膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法與流程

2023-10-06 19:59:29

本發明涉及植物組織培養技術領域。更具體地說，本發明涉及一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法。

背景技術：

衛矛科植物膝柄木是一種極度瀕危的熱帶樹種，我國僅廣西海岸邊有分布，天然種群數量不到10株，被列入1992年第一批《國家珍貴樹種名錄》中。野生膝柄木生樹高可達十多米，一年生苗高可達1米，適宜在海邊鹽漬環境中生長，是我國華南熱帶海岸有發展利用前景的鄉土綠化樹種。由於膝柄木種群數量小，種子產量低，因此獲得種子繁殖的實生苗很少，開展無性繁殖是搶救性保護這一種群的有效途徑。

無性繁殖包括扦插、嫁接和組織培養，我們對膝柄木開展了2年多年的扦插育苗試驗，使用了多種生根劑和大量枝條，最好結果生根率還不到10％，因此採用扦插繁殖對膝柄木而言難度相當大。對膝柄木的組培培養也實施3年多時間，利用莖段、葉片、花粉、種子等不同的外植體做了試驗，並且在誘導胚乳愈傷組培方面取得了突破，這對膝柄木的組培快繁有極大的推動作用。

技術實現要素：

本發明的一個目的是解決至少上述問題，並提供至少後面將說明的優點。

本發明還有一個目的是提供一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，解決瀕危植物膝柄木保護與人工繁殖的技術突破。

為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：

步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；

步驟二、配製初始培養基，在MS培養基中加入0.3-1mg/L的萘乙酸和0.1-0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤，並調節pH至5.8-6.0，並滅菌；

步驟三、將膝柄木胚乳接種於初始培養基中，在黑暗環境中培養6-8天，之後培養6-8天，每天用光照強度為1500～2000LX燈光照射9-12h，培養溫度控制在25℃，得到初愈傷組織；

步驟四、配製繼代培養基，在MS培養基中加入0.08-0.4mg/L的萘乙酸和0.08-0.4mg/L的6-苄氨基嘌呤，並滅菌；

步驟五、將所述初愈傷組織接種於繼代培養基中培養10-15天，每天用光照強度為1500～2000LX燈光照射9-12h，培養溫度控制在25℃，即誘導完成。

優選的是，所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將膝柄木種子去除表面泥土和汙物後，用質量濃度為1％-5％的洗衣粉浸泡10-30min，自來水清洗後剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數為60-80％酒精浸泡20-40s，無菌水衝洗1-3次，再用0.1％氯化汞處理7-10min，無菌水衝洗5-6次即得。

優選的是，初始培養基和繼代培養基均採用120-130℃高壓滅菌12-20min。

優選的是，初始培養基和繼代培養基均加入有瓊脂粉2-6g/L，以及蔗糖；其中初始培養基和繼代培養基中加入蔗糖的量均佔所加入MS培養基質量分數的1-6％。

優選的是，選擇每年3月中旬採收的膝柄木種子來獲取膝柄木胚乳。

優選的是，所述胚乳在用無菌水衝洗5-6次後接著浸泡於經過滅菌的質量分數為2％的牛奶樹汁液中15-20min。

優選的是，初愈傷組織在接種於繼代培養基前，在經過滅菌的第一浸液中浸泡了3-5小時，並期間向第一浸液中持續通入氧氣，所述第一浸液包括2-2.3mol/L的植物鹽、0.8-0.9mol/L的維生素C磷酸酯鎂和0.6-0.7mol/L鉬酸銨、1-1.2mol/L的花青素、2..6×10-4-2.9×10-4mol/L的CrCl3、1.4×10-3-1.7×10-3mol/L的生化黃腐酸鉀，溶劑為水。

本發明至少包括以下有益效果：

1)將胚乳利用牛奶樹汁液浸泡後，有利於活化修復胚乳表面的細胞，再接種於培養基中培育得到的愈傷組織更加鬆散更容易分離，使愈傷組織內部細胞吸收營養物質更加充分均勻，得到的愈傷組織性狀更加均一，鬆散的膝柄木愈傷組織相較於緊密的膝柄木愈傷組織，其活性細胞更豐富，老化的細胞較少，並不像緊密的膝柄木愈傷組織只有外部的細胞可進行誘變再生，從而提高了誘變效率。

