻門赤潮異灣藻屬4種海藻與4種抗赤潮異灣藻抗血清之間具有強烈的交叉反應，P(待測樣本)/N(空白對照)≥4，與其他種屬的海藻幾乎沒有交叉反應，所以抗赤潮異灣藻抗血清具有較好的屬特異性，可以用於海洋浮遊微型赤潮異灣藻類的檢測。
實施方式五樣品的檢測方法現場樣品提取將被檢測樣品溶液過濾，濾膜對摺放入5ml離心管中，加3mlPBS將濾膜完全浸泡，超聲波破碎5分鐘，去所得溶液1ml，剩餘2ml溶液加入到2ml的離心管中，將赤潮異灣藻半定量檢測試紙條玻璃纖維膜樣品層插入離心管中，15分鐘後可觀察結果。
進行檢測時，使用微量移液器吸取一定體積的樣品溶液，滴加在玻璃纖維膜樣品層2上，樣品溶液在毛細作用的拉動下做橫向層析流動樣品向玻璃纖維膜吸水層5方向流動，途徑載有抗體金標記的赤潮異灣藻抗體的玻璃纖維膜抗體標記層3後，將抗體金探針完全復溶，抗原與抗體金探針形成抗體金探針——抗原複合物，抗體金探針——抗原複合物與未結合的抗體金探針繼續向前流動至硝酸纖維膜檢測層4上固定有捕捉抗體金探針的捕獲抗原線6處。當樣品中不含有檢測物時，抗體金探針就會在6處形成抗體金探針——捕獲抗原複合物，膠體金聚合，呈現紅色陰性條帶；如樣品中有抗原，則抗原會在吸附抗體金標記的赤潮異灣藻抗體的玻璃纖維層3處形成抗原——抗體複合物，未複合的抗體金探針以及抗原——抗體複合物繼續向前流動至硝酸纖維素膜條4上，抗原——抗體複合物不被捕獲，就不顯色。只有未複合的抗體金探針會在6處形成抗體金探針——捕獲抗原複合物，膠體金聚合，呈現弱紅色陽性條帶，但條帶顏色會因抗體金探針數量的減少而減弱；若待測赤潮異灣藻抗原過量，則抗體金探針全部形成抗原——抗體複合物，而沒有游離的抗體金探針，故捕獲抗原線6處不顯色，結果為陽性。形成的抗原——抗體複合物繼續前移至固定有抗體金探針二抗的質控線7處，被固定呈現紅色的陽性條帶，表明該檢測試紙條未失效。
本領域的普通技術人員都會理解，在本發明的保護範圍內，對於上述實施例進行無顯著特點和實質性進步的修改，添加和替換都是可能的，這些改動都沒有超出本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種赤潮異灣藻半定量檢測試紙條，包括塑料載體板，玻璃纖維膜樣品層、玻璃纖維膜抗體標記層、硝酸纖維膜檢測層、玻璃纖維膜吸水層，其特徵在於所述檢測試紙條玻璃纖維膜樣品層、玻璃纖維膜抗體標記層、硝酸纖維膜檢測層、玻璃纖維膜吸水層順式膠合固定在塑料載體板一側；所述檢測試紙條硝酸纖維膜檢測層上設有赤潮異灣藻抗原分級檢測線、二抗質控線；所述玻璃纖維膜吸水層膠合在硝酸纖維膜檢測層右端之上；所述塑料載體板中部設有硝酸纖維膜檢測層，在該檢測層與玻璃纖維膜樣品層交界處，設有載有膠體金標記的赤潮異灣藻抗體的玻璃纖維膜抗體標記層，該層一端置於玻璃纖維膜樣品層下，並與塑料載體板膠合，另一端設置在硝酸纖維膜檢測層之上，並與硝酸纖維膜檢測層膠合。
2.根據權利要求1所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條，其特徵在於，所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條硝酸纖維膜檢測層上的赤潮異灣藻抗原分級標記線由檢測濃度分別為1010個/m3、108個/m3、106個/m3的三條標記線組成。
3.根據權利要求1所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條，其特徵在於，所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條硝酸纖維膜檢測層上的二抗質控線包被有羊抗兔IgG；赤潮異灣藻半定量檢測試紙條玻璃纖維膜抗體標記層上載有膠體金標記的兔抗赤潮異灣藻抗體。
