一種高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基的製作方法

2023-10-06 19:57:29 2

本發明屬於植物組織培養領域，具體涉及一種高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基。
背景技術：
：梅花，是中國的傳統名花，在我國有7000年以上的應用史和3000年以上的栽培史，品種繁多，在引種栽培過程中，培育出了眾多優良的園藝新品種，極大地豐富了我國的園林景觀。梅花從受粉到果實成熟僅要兩三個月左右的時間，果實發育時間短，其果實達到成熟時，胚尚未成熟。種子經過砂藏處理，在正常條件下播種萌發率也很低。愈傷組織培養不僅是一種植物快繁的新手段，同時也是植物改良，種質保存和有用化合物生產的理想途徑，梅花為木本植物，其愈傷組織的誘導比較困難，組織培養過程中常出現褐變、菌絲感染及誘導時間長等的問題。公開號為CN102550404A、申請號為201110422216.3的中國專利提供了一種梅花葉片愈傷組織高效誘導方法，該發明中詳細介紹了梅花葉片愈傷組織的誘導培養基成分及誘導培養過程，但外植體培養過程往往會出現褐變、菌絲感染等的問題，從而影響愈傷組織的質量及誘導率，該發明出沒有提供詳細的解決方法。技術實現要素：本發明的發明目的是，針對現有技術中沒有提供詳細方法以解決外植體培養過程出現褐變、菌絲感染等的問題，提供一種能解決褐變及菌絲感染等問題，從而提高梅花葉片愈傷組織的質量及誘導率的方法。為達到上述目的，本發明所採用的技術方案是：一種高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基，按重量份比，包括以下物質：MS培養基90-120份、母液I18-28份和純淨水15-25份；所述母液I溶液包括以下質量-體積濃度的物質：亞硫酸鉀1-5mg/L、氟苯丙氨酸1-5mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷2-6mg/L、4-碘苯氧乙酸3-7mg/L和噻菌銅2-6mg/L。在本發明中，進一步的說明，按重量份比，包括以下物質：MS培養基100-110份、母液I20-26份和純淨水17-23份；所述母液I溶液包括以下質量-體積濃度的物質：亞硫酸鉀2-4mg/L、氟苯丙氨酸2-4mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷3-5mg/L、4-碘苯氧乙酸4-6mg/L和噻菌銅3-5mg/L。在本發明中，進一步的說明，按重量份比，包括以下物質：MS培養基105份、母液I24份和純淨水19份；所述母液I溶液包括以下質量-體積濃度的物質：亞硫酸鉀3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷3mg/L、4-碘苯氧乙酸5mg/L和噻菌銅4mg/L。在本發明中，進一步的說明，所述母液I的配製方法如下：先按重量份比稱取稱取亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅；接著，將亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅分別加入部分純淨水中，充分攪拌至上述物質充分溶解，然後放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。在本發明中，進一步的說明，所述的高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基的製備方法，包括以下步驟：(1)按重量份比，稱取MS培養基和純淨水，先將純淨水加入鍋中，加熱使純淨水煮沸後停止加熱，接著將MS培養基加入純淨水中，使MS培養基溶解，並充分攪拌、混合均勻，此為體系1；(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調節體系2的pH值，此為體系3；(3)取體系3，用高壓蒸汽滅菌18-28min，然後取出，靜置冷卻凝固後即得培養基。在本發明中，進一步的發明，所述調節體系2的pH值為5.4-6.4之間。在本發明中，進一步的說明，所述高壓蒸汽滅菌，滅菌壓力為170-190KPa。本發明與現有技術相比較具有的有益效果：本發明具有促使梅花愈傷組織快速形成，有減少褐變產生及菌絲感染的問題，從而提高梅花葉片愈傷組織的質量及誘導率，研究發現，經使用本發明的培養基進行誘導梅花葉片愈傷組織，誘導時間縮短至6天，誘導率高達98.5％,褐變率僅為1.2％，愈傷組織緊密，顏色淺綠而透明，呈現出很好的狀態。1.在誘導形成愈傷組織的過程中往往會出現褐變現象，褐變的產生會對許多酶有抑制作用，從而影響培養材料的生長與分化，嚴重時甚至導致死亡，組織在培養過程中，引起褐變的酶主要有有多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶，通過抑制酶的活性減少酶促褐變途徑，減少褐變的產生，亞硫酸鉀和氟苯丙氨酸的復配添加可通過分別抑制多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性，可大大減少組培過程中出現的褐變現象，提高愈傷組織的質量，甲硫基異戊烯基腺苷有細胞分裂素的生理功能，可有效促進細胞分裂和擴大作用，並調控其分化，4-碘苯氧乙酸與甲硫基異戊烯基腺苷混合使用可快速高效誘導愈傷組織的形成及分化；而噻菌銅有效解決了菌絲感染導致外植體愈傷組織誘導不成功的問題。2.MS培養基提供了外植體在誘導愈傷組織的過程中維持生長所需基本的生長因子，而母液I的添加對愈傷組織的形成有高效促進作用和提高愈傷組織的作用。具體實施方式本發明提供了一種高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基，為使本發明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。實施例1本發明提供的高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基及其配製方法如下：一種高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基，按重量份比，包括以下物質：MS培養基90份、母液I18份和純淨水15份；所述母液I溶液包括以下質量-體積濃度的物質：亞硫酸鉀1mg/L、氟苯丙氨酸1mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷2mg/L、4-碘苯氧乙酸3mg/L和噻菌銅2mg/L。