菌根真菌在金線蓮栽培中的應用技術的製作方法

2023-10-06 21:38:14 2

專利名稱：菌根真菌在金線蓮栽培中的應用技術的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種金線蓮菌根栽培技術，具體地說涉及一種菌根真菌在金線蓮栽培中的應用技術，它包括本發明所用的菌根真菌、菌根真菌的培養、金線蓮芽增殖分化和叢芽形成苗及苗繼代的最佳培養基、菌根真菌在金線蓮栽培中的應用技術和對金線蓮苗的促生長效果及對金線蓮苗有效成分含量的影響。
金線蓮生於海拔400-1200米之間的闊葉林或針闊葉混交林中，一般生長在通風良好、溼度高、光線較弱的山澗常綠闊葉林下，石壁、溝邊、巖縫等陰溼地帶。由於該種植物分布範圍較窄，儲量極為稀少。從1990年開始，福建省科委、教委和林業廳陸續設立專項基金進行金線蓮的組織培養及栽培技術研究。目的是為提高金線蓮繁殖速度與進行人工栽培奠定基礎。試管苗快速繁殖雖然獲得了成功，但試管苗出瓶後成活率低、生長緩慢、生長周期長和有效成分含量低成為制約金線蓮擴大栽培的主要障礙。為此，目前金線蓮仍未大面積人工栽培繁殖。
由於金線蓮自然生態條件獨特，繁殖率低，生長緩慢，加上鳥類嗜食，特別是近年來對該植物需求量猛增，產區人們過度採控，使得金線蓮野生資源日漸枯竭。在金線蓮菌根研究方面，僅江海燕等觀察到有真菌侵染金線蓮種子的現象；我們在野生金線蓮的根中也觀察到有真菌的存在，並從該類植物中分離出多種內生真菌。實現金線蓮栽培從實驗室到工廠化到田間的轉化的關鍵技術，是首先需要解決的問題，而利用菌根技術將金線蓮與菌根真菌共生培養，篩選出促進金線蓮生長發育有效的優良菌株，對保存金線蓮種質資源、提高藥效，開闢金線蓮大面積栽培繁殖的新途徑具有重大理論意義和應用價值。
為實現上述目的，本發明採用的技術是先分別培養菌根真菌和金線蓮幼苗，再將菌根真菌與金線蓮幼苗共生栽培，能夠完成本發明的菌根真菌是一種小菇屬(Mycena)真菌，具體為石斛小菇(Mycena dendrobii)，紫萁小菇(Mycena osmundicola)，蘭小菇(Mycena orchidicola)，開唇蘭小菇(Mycena anoectochila)等4種。這4種真菌可以從鐵皮石斛、天麻、墨蘭和花葉開唇蘭獲得，於2002年1月14日在中國微生物菌種保藏管理委員會保藏，保藏編號為0685、0689、0688、0687。
具體地說，本發明所述技術的步驟方法如下(除有特殊說明外，本發明中所述的比例均為重量百分比)1、菌根真菌的培養將上述的菌根真菌自低溫保藏的斜面試管菌種活化後，分別轉接於PDA平皿中，於25℃恆溫培養12-20d，分別在菌落邊緣打孔成菌片，並以小碎塊接入液體或固體培養基；菌根真菌的液體培養為培養基的配製葡萄糖2.5％；KH2PO40.15％；K2HPO40.1％；MgSO40.15％；天然物麥麩3％(煮汁)。高壓滅菌後分別接入上述真菌。培養條件培養基pH5.6；三角瓶搖床培養瓶裝量50％；轉速120轉/分鐘；23℃培養30天收穫。發酵罐培養接種量10％，其餘參數同上。發酵培養結束時收穫發酵物，用勻漿機打碎菌體及發酵物備用。
菌根真菌的固體培養為培養基的配製闊葉樹鋸末∶麥麩∶玉米粒＝1∶1∶0.5，加水量為原料的150-250％。高壓滅菌後分別接入上述真菌。待菌絲從培養基頂部長入底部時(2個月左右)取出備用。
