玉米胚性愈傷組織誘導相關基因GRMZM2G023133的InDel分子標記及應用的製作方法

2023-10-06 19:58:34 2

本發明屬於分子遺傳學領域，涉及一種玉米胚性愈傷組織誘導相關基因grmzm2g023133的indel分子標記及應用。

背景技術：

玉米是全世界重要的糧食作物和能源作物，中國雖然是全世界玉米第二大生產國，但是缺乏抗逆、抗病、高配合力和適應性廣的優質玉米種質資源。轉基因育種是改良玉米種質資源的重要途徑之一。幼胚誘導胚性愈傷組織這一過程是整個玉米遺傳轉化的重要環節，誘導效率的高低直接影響著轉基因成功率的高低。

研究和生產實踐表明，幼胚胚性愈傷組織誘導率是一個複雜的數量性狀，在玉米自交系間存在顯著的基因型差異。大多數玉米骨幹自交系胚性愈傷組織誘導率很低，有些甚至根本無法誘導出胚性愈傷組織，因而不能直接作為外源基因的直接受體，只能以回交轉育的方法接受來源於轉基因自交系的目的基因。我國傳統的轉基因玉米品種培育技術體系須經歷遺傳轉化、自交純化、回交轉育、雜交組配等幾個環節，僅轉化體中目標基因回交轉育至骨幹自交系則需3～5年時間，極大的延長了玉米轉基因育種周期。鑑定控制玉米胚性愈傷組織誘導相關基因，闡明愈傷組織形成的分子機理，為培育更多高胚性愈傷組織誘導率骨幹自交系提供理論支持，為加快轉基因玉米育種進程奠定基礎，另一方面也能促進整個基因功能研究領域的快速發展。

全基因組關聯分析(gwas)是一種在自然群體中基於連鎖不平衡(ld)鑑定表型性狀與遺傳標記間關係的分析方法，是挖掘優良等位基因的有效途徑。qtl定位則是利用連鎖群體基於遺傳標記與qtl是否連鎖鑑定影響數量性狀的基因在染色體上所處的區段。qtl定位是針對全基因組的qtl掃描，而關聯分析可以對某個snp進行更精確地定位。因此，關聯分析和qtl定位是互補的，可用關聯分析鑑定出顯著的snp位點，然後在連鎖群體中對其進行驗證，兩種方法的整合將大大促進複雜數量性狀的剖析。目前，玉米種質改良和分子輔助育種中尚未有胚性愈傷組織誘導相關基因分子標記開發與利用的報導。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發明的第一個目的在於提供玉米胚性愈傷組織誘導相關基因grmzm2g023133的indel分子標記，該indel標記與玉米幼胚胚性愈傷組織誘導率顯著相關。

本發明的第二個目的是提供擴增上述indel標記的引物對。

本發明的第三個目的是提供上述indel標記的應用。

為實現上述目的，本發明採用技術方案如下：收集中國、美國、墨西哥等地的溫帶、熱帶、亞熱帶玉米自交系301份，作為本研究的關聯群體，結合關聯群體自交系幼胚胚性愈傷組織誘導率的表型數據和snp基因型數據，運用tassel軟體的一般線性模型和混合線性模型兩種方法進行全基因組關聯分析，檢測到一個(maizeb73refgen_v3chr6:1647888954bp)與玉米幼胚胚性愈傷組織誘導率顯著關聯的indel位點。該位點位於grmzm2g023133基因內部，等位基因為7bp插入/缺失，在供試自交系中有缺失和插入兩種純合基因型，所述7bp的序列如seqidno.1所示，該等位基因的側翼序列如seqidno.2所示。

該indel分子標記與玉米幼胚胚性愈傷組織誘導率顯著相關，等位基因為7bp插入的玉米自交系材料胚性愈傷組織誘導率高於等位基因為7bp缺失的玉米自交系材料。

篩選到一個顯著關聯的indel後，基於位點側翼序列，申請人設計了包含上述indel位點的檢測玉米幼胚胚性愈傷組織誘導率相關基因grmzm2g023133的特徵性引物對。引物對序列如下所示：

上遊(f)：caagatggctcggccattgga(seqidno.3)

下遊(r)：agtaaagttggacgtacggggc(seqidno.4)

進一步，本發明提供了上述indel分子標記在鑑定玉米幼胚胚性愈傷組織誘導能力相關基因grmzm2g023133中的應用；及在篩選或鑑定玉米幼胚胚性愈傷組織誘導能力高的種質資源中的應用；在玉米種質改良中的應用。以及在提高玉米幼胚胚性愈傷組織誘導率中的應用。優選地，indel分子標記的位點基因型7bp插入為優異基因型。本發明還提供了上述indel分子標記在玉米轉基因育種中的應用。