母液I的配製方法如下：1.稱取亞硫酸鉀1mg、氟苯丙氨酸1mg、甲硫基異戊烯基腺苷2mg、4-碘苯氧乙酸3mg和噻菌銅2mg；接著，將亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅分別加入純淨水中，充分攪拌使亞硫酸氫鈣、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環唑完全溶解，然後放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。培養基的配製方法如下：(1)按重量份比，稱取MS培養基和純淨水，先將純淨水加入鍋中，加熱使純淨水煮沸後停止加熱，接著將MS培養基加入純淨水中，使MS培養基溶解，並充分攪拌、混合均勻，此為體系1；(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調節體系2的pH值為5.4，此為體系3；(3)取體系3，將體系3以170KPa的滅菌壓力進行高壓蒸汽滅菌18min，然後取出，靜置冷卻凝固後即得培養基。實施例2本發明提供的高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基及其配製方法如下：一種高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基，其特徵在於，按重量份比，包括以下物質：MS培養基105份、母液I24份和純淨水19份；所述母液I溶液包括以下質量-體積濃度的物質：亞硫酸鉀3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷3mg/L、4-碘苯氧乙酸5mg/L和噻菌銅4mg/L。母液I的配製方法如下：2.稱取亞硫酸鉀3mg、氟苯丙氨酸3mg、甲硫基異戊烯基腺苷3mg、4-碘苯氧乙酸5mg和噻菌銅4mg；接著，將亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅分別加入純淨水中，充分攪拌使亞硫酸氫鈣、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環唑完全溶解，然後放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。培養基的配製方法如下：(1)按重量份比，稱取MS培養基和純淨水，先將純淨水加入鍋中，加熱使純淨水煮沸後停止加熱，接著將MS培養基加入純淨水中，使MS培養基溶解，並充分攪拌、混合均勻，此為體系1；(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調節體系2的pH值為5.9，此為體系3；(3)取體系3，將體系3以180KPa的滅菌壓力進行高壓蒸汽滅菌24min，然後取出，靜置冷卻凝固後即得培養基。實施例3本發明提供的高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基及其配製方法如下：一種高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基，按重量份比，包括以下物質：MS培養基120份、母液I28份和純淨水25份；所述母液I溶液包括以下質量-體積濃度的物質：亞硫酸鉀5mg/L、氟苯丙氨酸5mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷6mg/L、4-碘苯氧乙酸7mg/L和噻菌銅6mg/L。母液I的配製方法如下：3.稱取亞硫酸鉀5mg、氟苯丙氨酸5mg、甲硫基異戊烯基腺苷6mg、4-碘苯氧乙酸7mg和噻菌銅6mg；接著，將亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅分別加入純淨水中，充分攪拌使亞硫酸氫鈣、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環唑完全溶解，然後放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。培養基的配製方法如下：(1)按重量份比，稱取MS培養基和純淨水，先將純淨水加入鍋中，加熱使純淨水煮沸後停止加熱，接著將MS培養基加入純淨水中，使MS培養基溶解，並充分攪拌、混合均勻，此為體系1；(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調節體系2的pH值為6.4，此為體系3；(3)取體系3，將體系3以190KPa的滅菌壓力進行高壓蒸汽滅菌28min，然後取出，靜置冷卻凝固後即得培養基。實施例4本發明提供的高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基及其配製方法如下：一種高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基，按重量份比，包括以下物質：MS培養基100份、母液I20份和純淨水17份；所述母液I溶液包括以下質量-體積濃度的物質：亞硫酸鉀2mg/L、氟苯丙氨酸2mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷3mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L和噻菌銅3mg/L。母液I的配製方法如下：4.稱取亞硫酸鉀2mg、氟苯丙氨酸2mg、甲硫基異戊烯基腺苷3mg、4-碘苯氧乙酸4mg和噻菌銅3mg；接著，將亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅分別加入純淨水中，充分攪拌使亞硫酸氫鈣、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環唑完全溶解，然後放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。培養基的配製方法如下：(1)按重量份比，稱取MS培養基和純淨水，先將純淨水加入鍋中，加熱使純淨水煮沸後停止加熱，接著將MS培養基加入純淨水中，使MS培養基溶解，並充分攪拌、混合均勻，此為體系1；(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調節體系2的pH值為5.6，此為體系3；(3)取體系3，將體系3以175KPa的滅菌壓力進行高壓蒸汽滅菌20min，然後取出，靜置冷卻凝固後即得培養基。