4.根據權利要求1、2或3所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條，其特徵在於，所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條玻璃纖維膜抗體標記層上的膠體金標記的兔抗赤潮異灣藻抗體製備方法如下(1)膠體金的製備鞣酸—檸檬酸三鈉還原法製備20～30nm的膠體金，4℃保存；(2)兔抗赤潮異灣藻抗體的製備將生長旺盛的赤潮異灣藻細胞培養溶液用終濃度為1～3％的甲醛固定過夜，8000～12000r/min離心10min，收集藻細胞沉澱；藻細胞團塊再用蒸餾水清洗一次，PBS清洗二次，每次均通過離心收集藻細胞，離心條件均為，8000～12000r/min，8～12min；將收集的藻細胞分裝於1.5ml Eppendorf管，將赤潮異灣藻藻細胞破碎物用滅菌的0.3～0.6mlPBS重懸，混勻，與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，乳化程度儘量完全；初次免疫劑量分別約為1×106、2×106和4×106個細胞每隻動物；靜脈採血，採集的血液室溫放置2小時，然後2000～6000r/min，離心5min，分離血清，4℃冷藏保存。
5.根據權利要求1所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條，其特徵在於，所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條硝酸纖維膜檢測層上的二抗質控線包被有羊抗雞IgG；赤潮異灣藻半定量檢測試紙條玻璃纖維膜抗體標記層上載有膠體金標記的雞抗赤潮異灣藻抗體。
6.根據權利要求1所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條，其特徵在於，所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條硝酸纖維膜檢測層上的二抗質控線包被有羊抗鼠IgG；赤潮異灣藻半定量檢測試紙條玻璃纖維膜抗體標記層上載有膠體金標記的鼠抗赤潮異灣藻抗體。
7.根據權利要求1所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條，其特徵在於，所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條的檢測範圍是藻細胞濃度檢出下限為106個/m3，在藻細胞濃度106-1010個/m3的範圍內提供三級區分的半定量檢測結果1010個/m3、108個/m3、106個/m3；檢測時間少於30分鐘。
8.一種赤潮異灣藻半定量檢測試紙條的使用方法，其特徵在於，所述赤潮異灣藻半定量檢測試紙條的使用方法是將被檢測樣品溶液過濾，濾膜對摺放入5ml離心管中，加3mlPBS將濾膜完全浸泡，超聲波破碎5分鐘，去所得溶液1ml，剩餘2ml溶液加入到2ml的離心管中，將赤潮異灣藻半定量檢測試紙條玻璃纖維膜樣品層插入離心管中，15～30分鐘後可觀察結果。
全文摘要
本發明描述了一種基於膠體金免疫層析分析技術(gold immuno chromato graphy assay，GICA)的半定量檢測赤潮異灣藻試紙條。包括塑料載體板、硝酸纖維素膜和玻璃纖維素膜。檢測試紙條硝酸纖維層、玻璃纖維層分別用膠固定在塑料載體板上；檢測試紙條硝酸纖維膜上設有赤潮異灣藻抗原分級標記線、質控線；吸水玻璃纖維素膜層置於硝酸纖維膜檢測層右端上方；該載體中部設有硝酸纖維膜檢測層，在該檢測層與加樣端吸水層交界處，設有載有膠體金標記的兔抗赤潮異灣藻抗體的玻璃纖維素膜抗體標記層。本發明為常規環境監測、漁業養殖水體檢測、以及赤潮生效過程監測的現場實驗，提供快速簡便的對赤潮多發藻進行半定量的檢測方法。
文檔編號G01N33/557GK1786714SQ20051010949
公開日2006年6月14日 申請日期2005年10月24日 優先權日2005年10月24日
發明者米鐵柱, 甄毓, 亓海剛, 孫靜, 何閃英, 趙麗媛, 於志剛 申請人:中國海洋大學