2)採用本發明的繼代培養基和光照強度與光照時間的控制，大大縮短了繼代培養的次數，在初始培養完成後僅需更換一次繼代培養基，之後無需再更換培養基，繼代培養10-15天即可得到胚性愈傷組織；相較於傳統的組培需要繼代3-6次，大大簡化了工序。

3)由於膝柄木一種極度瀕危的熱帶樹種，天然種群數量不到10株，其每年2月-4月生長種子，由於2月的種子中的胚乳呈液體狀，還沒生長成熟，不適合用於進行組培，而4月份時膝柄木種子已完全成熟，導致胚乳進行組培誘導率低，當選取3月中旬膝柄木種子進行組培時(此時膝柄木果皮稍呈黃色，包裹1粒褐色種子，在果皮與種子之間有黃偏紅的肉質假種皮)，其誘導率幾乎可以達到100％，大大提高了誘導率。

4)初愈傷組織在第一浸液中浸泡後通過繼代培育形成的愈傷組織呈現多數胚狀體結構，有利於誘導分化形成幼苗，實現膝柄木的人工搶救繁殖。

本發明的其它優點、目標和特徵將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。

需要說明的是，下述實施方案中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。

實施例1

一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：

步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將3月11號和12號採集的膝柄木種子去除表面泥土和汙物後，用質量濃度為2％的洗衣粉浸泡20min，自來水清洗後剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數為70％酒精浸泡30s，無菌水衝洗1次，再用0.1％氯化汞處理8min，無菌水衝洗5次即得。

步驟二、配製初始培養基，在MS培養基中加入0.5mg/L的萘乙酸、0.3mg/L的6-苄氨基嘌呤、瓊脂粉4g/L，蔗糖佔所加入MS培養基質量分數的4％，並調節pH至5.9，並滅菌，採用121℃高壓滅菌15min。

步驟三、將膝柄木胚乳接種於初始培養基中，在黑暗環境中培養7天，之後培養7天，每天用光照強度為1800LX燈光照射10h，培養溫度控制在25℃，得到初愈傷組織。

步驟四、配製繼代培養基，在MS培養基中加入0.2mg/L的萘乙酸和0.2mg/L的6-苄氨基嘌呤、瓊脂粉4g/L、蔗糖佔所加入MS培養基質量分數的4％，並滅菌，採用121℃高壓滅菌15min。

步驟五、將所述初愈傷組織接種於繼代培養基中培養15天，每天用光照強度為1600LX燈光照射11h，培養溫度控制在25℃，即誘導完成。

在實施例1中選取3月11號和12號採集的膝柄木種子共90粒，分為三組，每組30瓶進行誘導培養，誘導率為88/90＝97.8％。

實施例2

一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：

步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將3月14號採集的膝柄木種子去除表面泥土和汙物後，用質量濃度為1％的洗衣粉浸泡10min，自來水清洗後剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數為60％酒精浸泡20s，無菌水衝洗1次，再用0.1％氯化汞處理7min，無菌水衝洗5次即得。

步驟二、配製初始培養基，在MS培養基中加入0.3mg/L的萘乙酸、0.1mg/L的6-苄氨基嘌呤、瓊脂粉2g/L，蔗糖佔所加入MS培養基質量分數的1％，並調節pH至5.8，並滅菌，採用120℃高壓滅菌12min。

步驟三、將膝柄木胚乳接種於初始培養基中，在黑暗環境中培養6天，之後培養8天，每天用光照強度為1500LX燈光照射9h，培養溫度控制在25℃，得到初愈傷組織。

步驟四、配製繼代培養基，在MS培養基中加入0.08mg/L的萘乙酸和0.08mg/L的6-苄氨基嘌呤、瓊脂粉2g/L、蔗糖佔所加入MS培養基質量分數的1％，並滅菌，採用120℃高壓滅菌12min。

步驟五、將所述初愈傷組織接種於繼代培養基中培養10天，每天用光照強度為2000LX燈光照射9h，培養溫度控制在25℃，即誘導完成。

在實施例2中選取3月14號採集的膝柄木種子共90粒，分為三組，每組30瓶進行誘導培養，誘導率為87/90＝96.7％。

實施例3

一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：

步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將3月15號採集的膝柄木種子去除表面泥土和汙物後，用質量濃度為5％的洗衣粉浸泡30min，自來水清洗後剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數為80％酒精浸泡40s，無菌水衝洗3次，再用0.1％氯化汞處理10min，無菌水衝洗6次即得。

