上皮源性癌症的診斷及預後方法
2023-10-07 04:29:09 2
專利名稱：上皮源性癌症的診斷及預後方法
技術領域：
本發明涉及通過評價從患者得到的生物樣品中ADAM 12水平來診斷及預測上皮源性癌症的方法。
背景技術：
癌症倖存者最重要的因素之一是早期檢測。檢測癌症早期活動的臨床分析提供幹預及預防癌症進展的機會。隨著基因概況分析及蛋白質組學的發展，在鑑定可用於診斷及預測特定癌症的分子標記或「生物標記」方面已取得了顯著的進步。舉例而言，在前列腺癌中，可在血液中檢測抗原PSA(為前列腺特異性抗原)，而其存在說明存在前列腺癌。因此，可快速、方便、安全地篩選出具前列腺癌風險的男人血液中升高的PSA水平。
即使癌症檢測領域已取得了顯著的進步，在該領域中仍需要有可方便地用於臨床應用的鑑定各種癌症的新生物標記。舉例而言，迄今為止方便地使用可檢測生物標記來診斷乳腺癌的有用選擇相當少。過量表達EGFR(尤其是與雌激素受體下調相關)為乳腺癌患者預後不良的標記。其它已知的乳腺癌標記包括血液中高水平M2丙酮酸激酶(M2PK)(美國專利第6,358,683號)、血液中高ZNF217蛋白水平(WO 98/02539)及乳腺癌中新鑑定的蛋白PDEBC的差別表達，該蛋白可用於診斷(美國專利申請第20030124543號)。這些生物標記提供可供選擇的診斷方法，然而，卻不能被廣泛應用。而且，儘管使用眾多組織化學、遺傳學和免疫學標記，臨床醫生預測腫瘤將轉移至其它器官仍有一段困難時間。
ADAM 12(解聯蛋白和金屬蛋白酶結構域12(a disintegrin andmetalloproteinase domain 12))，已知通過多配體蛋白聚糖(syndecan)和整聯蛋白相互作用介導細胞粘著及擴散，最近已暗示其作為肝癌的腫瘤攻擊性及進展的標記(Pabic等，Hepatology(2003)，第37卷，(5)1056-1066)。然而，在該研究中ADAM 12水平檢測需要活組織檢查，且未公開有關血清或尿液中ADAM 12的檢測。因此，由Pabic等人公開的ADAM 12顯然不能作為易於檢測的生物標記。
鑑定生物標記尤其與改進疾病的診斷、預後和治療有關。因此，在本領域需要鑑別可快速、方便、安全地檢測的可供選擇的生物標記。此生物標記可用於乳腺癌患者的診斷、分期或監測其進展或治療，尤其是對該疾病的侵襲、潛在轉移期。
發明概述本發明基於ADAM 12(存在有活性及潛伏期兩種)蛋白存在於上皮源性癌症患者的尿液中及在上皮源性癌症患者中ADAM 12表達和活性上調這一令人驚訝的發現，所述上皮源性癌症例如有乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌和皮膚癌以及其它癌症。因此，本發明涉及預後評價、幫助診斷上皮源性癌症及作為治療功效標記的方法。具體地說，生物樣品例如尿液中所檢測的ADAM 12蛋白的量與疾病狀態有關，致使ADAM12水平可用於預測癌症的存在以及轉移潛力。因此，生物樣品(例如尿液或血液)中ADAM 12水平的測量提供快速、方便、安全的篩選，這既可用於診斷又可用於預測患者的上皮源性癌症例如乳腺癌。
在一個實施方案中，提供幫助診斷患者上皮源性癌症的方法。該方法包括從患者獲得生物樣品且檢測該生物樣品中是否存在ADAM 12(或其片段)，其中存在ADAM 12說明存在上皮源性癌症。
在另一個實施方案中，該方法包括測量來自患者的試驗生物樣品中存在的ADAM 12水平，將所測得的ADAM 12水平與同樣類型對照樣品中存在的ADAM 12水平進行比較。試驗樣品中的ADAM 12水平高於對照樣品中的ADAM 12水平，說明存在癌症。本發明方法優選用於上皮源性癌症(尤其是乳腺癌)的早期檢測。舉例而言，患者可在每年體檢期間每年由醫生篩選出來。
術語「對照樣品」是指從認為沒有癌症的「正常」或「健康」個體獲得的生物樣品。可用本領域熟知方法來選擇對照。一旦對照群體水平適當地確立了，來自試驗生物樣品的數組結果可直接與已知水平進行比較。
術語「試驗樣品」是指從待測上皮源性癌症患者獲得的生物樣品。
舉例而言，生物樣品可從血液、組織(例如腫瘤或乳腺)、血清、大便、尿液、痰液、腦脊液、乳頭吸出液(nipple aspirates)和來自細胞裂解物的上清液中獲得。一種優選的生物樣品為尿液。
一方面，待診斷的上皮源性癌症有乳腺癌、基底細胞癌、腺癌、胃腸癌(例如唇癌、口腔癌、食管癌、小腸癌和胃癌)、結腸癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌和皮膚癌(例如鱗狀細胞癌和基底細胞癌)、前列腺癌、腎細胞癌及已知通過身體影響上皮細胞的其它癌症。
在另一個實施方案中，本發明提供懷疑患有或患有上皮源性癌症的患者的預後評價方法。該方法包括下述步驟i)測量從該患者獲得的試驗樣品中存在的ADAM 12水平；ii)將該試驗樣品中的ADAM12水平與同樣類型的生物樣品中存在的已知ADAM 12蛋白水平進行比較，該同樣類型的生物樣品從認為沒有癌症的健康患者獲得(對照樣品)；iii)基於該比較評價該患者預後，若試驗樣品中ADAM 12水平是對照樣品水平的至少3倍，則說明患有攻擊形式(aggressiveform)的癌症(例如轉移或侵襲(invasive)形式的癌症)，因此預後不良。
本發明也涉及評價從同一患者獲得的多種試驗樣品中存在的ADAM 12水平，若隨時間ADAM 12含量進行性增加，則說明癌症腫瘤攻擊性(例如轉移潛力)增加。因此，ADAM 12水平作為疾病狀態及病期的預報器(predictor)。
本發明還涉及評價ADAM 12水平以監測設計為治療上皮源性癌症患者的治療方案的治療功效。
在一個優選實施方案中，所述生物樣品為尿液樣品。然而，也可使用血液、組織、血清、大便、痰液、腦脊液、乳頭吸出液和來自細胞裂解物的上清液等生物樣品。
在本發明的一方面，試驗生物樣品中存在的ADAM 12水平通過將該試驗樣品或其製備物與基於抗體的結合部分接觸來測量，該部分可與ADAM 12蛋白或其部分特異性結合。基於抗體的結合部分與ADAM 12形成可檢測的複合物，由此來測量ADAM 12水平。
基於抗體的免疫測定是測量ADAM 12蛋白水平的優選手段。然而，任何本領域技術人員已知的手段皆可用於評價ADAM 12水平。舉例而言，在某些實施方案中ADAM 12表達水平可通過測量ADAM12mRNA轉錄物水平來檢測。或者，ADAM 12水平可通過質譜分析法(包括SELDI質譜分析法)來評價。ADAM 12水平也可通過生物學活性分析來評價，包括但不限於底物凝膠電泳。
在另一個實施方案中，本發明提供包含測量生物樣品中ADAM12的手段的試劑盒。
本發明其它方面在下文中公開。
附圖簡述附圖結合到本發明說明書中並構成本發明說明書的一部分，用於舉例說明本發明的實施方案，與本發明說明書共同起著解釋本發明的目的、優勢和原理的作用。
圖1顯示從乳腺癌患者獲得的尿液樣品與從未患乳腺癌且年齡及性別相當的正常對照獲得的尿液樣品比較的ADAM 12的免疫印跡分析。
圖2顯示從各期乳腺癌患者獲得的尿液樣品與從正常健康個體獲得的尿液樣品中的ADAM 12水平比較的ADAM 12免疫印跡分析。第11泳道表示純重組ADAM 12，包括該蛋白的92kDa潛伏形式和68kDa成熟形式。
圖3顯示所有樣品免疫印跡光密度測定法的柱狀圖。該柱狀圖指出晚期乳腺癌尿液中ADAM 12中位水平增加。誤差條表示標準誤差(*，p，0.01，方差分析)。
圖4顯示闡明存在ADAM 12與乳腺癌之間相關性存在的圖表。94％癌症患者的尿液樣品為ADAM 12陽性，相比之下，正常尿液樣品中明顯低頻率檢出ADAM 12(15％)。
圖5顯示ADAM 12的胺基酸序列(SEQ ID NO1)。
圖6顯示乳腺癌組和對照組中尿液有ADAM 12的患者百分比。將對照樣品的平均光密度分值作為閾值，計算相對於該對照組各癌症組的陽性百分比。
圖7顯示基於邏輯斯諦回歸分析的理論曲線，闡明基於ADAM 12水平升高患乳腺癌的概率(相對於正常)。該概率曲線疊加在ADAM 12水平特定區間的對照和乳腺癌患者百分比(p＜0.00001)。x軸表示ADAM 12水平區間，y軸表示各區間內患者和對照的實際百分比。
發明詳述我們已發現，患者生物樣品中存在的ADAM 12水平與上皮源性癌症存在與否相關。另外，已確定高水平ADAM 12與癌症腫瘤的攻擊性和轉移潛力相關。
本文所用的「上皮源性癌症」是指起於上皮細胞的癌症，包括但不限於乳腺癌、基底細胞癌、腺癌、胃腸癌、唇癌、口腔癌、食管癌、小腸癌和胃癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、乳腺癌和皮膚癌例如鱗狀細胞和基底細胞癌、前列腺癌、腎細胞癌及其它已知通過身體影響上皮細胞的癌症。