本發明可以採用上述4種菌根真菌中的任選一種，也可以是由其中任意兩種或兩種以上菌種組成。
2、金線蓮苗的培養芽增殖培養基MS(Murashige and Skoog 1968)培養基加6-BA(6-苄基嘌呤1.2mg/L、NAA(萘乙酸)0.6mg/L；叢芽增殖培養基MS為基本培養基6-苄基嘌呤(BA)1.5mg/L，吲哚丁酸(IBA)0.6mg/L，玉米素(ZT)0.15mg/L；苗繼代培養基1/2MS，200g/L馬鈴薯提取液，25g/L蔗糖，瓊脂9g/L，pH5.8；3、菌根真菌與金線蓮苗共生栽培(1)金線蓮栽培基質蛭石∶砂子(4∶1)或森林腐殖土∶砂子(6∶1)或泥炭土∶砂子(5∶1)或泥炭土∶砂子∶蛭石(4∶1∶2)。其中以泥炭土∶砂子∶蛭石(4∶1∶2)或森林腐殖土∶砂子(6∶1)為佳。
(2)金線蓮菌根共生栽培栽培工具各種硬質材料的託盤或花盆，立體栽培；硬質材料包括木製、不鏽鋼、塑料、玻璃、陶瓷等。在其容器的基部平鋪一層2-3釐米厚的基質，其上株行距各5-8釐米栽培一株或2-3株一叢的金線蓮苗，栽前每一株或一叢苗根的基部放置少量粉碎至0.5-1釐米大小的溼櫟樹(山毛櫸科Fagaceae)樹葉，其上再放以上備好的液體菌根真菌2ml或固體菌根真菌1-2g。使金線蓮的根與菌接觸，用栽培基質將苗埋好，覆蓋基質厚度視金線蓮幼苗的高度而定，一般2-3釐米厚。栽後澆放置至室溫的自來水即可。
(3)栽培條件一般塑料薄膜溫室、玻璃溫室、露天栽培遮陽網遮陰均可採用菌根栽培方法栽培金線蓮。栽培金線蓮適宜的環境溫度為18-25℃，光照量為正常日光量的1/3，照度2000Lx。
(4)金線蓮的收穫金線蓮一般栽後4-6個月收穫。收穫時即可剪取地上部分，也可一次性連根取出洗淨栽培基質。陰乾或60℃以下烘乾。
本發明提供的栽培技術，金線蓮生長周期可由傳統栽培的12個月縮短到4至6個月；產量提高20-40％；與不接菌根真菌栽培的金線蓮苗(對照)相比，該項技術使金線蓮苗中總糖含量提高60％，使苗中皂甙含量提高28％；生物鹼含量提高1.4倍。
(2)液體培養基的配製葡萄糖2.5％；KH2PO40.15％；K2HPO40.1％；MgSO40.15％；天然物麥麩3％(煮汁)。
(3)培養條件高壓滅菌後分別接入上述真菌，其培養條件培養基pH5.6；三角瓶搖床培養瓶裝量50％；轉速120轉/分鐘；溫度23℃；培養30天收穫。發酵罐培養接種量10％，其餘參數同上。發酵培養結束時收穫發酵物，用勻漿機打碎菌體及發酵物備用。
2、金線蓮芽分化發生過程莖段接種7天即可見節部腋葉對側生出乳白色顆粒，此為氣生根原基；少數莖段節間腋內分化出乳白色顆粒，此為腋芽原基。腋芽與根的最初萌生階段形態極為相似，均為乳白色顆粒，二者在節部相對而生，這一時期莖段有膨大現象。培養10d時多數莖段節部腋內鼓出乳白色顆粒，有的乳白色顆粒長至圓錐狀。腋葉對生的乳白色顆粒伸長成為根。當乳白色顆粒長至3mm左右長、1.5mm左右粗時，頂部出現芽尖，下部長成為淺綠莖，此為主芽。隨著主芽莖葉的生長，當主芽具有2-3節時，從其基部節開始分化一級側芽，其上可發出二級側芽，二級側芽上又可再生三級側芽、四級側芽。側芽一般先從上一級芽的最下部節發出，其次是下數第二節部。在分化能力強的培養基中，可出現多級側芽，且可見多級側芽同時生長分化，莖尖側芽的發生早於莖段。