步驟二、配製初始培養基，在MS培養基中加入1mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤、瓊脂粉6g/L，蔗糖佔所加入MS培養基質量分數的6％，並調節pH至6.0，並滅菌，採用130℃高壓滅菌20min。

步驟三、將膝柄木胚乳接種於初始培養基中，在黑暗環境中培養8天，之後培養6天，每天用光照強度為1500LX燈光照射12h，培養溫度控制在25℃，得到初愈傷組織。

步驟四、配製繼代培養基，在MS培養基中加入0.4mg/L的萘乙酸和0.4mg/L的6-苄氨基嘌呤、瓊脂粉6g/L、蔗糖佔所加入MS培養基質量分數的6％，並滅菌，採用130℃高壓滅菌20min。

步驟五、將所述初愈傷組織接種於繼代培養基中培養15天，每天用光照強度為2000LX燈光照射12h，培養溫度控制在25℃，即誘導完成。

在實施例3中選取3月15號採集的膝柄木種子共90粒，分為三組，每組30瓶進行誘導培養，誘導率為88/90＝97.8％。

實施例4

一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：

步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將3月13號採集的膝柄木種子去除表面泥土和汙物後，用質量濃度為2％的洗衣粉浸泡12min，自來水清洗後剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數為65％酒精浸泡22s，無菌水衝洗2次，再用0.1％氯化汞處理8min，無菌水衝洗6次，接著浸泡於經過滅菌的質量分數為2％的牛奶樹汁液中15min。。

步驟二、配製初始培養基，在MS培養基中加入0.7mg/L的萘乙酸、0.2mg/L的6-苄氨基嘌呤、瓊脂粉3g/L，蔗糖佔所加入MS培養基質量分數的4％，並調節pH至5.8，並滅菌，採用128℃高壓滅菌14min。

步驟三、將膝柄木胚乳接種於初始培養基中，在黑暗環境中培養7天，之後培養7天，每天用光照強度為1600LX燈光照射10h，培養溫度控制在25℃，得到初愈傷組織。

步驟四、初愈傷組織在經過滅菌的第一浸液中浸泡了4小時，並期間向第一浸液中持續通入氧氣，所述第一浸液包括2mol/L的植物鹽、0.8mol/L的維生素C磷酸酯鎂、0.6mol/L鉬酸銨、1mol/L的花青素、2..6×10-4mol/L的CrCl3、1.4×10-3mol/L的生化黃腐酸鉀，溶劑為水。

步驟五、配製繼代培養基，在MS培養基中加入0.08mg/L的萘乙酸和0.08mg/L的6-苄氨基嘌呤、瓊脂粉2g/L、蔗糖佔所加入MS培養基質量分數的5％，並滅菌，採用128℃高壓滅菌19min。

步驟六、將在經過滅菌的第一浸液中浸泡了的初愈傷組織接種於繼代培養基中培養11天，每天用光照強度為1700LX燈光照射11h，培養溫度控制在25℃，即誘導完成。

在實施例4中選取3月13號採集的膝柄木種子共90粒，分為三組，每組30瓶進行誘導培養，誘導率為89/90＝98.9％。

實施例5

一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：

步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將3月14號採集的膝柄木種子去除表面泥土和汙物後，用質量濃度為5％的洗衣粉浸泡30min，自來水清洗後剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數為80％酒精浸泡40s，無菌水衝洗3次，再用0.1％氯化汞處理10min，無菌水衝洗6次，接著浸泡於經過滅菌的質量分數為2％的牛奶樹汁液中20min。

步驟二、配製初始培養基，在MS培養基中加入1mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤、瓊脂粉6g/L，蔗糖佔所加入MS培養基質量分數的6％，並調節pH至6.0，並滅菌，採用130℃高壓滅菌20min。