實施例5本發明提供的高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基及其配製方法如下：一種高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基，按重量份比，包括以下物質：MS培養基110份、母液I26份和純淨水23份；所述母液I溶液包括以下質量-體積濃度的物質：亞硫酸鉀4mg/L、氟苯丙氨酸4mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷5mg/L、4-碘苯氧乙酸6mg/L和噻菌銅5mg/L。母液I的配製方法如下：5.稱取亞硫酸鉀4mg、氟苯丙氨酸4mg、甲硫基異戊烯基腺苷5mg、4-碘苯氧乙酸6mg和噻菌銅5mg；接著，將亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅分別加入純淨水中，充分攪拌使亞硫酸氫鈣、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環唑完全溶解，然後放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。培養基的配製方法如下：(1)按重量份比，稱取MS培養基和純淨水，先將純淨水加入鍋中，加熱使純淨水煮沸後停止加熱，接著將MS培養基加入純淨水中，使MS培養基溶解，並充分攪拌、混合均勻，此為體系1；(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調節體系2的pH值為6.2，此為體系3；(3)取體系3，將體系3以185KPa的滅菌壓力進行高壓蒸汽滅菌26min，然後取出，靜置冷卻凝固後即得培養基。實施例6本發明提供的高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基及其配製方法如下：其中，所述母液I由以下質量-體積濃度的物質組成：亞硫酸鉀3mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷4mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L和噻菌銅2.5mg/L，其餘與實施例2相同。實施例7本發明提供的高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基及其配製方法如下：其中，所述母液I由以下質量-體積濃度的物質組成：氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷4mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L和噻菌銅2.5mg/L，其餘與實施例2相同。實施例8本發明提供的高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基及其配製方法如下：其中，所述母液I由以下質量-體積濃度的物質組成：亞硫酸鉀3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷4mg/L和4-碘苯氧乙酸4mg/L，其餘與實施例2相同。實施例9本發明提供的高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基及其配製方法如下：其中，所述母液I由以下質量-體積濃度的物質組成：亞硫酸鉀3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷4mg/L和噻菌銅2.5mg/L，其餘與實施例2相同。實施例10本發明提供的高效快速誘導梅花愈傷組織形成的培養基及其配製方法如下：其中，所述母液I由以下質量-體積濃度的物質組成：亞硫酸鉀3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L和噻菌銅2.5mg/L，其餘與實施例2相同。試驗例:取幼嫩的梅花葉片，去掉葉柄，用手術刀切割成小片，用刀片沿主脈劃3刀，保證葉緣處相連，目的在於使葉片產生更多的傷口，再用鑷子將其接種到對應的培養基上，每個瓶接種3片，每組接種30瓶，共接種11組，以上操作在超淨臺上完成，封好口後置於相同的環境中經行培養，培養至產生愈傷組織，培養條件為：(25±1)℃，暗培養。記錄愈傷組織形成時間、愈傷組織的顏色、顆粒散碎度，統計其誘導率和褐變率，結果如下表：試驗組形成時間(天)誘導率褐變率顆粒散碎度顏色實施例1796.6％1.4％緊密淺綠而透明實施例2698.5％1.2％緊密淺綠而透明實施例3797.2％1.3％緊密淺綠而透明實施例4697.1％1.6％緊密淺綠而透明實施例5895.6％1.7％緊密淺綠而透明實施例6784.3％14％緊密淺綠而透明實施例7682.3％16％緊密淺綠而透明實施例8763.4％1.4％緊密淺綠而透明實施例91288.4％1.3％疏鬆白色透明實施例101387.3％1.2％疏鬆白色透明由上表可知，由於實施例1-5使用本發明的培養基進行培養，其誘導時間明顯比其他試驗組短，誘導率比其他試驗組高，褐變率低，顆粒散碎度及顏色都明顯優於其他試驗組。實施例6-10為對比例，其中：實施例6中母液I的成分為：亞硫酸鉀、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅；實施例7中母液I的成分為：氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅；實施例8中母液I的成分為：亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷和4-碘苯氧乙酸；實施例9中母液I的成分為：亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷和噻菌銅；實施例10中母液I的成分為：亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅。分別對比實施例6、實施例7和實施例2的數據，可證實氟苯丙氨酸和亞硫酸鉀有緩解組織培養過程中褐變的問題；通過對比實施例8和實施例2的數據，可證實噻菌銅有效解決了菌絲感染從而提高外植體愈傷組織誘導率；通過對比實施9、實施例10和實施例2的數據，可證實甲硫基異戊烯基腺苷和4-碘苯氧乙酸混合使用可加快愈傷組織形成。上述說明是針對本發明較佳可行實施例的詳細說明，但實施例並非用以限定本發明的專利申請範圍，凡本發明所提示的技術精神下所完成的同等變化或修飾變更，均應屬於本發明所涵蓋專利範圍。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp