Irf7基因在動脈粥樣硬化中的功能及其抑制劑的應用的製作方法

2023-10-07 06:16:14 4

Irf7基因在動脈粥樣硬化中的功能及其抑制劑的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種IRF7基因在動脈粥樣硬化中的功能及其抑制劑的應用，屬於基因的功能與應用領域。本發明以ApoE-/-小鼠和IRF7-/-ApoE-/-小鼠為實驗對象，通過高脂誘導的動脈粥樣硬化模型，進行了AS模型小鼠斑塊面積測定和內含物分析，結果表明與ApoE-/-小鼠對比，IRF7-/-ApoE-/-小鼠的主動脈斑塊面積顯著減少。這提示一種IRF7基因在動脈粥樣硬化疾病中的功能，主要體現在其具有促使主動脈斑塊形成的作用，特別是IRF7基因能夠惡化動脈粥樣硬化。針對IRF7的上述功能，IRF7可作為藥物靶標篩選治療動脈粥樣硬化疾病的藥物；IRF7的抑制劑可用於製備治療動脈粥樣硬化疾病的藥物。
【專利說明】IRF7基因在動脈粥樣硬化中的功能及其抑制劑的應用
[0001]【技術領域】
[0002]本發明屬於基因的功能與應用領域,特別涉及一種IRF7(interferon regulatoryfactor 7)基因在動脈粥樣硬化中的功能及其抑制劑的應用。
【背景技術】
[0003]心腦血管疾病在許多發達國家中是主要致死性病因，在我國的發病率和致死率也逐年升高。心腦血管疾病的基礎是動脈粥樣硬化(Atheosclersisis, AS),動脈粥樣硬化可使動脈管壁增厚、變硬、管腔狹窄，導致很多心腦血管事件發生。而動脈粥樣硬化不穩定斑塊的破裂、血小板的聚集及血栓形成造成的冠狀動脈急性狹窄和閉塞是導致急性冠狀動脈症候群(acute coronary syndrome, ACS)的重要原因。
[0004]動脈粥樣硬化是多種遺傳基因、危險因素及免疫機制共同參與的一種慢性炎症性疾病，局部和全身的炎症免疫反應在動脈粥樣硬化發生發展過程中起著重要作用，固有免疫和適應性免疫共同參與調節動脈粥樣硬化病變，病理上表現為大、中動脈多處斑塊形成，好發於血液分流、動脈彎曲及動脈分支等區域，其病變特徵是血中脂質在動脈內膜沉積，弓丨起內膜灶性纖維性增厚，病灶深部為由壞死組織和細胞外脂質池形成的粥樣物質。動脈粥樣硬化斑塊中存在著多種免疫細胞，其中以巨噬細胞和T細胞最為常見，此外還有少量的樹突狀細胞(Dentritic cell,DC)、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK cell)和肥大細胞(mast cell)等,偶有B淋巴細胞。
[0005]動脈粥樣硬化最早期肉眼可見的損傷是脂質條紋，主要由攝取了大量膽固醇的巨噬細胞源性泡沫細胞構成 。血液循環中的單核細胞在動脈易損部位黏附到活性內皮細胞，啟動了脂質條紋的形成，黏附的單核細胞隨後受局部產生的化學趨附分子的吸引遷移到內膜下，並進一步分化為巨噬細胞。大量膽固醇脂在巨噬細胞內積聚，形成泡沫細胞，這是動脈粥樣硬化形成早期的特徵性病理生理過程。動脈粥樣硬化的發生是多因素共同作用的結果。目前已發現的動脈粥樣硬化危險性因素很多，但相關針對治療及控制效果均不理想，降脂和抗炎治療是目前最主要的治療措施。越來越多的證據顯示免疫反應參與動脈粥樣硬化發展的各個環節，因此探索調控免疫細胞功能的基因對控制動脈粥樣硬化具有重要意義。
[0006]幹擾素(interferon，IFN)是一類具有多種功能的細胞因子，具有廣譜抗病毒活性，是機體抵抗病毒感染的第一道防線；對癌細胞的免疫監控、抑制細胞增殖和免疫調控等方面也有著重要的作用。幹擾素調節因子最重要的功能是誘導IFN的產生、誘導機體抗病毒的作用，以及其在IFN信號途徑中的作用。IRF7是幹擾素調節因子(interferonregulatory factor, IRF)家族中的一個成員，有研究表明IRF7與腫瘤、肝炎、自身免疫性疾病等有著密切的關係。

【發明內容】

[0007]為解決現有技術的缺陷和不足，本發明的目的在於提供一種IRF7及其抑制劑在製備治療動脈粥樣硬化疾病的藥物中的應用。[0008]本發明的目的通過下述技術方案實現:
本發明以ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠與IRF7/ApoE雙基因敲除(IRF7+APOE+)小鼠為實驗對象，通過高脂飲食誘導獲得動脈粥樣硬化小鼠模型(AS)模型，進行了 AS模型小鼠斑塊面積測定和內含物分析，結果表明與ApoE+小鼠對比，IRF7+APOE+小鼠動脈粥樣硬化主動脈斑塊面積明顯低於同種飼料飼養的ApoE+小鼠。這提示IRF7基因敲除會抑制動脈粥樣硬化的發生，說明IRF7基因能夠惡化動脈粥樣硬化的發生，為研究防治動脈粥樣硬化的新靶點和新策略提供了理論依據和臨床基礎。
[0009]一種IRF7基因在動脈粥樣硬化中的功能，主要體現在IRF7基因具有惡化主動脈斑塊形成的作用，特別是IRF7具有惡化動脈粥樣硬化的作用。
[0010]針對IRF7的上述功能，提供IRF7作為藥物靶標在篩選抑制主動脈斑塊形成的藥物中的應用。
[0011]針對IRF7的上述功能，提供IRF7作為藥物靶標在篩選治療動脈粥樣硬化疾病的藥物中的應用。[0012]針對IRF7的上述功能，提供IRF7的抑制劑在製備抑制主動脈斑塊形成的藥物中的應用。
[0013]一種抑制主動脈斑塊形成的藥物，包含IRF7的抑制劑。
[0014]針對IRF7的上述功能，提供IRF7的抑制劑在製備治療動脈粥樣硬化疾病的藥物中的應用。
[0015]一種治療動脈粥樣硬化疾病的藥物，包含IRF7的抑制劑。
[0016]所述的IRF7的抑制劑優選為IRF7基因的siRNA、IRF7基因的RNA幹擾載體，IRF7的抗體及其他能夠抑制IRF7表達的抑制劑中的一種。
[0017]本發明的研究結果表明，IRF7+APOE+小鼠在高脂飲食誘導的動脈粥樣硬化中，與ApoE+小鼠相比，主動脈斑塊面積明顯減少而膠原含量增多，說明IRF7基因在動脈粥樣硬化疾病模型中有著重要的惡化作用。
[0018]本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果:
(I)本發明發現IRF7基因的新功能，即IRF7基因具有惡化動脈粥樣硬化疾病的作用。
[0019](2)基於IRF7在惡化動脈粥樣硬化疾病中的作用，其可為研製動脈粥樣硬化疾病的藥物提供靶標，IRF7的抑制劑可用於製備治療動脈粥樣硬化的藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是ApoE+和IRF7+APOE+小鼠體重變化結果圖(NS代表組間無差異)。
[0021]圖2是ApoE+和IRF7+APOE+小鼠的斑塊染色結果圖；A為小鼠主動脈樹油紅0染色圖及斑塊面積統計柱狀圖是ApoE+和IRF7+APOE+小鼠主動脈竇HE染色圖及斑塊面積統計柱狀圖。
[0022]圖3是ApoE+和IRF7+APOE+小鼠的斑塊內含物的分析結果圖；A是ApoE+和IRF7+APOE+小鼠的巨噬細胞標誌物(⑶68 )和平滑肌細胞標誌物(SMA)免疫螢光染色及結果統計柱狀圖(圖中m代表主動脈中膜，L代表主動脈管腔);B是ApoE+和IRF7+APOE+小鼠的天狼星紅染色及結果統計柱狀圖。【具體實施方式】
[0023]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0024]實驗用動物及飼養:
實驗動物種屬，性別，周齡及來源=ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠與IRF7/ApoE雙基因敲除(IRF7+APOE+)小鼠，雄性，8周齡，體重19-25g。ApoE基因敲除小鼠(ApoE+小鼠，C57BL/6J 背景，購自 Jackson Laboratory，貨號 002052)。IRF7+ApoE+小鼠由 IRF7 基因敲除小鼠(IRF7基因敲除小鼠，C57BL/6J背景，購自RIKEN BRC公司，BRC編號:RBRC01420)和ApoE基因敲除小鼠雜交得到。
