一種耐鹽鹼速生白榆無性系葉片愈傷組織誘導及分化方法與流程

2023-10-06 21:53:49

本發明涉及一種植物愈傷誘導方法，特別涉及一種耐鹽鹼速生白榆無性系愈傷組織誘導及分化的方法。

背景技術：

白榆(ulmuspumilal.)，為榆科(ulmaceae)榆屬(ulmus)植物，變種較多。白榆作為我國主要的園林鄉土觀賞樹種之一，對煙塵、二氧化硫和氟化氫等有毒氣體抗性強，並且具有極高的環境適應性、抗汙染、抗病蟲、宜繁殖和較強的耐鹽鹼特性，使得白榆極有希望成為鹽鹼地區園林綠化骨幹樹種。

木本植物在植物組織培養生產中的成功經驗與案例相對草本植物較為罕見，適宜不同木本植物生長的基礎培養基的匱乏導致木本植物難以大規模生產。前期對白榆無性外植體瓶內繁殖的研究取得了突破性成果，在一定程度上解決了工廠生產需要，但是由於白榆外植體取材要求嚴格，造成繁殖材料短缺，降低生產效率。因此，針對白榆的巨大開發價值，亟待發明一種利用白榆葉片或植株組織細胞進行大量繁殖的方法。

目前白榆可以用的愈傷誘導培養方法有王靜華(ms+tdz0.005mg/l+iaa0.005mg/l)，孫震(ms+kt0.5mg/l+naa0.1mg/l)，李雯(愈傷誘導培養基ms+tdz0.1mg/l+iba0.2mg/l；分化培養基tdz0.2mg/l+iba0.05mg/l)等的誘導培養方法。上述培養基的愈傷組織誘導率較高(89％-100％)，但總體愈傷組織不定芽分化率較低(50％-76％)，造成白榆工廠化生產的高成本及資源浪費。

技術實現要素：

本發明的目的在於為耐鹽鹼速生白榆提供一個適宜工廠化生產的愈傷誘導及分化方法。該方法採用組培苗的葉片作為愈傷誘導材料，採用ms培養基(2,4-d0.5mg/l)進行愈傷組織誘導，採用em培養基(6-ba0.3mg/l)進行繼代培養與促進不定芽的形成，使愈傷組織出愈率達100％，不定芽再生率達95％。採用該愈傷誘導方法提高了白榆工廠化生產的效率，且白榆長勢旺盛，降低生產成本，提高經濟效益。

本發明的技術方案是：一種耐鹽鹼速生白榆無性系葉片愈傷組織誘導及分化方法，其特徵是，

(1)外植體選擇：耐鹽鹼速生白榆無性系愈傷組織誘導的外植體源於白榆工廠組培生根苗，即選取生長健壯、葉片舒展、組培苗株高＞2.5cm、生長一致的生根苗作為外植體；

(2)外植體處理：切取外植體第2-5片(由上到下)葉片；將葉片從葉柄處切下(保留葉柄)，然後沿葉片邊緣環割並保留葉柄至葉片中部2/5-3/5(優選1/2)葉片(圖1右)作為愈傷誘導材料，用於愈傷組織誘導；

(3)愈傷組織誘導：將切割完後獲取的葉片及時接入ms培養基中，葉片橫向平放於ms培養基表面；接種後置於白天26℃(±2℃)/夜間18℃(±2℃)、相對空氣溼度90％(±5％)黑暗環境培養3天；第4天起，每天光照12小時，光照強度2000—3500勒克斯，溫度白天26℃(±2℃)/夜間18℃(±2℃)。

(4)愈傷組織繼代培養與不定芽的形成：葉片材料形成膨大的愈傷組織後(1-2周)，將愈傷組織轉接入em分化培養基(每兩周轉接一次)；繼代培養一周後，部分愈傷組織開始分化成不定芽；繼代培養2-3周後，愈傷組織分化率可達95％。

繼代培養條件為：培養溫度為白天(或光照條件下)26℃±2℃，夜間(或黑暗條件下)18℃±2℃，光照時間為每天12小時，溼度90％以上。

進一步地，ms培養基還包括下述組分：2,4-d(氯苯氧乙酸)0.5mg/l。

進一步地，ms培養基還包括輔料為：瓊脂7g/l，蔗糖30g/l。

進一步地，em培養基還包括下述組分：6-ba(6-苄氨基腺嘌呤)0.3mg/l。

進一步地，em培養基還包括輔料為：瓊脂7g/l，蔗糖30g/l。

本發明的有益效果是：

1)與現有方法相比，本發明採用了ms培養基和em培養基兩種培養基，二者相互配合使用，協同作用促進不定芽再生(見表3)。本發明採用ms培養基(2,4-d0.5mg/l)處理，白榆愈傷組織誘導率達100％；然後再採用em培養基(6-ba0.3mg/l)處理，不定芽再生率達95％。相比採用單個ms培養基，不定芽分化率提高20-45％左右，愈傷組織誘導率也有提高。