步驟三、將膝柄木胚乳接種於初始培養基中，在黑暗環境中培養6天，之後培養7天，每天用光照強度為1500LX燈光照射10h，培養溫度控制在25℃，得到初愈傷組織。

步驟四、初愈傷組織在經過滅菌的第一浸液中浸泡了4小時，並期間向第一浸液中持續通入氧氣，所述第一浸液包括2.3mol/L的植物鹽、0.9mol/L的維生素C磷酸酯鎂、0.7mol/L鉬酸銨、1.2mol/L的花青素、2.9×10-4mol/L的CrCl3、1.7×10-3mol/L的生化黃腐酸鉀，溶劑為水。

步驟五、配製繼代培養基，在MS培養基中加入0.4mg/L的萘乙酸和0.4mg/L的6-苄氨基嘌呤、瓊脂粉6g/L、蔗糖佔所加入MS培養基質量分數的6％，並滅菌，採用130℃高壓滅菌20min。

步驟六、將在經過滅菌的第一浸液中浸泡了的初愈傷組織接種於繼代培養基中培養10-15天，每天用光照強度為2000LX燈光照射12h，培養溫度控制在25℃，即誘導完成。

在實施例5中選取3月14號採集的膝柄木種子共90粒，分為三組，每組30瓶進行誘導培養，誘導率為90/90＝100％。

對照例1

一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：

步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將4月10號採集的膝柄木種子去除表面泥土和汙物後，用質量濃度為2％的洗衣粉浸泡20min，自來水清洗後剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數為70％酒精浸泡30s，無菌水衝洗1次，再用0.1％氯化汞處理8min，無菌水衝洗5次即得。

步驟二、配製初始培養基，在MS培養基中加入0.2mg/L的萘乙酸、0.7mg/L的6-苄氨基嘌呤、瓊脂粉4g/L，蔗糖佔所加入MS培養基質量分數的4％，並調節pH至5.9，並滅菌，採用121℃高壓滅菌15min。

步驟三、將膝柄木胚乳接種於初始培養基中，在黑暗環境中培養7天，之後培養7天，每天用光照強度為1000LX燈光照射6h，培養溫度控制在25℃，得到初愈傷組織。

步驟四、配製繼代培養基，在MS培養基中加入0.01mg/L的萘乙酸和0.01mg/L的6-苄氨基嘌呤、瓊脂粉4g/L、蔗糖佔所加入MS培養基質量分數的4％，並滅菌，採用121℃高壓滅菌15min。

步驟五、將所述初愈傷組織接種於繼代培養基中培養15天，每天用光照強度為1000LX燈光照射6h，培養溫度控制在25℃，即誘導完成。

在對照組1中選取4月10號採集的膝柄木種子共90粒，分為三組，每組30瓶進行誘導培養，誘導率為27/90＝30％。

對照例2

一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：

步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將4月3號採集的膝柄木種子去除表面泥土和汙物後，用質量濃度為2％的洗衣粉浸泡20min，自來水清洗後剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數為70％酒精浸泡30s，無菌水衝洗1次，再用0.1％氯化汞處理8min，無菌水衝洗5次即得。

步驟二、配製初始培養基，在MS培養基中加入1.5mg/L的萘乙酸、1mg/L的6-苄氨基嘌呤、瓊脂粉4g/L，蔗糖佔所加入MS培養基質量分數的4％，並調節pH至5.9，並滅菌，採用121℃高壓滅菌15min。

步驟三、將膝柄木胚乳接種於初始培養基中，在黑暗環境中培養7天，之後培養7天，每天用光照強度為2800LX燈光照射18h，培養溫度控制在25℃，得到初愈傷組織。

步驟四、配製繼代培養基，在MS培養基中加入0.8mg/L的萘乙酸和0.8mg/L的6-苄氨基嘌呤、瓊脂粉4g/L、蔗糖佔所加入MS培養基質量分數的4％，並滅菌，採用121℃高壓滅菌15min。

步驟五、將所述初愈傷組織接種於繼代培養基中培養15天，每天用光照強度為2800LX燈光照射18h，培養溫度控制在25℃，即誘導完成。

在對照組2中選取4月3號採集的膝柄木種子共90粒，分為三組，每組30瓶進行誘導培養，誘導率為34/90＝37.8％。

儘管本發明的實施方案已公開如上，但其並不僅僅限於說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用於各種適合本發明的領域，對於熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同範圍所限定的一般概念下，本發明並不限於特定的細節和這裡示出與描述的實施例。