[0025]實驗動物飼料配方:高脂飼料(HFD，購自北京華阜康生物科技有限公司，按AIN-76 A Western Diets配方，熱量百分比:蛋白質15.8%，脂肪40%，碳水化合物44.2%);低脂飼料(NC，購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12450B):熱量百分比:蛋白質20%，碳水化合物70%，脂肪10%。
[0026]動物飼養及環境條件:所有的實驗小鼠均飼養在武漢大學心血管病研究所SPF級動物房(許可證號=SYXK (鄂):2009-0053)。每12小時交替照明，溫度24±2°C，溼度40%-70%，小鼠自由飲水進食。
[0027]實施例1小鼠動脈粥樣硬化模型(AS)獲得
1.實驗動物分組:選用8周齡，體重19-25g，雄性，ApoE+小鼠和IRF7+APOE+小鼠，分別給予高脂飼料(Western Diets, HFD)和低脂飼料(Normal chow, NC)飼養,ApoE+ HFD組，ApoE+ NC 組，IRF7+APOE+ HFD 組，IRF7+APOE+ NC 組共 4 個組別。
[0028]2.動脈粥樣硬化模型通過高脂飼料誘導操作流程:
採用ApoE+小鼠和IRF7+APOE+小鼠，建立AS模型，進行表型相關分析，明確IRF7基因對動脈粥樣硬化發病發揮重要作用。小鼠從8周齡開始餵養飼料直至28周處死並收集樣本。
[0029]實施例2 AS模型小鼠斑塊面積測定 1.小鼠終末組織取材 小鼠餵養高脂飼料直至28周時，稱重，用3%戊巴比妥鈉，90mg/kg麻醉小鼠，用針頭固定於取材板，用紗布溼潤小鼠胸腹部皮膚，用眼科剪剪開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，把輸液器的針頭刺進左心室，用50mL注射器緩慢推注10-15mL PBS緩衝液，待右心耳流出液清亮，換上4%多聚甲醛繼續推注10-15mL。灌流結束後，清除胸腹腔臟器，僅保留心臟。將小鼠置於顯微鏡下，分離主動脈弓周圍筋膜、脂肪組織，剪下頭臂幹，放入裝有4%多聚甲醛的5mlEP管中，在升主動脈起始部剪下心臟，在胸主動脈中部剪斷，並在頸總和鎖骨下約3mm處剪斷，把主動脈弓放入上述EP管中。
[0030]2.主動脈樹斑塊面積測定
主動脈樹置於4%多聚甲醛中隔夜固定一純水漂洗30min — 60%異丙醇處理10 min —油紅0染液染色60 min — 60%異丙醇漂洗IminX 3次至背景乾淨一解剖鏡下去除殘餘外壁脂肪一將染色好的動脈平鋪於黑色解剖蠟板上，染色後用數位相機拍照，並使用IPP圖像分析軟體進行斑塊面積定量測定。(油紅0原液=0.5克油紅0+100毫升100%異丙醇，油紅0染液(工作液)=V (油紅0原液)/V (H2O) =3/2)主動脈樹斑塊面積(％)=斑塊總面積/主動脈樹總面積*100%。
[0031]3.病理組織處理
3.1石蠟標本
心臟標本在4%多聚甲醛中隔夜固定後拿出，將頭臂幹、主動脈弓用濾紙小心包好，以防從包埋框間隙中漏出。流水衝洗30min後放入脫水機，30%乙醇15min — 50%乙醇15min — 75% 乙醇 15min — 85% 乙醇 15min — 95% 乙醇 15min — 100% 乙醇 15min — 100%乙醇15min — 二甲苯15min — 二甲苯15min —石臘30min —石臘30min。頭臂幹及主動脈弓脫水完成後，從脫水機拿出。頭臂幹呈Y直立於石蠟中，主動脈弓平躺於石蠟中。
[0032]3.2主動脈組織切片
蠟塊固定於切片機頭上的夾座內，調整到稍離開切片能夠切到的位置上，蠟塊組織切面與切片刀口要垂直平行，調整切片厚度(5微米)。切下的片子，右手用彎鑷子輕輕鉗牢石蠟切片，左手用乾燥毛筆將切片從切片取下，放入盛溫水(約30°C )的玻璃皿內，將切片攤於溫水面上，光亮的切面向下，待切片在恆溫水內充分攤開展平後(大約不超過10秒鐘)，將載玻片垂直插入水中輕靠切片，並用鑷子將切片一邊撥於玻片上，並調整好切片的位置，隨即將玻片直立提起。用鉛筆在玻片一端的磨砂玻璃上寫上標本編號。將切片晾乾過夜。
[0033]4.主動脈竇斑塊面積測定