本發明提供一種檢測玉米幼胚胚性愈傷組織誘導率相關基因grmzm2g023133的方法，用上述引物對進行pcr擴增，待檢測玉米基因組dna，如果能夠擴增出seqidno.2所示的片段，則說明該待檢測玉米存在幼胚胚性愈傷組織誘導率相關基因grmzm2g022133。

pcr程序為：94℃預變性2min；98℃變性10s；60℃退火30s；68℃延伸5s；共35個循環；68℃再延伸10min。

同時，發明人利用已構建的玉米ibmsyn10dh(b73×mo17)群體的239個家係為連鎖群體，結合binmarker基因型數據和幼胚胚性愈傷組織誘導率的表型數據，進行qtl定位。結果發現上述indel分子標記落在qtl定位的區段裡，進一步驗證了上述indel分子標記與玉米幼胚胚性愈傷組織誘導率的重要性。

為進一步驗證所開發標記的有效性，發明人在關聯群體和連鎖群體裡各挑選8份玉米自交系，測定其幼胚胚性愈傷組織誘導率(見圖1)，並以基因組dna為模板，利用上述引物和程序進行pcr擴增並測序驗證，結果顯示該indel位點成功在16份玉米自交系進行長度多態性檢測(見圖2)。

本發明還提供了一種檢測玉米幼胚胚性愈傷組織誘導率相關基因grmzm2g022133的試劑盒，其含有seqidno.3和seqidno.4所示的引物對。

本發明利用全基因組關聯分析和qtl定位相結合的策略，揭示了該基因與玉米幼胚胚性愈傷組織誘導率之間的內在聯繫，發掘其中顯著的功能位點，並作為遺傳標記應用於玉米分子育種，對加快玉米轉基因育種進程具有重要意義。

本發明的有益效果在於：結合全基因組關聯分析和qtl定位策略，快速精確地檢測到與特定性狀顯著關聯的snp或indel位點。玉米第6號染色體1647888954bp位置的indel位點(maizeb73refgen_v3chr6:1647888954bp)與幼胚胚性愈傷組織誘導率顯著相關，解釋表型變異分別為6.19％。該indel位點能夠作為遺傳標記，用於分子育種，提高玉米幼胚胚性愈傷組織誘導能力，具有較高的應用價值。

附圖說明

圖1為8份關聯群體自交系(027、141、155、208、333、336、339、356)和8份連鎖群體自交系(003、009、062、097、144、182、270、327)的幼胚胚性愈傷組織誘導率。其中003、027、097、141、155、182、208、270表現出較高的誘導率，而009、062、144、327、333、336、339、356的誘導率幾乎為0。

圖2為上述8份關聯群體自交系和8份連鎖群體自交系pcr擴增indel位點的測序結果。其中方框標識出高胚性愈傷組織誘導率自交系的位點基因型為7bp的插入，而對應低胚性愈傷組織誘導率自交系的位點基因型為7bp的缺失。

具體實施方式

下面結合具體試驗方法和附圖對本發明的技術方案及其所產生的技術效果做進一步的闡述，下述說明僅是為了解釋本發明，但不以任何方式對本發明加以限制，基於本發明教導所作的任何變換或替換，均屬於本發明的保護範圍。本發明所述方法如無特殊說明，均為本領域常規方法。所用試劑如無特殊說明，均可以從商業途徑獲得。

實施例1.玉米基因grmzm2g022133與幼胚胚性愈傷組織誘導率顯著相關的一個indel分子標記的獲得。

方法如下：

1)收集301份來自中國、美國、墨西哥的玉米自交系，構建了作圖所用的關聯群體。該群體有著豐富的遺傳多樣性，包含121個溫帶玉米自交系和180個熱帶/亞熱帶玉米自交系。

2)關聯群體表型鑑定。分別於2015年和2016年在四川農業大學西雙版納基地和崇州基地對獲得的301份玉米自交系進行田間種植，設置單行區，每行7穴，每穴2株，54000株/hm2，3次重複。以套袋自交種子用作幼胚培養的試驗材料，授粉12-15天左右，每個dh系取自交果穗3個(即3次重複)，每個果穗接種3個培養皿(即每個重複3個觀察值)，每個培養皿36個幼胚，幼胚大小控制在1.0-1.5cm。用含2mg/l2,4-d的n6誘導培養基，27℃暗培養30天後，調查胚性愈傷組織的誘導率(出現胚性愈傷組織幼胚數佔接種幼胚數的百分率)。經統計後發現其中胚性愈傷組織誘導率在40％～80％的材料有3個，30％～40％的材料有3個，20％～30％的材料有12個，10％～20％的材料有25個，0％～10％的材料有69個，0％的材料有188個。方差分析表明，胚性愈傷組織誘導率在不同自交系間差異達極顯著水平(表1)。