2)從表2可以看出：在添加不同激素的ms培養基下，採用葉片作為愈傷誘導材料，其誘導分化率明顯低於莖段(莖段更容易形成愈傷)。而本發明採用ms培養基(2,4-d0.5mg/l)培養葉片材料後不僅誘導率達到了100％，且相比採用莖段作為材料，不定芽再生率提高10％。本發明採用葉片作為愈傷誘導材料，擴大了愈傷誘導材料的選取範圍，且材料的獲取簡單易得，更適合工廠化生產。

3)經實驗證明，採用該高效愈傷誘導方法解決了白榆工廠化生產需要，且再生芽長勢旺盛，大幅提高生產效率，增加經濟效益。

附圖說明

圖1為白榆愈傷誘導材料示意圖，框內區域分別為莖段(左)，葉片(右)愈傷誘導材料。

圖2為葉片材料愈傷組織生長狀況示意圖；圖2-a為葉片材料接種一周後生長情況，邊緣形成膨大透明組織；圖2-b為緻密的愈傷組織(經繼代培養可形成不定芽)；圖2-c為海綿狀愈傷組織(經繼代培養較難形成不定芽)。

圖3為莖段材料愈傷組織生長狀況示意圖；圖3-a為莖段材料接種一周後生長情況，邊緣形成膨大透明組織；圖3-b為緻密的愈傷組織(經繼代培養可形成不定芽)；圖3-c為疏鬆的愈傷組織(經繼代培養較難形成不定芽)。

圖4為葉片、莖段材料愈傷組織繼代培養與不定芽的再生示意圖；圖4-a為葉片材料形成的愈傷組織；圖4-b為莖段材料形成的愈傷組織；圖4-c為葉片材料經繼代培養一周後，愈傷組織開始形成不定芽；圖4-d為葉片材料經繼代培養三周後，大部分(95％)愈傷組織分化形成不定芽。

具體實施方案

為了充分表現本項發明的創新性、實用性、高效性等特點，下面進一步詳細闡述本發明。

實施例1

(1)外植體選擇：耐鹽鹼速生白榆無性系愈傷組織誘導外植體源於白榆工廠組培生根苗，即選取生長健壯、葉片舒展、組培苗株高＞2.5cm、生長一致的生根苗葉片(含葉柄)或莖段作為愈傷誘導材料。

(2)外植體處理：按照圖1(左)所示區域切割，切取組培苗由上到下第2片葉片與第5片葉片之間的生長健壯的莖段。切割時去掉帶有腋芽節的部位，只取節間部位作為試驗材料，切割長度約0.3-0.4cm。切取後及時將莖段接入培養基中，莖段橫向平放於培養基表面，每瓶(直徑6.5cm；高9.5cm)培養基(20-30ml)接種5個莖段材料，重複4次。切取組培苗第2片葉片與第5片(由上到下)葉片之間的葉片。將葉片從葉柄處切下(保留葉柄)，然後沿葉片邊緣環割並保留葉柄至葉片中部的1/2葉片(圖1右)，切割完後獲取的葉片及時接入ms培養基中，葉片橫向平放於培養基表面，每瓶培養基接種5個葉片材料，重複4次。

生長環境為：白天26℃(±2℃)/夜間18℃(±2℃)，相對空氣溼度90％黑暗環境培養3天。第4天起，每天光照12小時，光照強度2000—3500勒克斯，溫度白天26℃(±2℃)/夜間18℃(±2℃)。

培養基：

ms培養基，包括以下含量的各種組分：cacl2·2h2o440mg/l，kh2po4170mg/l，mgso4·7h2o370mg/l，nh4no31650mg/l，kno31900mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，cuso4·5h2o0.025mg/l，h3bo36.2mg/l，mnso4·h2o22.3mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，znso4·7h2o8.6mg/l，ki0.83mg/l，feso4·7h2o27.8mg/l，na2edta·2h2o37.3mg/l，myo-inositol(肌醇)100mg/l，glycine(甘氨酸)2mg/l，nicotinicacid(煙酸)0.5mg/l，pyridoxinehclv6(鹽酸吡哆醇)0.5mg/l，thiaminehclv1(鹽酸硫銨素)0.1mg/l。

