一株農藥殘留廣譜降解菌株DS3及其生產的菌劑和應用的製作方法
2023-10-06 21:46:14 3
本發明涉及環境汙染微生物修復，具體涉及一株農藥殘留廣譜降解菌株ds3及其生產的菌劑和應用。
背景技術：
化學農藥作為保障農業豐收的重要手段，在農業生產中發揮著非常重要的作用。然而由於人們長期對化學農藥的不科學使用，以及化學農藥在施用過程中利用率很低，使得化學農藥在應用過程中，僅有小部分藥劑可以附著於植物上發揮作用，其餘大部分散落在大氣、土壤和水體等生態環境中。農藥使用沒有被分解而殘留於生物體、收穫物、土壤、水體、大氣中的農藥原體，降解物，有毒代謝物和雜質等稱為農藥殘留。殘留在環境中，汙染了土壤、水體等生態系統中的農藥不僅會造成環境汙染，而且會通過食物鏈富集，最終進入人體，嚴重危害了人類的健康，近年來越來越多的農藥殘留使人中毒事件發生，造成了極其嚴重的不良後果。因此，需要進一步研究有關農藥殘留的降解，來解決農藥殘留問題。
在當今農藥生產中，有機磷農藥是其主要類別之一，國內外都在大量生產和廣泛使用。目前全球與有機磷農藥相關的商品已達到150多種，在我國被廣泛應用於農業生產的除草劑、殺蟲劑和殺菌劑等有機磷農藥約有30種。雖然有機磷農藥有效地提高了農作物的產量，但同時由於其大量不合理的使用，使得在蔬菜、瓜果、糧食等農產品和土壤中都發現了有機磷農藥殘留甚至嚴重超標的現象。
二苯醚類除草劑是由美國ppg工業公司開發的一類高效除草劑，廣泛用於禾穀類作物、玉米、棉花、水稻、大豆和花生田防除闊葉雜草。該類除草劑的作用靶標是雜草的原卟啉原氧化酶，通過抑制其催化的氧化反應導致光依賴的膜脂過氧化，最終造成靶標雜草的死亡。隨著二苯醚類除草劑的大量使用，在土壤、地下水及河流中都有殘留，對環境生物造成潛在威脅。此外，高劑量的二苯醚類除草劑對人體具有致癌性。
芳氧苯氧丙酸酯類除草劑(aopp)是防除禾本科雜草的一類雜環、含氟、光學活性除草劑。它是由赫司特公司首先開發的，在2，4-滴的基礎上進一步優化發展而成。此類除草劑主要作為莖葉處理劑，在中國廣泛地用於闊葉作物防除一年生和多年生的禾本科雜草。芳氧苯氧丙酸酯類除草劑被用來控制稻田中禾本科雜草，其大規模使用導致環境中土壤、地下水大量殘留。
生物修復是利用生物特別是微生物的生命代謝活動將有機農藥降解為無公害的無機物(二氧化碳和水)或其他無害的代謝產物，使受農藥汙染土壤部分或者完全地恢復到健康狀態。它被公認為具有安全、有效、低耗和環保等顯著優點，已經成為研究農藥修復的熱點。生物修復過程中的微生物主要有3種類型：土著微生物、基因工程菌和外來微生物。已報導的能有效降解農藥的微生物包括細菌、放線菌、真菌、藻類等。細菌由於容易誘變和適應性強等特性而在生物修復中佔據主導地位。
目前關於鞘脂菌(sphingobiumsp.)農藥降解菌株已有一些報導到，但是這些農藥降解菌株都是效果單一，一般能降解一種類型的農藥，缺乏廣譜性，主要集中在單一的有機磷類、醯胺類或者菊酯類農藥。例如專利(cn102757915b)一種氯代乙醯胺類除草劑降解菌及其生產的菌劑和應用，公開了鞘脂菌(sphingobiumsp.)dc-3可以降解乙草胺、丁草胺等醯胺類農藥殘留；cloningofanovelpyrethroid-hydrolyzingcarboxylesterasegenefromsphingobiumsp.strainjz-1andcharacterizationofthegeneproduct.(appliedenvironmentalmicrobiology,2009,75(17):5496-500)，公開了在sphingobiumsp.jz-1克隆到對菊酯類農藥降解的基因。
技術實現要素：
發明目的：針對現有技術存在的問題，本發明提供一株農藥殘留廣譜降解菌株ds3，該菌株對於有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農藥殘留都可以進行有效地降解，具有農藥殘留廣譜降解性。
本發明的另一目的是提供該農藥殘留廣譜降解菌株生產的降解菌劑及其應用；該菌株製備的降解菌劑可在短時間內使土壤或水體環境中殘留的有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農藥。