表1玉米幼胚胚性愈傷組織誘導率的方差分析

表1中**表示在0.01水平下顯著。

3)全基因組關聯分析。結合步驟2中玉米自交系幼胚胚性愈傷組織誘導率的表型數據和高密度snp分子標記，分別利用tessel5.0的一般線性模型(glm)和混合線性模型(mlm)進行關聯分析，等位基因頻率閾值設為0.05，在p<0.0001水平上，判定snp標記與性狀關聯的顯著性。結果檢測到一個indel位點與玉米幼胚胚性愈傷組織誘導率顯著相關，該indel標記位於玉米第6號染色體1647888954bp的位置，等位基因為7bp的插入/缺失，所述7bp的序列如seqidno.1所示，該等位基因的側翼序列如seqidno.2所示。glm模型的檢測p值分別為0.0273，可解釋的表型變異分別為5.46％，mlm模型的檢測p值分別為0.0534，可解釋的表型變異分別為6.19％。兩個不同模型的相互驗證，避免了在0.01水平該位點關聯結果的假陽性可能，進一步證實了結果的真實可靠性。

4)qtl定位驗證。利用已構建的玉米ibmsyn10dh(b73×mo17)群體的239個家係為連鎖群體，田間種植和表型鑑定方法同步驟2，再結合6618個binmarker基因型數據，進行qtl定位。在第6染色體上檢測到9個與高胚性愈傷誘導率有關qtl位點，表型貢獻率在6.1074～9.6101％之間，位於區段chr06.1641.5～chr06.1653.5，對應染色體上的物理位置是164.100mb～165.300mb(maizeb73refgen_v3)。步驟3中檢測到的indel分子標記落在qtl定位的區段裡，進一步驗證了上述indel分子標記與玉米幼胚胚性愈傷組織誘導率的重要性。

實施例2.本發明的indel標記在玉米幼胚胚性愈傷組織誘導率上的應用試驗。

在關聯群體和連鎖群體裡各挑選8份玉米自交系，測定其幼胚胚性愈傷組織誘導率(見圖1)，並以基因組dna為模板，利用indel分子標記位點側翼序列(seqidno.2)設計特異性引物，引物序列如seqidno.3和seqidno.4所示，採用kodfxneo高保真聚合酶(東洋紡(上海)生物科技有限公司)進行pcr擴增，程序為：94℃預變性2min；98℃變性10s；60℃退火30s；68℃延伸5s；共35個循環；68℃再延伸10min。將特異性的目標條帶用膠回收試劑盒(omegabio-tek)回收純化，連接平末端克隆載體peasy-bluntcloningvector(北京全式金生物技術有限公司)測序。利用snapgene2.3.2軟體對測序結果進行比對(見圖2)。結果顯示indel位點成功在16份玉米自交系進行長度多態性檢測，其中8份高胚性愈傷組織誘導率自交系在上述indel位點基因型全為7bp插入，8份低胚性愈傷組織誘導率自交系位點基因型全為7bp缺失。本試驗進一步證明本發明中全基因組關聯分析和qtl定位檢測結果的準確性。

因此，7bp插入的等位基因型被視作優異/增效等位基因。本發明進一步證實上述indel位點能夠作為有效的遺傳標記應用於分子標記輔助選擇，提高玉米幼胚胚性愈傷組織誘導能力。

雖然，上文已經用一般性說明、具體實施方式及試驗，對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之做出一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。

sequencelisting

四川農業大學

玉米胚性愈傷組織誘導相關基因grmzm2g023133的indel分子標記及應用

4

patentinversion3.3

1

7

dna

zeamaysl.

1

gaggtaa7

2

65

dna

zeamaysl.

indel分子標記位點側翼序列

(30)..(30)

n=gaggtaa/缺失

2

ctacaagatggctcggccattggaggtaancttccgtgccccgtacgtccaactttactg60

gaaca65

3

21

dna

人工序列

3

caagatggctcggccattgga21

4

22

dna

人工序列

4

agtaaagttggacgtacggggc22