蘇木素伊紅染色染色):石蠟白片65°C烘烤30分鐘一二甲苯5分鐘X3次一100%乙醇I分鐘一95%乙醇I分鐘一70%乙醇I分鐘一純水漂洗(以玻片上不掛有水珠為標準)—甩盡載玻片上的水分，蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021)浸染5分鐘一自來水漂洗(去除玻片上蘇木素的浮色)一1%鹽酸乙醇1-3秒一自來水漂洗(去除玻片上鹽酸乙醇)一Scott液(碳酸氫鈉0.35g，硫酸鎂2g，蒸餾水100ml)l分鐘一自來水浸洗(去除玻片上的Scott液)—甩盡在玻片上的水分，伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024)染色10秒鐘一純水漂洗(去除玻片上伊紅的浮色)一70%乙醇一下一95%乙醇一下一100%乙醇30秒，3次一二甲苯2分鐘，3次一趁二甲苯未乾時封片(每拿出一張封一張，以切片無氣泡為原則)一顯微鏡拍照。直接用IPP圖像分析軟體圈主動脈竇斑塊面積(mm2)。
[0034]為了觀察IRF7是否對ApoE+小鼠的基礎體重產生影響，我們測了各組小鼠的體重。圖1結果顯示，HFD組ApoE+小鼠的體重要明顯高於其NC組，而無論NC組還是HFD組，組內的ApoE+小鼠與IRF7+APOE+小鼠體重均無明顯差異，表明IRF7基因未影響ApoE+小鼠的體重變化。
[0035]通過主動脈樹油紅0染色可大體評估動脈粥樣硬化斑塊形成的多少、分布情況及斑塊面積大小。圖2A是小鼠AS模型後油紅0染色結果圖，頭皮幹和主動脈根部是動脈粥樣硬化斑塊最明顯的部位。圖2B是小鼠AS模型後HE染色結果圖，結果表明，與ApoE+小鼠相比，IRF7+APOE+小鼠主動脈樹內斑塊面積明顯減少，IRF7+APOE+小鼠主動脈竇斑塊面積明顯減少，表明IRF7基因的缺失可顯著降低動脈粥樣硬化斑塊的大小。
[0036]實施例3 AS模型小鼠斑塊內含物的分析
1.巨噬細胞及 平滑肌細胞表達測定
免疫螢光染色檢測巨噬細胞(⑶68)、平滑肌肌動蛋白(Smooth Muscle Actin, SMA)的表達。所需一抗信息:CD68 (MCA1957; 1:100; rat; AbD Serotec), SMA (ab5694;1:100; rabbit; Abeam);所需二抗信息:Alexa Flour? 568 goat ant1-rat IgG (Al 1077;Invitrogen, Carlsbad, CA), Alexa Fluor 488-conjugated goat ant1-rabbit IgG(Al1008; Invitrogen, Carlsbad, CA)。
[0037]主要步驟為:
I)烤片:將石蠟切片置於烤箱中30min以上。
[0038]2)脫蠟:二甲苯 5minX3 次。
[0039]3)水合:100% 乙醇 5minX2 次；95% 乙醇 5min ；70% 乙醇 5min ;ddH20浸洗 5minX2次。
[0040]4)檸檬酸鹽組織抗原修復(高壓修復):取一定量的pH6.0檸檬酸鹽抗原修復工作液於修復盒中，修復工作液的量必須能足夠浸沒整張切片，將修復盒放入已加入適量自來水的高壓鍋中，大火加熱至沸騰，將脫蠟水合後的組織切片置於耐高溫染色架上，再將染色架緩慢放入修復盒中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續加熱至噴氣，開始計時5min後，壓力鍋斷開電源，去閥開蓋，取出修復盒；室溫放置20min自然冷卻後取出切片。
[0041]5) ddH20 漂洗 5minX2 次，PBS 漂洗 5minX2 次。
[0042]6)組化筆劃圈，滴加10%羊血清(GTX27481，GeneTex)封閉，於溼盒中37°C封閉60mino
[0043]7)棄封閉液,滴 加適當比例稀釋的一抗，4°C孵育過夜,37°C復溫30min,棄去一抗，PBS 洗 IOminX 3 次。
[0044]8)滴加二抗，於溼盒中37°C孵育60min，棄去二抗，PBS浸洗5minX3次。
[0045]9) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (S36939, Invitrogen)封片。