技術方案：為了實現上述目的，如本發明所述的一株農藥殘留廣譜降解菌株ds3，經鑑定為鞘脂菌(sphingobiumsp.)，已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏時間為2017年6月5日，保藏編號為cctccno:m2017305。
本發明所述的菌株ds3在降解有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農藥殘留中的應用。
進一步地，所述菌株ds3可以降解土壤或水體環境中有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農藥殘留。
所述有機磷類農藥包括久效磷、毒死蜱、三唑磷、甲基對硫磷、敵敵畏等。
所述二苯醚類農藥包括乙羧氟草醚、氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、乳氟禾草靈等。
所述芳氧苯氧羧酸酯類農藥包括氰氟草酯、精惡唑禾草靈、精吡氟禾草靈、精喹禾靈、炔草酯等。
本發明所述的菌株ds3生產的降解菌劑。
本發明所述的降解菌劑的製備方法，包括如下步驟：
(1)將降解菌株ds3培養到對數期的試管液按發酵培養基體積的0.5-1％接種於發酵培養基中，培養至對數期，製得發酵菌種；
(2)將上述製得發酵菌種按種子罐的培養基體積的5-10％接種於種子罐的培養基中，培養至對數生長期，製得種子液；
(3)將種子液按生產罐的培養基體積的5-10％接種於生產罐的培養基中培養發酵，發酵完成後的培養液即為即為降解菌劑。
其中，步驟(2)和步驟(3)所述培養過程中每分鐘無菌空氣的通氣量為1:(1-0.8)，攪拌速度為150-180rpm，培養溫度為27-30℃。
其中，步驟(3)所述培養發酵時間為30-48小時。
進一步地，步驟(3)所述發酵完成後的培養液中菌體數量達到10億個/ml以上。
其中，發酵培養基、種子罐的培養基、生產罐的培養基配方相同，均為葡萄糖0.1wt％、nacl1.0wt％、蛋白腖0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶劑為蒸餾水，ph7.2-7.5。
本發明所述的降解菌劑在降解有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農藥殘留中的應用。
進一步地，所述降解菌劑可以降解土壤或水體環境中有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農藥殘留。
有益效果：與現有技術相比較，本發明經分離篩選獲得農藥殘留廣譜降解菌株ds3可以有效地降解有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農藥殘留；能將無機鹽培養基中的有機磷類如久效磷、二苯醚類如乙羧氟草醚、芳氧苯氧羧酸酯類如氰氟草酯的殘留都降解90％以上，同時該菌株製備的降解菌劑能在短時間內降解土壤或水體中高濃度的有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類殘留達87％以上，解決殘留有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類對土壤水體環境、農作物和人體健康的危害問題。
本發明的降解菌劑可以用發酵工業通用發酵設備進行生產，具有生產成本低，使用方便，去除效果好的優點，適用於有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農藥殘留汙染的土壤與水體修復；本發明對於保護生態環境，降低農藥殘留對農作物藥害，保護人體的身體健康具有重要的意義。
附圖說明
圖1為本發明菌株ds3的菌落照片；
圖2為本發明菌株ds3的電鏡圖；
圖3為本發明菌株ds3降解久效磷的hplc分析圖譜(a：ck；b：24h處理)；
圖4為本發明菌株ds3降解乙羧氟草醚的hplc分析圖譜(a：ck；b：24h處理)；
圖5為本發明菌株ds3降解氰氟草酯的hplc分析圖譜(a：ck；b：24h處理)。
具體實施方式
以下結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