術語「攻擊性(aggressive)」或「侵襲性(invasive)」，就癌症而言，是指腫瘤超過其界限擴展至鄰近組織的傾向(Darnell，J.(1990)，Molecular Cell Biology，第三版，W.H.Freeman，NY)。侵襲性癌可與其中腫瘤局限於某一特定器官的器官局限性癌形成對照。腫瘤的侵襲特性通常伴有蛋白水解酶例如膠原酶的合成加工，降解基質材料和基底膜材料使得腫瘤可超過被膜界線及超過腫瘤位於其中的特定組織界線向外擴展。
本文所用的術語「轉移」是指癌症從源器官擴散到患者的另外遠端部位的情況。腫瘤轉移過程為多步驟的活動，包括局部侵襲及破壞胞間基質，進入血管、淋巴管或其它運輸通道，存在於循環中，在第二個部位溢出血管，並且在新位置生長(Fidler等，Adv.Cancer Res.28，149-250(1978)，Liotta等，Cancer Treatment Res.40，223-238(1988)，Nicolson，Biochim.Biophy.Acta 948，175-224(1988)；Zetter，N.Eng.J.Med.322，605-612(1990))。惡性細胞移動性增加一直與動物腫瘤以及人類腫瘤增加轉移潛力有關(Hosaka等，Gann 69，273-276(1978)；Haemmerlin等，Int.J.Cancer 27，603-610(1981))。
本文所用的「生物樣品」是指從患者(優選病人)獲得的生物材料樣品，包括組織、組織樣品、細胞樣品(例如組織活檢樣品，例如吸出活檢樣品、刷拭活檢樣品、表面活檢樣品、針吸活檢樣品、鑽取活檢樣品、切除活檢樣品、開胸腹活檢樣品、切開式活檢樣品或內窺鏡活檢樣品)和腫瘤樣品。生物樣品也可為生物流體樣品。在一個優選實施方案中，生物樣品為尿液。然而，也可使用血液、血清、唾液、腦脊液、乳頭吸出液和細胞裂解物上清液。
本發明也包括生物樣品分離物在本發明方法中的用途。本文所用的生物樣品「分離物」(例如組織或腫瘤樣品分離物)是指已從樣品中分開的、從樣品中獲取的、從樣品中提取的、從樣品中純化的或從樣品中分離的材料或組合物(例如生物材料或組合物)，優選基本上無與生物樣品相關的不需要的組合物和/或雜質或汙染物。
在一個優選實施方案中，對生物樣品進行處理以防降解ADAM12蛋白或ADAM 12mRNA。抑制或防止降解的方法包括但不限於用蛋白酶或RNA酶抑制劑處理生物樣品，冷凍生物樣品或將生物樣品放在冰上。優選在分析之前，將生物樣品或分離物恆定保持在防止降解ADAM 12蛋白或ADAM 12RNA的條件下。
本文所用的「組織樣品」是指從受試者(優選人類受試者)獲得或從受試者完整組織取出的組織的部分、小塊、局部、節片或小部分。一種優選的組織樣品為乳腺組織。
本文所用的「腫瘤樣品」是指腫瘤的部分、小塊、局部、節片或小部分，舉例而言，從受試者(優選人類受試者)獲得或取出(例如從受試者組織取出或提取)的腫瘤。
本文所用的「原發性腫瘤」是在受試者體內開始部位出現的腫瘤，並且可以與「轉移性腫瘤」區別開來，後者出現在受試者體內遠離原發性腫瘤的部位。
本文所用的「LCIS」是指小葉原位癌。LCIS也稱作小葉瘤，有時劃分為非侵襲型乳腺癌。其不穿透小葉壁。儘管其本身通常不變為侵襲性癌，但患有該病的婦女在同一乳房或對側乳房具有發生侵襲性乳腺癌的較高風險。
本文所用的「DCIS」是指導管原位癌。導管原位癌為最常見的非侵襲型乳腺癌。在DCIS中，惡性細胞不通過導管壁轉移至乳腺脂肪組織。在乳房腫瘤切除後，粉刺癌為比其它類DCIS更可能回到同一部位的一類DCIS，比起其它形式的DCIS，與侵襲性導管癌的最終進展更密切相關。
本文所用的「ADAM 12」是指基因庫(Genebank)檢索號為NM_003474(人(Homosapiens))的ADAM 12蛋白(SEQ ID NO1)(圖5)。該術語也包括其變異體、同源物、等位形式、突變形式及其等同物。
本發明涉及幫助診斷患者上皮源性癌症的方法。在一個實施方案中，該方法包括獲得患者的生物樣品，檢測該生物樣品中是否存在ADAM 12(或其片段)，其中存在ADAM 12說明存在上皮源性癌症。
在另一個實施方案中，該方法包括測量從懷疑患有癌症的患者獲得的試驗樣品中的ADAM 12水平，將所測得的水平與對照樣品中發現的ADAM 12水平進行比較，舉例而言，對照樣品為從據信未患癌症的個體患者或群體獲得的樣品。ADAM 12水平高於在正常對照所測得的水平，說明存在癌症。ADAM 12水平可用任意單位表示，例如，表示為得自光密度計、發光計或Elisa讀板儀的單位。
本文所用的「試驗樣品中的ADAM 12水平高於對照樣品中的水平」，是指ADAM 12含量高於對照樣品中存在的ADAM 12含量。術語「更高水平」是指統計學顯著性水平，即顯著高於對照樣品中存在的水平的水平。優選該「更高水平」為至少2倍大。說明存在攻擊形式的癌症的ADAM 12蛋白水平，是指ADAM 12含量是對照樣品中存在的ADAM 12含量的至少3倍，優選5倍至6倍。
術語「統計學顯著性」或「顯著性」是指統計學上有意義(顯著性)，一般指超出正常或高於標記物濃度的兩個標準差(2SD)。
為了比較的目的，試驗樣品和對照樣品為相同類型，也就是說，均從相同生物學來源獲得。對照樣品也可為標準樣品，其濃度與在從健康個體獲得的相同類型生物樣品中正常情況下發現的ADAM 12的濃度相同。舉例而言，對於正常情況下發現於生物樣品例如尿液、血液、腦脊液或組織中的ADAM 12含量而言，可以有標準正常對照樣品。
在一個實施方案中，本文所述方法用於檢測乳腺癌。任意類型的乳腺癌皆可檢測。舉例而言，可檢測腺癌、導管原位癌(DCIS)、浸潤性(或侵襲性)導管癌(IDC)、浸潤性(或侵襲性)小葉癌(ILC)、炎性乳腺原位癌、小葉原位癌(LCIS)、髓樣癌、粘蛋白性腺癌、乳頭佩吉特病(Paget’s disease)、葉狀腫瘤和小管癌。另外，任何進行性病期的乳腺癌皆可檢測，例如原發性乳腺癌、轉移性乳腺癌和復發性乳腺癌。例如從美國癌症學會(the American Cancer Society)或例如從Wilson等，(1991)，內科學的哈裡斯原理(Harrison′s Principles of InternalMedicine)，第12版，McGraw-Hill，Inc.)可找到關於眾多類型乳腺癌的資料。
在本發明的一方面，可實施第二診斷步驟。舉例而言，若發現ADAM 12水平就說明存在癌症，則可實施另外的檢測癌症的方法，以確證存在該癌症。可使用多種另外診斷步驟中的任何一種，例如乳房X線照相術(乳腺癌)、超聲波、PET掃描、MRI或任何其它顯像技術、活組織檢查、臨床檢查、管腔造影或任何其它方法。
本發明還提供懷疑患有或患有上皮源性癌症的患者的預後評價方法。該方法包括測量從患者獲得的試驗生物樣品中存在的ADAM 12水平，將所測得的水平與在健康個體生物樣品(相同類型的)中發現的正常ADAM 12水平範圍進行比較。舉例而言，高水平說明轉移活性的較大的可能性及相應的不好的預後，而低水平說明腫瘤攻擊性較小且對應較好的預後。
另外，通過跟蹤個體患者ADAM 12水平可評價疾病進展。舉例而言，通過比較患者隨時間ADAM 12表達水平的變化可監測患者病症的變化。ADAM 12水平進行性增加，說明腫瘤侵襲及轉移潛力增加。
本發明預後方法也可用於確定癌症患者合適的治療過程。治療過程是指在癌症診斷後或治療後對患者採取的治療措施。舉例而言，確定癌症復發、擴散或患者倖存的可能性，可幫助確定是否應該採取更為保守的或更加激進的方法來治療，或是否應該聯合治療形式。舉例而言，當癌症很可能復發時，在外科手術之前或之後用化療、輻射、免疫療法、生物改良療法、基因療法、疫苗等等治療可能有利，或調整患者治療期間的時間段可能有利。
測量ADAM 12水平如本文所述，可通過本領域技術人員所知的任何手段來測量ADAM 12水平。在本發明中，一般優選使用抗體或抗體等同物來檢測生物樣品中的ADAM 12蛋白水平。然而，檢測ADAM 12表達的其它方法也可使用，例如通過分析mRNA轉錄物來測量ADAM 12表達。舉例而言，當生物樣品為腫瘤或組織樣品時，可優選測量ADAM12mRNA。
mRNA水平的評價方法為本領域技術人員所熟知。舉例而言，通過RNA印跡法可完成RNA轉錄物的檢測，其中RNA製備物在變性瓊脂糖凝膠上進行，並轉移至合適支持物上，例如活性纖維素膜、硝酸纖維素膜或玻璃膜或尼龍膜。然後使標記(例如放射性標記)的cDNA或RNA與該製備物雜交，洗滌，並通過例如放射自顯影等方法來分析。
還可用已知擴增方法來完成對RNA轉錄物的檢測。舉例而言，在本發明範圍內可將mRNA逆轉錄為cDNA，然後進行聚合酶鏈式反應(RT-PCR)；或如美國專利第5,322,770號所述兩步用一單酶來完成；或將mRNA逆轉錄為cDNA，然後進行對稱缺口連接酶鏈式反應(lipase chain reaction)(RT-AGLCR)，參見R.L.Marshall等，PCRMethods and Applications(PCR方法及應用)，480-84(1994)。一種檢測ADAM 12mRNA轉錄物的合適方法描述於參考文獻Pabic等，Hepatology，37(5)1056-1066，2003，所述文獻的全部內容通過引用結合到本文中。
可用於本文的其它已知的擴增方法包括但不限於所謂「NASBA」或「3SR」技術，描述於PNAS USA 871874-1878(1990)，也描述於Nature 350(No.6313)91-92(1991)；Q-β擴增法，描述於公布的歐洲專利申請(EPA)第4544610號；鏈置換擴增法，參見G.T.Walker等，Clin.Chem.429-13(1996)；歐洲專利申請第684315號；目標介導擴增，參見PCT公布的WO 9322461。
也可採用原位雜交顯現，其中放射性標記的反義RNA探針與活檢樣品薄切片雜交，洗滌，用RNA酶切割，對放射自顯影感光乳劑曝光。所述樣品可用蘇木精染色以證明樣品中的組織學組成，而帶合適的濾光鏡的暗視野圖像顯示感光的乳劑。也可用非放射性標記例如地高辛配基。
或者，可在DNA陣列、晶片或微陣列上檢測mRNA表達。將對應於ADAM 12的寡核苷酸固定在晶片上，然後與從患者獲得的試驗樣品中標記的核酸雜交。用含有ADAM 12轉錄物樣品獲得陽性雜交信號。DNA陣列的製備方法及其應用在本領域已熟知(參見例如以下美國專利第6,618,6796號；第6,379,897號；第6,664,377號；第6,451,536號；第548,257號；美國專利申請第20030157485號，Schena等，1995 Science 20467-470；Gerhold等，1999，Trends in Biochem.Sci.24，168-173；Lennon等，2000，當今藥物發現(Drug discovery Today)559-65，上述參考文獻的全部內容通過引用結合到本文中)。也可進行基因表達的系列分析(SAGE)(參見例如美國專利申請第20030215858號)。
舉例而言，為監測mRNA水平，從待測生物樣品中提取mRNA，逆轉錄，產生螢光-標記的cDNA探針。然後用標記的cDNA探針探測能夠與ADAM 12 cDNA雜交的微陣列，掃描載玻片，測量螢光強度。該強度和雜交強度及表達水平相關。
也可測量ADAM 12蛋白水平或ADAM 12活性，尤其是當該生物樣品為流體樣品例如血液或尿液時。在一個實施方案中，通過讓生物樣品與特異性結合ADAM 12或ADAM 12片段的基於抗體的結合部分接觸，來測量ADAM 12蛋白水平。然後檢測形成的抗體-ADAM12複合物，以測量ADAM 12水平。
術語「基於抗體的結合部分」或「抗體」包括與ADAM 12特異性結合(起免疫反應)的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學活性決定簇，例如含有抗原結合位點的分子。術語「基於抗體的結合部分」意指包括全抗體，例如任何同種型(IgG、IgA、IgM、IgE等等)，包括也與ADAM 12蛋白特異性反應的抗體片段。可使用常規技術使抗體片段化。因此，該術語包括能夠選擇性地與某一蛋白反應的抗體分子的蛋白水解片段或重組製備的部分。此等蛋白水解和/或重組片段的非限制性實例包括Fab、F(ab′)2、Fab′、Fv、dAbs及含有由多肽接頭連接的VL區和VH區的單鏈抗體(scFv)。所述scFv可共價或非共價連接形成含兩個以上結合位點的抗體。因此，「基於抗體的結合部分」包括多克隆抗體、單克隆抗體或抗體的其它純化製備物和重組抗體。術語「基於抗體的結合部分」還指包括人源化抗體、雙特異性抗體及含至少一個源自抗體分子的抗原結合決定簇的嵌合分子。在一個優選實施方案中，基於抗體的結合部分被可檢測地標記。
本文所用的「標記抗體」包括以可檢測的方式標記的抗體，包括但不限於酶標記抗體、放射性標記抗體、螢光標記抗體和化學發光標記抗體。也可用可檢測標籤例如c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5或HIS標記抗體。
在本發明診斷及預後方法中使用基於抗體的結合部分檢測ADAM 12，生物樣品中存在的ADAM 12水平與可檢測標記抗體發射的信號強度相關。
在一個優選實施方案中，可通過將抗體與酶連接，來可檢測地標記基於抗體的結合部分。進而當該酶與其底物接觸時，將與該底物反應，其反應方式能產生可檢測化學部分，舉例而言，通過分光光度法、螢光測定法或通過視覺手段來檢測。可用於可檢測地標記本發明抗體的酶包括但不限於蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-類固醇異構酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構酶、辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、天冬醯胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、過氧化氫酶、葡萄糖-VI-磷酸脫氫酶、葡萄糖澱粉酶和乙醯膽鹼酯酶。化學發光是另一種可用於檢測基於抗體的結合部分的方法。
使用多種其它免疫測定中的任一種也可完成檢測。舉例而言，通過放射性標記抗體，通過使用放射免疫測定可能檢測該抗體。通過使用例如γ計數器或閃爍計數器或通過放射自顯影等手段可檢測放射性同位素。對本發明目的尤其有用的同位素為3H、131I、35S、14C，優選125I。
用螢光化合物標記抗體也是可行的。當螢光標記的抗體暴露於合適波長的光時，由於螢光於是可檢測其存在。在最常用螢光標記化合物中有CYE染料、異硫氰酸螢光素、羅丹明、藻紅蛋白(phycoerytherin)、藻青蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛和螢光胺。
用發射螢光的金屬例如152Eu或其它鑭系元素也可檢測地標記抗體。利用如二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金屬螯合基團可將這些金屬連接至抗體。
通過將抗體偶聯到化學發光化合物，也可檢測地標記抗體。然後通過檢測化學反應期間產生的化學光的存在來確定化學發光抗體的存在。尤其有用的化學發光標記化合物實例為魯米諾、螢光素、異魯米諾、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶鹽和草酸酯。
如上所述，可通過免疫測定來檢測ADAM 12蛋白水平，例如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、免疫放射測定(IRMA)、蛋白質印跡法或免疫組織化學，每一種方法皆更詳細地在下面闡述。通常更優選可極快速測定的免疫測定例如ELISA或RIA。也可採用抗體陣列或蛋白質晶片，參見例如美國專利申請第20030013208A1號、第20020155493A1號、第20030017515號和美國專利第6,329,209號、第6,365,418號，所述文獻的全部內容通過引用結合到本文中。
免疫測定法「放射免疫測定」是使用標記(例如放射性標記)形式的抗原來檢測和測量抗原濃度的技術。抗原的放射性標記物實例包括3H、14C和125I。通過用生物樣品中含有的抗原與標記(例如放射性)抗原競爭性結合抗該抗原的抗體，來測量生物樣品中的ADAM 12抗原濃度。為確保在標記抗原與未標記抗原之間的競爭性結合，標記抗原以足夠飽和抗體結合位點的濃度存在。樣品中抗原濃度愈高，將結合該抗體的標記抗原濃度愈低。
在放射免疫測定中，為確定結合抗體的標記抗原濃度，應該將抗原-抗體複合物與游離抗原分離開來。把抗原-抗體複合物與游離抗原分離開來的一種方法是，用抗同種型抗血清沉澱該抗原-抗體複合物。把抗原-抗體複合物與游離抗原分離開來的另一方法是，用福馬林殺死的金黃色葡萄球菌(S.aureus)沉澱該抗原-抗體複合物。把抗原-抗體複合物與游離抗原分離開來的又一方法是，實施「固相放射免疫測定」，其中使抗體與瓊脂糖凝膠珠粒、聚苯乙烯孔、聚氯乙烯孔或微量滴定孔結合(例如共價結合)。通過將與抗體結合的標記抗原濃度與基於含已知抗原濃度樣品的標準曲線進行比較，可以確定生物樣品中的抗原濃度。
「免疫放射測定」(IRMA)是一種抗體試劑被放射性標記的免疫測定法。IRMA需要通過例如與蛋白例如兔血清白蛋白(RSA)綴合等技術，產生多價抗原綴合物。該多價抗原綴合物每分子必須至少有2個抗原殘基，該抗原殘基應該具有足夠的間隔距離，以使至少2個抗體與該抗原結合。舉例而言，在IRMA中，該多價抗原綴合物可與固體表面例如塑料球連接。將未標記「樣品」抗原和抗放射性標記抗原的抗體加入到裝有多價抗原綴合物包被的球體的試管中。樣品中的抗原與多價抗原綴合物競爭抗原抗體結合位點。在經過適當溫育後，通過洗滌除去未結合的反應物，測定固相上的放射性量。結合的放射性抗體量與樣品中的抗原濃度成反比。
最普通的酶免疫測定為「酶聯免疫吸附測定(ELISA)」。ELISA是使用標記(例如酶聯)形式的抗體來檢測和測量抗原濃度的技術。有不同形式的ELISA，均為本領域人員所熟知。本領域已知的ELISA標準技術描述於「Methods in Immunodiagnosis(免疫診斷方法)」第2版，Rose和Bigazzi編輯，John Wiley Sons，1980；Campbell等，「Methods and Immunology(方法與免疫學)」，W.A.Benjamin，Inc.，1964；Oellerich，M.1984，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.，22895-904。
在「夾層ELISA」中，先將抗體(例如抗ADAM 12)連接至固相(即微量滴定板)，再與含有抗原(例如ADAM 12)的生物樣品接觸。然後洗滌該固相，以除去未結合的抗原。然後將標記抗體(例如酶聯)結合該已結合的抗原(若存在)，形成抗體-抗原-抗體夾層。可與該抗體連接的酶的實例為鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶、尿素酶和β-半乳糖苷酶。該酶聯抗體與底物反應，以產生可測量的有色反應產物。
在「競爭性ELISA」中，將抗體與含有抗原(即ADAM 12)的樣品一起溫育。然後讓抗原-抗體混合物與已包被抗原(即ADAM 12)的固相(例如微量滴定板)接觸。樣品中存在的抗原越多，可用於結合該固相的游離抗體就越少。然後將標記(例如酶聯)的第二抗體加入到該固相中，以確定已結合該固相的第一抗體的量。
在「免疫組織化學分析」中，通過將組織暴露於對擬分析的蛋白質具特異性的抗體來測試組織切片的特異性蛋白質。然後通過很多方法中的任一種來顯現抗體，以確定蛋白質的存在和存在量。舉例而言，用於顯現抗體的方法的實例有通過酶連接至抗體(例如螢光素酶、鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶或β-半乳糖苷酶)或化學方法(例如DAB/Substrate chromagen)。
可根據專業人員的偏愛，基於本發明公開的內容，使用其它技術檢測ADAM 12。一種如此技術為蛋白質印跡法(Towbin等，Proc.Nat.Acad.Sci.764350(1979))，其中適宜地處理的樣品進行SDS-PAGE凝膠分離，然後轉移至固體支持物例如硝酸纖維素濾膜上。然後可將可檢測地標記的抗ADAM 12抗體用於評價ADAM 12水平，其中來自可檢測標記物的信號強度對應於存在的ADAM 12量。舉例而言，可通過光密度測定法來定量測定水平。
質譜法另外，可使用質譜法檢測ADAM 12，例如MALDI/TOF(飛行時間)、SELDI/TOF、液相層析-質譜聯用(LC-MS)、氣相層析-質譜聯用(GC-MS)、高效液相層析-質譜聯用(HPLC-MS)、毛細管電泳-質譜聯用、核磁共振質譜法或串聯質譜法(例如MS/MS、MS/MS/MS、ESI-MS/MS等等)。參見例如美國專利申請第20030199001號、第20030134304號、第20030077616號，所述文獻通過引用結合到本文中。
質譜法為本領域所熟知，一直用於定量和/或鑑定生物分子例如蛋白質(參見例如Li等，(2000)Tibtech 18151-160；Rowley等，(2000)Methods 20383-397；Kuster和Mann(1998)Curr.Opin.Structural Biol.8393-400)。此外，質譜測定技術已發展為允許至少部分從頭測定分離的蛋白質序列。Chait等，Science 26289-92(1993)；Keough等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.967131-6(1999)；有關綜述參見Bergman，EXS 88133-44(2000)。
在某些實施方案中，使用氣相離子分光光度計。在其它實施方案中，使用雷射-解吸/電離質譜法來分析樣品。現代雷射解吸/電離質譜法(「LDI-MS」)可以兩種主要版本來實行基質輔助雷射解吸/電離(「MALDI」)質譜法和表面增強雷射解吸/電離法(「SELDI」)。在MALDI中，被分析物與含有基質的溶液混合，將一滴液體置於基底表面。然後讓基質溶液與生物分子共結晶。將該基底插入質譜儀中。雷射能量對準基底表面，在此處其使生物分子解吸附並電離而不會使其明顯成為片段。然而，MALDI作為分析工具有很多限制。其不能提供分餾樣品的手段，該基質材料可幹擾檢測，尤其是對低分子量的分析物。參見例如美國專利第5,118,937號(Hillenkamp等)和美國專利第5,045,694號(Beavis和Chait)。
在SELDI中，基底表面經修飾以便在解吸過程中其為主動參與者。在一版本中，該表面用吸附劑和/或選擇性結合目標蛋白質的捕獲劑衍生。在另一版本中，該表面用能量吸收分子衍生，當用雷射撞擊時該能量吸收分子不再吸收。在另一版本中，該表面用結合目標蛋白質的分子衍生，該分子含有在使用雷射時斷裂的光解鍵。在這些方法每一種中，通常將衍生劑固定於上樣樣品的基底表面上的特定位置。參見例如美國專利第5,719,060號和WO 98/59361。舉例而言，使用SELDI親和表面來捕獲分析物，將含有基質的液體加到所捕獲的分析物上，以提供能量吸收材料，這兩種方法可聯合使用。
關於質譜儀的其它信息，參見例如《儀器分析原理》(Principles ofInstrumental Analysis)，第3版，Skoog，Saunders College Publishing，Philadelphia，1985；和Kirk-Othmer的《化學技術百科全書》(Encyclopedia of Chemical Technology)，4.sup.th ed.Vol.15(John Wiley Sons，New York 1995)，第1071-1094頁。
檢測標記物或其它物質存在，通常將包括檢測信號強度。這進而又可反映結合底物的多肽的數量和特性。舉例而言，在某些實施方案中，可比較來自第一樣品和第二樣品光譜的峰值信號強度(例如視覺上、通過計算機分析等等)，以確定具體生物分子的相對量。可使用軟體程序例如生物標記Wizard程序(Ciphergen Biosystems，Inc.，Fremont，Calif.)來幫助分析質譜。質譜法及其技術為本領域技術人員所熟知。
任何本領域技術人員理解質譜儀的任一種組件(例如解吸源、質譜分析儀、檢測等等)和各種樣品製備物可與本文所述或為本領域技術人員所知的其它合適組分或製備物聯合。舉例而言，在某些實施方案中，對照樣品可含有重原子(例如13C)，從而使得可在同一次質譜測定分析中將試驗樣品與已知對照樣品混合。
在一個優選實施方案中，使用雷射解吸飛行時間(TOF)質譜儀。在雷射解吸質譜法中，將結合標記物的基底引入至入口系統。解吸該標記物並通過來自電離源的雷射使其電離成為氣相。由離子光纜收集產生的離子，然後在飛行時間質譜分析儀中通過突然的高壓電場來加速離子，使其漂流入高真空室內。在高真空室內的遠端，加速的離子在不同時間撞擊靈敏檢測器表面。因為飛行時間是離子質量的函數，在離子形成與離子檢測器撞擊之間消逝的時間可用於鑑別有或無特定質荷比的分子存在。
在某些實施方案中，可部分通過用可編程數字計算機執行運算法則，來確定第一或第二樣品中存在的一種或多種生物分子的相對量。運算法則至少識別第一質譜和第二質譜的一個峰值。然後運算法則將第一質譜峰值的信號強度與第二質譜峰值的信號強度進行比較。相對信號強度說明第一和第二樣品中存在的生物分子量。含有已知量生物分子的標準品可作為第二樣品來分析，以對第一樣品中存在的生物分子的量提供更好的定量。在某些實施方案中，也可確定第一和第二樣品中生物分子的身份。
在一個優選實施方案中，通過MALDI-TOF質譜法來測量ADAM12水平。
其它分析ADAM 12水平也可使用其它生物分析方法來測量，舉例而言，測量活性，包括但不限於酶譜法(zymography)。酶譜法是一種本領域技術人員所熟知的方法，描述於Heusen等，Anal.Biochem.，(1980)102196-202；Wilson等，Journal of Urology，(1993)149653-658；Hernon等，J.Biol.Chem.(1986)2612814-2828；Braunhut等，J.Biol.Chem.(1994)26913472-13479；Moses等，Cancer Research 58，1395-1399，1998年4月1日，上述參考文獻的全部內容通過引用結合到本文中。
ADAM 12抗體本發明使用的抗體可市購獲得。或者，抗體可針對ADAM 12多肽或ADAM 12多肽部分來產生。ADAM 12抗體的生產方法公開於PCT公布號WO 97/40072或美國專利申請第2002/0182702號，所述文獻通過引用結合到本文中。
可使用抗體的標準產生方法來產生本發明使用的抗體，舉例而言，通過單克隆抗體生產(Campbell，A.M.，Monoclonal AntibodiesTechnologyLaboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology(單克隆抗體技術生物化學及分子生物學的實驗室技術)，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，the Netherlands(1984)；St.Groth等，J.Immunology，(1990)351-21；Kozbor等，Immunology Today(1983)472)。通過本領域熟知方法，使用蛋白質抗原部分來篩選抗體文庫，例如噬菌體展示文庫，也可易於獲得抗體。舉例而言，美國專利第5,702,892號(U.S.A.Health Human Services)和WO01/18058(Novopharm Biotech Inc.)公開了噬菌體展示文庫和生產抗體結合結構域片段的選擇方法。
ADAM 12檢測試劑盒本發明也涉及檢測和預後評價上皮源性癌症的商用試劑盒。該試劑盒可以是本領域普通技術人員所熟知的任何配置，用於實施一種或多種本文所述檢測ADAM 12的方法。所述試劑盒方便使用，因為其中提供了大量(如果不是所有的)實施分析生物樣品中ADAM 12檢測的必需試劑。另外，優選用包括於試劑盒中的一種標準或多種標準同時實施測試，例如預先確定ADAM 12蛋白或核酸量以便該測試結果可定量或確證。
試劑盒包括檢測ADAM 12水平的手段，例如選擇性結合ADAM12蛋白的抗體或抗體片段，或一套可使編碼該蛋白質的cDNA合成的DNA寡核苷酸引物，舉例而言，檢測ADAM 12mRNA表達的DNA探針。診斷檢測試劑盒優選以標準雙抗體結合形式配製，其中一種ADAM 12特異性抗體捕獲患者樣品中的ADAM 12，另一種ADAM特異性抗體用於檢測捕獲的ADAM 12。舉例而言，將該捕獲抗體固定於例如測試板、測試孔、硝酸纖維素膜、珠粒、浸棒(dipstick)或洗脫柱組件等固相上。通常用可檢測標記例如量熱劑或放射性同位素來給第二抗體即檢測抗體作標籤。
在一個優選實施方案中，該試劑盒包括檢測尿液樣品中ADAM12水平的手段。在一個具體實施方案中，試劑盒包括具抗ADAM 12抗體或片段的「浸棒」，抗體固定在其上，並可特異性結合ADAM 12蛋白。然後可使用例如使用量熱劑或放射性同位素可檢測地標記的第二抗體，來檢測特異性地結合的ADAM 12蛋白。
在其它的實施方案中，檢測試劑盒可採用(但不限於)下列技術競爭性和非競爭性測定、放射免疫測定(RIA)、生物發光和化學發光測定、螢光測定、夾層試驗、免疫放射測定、斑點印跡、酶聯測定(包括ELISA)、微量滴定板和免疫細胞化學法。對每一試劑盒，測試的範圍、靈敏度、準確度、可靠性、特異性和再現性均通過本領域技術人員所熟知的方法來確立。
上述檢測試劑盒將還提供使用說明書。
上文及下文引用的所有參考文獻都通過引用結合到本文中。
本發明由下列實施例作進一步說明。
提供這些實施例是為了幫助理解本發明，不得解釋為對本發明的限制。
實施例1尿液ADAM 12與乳腺癌疾病狀態和病期的相關性ADAM(解聯蛋白和金屬蛋白酶)是最近發現的與蛇毒金屬蛋白酶(SVMP)和基質金屬蛋白酶(MMP)有關的整合膜和分泌型糖蛋白質家族。在正常發展和病理狀態(例如阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease)、類風溼性關節炎和癌症)兩種情況下，該家族成員在細胞表面重建改變、胞外結構域脫落、調節生長因子有效性方面和在介導細胞-細胞和細胞-基質之間相互作用方面顯示出不同的作用。人ADAM 12表達為兩種可變剪接形式，一種長錨定膜型(ADAM 12-L)和一種較短的分泌型(ADAM 12-S)。先前已報導在乳腺癌組織、結腸癌組織、肺癌組織和肝細胞癌組織中增加了ADAM 12mRNA和蛋白質水平。我們先前已報導可檢測各種不同癌症患者尿液中的基質金屬蛋白酶(MMP)，其存在為一種獨立的疾病狀態預報器(predictor)。然而，尿液中作為疾病標記物的不同於MMP的其它蛋白酶的存在還沒有完全弄清楚。本研究的目的是鑑定癌症患者尿液中存在的其它蛋白酶，確定它們的存在是否可能與疾病狀態有關。通過聯合使用層析步驟與MALDI-TOF質譜法，我們報告了對乳腺癌患者尿液中ADAM 12的檢測結果。
材料與方法尿液ADAM 12的鑑定用50毫升尿液(總蛋白約5毫克)進行ADAM 12的初步鑑定。通過用Amicon膜XM-50(Millipore Corporation，Bedford，MA)超濾來濃縮尿液。用2倍體積pH 7.5的50mM Tris(緩衝液A)稀釋樣品，上樣到Q瓊脂糖凝膠柱。洗滌後用緩衝液A中的0-400mM NaCl梯度洗脫。合併含有明膠酶活性的部分，將NaCl濃度調節至200mM，與明膠瓊脂糖凝膠(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)於4℃持續振蕩溫育16小時。在洗滌步驟後，用含有200mM NaCl的緩衝液A中的分別為5％、10％和20％的DMSO實施分級梯度洗脫。濃縮洗脫部分，通過在非還原條件下的SDS-PAGE分離，用Sterling快速銀染試劑盒(National Diagnostics，Atlanta，GA)，按照廠商用法說明進行染色。檢測到幾條約52kDa、80kDa、120kDa和140kDa的明顯的條帶。從該凝膠上切下蛋白質條帶，用胰蛋白酶消化，通過MALDI飛行時間(TOFMS)質譜法(Perceptive STR，Applied Biosystems，Framingham，MA)分析，來確定所述蛋白質的分子量，並用337nm波長的解吸雷射和分析反射方式來確定胰蛋白酶消化物的肽圖譜。用MSFit(Baker，P.R.和Clauser，K.R.)搜索程序，在NCBI和Swiss-Prot擁有的非冗餘資料庫中蛋白質詞條構成的公共領域蛋白質FASTA資料庫裡搜索產生的肽圖譜。按照所觀察的肽和蛋白質的MOWSE分值、質量匹配百分比、分子量和數量來過濾由MSFit鑑別的肽匹配物。為保守鑑定蛋白質，需要至少兩個具有與單個蛋白質匹配的有效分值的肽。
ADAM 12-S的表達及純化將全長人ADAM 12-S基因克隆到質粒(p1151)中，如前述(5)轉染Cos-7細胞(ATCC，CRL 1651)。表達的重組ADAM 12-S分泌到條件培養基中，如前述加上小改變來純化。簡言之，來自轉染Cos-7細胞的條件培養基接受如(6)所述的連續的SP瓊脂糖凝膠及ConA瓊脂糖凝膠層析步驟。將來自ConA瓊脂糖凝膠柱含有ADAM 12-S的部分合併，緩衝液交換後上樣到用含有0.05％CHAPS的緩衝液A預平衡的Vivapure H Mini Q柱(VivaScience，Carlsbad，CA)。通過SDS-PAGE及免疫印跡分析來檢測流通部分中的純ADAM 12-S。
底物特異性研究如前述(14)測量ADAM 12-S降解明膠、IV型膠原、纖連蛋白和酪蛋白的活性。將ADAM 12-S(1μM)與非還原性樣品緩衝液混合，在含有0.1％明膠、0.1％IV型膠原或0.02％纖連蛋白的10％聚丙烯醯胺凝膠及含有0.1％酪蛋白的12％聚丙烯醯胺凝膠上分離。電泳後，用2.5％Triton X-100洗滌電泳凝膠30分鐘。通過讓電泳凝膠在pH 7.6的50mM Tris(含有5mM CaCl2、1μM ZnCl2和0.02％NaN3)中於37℃溫育18小時，來實施底物消化。用0.1％考馬斯染色凝膠，在均衡的藍染色背景上酶活性條帶檢測為清晰區帶。為確定ADAM 12是否具有I型膠原降解活性，如前述(16)用放射分析膠原酶法來分析純酶(1μM)。對於抑制分析，ADAM 12(160nM)與30微克明膠在測試緩衝液(50mM Tris，pH 7.5)中於37℃溫育18小時，在30微升終體積緩衝液中有或無各種抑制劑存在5mM 1，10-二氮雜菲、5mM EDTA、1mM馬立馬司他或兩種不同濃度(100nM和500nM)的TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3或TIMP-4。加入非還原性樣品緩衝液來終止反應，通過SDS-PAGE分析後進行考馬斯染色來分辨樣品。