3、激素對芽增殖分化的影響MS培養基不能誘導金線蓮芽增殖。當培養115天時，在MS(Murashige and Skoog 1968)培養基附加6-BA(6-苄基嘌呤)1.0mg/L時，誘導金線蓮莖段、莖尖芽增殖數最多，其主芽及莖尖一般都能產生2-4級分枝。
在MS培養基附加6-BA 1.2mg/L、NAA(萘乙酸)0.6mg/LNAA誘導的莖段、莖尖芽增殖數最多，分別為對照的3.7倍和3.6倍。截取芽頂部2-2.5cm轉接到MS培養基中，10後天即可生根，25天成為完整苗。
4、激素對叢芽形成的影響以福建野生金線蓮的頂芽、側芽或休眠芽為材料快速繁殖，以MS為基本培養基，附加不同的激素和不同濃度配比，結果表明，當細胞分裂素6-苄基嘌呤(BA)1.5mg/L，生長素吲哚丁酸(IBA)0.6mg/L，再附加玉米素(ZT)0.15mg/L時，對叢芽的形成和生長達最佳效果。以快速繁殖的叢芽作為外植體，切取單芽或叢芽接種生根培養基上，40天後，可生根形成幼芽。
5、金線蓮苗的繼代培養金線蓮(Anoectochilus roxburghii)材料為組織培養獲得的無菌苗，其繼代培養為將金線蓮苗轉入有培養基的三角瓶中，培養基組成為1/2MS(主要指大量和微量元素)，200g/L馬鈴薯提取液+25g/L蔗糖，瓊脂9g/L，pH5.8。121℃高壓滅菌30分鐘。每瓶接3株苗，培養溫度24℃，每日光照10小時，光強為100Lx。培養至莖粗0.15釐米，株高6釐米以上，具有4片葉，2-3條根長1釐米的壯苗(40天後)即可進行栽培。
6、石斛小菇真菌與金線蓮幼苗共生栽培(1)金線蓮栽培基質泥炭土∶砂子∶蛭石(4∶1∶2)；(2)栽培方法栽培工具為15釐米高的不鏽鋼託盤，立體栽培；在其容器的基部平鋪一層2-3釐米厚的基質，其上株行距各5-8釐米栽培一株或2-3株一叢的金線蓮苗，栽前每一株或一叢苗根的基部放置少量粉碎至0.5-1釐米大小的溼櫟樹(山毛櫸科Fagaceae)樹葉，其上再放以上備好的液體石斛小菇真菌2ml，使金線蓮的根與菌接觸，用栽培基質將苗埋好，覆蓋基質厚度視金線蓮幼苗的高度而定，一般2-3釐米厚。栽後澆放置至室溫的水。
(3)栽培條件塑料薄膜溫室，環境溫度為18-25℃，光照量為正常日光量的1/3，最忌夏秋中午前後的直射光，栽培地需架設遮陽網。金線蓮生長需較高的空氣溼度，土壤不宜積水。其空氣溫度夏天應控制在25℃以下，冬天應控制在18℃以上。每天光照11h，光照量為正常日光量的1/3；避免直射光；照度2000Lx。
(4)金線蓮的收穫栽後5個月收穫，收穫時即可剪取地上部分，也可一次性連根取出洗淨栽培基質。陰乾或60℃以下烘乾。
實施例二本實施例操作條件基本同實施例一，不同之處是
1、本實施例所用的菌根真菌為石斛小菇、紫萁小菇、蘭小菇和開唇蘭小菇。
2、採用固體培養基，該培養基的配製闊葉樹鋸末∶麥麩∶玉米粒＝1∶1∶0.5，加水量為原料的200％。高壓滅菌後分別接入上述4種真菌。待菌絲從培養基頂部長入底部時(1.5個月左右)取出備用。
比較例1、菌根真菌對金線蓮苗的促生長效果菌根真菌對金線蓮苗的促生長作用菌根真菌促進金線蓮苗增高作用與未接菌的金線蓮苗(對照)相比，所有小菇屬這些菌根真菌均有促進金線蓮苗增高作用，增高效果在30％-60％；增重在20％-40％。