實施例1
菌株ds3的分離和鑑定：
用來富集降解菌株的富集基質取自上海亞農農藥化工有限公司的廢水生化處理池的活性汙泥，取15g汙泥樣品置於100ml添加含有100mg/l乙羧氟草醚、100mg/l久效磷和100mg/l氰氟草酯的無機鹽液體培養基(nh4no31.0g，k2hpo41.5g，kh2po40.5g，mgso40.2g，nacl1.0g，水1000ml，ph7.0-7.2)中，30℃、150r/min培養7天，以5％的接種量轉接到相同的添加50mg/l乙羧氟草醚的無機鹽液體培養基，連續轉接4次。通過紫外分光光度計和液相色譜法測定富集液乙羧氟草醚降解效果，獲得有降解效果的富集液。取0.5ml有效果的富集液，10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋，每個梯度的稀釋富集液取100μl塗布在含有100mg/l乙羧氟草醚、100mg/l久效磷和100mg/l氰氟草酯的無機鹽固體培養基平板上，30℃培養7d。挑取平板上長出的單菌落接種於液體lb培養基(蛋白腖10g，酵母膏5g，nacl5g，水1000ml，ph7.0-7.2)試管中，30℃、165r/min培養2天，取1mllb培養液，5000rpm離心5min，無菌水洗去lb培養基後，取1ml無菌水重懸菌體，分別接種至加有含有100mg/l乙羧氟草醚、100mg/l久效磷和100mg/l氰氟草酯的無機鹽液體培養基中，30℃、165r/min培養3d，通過紫外分光光度計和高效液相色譜分別檢測三種農藥降解效果。對三種農藥均有降解效果的菌株即為降解菌株。
紫外分光光度計降解效果的驗證方法：採用uv-1700微量紫外分光光度計分別測定乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯的質量濃度。往待測降解菌液中加入等量體積的二氯甲烷，劇烈振蕩5-10min，然後靜置直到水相和有機相完全分層，吸取下層水相，保留有機相，下層水相再一次用等體積的二氯甲烷萃取，兩次得到的有機相經無水硫酸鈉去除殘留的水分後，於紫外-可見分光光度計上在波長200-350nm範圍內進行掃描。通過乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯在200nm-350nm處的特徵吸收峰峰值的高低來分別判斷降解液中三種農藥濃度的高低。
高效液相色譜降解效果的驗證方法：在培養液中加入等體積的二氯甲烷進行全量提取，劇烈振蕩後靜置分層，然後取1ml下層二氯甲烷揮發完全後，加入1ml甲醇溶解(色譜純)，用濾膜(孔徑0.22μm)過濾。採用紫外和高效液相色譜分別測定提取液中乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯的含量，液相色譜條件：流動相已腈：水(50：5，v/v)，zorbaxc218odsspherex反相柱(5μm，4.6mm×250mm，agilent，usa)，柱溫為40℃，pda檢測器，測定波長230或280nm，進樣量10μl，流速為1.0ml·min-1。外標法按峰面積定量。
從富集液中，通過驗證得到1株廣高效廣譜農藥降解菌株，可以降解乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯三種農藥，命名為ds3。該菌株16h對100mg/l的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯降解率都能達到90％以上。如圖1所示，菌落ds3在lb固體平板上菌落形態為整體圓形，表面隆起、邊緣整齊，溼潤、光滑，呈淡黃色，革蘭氏染色陰性。菌株ds3電鏡圖如圖2所示，無鞭毛，短杆狀(0.3–0.5μm×0.9–1.0μm)。