尿液樣品採集及處理如前所述(14)實施尿液採集。樣品採集於無菌容器中且立即冷凍於-20℃。按照制定的與丟棄的臨床材料有關的生物倫理指導原則收集尿液。在分析之前，用Multistix 9尿分析試條(Bayer，Elkhart，IN)測試尿液中有無紅細胞和白細胞存在，含有紅細胞或白細胞的樣品排除在外。用商用試劑盒(Sigma，St.Louis，MO)，按照廠商說明，測定尿液肌氨酸酐濃度。用牛血清白蛋白作為標準品，通過Bradford方法測定尿液蛋白質濃度。
患者群體分析了117份尿液樣品存在的ADAM 12。對照組由無可辨別的疾病的46位婦女組成(中位年齡約50歲)。乳腺癌組包括71位診斷患有各期乳腺癌的患者，包括不典型導管增生(ADH)、小葉原位癌(LCIS)、導管原位癌(DCIS)、局部侵襲性乳腺癌(IBC)和轉移性疾病(參見圖2)。
蛋白質印跡分析在還原條件下，通過SDS-PAGE分離等量蛋白質(20μg)。將分離蛋白質電泳轉移至硝酸纖維素膜(Schleicher和Schuell，Keene，NH)，如前述(15)處理。用增強化學發光(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)來顯現標記蛋白質。使用濃度分別為1微克/毫升和2微克/毫升的人ADAM 12、rb122(4)、S-18多克隆抗體(sc-16526，SantaCruz Biotechnology，CA)。用UN-SCAN-ITTM(Silk Scientific，Orem，UT)軟體數字轉換器技術，分析分離帶的強度。
統計分析用標準公式計算靈敏度、特異性、假陽性率(FPR)、假陰性率(FNR)和似然比(LR)。用邏輯斯諦回歸分析比較癌症組(ADH/LCIS、DCIS、IBC和轉移性疾病)與對照之間ADAM 12的存在。對每一組而言，以百分比來表示ADAM 12的存在，根據正態近似計算95％置信區間。用邏輯斯諦回歸分析來模擬ADAM 12水平與乳腺癌之間的非線性關係，通過對選擇的ADAM 12區間的最大似然估計來確定概率(17)。用Kruskal-Wallis檢驗法(其基於Mann-Whitney U檢驗成雙比較)，比較對照與癌症患者之間的ADAM 12中位水平，而通過方差分析(ANOVA)比較平均水平。為了評價ADAM 12的診斷準確度，使用受試者抽檢特徵(ROC)曲線分析，對不同ADAM 12水平的所有成對的真陽性和假陽性作圖。為區別所有乳腺癌患者和對照，繪製ROC曲線，分別為每一癌症組構建。從(0，0)陡峭上升且達到接近(0，1)的ROC曲線，表明測試幾乎能完美區別癌症患者與對照，然而接近45度斜線的曲線的鑑別力很低。用Hanley-McNeil運算法則來確定具95％置信區間的曲線下面積(AUC)，作為ADAM 12(其作為疾病的生物標記)性能指數。另外，AUC等於將隨機選擇患者和對照對恰當地分類的概率。將癌症患者和對照的實際人數繪成柱狀圖，附加理論概率曲線以說明更高ADAM 12水平增加了乳腺癌的可能性。為說明5個獨立組(根據病期的4個乳腺癌組和正常對照組)之間的多重比較，把保守的雙尾檢驗準則P＜0.01(0.05除以5)看作是統計上顯著。使用SAS統計軟體包(6.12版，SAS Institute，Cary，NC)實施所有統計分析。功效分析表明，每組乳腺癌期最少有13名患者提供80％的檢測ADAM 12水平差別的功效(5.0版，nQuery Advisor，StatisticalSolutions，Boston，MA)。
結果ADAM 12的分離和鑑定乳腺癌患者的尿液接受分步層析，用明膠瓊脂糖凝膠實施親和層析步驟來努力分離蛋白酶。ADAM 12結合明膠瓊脂糖凝膠珠粒這一事實支持了我們的數據(參見下文)，即該酶具有降解明膠的能力。當用20％DMSO上樣到明膠瓊脂糖凝膠柱時收集的部分含有幾種獨特的約52kDa、80kDa、120kDa和140kDa蛋白質條帶(數據未列出)。約120kDa蛋白質條帶的MALDI-TOF分析確定其為解聯蛋白和金屬蛋白酶結構域12(ADAM 12)(檢索號為NP_003465)。鑑定出了四種截然不同的橫跨人ADAM 12胺基酸序列的肽。所鑑別的肽的高MOWSE分值、質量匹配百分比和數量預測該以高置信度分析的蛋白質條帶中存在ADAM 12。為確證這些結果，分析了較大群體的尿液ADAM 12，包括乳腺癌患者樣品和年齡相當、性別一樣的對照樣品。濃縮尿液樣品，使蛋白質標準化(每一分析使用20微克總蛋白質)，進行蛋白質印跡分析。在非還原性尿液樣品中，多克隆ADAM 12-特異性抗體rb122可識別～120kDa蛋白質條帶(數據未列出)，然而，當用β-巰基乙醇還原該樣品且煮沸5分鐘時，可檢測出～68kDa條帶。用其它ADAM 12-特異性抗體、多克隆抗體S18和單克隆抗體8F8和6E6進行免疫印跡分析時得到相似的結果(數據未列出)。根據分子量，將該～68kDa條帶鑑定為成熟形式的ADAM 12-S(5)。根據ADAM12-特異性抗體可檢測癌症患者尿液中蛋白質的成熟形式這一事實，通過質譜法鑑定來自ADAM 12前域的2種肽是有價值的發現。已報導即使在非還原條件下弗林蛋白酶(furin)裂解後，ADAM 12前域仍具有與該蛋白酶的相關性(6)。這提示胰蛋白酶切割(質譜分析前的必需步驟)該成熟的與ADAM 12有關的前肽，導致可檢測來自該前域的2種肽。儘管使用ADAM 12-特異性抗體，通過免疫印跡分析檢測的蛋白質條帶的大小與成熟的ADAM 12-S大小最相符，但多克隆抗體rb122識別ADAM 12的富半胱氨酸區，該區具有L和S二種形式的同源性。因此，我們不能排除所檢測的條帶為加工過的ADAM 12-L形式的可能性。全長ADAM 12-L具有報告過的～120kDa的質量，而成熟的(無該前肽)錨定膜形式為～90kDa(18)。儘管通過質譜法分析的～120kDa種類含有全長蛋白質，但免疫印跡分析表明，尿液中的主要種類似乎為該酶的～68kDa的成熟形式。
ADAM 12的底物特異性為測試ADAM 12降解ECM蛋白的能力，將重組ADAM 12-S蛋白在Cos-7細胞中表達，如前述純化為同質物。當通過底物酶譜法分析時，ADAM 12可蛋白水解降解明膠。該純化的人ADAM 12-S樣品由表現明膠酶活性條帶的該酶的～68kDa的成熟形式組成。放射測定膠原酶分析中檢測時用底物酶譜法或I型膠原分析，ADAM 12也降解纖連蛋白和IV型膠原，但不能降解酪蛋白(數據未列出)。ADAM 12降解明膠的活性用於評價不同種類蛋白酶抑制劑對該酶的效果。純ADAM 12-S與明膠在沒有(圖2C第3-4泳道)或有各種抑制劑存在時於37℃溫育2小時或18小時。～140kDa條帶的消失表明，ADAM 12以時間依賴方式來切割明膠。鋅金屬蛋白酶的典型螯合劑、EDTA和1，10-二氮雜菲抑制ADAM 12降解明膠，而加入1mM馬立馬司他導致部分抑制酶活性。內源性抑制劑TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4即使是在高於該酶5倍的濃度下也不抑制ADAM 12的明膠酶活性，然而，TIMP-3(500nM)為ADAM 12活性的有效抑制劑。
疾病進展中的ADAM 12水平分析了117份尿液樣品，包括46份來自健康年齡相當的女性志願者和71份來自已診斷患有各期乳腺癌患者的樣品。大部分來自癌症患者的樣品(圖1，表I)與其中ADAM 12以顯著低頻率檢測到的正常尿液比較為ADAM 12陽性。乳腺癌組(71份尿液中67份為陽性)中ADAM 12物質檢測頻率與對照組(15％)(46份中7份為陽性)比較較高(94％)。乳腺癌患者與對照組的尿液樣品在ADAM 12蛋白水平上也不同。健康個體和進展期乳腺癌患者的代表性尿液樣品的免疫印跡分析見圖2。ADAM 12條帶的光密度分析表明，疾病進展期的尿液ADAM 12水平增高。對照中檢出的ADAM 12極低或沒有ADAM12，稍高一點的蛋白水平與早期乳腺癌例如ADH/LCIS和DCIS相關，而在局部侵襲和轉移性疾病的患者尿液中可觀察到明顯較高的水平(圖3)。