真菌以菌絲結形式定殖於根表皮細胞及少數皮層最外一層細胞內，植株根淺黃褐色，為蘭科植物菌根特徵，真菌與金線蓮建立了良好的共生關係，並形成了菌根。菌根真菌不但可促進植物生長，同時還可防止植物致病菌對其汙染，因為這些真菌常可產生抗生素類物質，為金線蓮植株的生長創造一個良好微環境。
2、菌根真菌對金線蓮苗有效成分含量的影響我們根據蘭科植物幾乎均與真菌形成菌根關係的特點，自1994年開始，從自然生長的金線蓮根中分離了多種菌根真菌，經篩選發現有兩種真菌對金線蓮苗生長有顯著促進作用。在此基礎上，為確保金線蓮藥材質量，我們較系統對金線蓮與菌根真菌共培養不同時期苗中所含的幾種主要化學成分進行了含量分析，結果表明在栽培方法完全一致的情況下，與不接菌根真菌栽培的金線蓮苗(對照)相比，菌根真菌使金線蓮苗中總糖含量提高60％，使苗中皂甙含量提高28％；生物鹼含量提高1.4倍。菌根真菌對金線蓮苗吸收其餘8種元素的量均有提高作用。上述結果為在菌根真菌促進金線蓮苗生長作用基礎上，為今後菌根真菌在金線蓮大規模栽培中應用，保證藥材質量提供了科學依據。
糖類成分是金線蓮藥材質量優劣的評價指標之一。不論葡萄糖還是總糖含量，接菌根真菌均明顯促進金線蓮苗中糖的含量，而且隨培養時間的延長呈明顯的遞增關係，表明菌根真菌不但促進金線蓮生長，而且對糖類成分的合成也有正效應。值得注意的是，這兩種促生菌根真菌對金線蓮苗的次生代謝產物皂甙和生物鹼合成也有顯著促進作用，有資料報導這兩種化合物是金線蓮藥材的主要成分之一。
從上述比較例可以顯然看出，本發明有如下優點小菇屬這4種真菌對金線蓮的生長發育均有明顯促進作用；採用該項新技術，可大大縮短金線蓮的生長周期；提高金線蓮產量和有效成分含量。另外，該項技術栽培方法簡單、投資少、不施任何肥料和農藥，為綠色產品；還為今後金線蓮大規模產業化生產提供了科學依據。
權利要求
1.一種菌根真菌在金線蓮栽培中的應用技術，採用小菇屬4種真菌石斛小菇(Mycena dendrobii)、紫萁小菇(Mycenaosmundicola)、蘭小菇(Mycena orchidicola)、開唇蘭小菇(Mycena anoectochila)中的任選一種或由其中任意兩種或兩種以上組成，其主要步驟及條件如下(所述比例均為重量百分比)(1)菌根真菌的培養將上述的菌根真菌自低溫保藏的斜面試管菌種活化後，分別轉接於PDA平皿中，於25℃恆溫培養12-20d，分別在菌落邊緣打孔成菌片，並以小碎塊接入液體培養基進行培養和發酵或接入固體培養基進行培養；(2)金線蓮苗的培養芽增殖培養基MS(Murashige and Skoog 1968)培養基，附加6-BA(6-苄基嘌呤1.2mg/L、NAA(萘乙酸)0.6mg/L；叢芽增殖培養基MS為基本培養基，附加6-苄基嘌呤(BA)1.5mg/L，吲哚丁酸(IBA)0.6mg/L，玉米素(ZT)0.15mg/L；苗繼代培養基1/2MS，200g/L馬鈴薯提取液，25g/L蔗糖，瓊脂9g/L，pH5.8；(3)菌根真菌與金線蓮苗共生栽培(a)金線蓮栽培基質蛭石∶砂子＝4∶1或森林腐殖土∶砂子＝6∶1或泥炭土∶砂子＝5∶1或泥炭土∶砂子∶蛭石＝4∶1∶2；(b)金線蓮菌根共生栽