以菌株ds3的基因組dna為模板，用細菌16srrna基因序列通用引物進行pcr擴增，得到長度為1409bp的16srdna基因序列，如seqidno：1所示。在eztaxon資料庫(www.ezbiocloud.net)中進行blast，結果表明菌株ds3與鞘脂菌(sphingobiumsp.)菌株的同源性最近，與菌株sphingobiumyanoikuyaeatcc51230t和sphingobiumscionensewp01t同源性都達到98％以上，結合形態和生理生化特徵，將菌株ds3初步鑑定為鞘脂菌(sphingobiumsp.)，命名為鞘脂菌ds3(sphingobiumsp.ds3)。將該菌株ds3送交位於中國武漢，中國典型培養物保藏中心(簡稱cctcc)保藏，保藏時間為2017年6月5日，保藏編號為cctccno:m2017305。
實施例2
在無機鹽培養基中菌株ds3對有機磷類農藥殘留的降解效果：
在無機鹽液體培養基中降解菌株ds3對久效磷降解特性測定：挑取ds3單菌落於50mllb液體培養基中，30℃、165r/min振蕩培養24h，獲得新鮮菌液。將3ml培養好的新鮮菌液經6000r/min離心5min，棄去上清液，加入10ml無菌水重懸，為離心懸浮後的種子液，種子液的菌體量達為6×107cfu/ml以上。
在無機鹽培養基中加入終濃度為100mg/l的久效磷，按3％體積比的接種量接入菌株ds3的種子液；同時在無機鹽培養基中加入終濃度為100mg/l的久效磷，按3％體積比的接種量接入滅活的菌株ds3種子液作為對照，30℃恆溫搖床中培養24h，採用實施例1中降解效果的驗證方法通過高效液相色譜法檢測菌株ds3對久效磷的降解情況，並計算降解率，如圖3所示，其中a為對照，b為處理。菌株ds3在24h內對久效磷降解率可以達到90％。
採用相同的方法測試毒死蜱、三唑磷、甲基對硫磷、敵敵畏等有機磷農藥的降解情況，反應48h後毒死蜱、三唑磷、甲基對硫磷、敵敵畏的降解率都能達到90％以上。
實施例3
在無機鹽培養基中菌株ds3對二苯醚類農藥殘留的降解效果：
在無機鹽液體培養基中降解菌株ds3對乙羧氟草醚降解特性測定：挑取ds3單菌落於50mllb液體培養基中，30℃、165r/min振蕩培養24h，獲得新鮮菌液。將3ml培養好的新鮮菌液經6000r/min離心5min，棄去上清液，加入10ml無菌水重懸，為離心懸浮後的種子液，種子液的菌體量達為6×107cfu/ml以上。
在無機鹽培養基中加入終濃度為100mg/l的乙羧氟草醚，按3％體積比的接種量接入菌株ds3的種子液；同時在無機鹽培養基中加入終濃度為100mg/l的乙羧氟草醚，按3％體積比的接種量接入滅活的菌株ds3種子液作為對照，30℃恆溫搖床中培養24h，採用實施例1中降解效果的驗證方法通過高效液相色譜法檢測菌株ds3對乙羧氟草醚的降解情況，並計算降解率，如圖4所示，其中a為對照，b為處理。菌株ds3在24h內對乙羧氟草醚降解率可以達到92％。
採用相同的方法測試氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、乳氟禾草靈等二苯醚類農藥的降解情況，反應48h後氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、乳氟禾草靈的降解率都能達到90％以上。
實施例4
在無機鹽培養基中菌株ds3對芳氧苯氧羧酸酯類農藥殘留的降解效果：
在無機鹽液體培養基中降解菌株ds3對氰氟草酯降解特性測定：挑取ds3單菌落於50mllb液體培養基中，30℃、165r/min振蕩培養24h，獲得新鮮菌液。將3ml培養好的新鮮菌液經6000r/min離心5min，棄去上清液，加入10ml無菌水重懸，為離心懸浮後的種子液，種子液的菌體量達為6×107cfu/ml以上。
在無機鹽培養基中加入終濃度為100mg/l的氰氟草酯，按3％體積比的接種量接入菌株ds3的種子液；同時在無機鹽培養基中加入終濃度為100mg/l的氰氟草酯，按3％體積比的接種量接入滅活的菌株ds3種子液作為對照，30℃恆溫搖床中培養24h，採用實施例1中降解效果的驗證方法通過高效液相色譜法檢測菌株ds3對乙羧氟草醚的降解情況，並計算降解率，如圖5所示，其中a為對照，b為處理。菌株ds3在24h內對氰氟草酯降解率可以達到94％。
採用相同的方法測試精惡唑禾草靈、精吡氟禾草靈、精喹禾靈、炔草酯等芳氧苯氧羧酸酯類農藥的降解情況，反應48h後精惡唑禾草靈、精吡氟禾草靈、精喹禾靈、炔草酯的降解率都能達到90％以上。
實施例5