統計分析ADAM 12陽性表達患者的百分比以及各組中位數水平見表I。將對照樣品的平均光密度值(12DU)設為閾值，相對於該對照組計算各癌症組的％陽性。如圖6所示，根據比較百分比，與對照比較在各乳腺癌組中ADAM 12表達具有明顯較高的個體比例(所有組P＜0.01)。表II列出了作為所有患者和各期癌症組的二分檢驗(根據陽性或陰性試驗結果)的ADAM 12診斷特徵。對於所有癌症患者，基於任意陽性表達水平ADAM 12靈敏度為0.94(95％置信區間0.86-0.98)，而特異性為0.61(46名對照中有28名)(95％置信區間0.46-0.75)。設定12DU閾值對所有癌症患者得到高得多的特異性，為0.85(46名對照中有39名)。根據117名個體中有95名正確地分類為病例或對照(95％置信區間0.73-0.88)，總準確度為0.81。計算的似然比(LR)為2.4，因為陽性測試結果表明，尿液ADAM 12的存在與高於2.4倍的個體有乳腺癌的可能性有關。所有71名癌症患者和46名對照的ADAM 12中位數水平分別為37(四分位數間距14-84)和0(四分位數間距0-7)(P＜0.001，Mann Whitney U-檢驗)。以經驗ADAM 12水平作為連續變量繪製出不同組包括所有癌症患者、ADH/LCIS患者、DCIS患者、IBC患者和轉移性疾病患者的受試者抽檢特徵(ROC)曲線以確定TPR(靈敏度)和FPR(1-特異性)之間的相互關係(數據未列出)。所有ROC曲線都顯示出極為明顯的區別，急劇地從45度斜線上升(即非歧視線)。ROC曲線作為區別正常對照與IBC女性患者的基礎，那些比較對照與轉移性疾病患者的ROC曲線的AUC最高(分別為0.90和0.92)，ADAM 12水平大於0，鑑別IBC患者和轉移性疾病患者的靈敏度很理想(即靈敏度＝1.00)。使用邏輯斯諦回歸分析導出基於ADAM 12水平的乳腺癌概率(圖7)。經驗ADAM 12水平以柱狀圖表示，具ADAM 12水平的女性病例和對照百分比繪在x-軸上。在46名對照中，28名(61％)的ADAM 12水平為0，而71名癌症患者僅4名(6％)的ADAM 12水平為0。另外，6名對照(13％)的ADAM 12水平超過20，而71名癌症患者中有46名(65％)的水平超過20。邏輯斯諦回歸確證ADAM 12水平與癌症概率(似然比檢驗＝34.62，P＜0.0001)之間高度顯著的直接關係。如圖7中的理論非線性曲線所指出，對於ADAM 12水平為0(即無表達)的個體，乳腺癌概率為32％，而當水平在1和20之間時為將近50％。模型預測，對於ADAM 12水平介於21和40之間乳腺癌概率為67％，當水平介於41和60之間為80％，水平介於61和80之間為90％，ADAM 12水平為81-100的個體為95％，而當水平超過100時為98％。
表I.乳腺癌患者和對照的ADAM12表達
ADH＝不典型導管增生，LCIS＝小葉原位癌，DCIS＝導管原位癌，IBC＝局部侵襲性乳腺癌，DU＝光密度單位，IQR＝四分位數間距。
表II.ADAM 12在不同乳腺癌患者和對照中的診斷特徵
ADH＝不典型導管增生，LCIS＝小葉原位癌，DCIS＝導管原位癌，IBC＝局部侵襲性乳腺癌，FNR＝假陰性率，FPR＝假陽性率 LR＝似然比。
下面引用的參考文獻及貫穿本說明書的參考文獻都通過引用全部結合到本文中。
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序列表110兒童醫療中心有限公司(CHILDREN』S MEDICAL CENTER CORPORATION)120上皮源性癌症的診斷及預後方法130701039-054481-PCT140PCT/US05/007141412005-01-1015060/535,3061512004-01-091601170PatentIn Ver.3.32101211909212PRT213智人(Homo sapiens)4001Met Ala Ala Arg Pro Leu Pro Val Ser Pro Ala Arg Ala Leu Leu Leu1 5 10 15Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu Ala Pro Cys Glu Ala Arg Gly Val Ser20 25 30Leu Trp Asn Gln Gly Arg Ala Asp Glu Val Val Ser Ala Ser Val Arg35 40 45Ser Gly Asp Leu Trp Ile Pro Val Lys Ser Phe Asp Ser Lys Asn His50 55 60Pro Glu Val Leu Asn Ile Arg Leu Gln Arg Glu Ser Lys Glu Leu Ile65 70 75 80Ile Asn Leu Glu Arg Asn Glu Gly Leu Ile Ala Ser Ser Phe Thr Glu85 90 95Thr His Tyr Leu Gln Asp Gly Thr Asp Val Ser Leu Ala Arg Asn Tyr100 105 110Thr Val Ile Leu Gly His Cys Tyr Tyr His Gly His Val Arg Gly Tyr115 120 125
Ser Asp Ser Ala Val Ser Leu Ser Thr Cys Ser Gly Leu Arg Gly Leu130 135 140Ile Val Phe Glu Asn Glu Ser Tyr Val Leu Glu Pro Met Lys Ser Ala145 150 155 160Thr Asn Arg Tyr Lys Leu Phe Pro Ala Lys Lys Leu Lys Ser Val Arg165 170 175Gly Ser Cys Gly Ser His His Asn Thr Pro Asn Leu Ala Ala Lys Asn180 185 190Val Phe Pro Pro Pro Ser Gln Thr Trp Ala Arg Arg His Lys Arg Glu195 200 205Thr Leu Lys Ala Thr Lys Tyr Val Glu Leu Val Ile Val Ala Asp Asn210 215 220Arg Glu Phe Gln Arg Gln Gly Lys Asp Leu Glu Lys Val Lys Gln Arg225 230 235 240Leu Ile Glu Ile Ala Asn His Val Asp Lys Phe Tyr Arg Pro Leu Asn245 250 255Ile Arg Ile Val Leu Val Gly Val Glu Val Trp Asn Asp Met Asp Lys260 265 270Cys Ser Val Ser Gln Asp Pro Phe Thr Ser Leu His Glu Phe Leu Asp275 280 285Trp Arg Lys Met Lys Leu Leu Pro Arg Lys Ser His Asp Asn Ala Gln290 295 300Leu Val Ser Gly Val Tyr Phe Gln Gly Thr Thr Ile Gly Met Ala Pro305 310 315 320Ile Met Ser Met Cys Thr Ala Asp Gln Ser Gly Gly Ile Val Met Asp325 330 335His Ser Asp Asn Pro Leu Gly Ala Ala Val Thr Leu Ala His Glu Leu340 345 350Gly His Asn Phe Gly Met Asn His Asp Thr Leu Asp Arg Gly Cys Ser355 360 365Cys Gln Met Ala Val Glu Lys Gly Gly Cys Ile Met Asn Ala Ser Thr370 375 380