培在硬質材料的託盤或盆中立體栽培，其容器的基部平鋪一層金線蓮栽培基質，其上按株行距栽培一株或一叢的金線蓮苗，在苗根的基部放置少量粉碎的溼櫟樹(山毛櫸科Fagaceae)樹葉，其上再放以上備好的液體菌根真菌2ml或固體菌根真菌1-2g，使金線蓮的根與菌接觸，用栽培基質將苗覆蓋2-3釐米厚，澆放置至室溫的水；(c)栽培條件採用塑料薄膜溫室、玻璃溫室、露天栽培遮陽網遮陰，環境溫度為18-25℃，光照量為正常日光量的1/3，照度2000Lx；(d)金線蓮的收穫收穫時可剪取地上部分，也可一次性連根取出洗淨栽培基質；陰乾或60℃以下烘乾；其中所述的菌根真菌的液體培養為培養基的配製葡萄糖2.5％；KH2PO40.15％；K2HPO40.1％；MgSO40.15％；天然物麥麩3％(煮汁)，高壓滅菌後分別接入上述真菌；培養條件培養基pH5.6；三角瓶搖床培養瓶裝量50％；轉速120轉/分鐘；23℃培養30天；發酵罐培養接種量10％，其餘參數同上；發酵培養結束時將發酵物用勻漿機打碎菌體及發酵物備用；其中所述的菌根真菌的固體培養為培養基的配製闊葉樹鋸末∶麥麩∶玉米粒＝1∶1∶0.5，加水量為原料的150-250％，高壓滅菌後分別接入上述真菌，待菌絲從培養基頂部長入底部時取出備用。
2.如權利要求1所述的菌根真菌在金線蓮栽培中的應用技術，其特徵在於，所述金線蓮栽培基質為泥炭土∶砂子∶蛭石＝4∶1∶2或森林腐殖土∶砂子＝6∶1。
3.如權利要求1所述的菌根真菌在金線蓮栽培中的應用技術，其特徵在於，所述栽培工具為各種硬質材料的託盤或花盆。
4.如權利要求1或3所述的菌根真菌在金線蓮栽培中的應用技術，其特徵在於，所述硬質材料包括木製、不鏽鋼、塑料、玻璃或陶瓷。
5.如權利要求1所述的菌根真菌在金線蓮栽培中的應用技術，其特徵在於，所述容器基部平鋪金線蓮栽培基質為2-3釐米厚。
6.如權利要求1所述的菌根真菌在金線蓮栽培中的應用技術，其特徵在於，所述株行距為各5-8釐米栽培一株或2-3株一叢。
7.如權利要求1所述的菌根真菌在金線蓮栽培中的應用技術，其特徵在於，所述粉碎的溼櫟樹葉為0.5-1釐米大小。
8.如權利要求1所述的菌根真菌在金線蓮栽培中的應用技術，其特徵在於，所述室溫的水為放置至室溫的自來水。
9.如權利要求1所述的菌根真菌在金線蓮栽培中的應用技術，其特徵在於，所述金線蓮的收穫為栽培後的4-6個月。
全文摘要
一種菌根真菌在金線蓮栽培中的應用技術，所用的小菇屬4種真菌石斛小菇(Mycena dendrobii)，紫萁小菇(Mycena osmundicola)，蘭小菇(Mycena orchidicola)，開唇蘭小菇(Mycena anoectochila)；先分別培養菌根真菌和金線蓮幼苗，再將菌根真菌與金線蓮幼苗共生栽培。採用該項新技術，可大大縮短金線蓮的生長周期；提高金線蓮產量和有效成分含量。該項技術栽培方法簡單、投資少、不施任何肥料和農藥，生產出的金線蓮為綠色產品。
文檔編號A01H17/00GK1433670SQ02100779
公開日2003年8月6日 申請日期2002年1月25日 優先權日2002年1月25日
發明者郭順星, 於雪梅, 高微微, 肖培根 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所