採用實施例2的方法，在無機鹽培養基中加入終濃度均為100mg/l的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯，按5％體積比的接種量接入菌株ds3的種子液；同時在無機鹽培養基中加入終濃度為終濃度均為100mg/l的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯，按5％體積比的接種量接入滅活的菌株ds3種子液作為對照，30℃恆溫搖床中培養48h，通過高效液相色譜法檢測菌株ds3對乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯混合農藥的降解情況，經過48h培養後發明乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯基本均被降解。
實施例6
菌株ds3的降解菌劑的製備
1)將實施例1分離篩選的降解菌株ds3接種到含3ml的lb(蛋白腖10g，酵母膏5g，nacl5g，水1000ml，ph7.0-7.2)試管中培養到對數期，將試管液按0.5％體積比的接種量接種於100ml發酵培養基中，30℃，150rpm振蕩培養至對數期，製得發酵菌種；
2)將上述製得發酵菌種按5％(v/v，以培養基體積為基準)的接種量接種於裝液量為70％(以發酵罐體積為基準，下同)的500升種子罐的培養基中培養(培養基已經121℃高壓溼熱滅菌，冷卻)，培養至對數生長期，培養過程中每分鐘無菌空氣的通氣量為1:0.8(培養基與無菌空氣體積比)，攪拌速度為180rpm，培養溫度為30℃；製得種子液；
3)將種子液按5％(v/v，以培養基體積為基準)的接種量接入裝液量為70％的5000升生產罐的培養基中培養發酵(生產罐培養基已經在1.1kg/cm2的壓力下，121℃高壓溼熱滅菌，冷卻)，培養發酵過程中每分鐘無菌空氣的通氣量為1:1(培養基與無菌空氣體積比)，攪拌速度為180rpm，培養溫度為27℃，培養時間為48小時，發酵結束後菌體數量達到10億個/ml以上，發酵完成後培養液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型即為降解菌劑。
其中，發酵培養基、種子罐的培養基、生產罐的培養基配方相同，均為葡萄糖0.1wt％、nacl1.0wt％、蛋白腖0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶劑為蒸餾水，ph7.2-7.5。
實施例5
菌株ds3的降解菌劑的製備
1)將實施例1分離篩選的降解菌株ds3接種到含3ml的lb(蛋白腖10g，酵母膏5g，nacl5g，水1000ml，ph7.0-7.2)試管中培養到對數期，將試管液按0.5％體積比的接種量接種於100ml發酵培養基中，30℃，150rpm振蕩培養至對數期，製得發酵菌種；
2)將上述製得發酵菌種按10％(v/v，以培養基體積為基準)的接種量接種於裝液量為70％(以發酵罐體積為基準，下同)的500升種子罐的培養基中培養(培養基已經121℃高壓溼熱滅菌，冷卻)，培養至對數生長期，培養過程中每分鐘無菌空氣的通氣量為1:1(培養基與無菌空氣體積比)，攪拌速度為150rpm，培養溫度為30℃；製得種子液；
3)將種子液按10％(v/v，以培養基體積為基準)的接種量接入裝液量為70％的5000升生產罐的培養基中培養發酵(生產罐培養基已經在1.1kg/cm2的壓力下，121℃高壓溼熱滅菌，冷卻)，培養發酵過程中每分鐘無菌空氣的通氣量為1:1(培養基與無菌空氣體積比)，攪拌速度為180rpm，培養溫度為30℃，培養時間為30小時，發酵結束後菌體數量達到10億個/ml以上，發酵完成後培養液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型即為降解菌劑。
其中，發酵培養基、種子罐的培養基、生產罐的培養基配方相同，均為葡萄糖0.1wt％、nacl1.0wt％、蛋白腖0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶劑為蒸餾水，ph7.2-7.5。
實施例6
菌株ds3降解菌劑對土壤中乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯的降解效果測定：