em培養基，包括以下含量的各種組分：cacl2·2h2o441mg/l，nh4no31600mg/l，kno32022mg/l，mgso43361mg/l，nah2po4·2h2o312mg/l，k2so4350mg/l，na2so4300mg/l，cacl2230mg/l，cocl2·6h2o0.24mg/l，cuso4·5h2o0.375mg/l，h3bo39.3mg/l，mnso4·h2o16.9mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，znso4·7h2o11.5mg/l，ki0.83mg/l，feso4·7h2o27.8mg/l，na2edta·2h2o37.25mg/l，myo-inositol(肌醇)108mg/l，glycine(甘氨酸)3.75mg/l，nicotinicacid(煙酸)5mg/l，pyridoxinehclv6(鹽酸吡哆醇)1.2mg/l，thiaminehclv1(鹽酸硫銨素)13.5mg/l，biotin(生物素)0.2mg/l，folicacid(葉酸)0.88mg/l，ascorbicacid(維生素c)1.76mg/l，lactoflavin(核黃素)1.9mg/l。

配製條件：試驗用1mol/l的naoh及hcl調節培養基ph值至5.9(滅菌前)，並在121℃、1.1kg/cm2(0.11mpa)滅菌14min。

為了對比現有白榆愈傷誘導方法以及不同輔料、激素以及營養元素處理和本發明的差別，本發明採用不同含量蔗糖(s)、激素(naa萘乙酸，2,4-d氯苯氧乙酸，ba6-苄氨基腺嘌呤)以及ms大量元素三大因素，共組合設計22組愈傷誘導培養基(詳見表1)進行比較分析試驗。每個配方重複8瓶，莖段和葉片每個配方各接種四瓶，每瓶接種5個試驗材料。從外植體(葉片或莖段)接入愈傷誘導培養基起，至愈傷組織形成轉入分化(em具體成分見上)培養基，進行不定芽的誘導。

表1白榆愈傷誘導培養基配方表

實驗處理結果：

第一周期，愈傷組織誘導：從外植體(葉片或莖段)放入培養基起(一周後生長情況如圖2-a或圖3-a所示)，至愈傷組織形成轉入分化培養基，根據白榆愈傷組織的生長狀況，將愈傷形成狀態分為四類：①優——莖段整體膨大形成愈傷，葉片和葉柄均出愈傷，愈傷形態佳，為a(圖2-b；圖3-b)；②良——相同時間處理後莖段剛剛開始膨大或形成愈傷相對較小以及葉片中只有葉柄出愈傷，為b；③中——莖段僅兩端膨大，葉片中脈膨大，為c；④差——莖段、葉片未有明顯愈傷，以及葉片、莖段愈傷顏色暗褐色且膨大海綿狀(圖2-c)或較小鬆散(圖3-c)，為d。不同部位材料愈傷形成率及愈傷形態狀況詳見(表2)。

表2白榆愈傷組織形成率及生長狀況評價

註：空白表示沒有愈傷組織的形成

由表2可以看出，葉片組織在s35、s36培養基處理條件下愈傷分化率達100％，且愈傷組織生長較好；莖段組織在s25、s26、s28至s36培養基處理條件下分化率達100％，且愈傷組織生長較好。

第二周期，愈傷組織繼代培養及不定芽分化(即有效愈傷組織的誘導，圖4)：將第一階段誘導形成的愈傷組織轉接至分化培養基(em+0.3ba+3％s)進行愈傷組織的繼代培養。有效的愈傷組織經過2-3周繼代培養，進而分化形成不定芽。不同激素處理條件下葉片、莖段組織有效愈傷分化率詳見(表3)。

表3葉片、莖段愈傷組織不定芽分化率

註：最終不定芽分化率＝不定芽分化率×愈傷誘導率

由表3可以看出，s35培養基誘導的獲得的葉片愈傷組織具有較高的再生能力，不定芽再生率達95％；s36培養基處理條件下葉片、莖段愈傷組織再生能力次之，不定芽分化率均為90％。從不定芽再生率及減少2,4-d的添加量角度，採用s35更適合工業化生產。

通過上述兩個實驗結果的分析與處理，可以明顯看出，耐鹽鹼速生白榆無性系葉片在ms+2,4-d0.5+3％s培養基處理條件下愈傷組織誘導形成率達100％；且不定芽分化率(有效愈傷)高達95％。不定芽分化率相比之前方法提高20％至45％左右。在生產過程中，此方法在提高生產白榆生產數量的前提下降低了生產成本，在規模化生產中，帶來了更高的經濟效益。

以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內，本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等效物界定。