Gly Tyr Pro Phe Pro Met Val Phe Ser Ser Cys Ser Arg Lys Asp Leu385 390 395 400Glu Thr Ser Leu Glu Lys Gly Met Gly Val Cys Leu Phe Asn Leu Pro405 410 415Glu Val Arg Glu Ser Phe Gly Gly Gln Lys Cys Gly Asn Arg Phe Val420 425 430Glu Glu Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Glu Pro Glu Glu Cys Met Asn435 440 445Arg Cys Cys Asn Ala Thr Thr Cys Thr Leu Lys Pro Asp Ala Val Cys450 455 460Ala His Gly Leu Cys Cys Glu Asp Cys Gln Leu Lys Pro Ala Gly Thr465 470 475 480Ala Cys Arg Asp Ser Ser Asn Ser Cys Asp Leu Pro Glu Phe Cys Thr485 490 495Gly Ala Ser Pro His Cys Pro Ala Asn Val Tyr Leu His Asp Gly His500 505 510Ser Cys Gln Asp Val Asp Gly Tyr Cys Tyr Asn Gly Ile Cys Gln Thr515 520 525His Glu Gln Gln Cys Val Thr Leu Trp Gly Pro Gly Ala Lys Pro Ala530 535 540Pro Gly Ile Cys Phe Glu Arg Val Asn Ser Ala Gly Asp Pro Tyr Gly545 550 555 560Asn Cys Gly Lys Val Ser Lys Ser Ser Phe Ala Lys Cys Glu Met Arg565 570 575Asp Ala Lys Cys Gly Lys Ile Gln Cys Gln Gly Gly Ala Ser Arg Pro580 585 590Val Ile Gly Thr Asn Ala Val Ser Ile Glu Thr Asn Ile Pro Leu Gln595 600 605Gln Gly Gly Arg Ile Leu Cys Arg Gly Thr His Val Tyr Leu Gly Asp610 615 620Asp Met Pro Asp Pro Gly Leu Val Leu Ala Gly Thr Lys Cys Ala Asp625 630 635 640Gly Lys Ile Cys Leu Asn Arg Gln Cys Gln Asn Ile Ser Val Phe Gly
645 650 655Val His Glu Cys Ala Met Gln Cys His Gly Arg Gly Val Cys Asn Asn660 665 670Arg Lys Asn Cys His Cys Glu Ala His Trp Ala Pro Pro Phe Cys Asp675 680 685Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ser Thr Asp Ser Gly Pro Ile Arg Gln Ala690 695 700Asp Asn Gln Gly Leu Thr Ile Gly Ile Leu Val Thr Ile Leu Cys Leu705 710 715 720Leu Ala Ala Gly Phe Val Val Tyr Leu Lys Arg Lys Thr Leu Ile Arg725 730 735Leu Leu Phe Thr Asn Lys Lys Thr Thr Ile Glu Lys Leu Arg Cys Val740 745 750Arg Pro Ser Arg Pro Pro Arg Gly Phe Gln Pro Cys Gln Ala His Leu755 760 765Gly His Leu Gly Lys Gly Leu Met Arg Lys Pro Pro Asp Ser Tyr Pro770 775 780Pro Lys Asp Asn Pro Arg Arg Leu Leu Gln Cys Gln Asn Val Asp Ile785 790 795 800Ser Arg Pro Leu Asn Gly Leu Asn Val Pro Gln Pro Gln Ser Thr Gln805 810 815Arg Val Leu Pro Pro Leu His Arg Ala Pro Arg Ala Pro Ser Val Pro820 825 830Ala Arg Pro Leu Pro Ala Lys Pro Ala Leu Arg Gln Ala Gln Gly Thr835 840 845Cys Lys Pro Asn Pro Pro Gln Lys Pro Leu Pro Ala Asp Pro Leu Ala850 855 860Arg Thr Thr Arg Leu Thr His Ala Leu Ala Arg Thr Pro Gly Gln Trp865 870 875 880Glu Thr Gly Leu Arg Leu Ala Pro Leu Arg Pro Ala Pro Gln Tyr Pro885 890 895His Gln Val Pro Arg Ser Thr His Thr Ala Tyr Ile Lys900 90權利要求
1.一種幫助診斷上皮源性癌症患者的方法，該方法包括a.獲得患者的生物樣品；和b.檢測所述生物樣品中是否存在解聯蛋白和金屬蛋白酶結構域12(ADAM 12)；其中存在ADAM 12說明存在上皮源性癌症。
2.權利要求1的方法，其中所述生物樣品選自血液、組織、血清、尿液、大便、痰液、腦脊液、乳頭吸出液和來自細胞裂解物的上清液。
3.權利要求1的方法，其中所述生物樣品為尿液。
4.一種診斷患者上皮源性癌症的方法，該方法包括a.測量來自所述患者的試驗樣品中存在的ADAM 12水平b.將所述試驗樣品中的ADAM 12水平與對照樣品中存在的ADAM 12水平進行比較；其中試驗樣品中的ADAM 12水平高於對照樣品中的ADAM 12水平，說明存在上皮源性癌症。
5.權利要求4的方法，其中所述試驗樣品和所述對照樣品選自血液、組織、血清、尿液、大便、痰液、腦脊液、乳頭吸出液和來自細胞裂解物的上清液。
6.權利要求4的方法，其中所述試驗樣品和對照樣品為尿液。
7.一種用於懷疑患有或患有上皮源性癌症的患者預後評價的方法，該方法包括a.測量從所述患者獲得的試驗樣品中存在的ADAM 12水平；b.將步驟(a)所測定的水平與對照樣品中的ADAM 12水平進行比較；和c.根據步驟(b)的比較評價所述患者的預後，其中所述試驗樣品中的ADAM 12水平是對照樣品中的ADAM 12水平的至少3倍，說明存在攻擊形式的癌症，因此預後不良。
8.權利要求7的方法，其中所述試驗樣品選自血液、組織、血清、尿液、大便、痰液、腦脊液、乳頭吸出液和來自細胞裂解物的上清液。
9.權利要求1、4或7中任一項的方法，其中所述上皮源性癌症選自乳腺癌、基底細胞癌、腺癌、胃腸癌、唇癌、口腔癌、食管癌、小腸癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、皮膚癌、前列腺癌和腎細胞癌。
10.權利要求1的方法，其中用特異性結合ADAM 12的基於抗體的結合部分檢測ADAM 12的存在與否。
11.權利要求4-7中任一項的方法，其中所述ADAM 12水平通過測量ADAM 12蛋白水平來測量。
12.權利要求11的方法，其中所述ADAM 12蛋白水平通過包括下述步驟的方法來測量a.使所述試驗樣品或其製備物與特異性結合ADAM 12的基於抗體的結合部分接觸，以形成抗體-ADAM 12複合物；和b.檢測所述複合物的存在，由此來測量存在的ADAM 12水平。
13.權利要求10或12的方法，其中所述基於抗體的結合部分用可檢測標記物來標記。
14.權利要求13的方法，其中所述標記物選自放射性標記物、半抗原標記物、螢光標記物和酶標記物。
15.權利要求10或12的方法，其中所述基於抗體的結合部分為抗體。
16.權利要求15的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
17.一種檢測尿液樣品ADAM 12的試劑盒，該試劑盒包括裝有尿液樣品和至少一種特異性結合ADAM 12的抗體的容器。
18.權利要求17的試劑盒，其中所述試劑盒包含兩種與ADAM 12特異性結合的抗體，其中一種抗體固定在固相上，另一種抗體被可檢測地標記。
19.權利要求17的試劑盒，該試劑盒還包括使用說明書。
全文摘要
上皮源性癌症例如乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌和皮膚癌以及其它癌症的患者的ADAM12表達及活性被上調。因此，本發明涉及上皮源性癌症預後評價及診斷的方法。具體地說，生物樣品中存在ADAM 12說明存在上皮源性癌症。另外，在生物樣品例如尿液中所檢測到的ADAM 12蛋白量與疾病狀態有關，因此ADAM 12水平可用於預測癌症的存在及其轉移潛力。因此，測量生物樣品(例如尿液或血液)中ADAM 12的水平，提供了快速、方便、安全的篩選，這既可用於診斷又可用於預測患者的癌症。
文檔編號C07K14/00GK1930461SQ200580007273
公開日2007年3月14日 申請日期2005年1月10日 優先權日2004年1月9日
發明者M·A·莫塞斯, R·羅伊 申請人:兒童醫療中心有限公司