稱取多份1000g菜園土作為供試土壤，風乾過篩，每份分別加入乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯，使土壤中乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯濃度為200mg/kg，按2％的接種量(ml/g)將實施例4製備的ds降解菌劑分別接入到上述土壤中混勻作為處理組1，設相應不加ds3降解菌劑以及加入相同體積滅活lms-cy降解菌劑的含相同濃度農藥土壤為對照1組和2組，置於30℃培養箱中黑暗條件下恆溫培養，期間土壤的持水量保持在60％，第3天取樣分別測定乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯在土壤中的殘留量，每組做平行實驗3次，利用高效液相色譜測定殘留量，計算多次平均降解率，結果見表1。
表1菌株ds3降解菌劑對土壤中對農藥殘留的降解效果
由表1可見，使用實施例4製備的菌株ds3降解菌劑，土壤中乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯濃度為200mg/kg時降解菌ds3對其的降解率達到88.3％、90.5％和87.5％，並且對照中的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯均沒有被降解。結果表明，ds3降解菌劑可有效降解土壤中的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯農藥殘留。同時採用相同方法檢測土壤中其他類型的有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農藥殘留的降解情況，結果與本實施例類似。
實施例7
菌株ds降解菌劑對水體中乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯的降解效果測定：
取多份500ml製藥廠廢水生化處理池中廢水，過濾後，每份分別加入氟草醚、久效磷或氰氟草酯，調整濃度後使水體中乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯濃度分別達到為200mg/l，按2％的接種量(體積比)將實施例5製備的ds降解菌劑分別接入到上述水體中混勻作為處理組2，設相應不加ds3降解菌劑以及加入相同體積滅活ds3降解菌劑的水體為對照3組和4組，置於30℃培養箱中黑暗條件下恆溫培養，第3天取樣測定乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯在水體中的殘留量，每組做平行實驗3次，利用高效液相色譜測定殘留量，計算多次平均降解率，結果見表2。
表2菌株ds3降解菌劑對水體中對農藥殘留的降解效果
由表2可見，使用實施例5製備的菌株ds3降解菌劑，水體中乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯濃度為200mg/kg時降解菌ds3對其的降解率達到89.5％、91.3％和88.7％，並且對照中的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯均沒有被降解。結果表明，ds3降解菌劑可有效降解水體中的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯農藥殘留。同時採用相同方法檢測水體中其他類型的有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農藥殘留的降解情況，結果與本實施例類似。
針對實施例6和實施例7三種農藥同時混合添加在土壤中或者水體中情況，通過調整降解菌劑的接種量和延長反應時間，最終都可以達到全部降解。
sequencelisting
上海市農業科學院
一株農藥殘留廣譜降解菌株ds3及其生產的菌劑和應用
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