[0046]10)螢光鏡下觀察，拍照。若需保存，於暗溼盒中4°C保存。
[0047]螢光統計方法:SMA (%)=斑塊內SMA陽性吸光度值/斑塊總面積*100% KD68 (%)=斑塊內CD68陽性吸光度值/斑塊總面積*100%。
[0048]2.天狼星紅(PSR)染色
主要步驟為:55 0C烘烤30min — 二甲苯2min，3次一100%酒精Imin — 95%酒精Imin — 70%酒精Imin —流水衝洗IOmin —雙蒸水Imin —質量分數0.2%磷鑰酸2min — 0.1%天狼猩紅苦味酸溶液滴於組織上,溼盒中染色90min —去除殘液一0.01N鹽酸4s — 70%酒精I次一90%酒精I次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未乾立即蓋玻片封片,顯微鏡拍照。
[0049]統計方法:膠原(％)=斑塊內膠原陽性總面積/斑塊總面積*100%。
[0050]平滑肌細胞可分泌多種細胞基質，是動脈粥樣硬化斑塊內分泌膠原的細胞源，主要作用是修復被破壞的細胞基質成分從而起到保護作用；巨噬細胞是斑塊內最重要的細胞成分，它主要有血液循環單核細胞進入內皮下後分化而來，單核/巨噬細胞可分泌多種粘附、趨化因子如細胞黏附分子(ICAM-1)、單核細胞趨化和激活因子(MCP-1)等，增進斑塊內細胞的進入，此外巨噬細胞還可分泌多種基質金屬蛋白酶(MMPs)，降低斑塊內膠原面積，從而破壞斑塊的穩定性；膠原成分是斑塊內最重要的細胞外基質，也是纖維帽的主要成分，具有抗血流衝擊防止斑塊破裂的作用，也是維護斑塊穩定性的重要評估指標。
[0051]圖3是ApoE+和IRF7+APOE+小鼠的斑塊內含物的分析結果圖。為檢測斑塊內巨噬細胞和平滑肌細胞的表達情況，我們將主動脈竇切片分別進行CD68 (巨噬細胞標誌)和SMA (平滑肌細胞標誌)等免疫螢光染色分析巨噬細胞與平滑肌細胞成分。免疫螢光發觀察SMA、CD68在ApoE+小鼠和IRF7+ApoE+小鼠斑塊內均有表達，SMA在IRF7+ApoE+小鼠斑塊內表達量明顯高於ApoE+小鼠<D68在IRF7+AP0E+小鼠斑塊內表達量則顯著低於ApoE+小鼠(A) ；PSR染色結果表明高脂飲食後的模型，IRF7+AP0E+組小鼠的膠原比例明顯高於ApoE+小鼠，說明IRF7+AP0E+組小鼠的斑塊更穩定(B)。結果表明IRF7基因敲除在AS模型中可降低斑塊內面積，保護斑塊的穩定性。
[0052]上述實施例結果顯示，ApoE+小鼠及IRF7+AP0E+小鼠在高脂飲食的誘導下發生動脈粥樣硬化。IRF7/ApoE雙基因敲除後，小鼠主動脈斑塊面積較ApoE+小顯著減少。這些結果提示，IRF7基因可促進主動脈斑塊的形成和動脈粥樣硬化的發生發展。本發明證明了IRF7基因在動脈粥樣硬化模型中有著重要的惡化作用，其可作為藥物靶標篩選治療動脈粥樣硬化疾病的藥物。
[0053]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換 方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.1RF7作為藥物靶標在篩選抑制主動脈斑塊形成的藥物中的應用。
2.1RF7作為藥物靶標在篩選治療動脈粥樣硬化疾病的藥物中的應用。
3.1RF7的抑制劑在製備抑制主動脈斑塊形成的藥物中的應用。
4.一種抑制主動脈斑塊形成的藥物，其特徵在於:包含IRF7的抑制劑。
5.1RF7的抑制劑在製備治療動脈粥樣硬化疾病的藥物中的應用。
6.一種治療動脈粥樣硬化疾病的藥物，其特徵在於:包含IRF7的抑制劑。
7.根據權利要求3或5所述的應用或權利要求4和6所述 的藥物，其特徵在於所述的IRF7的抑制劑為IRF7基因的siRNA、IRF7基因的RNA幹擾載體或IRF7的抗體中的一種。
【文檔編號】A61P9/10GK103784975SQ201410031612
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月23日 優先權日:2014年1月23日
【發明者】李紅良, 王丕曉, 向梅, 鄧克窮, 胡俊飛, 黃玲 申請人:武漢大學