環狀半縮醛衍生物及其應用的製作方法

2023-10-07 08:20:19 3

專利名稱：環狀半縮醛衍生物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有鈣蛋白酶抑制活性的新的環狀半縮醛衍生物。更具體地，本發明涉及含有新的環狀半縮醛衍生物的藥物。
背景技術：
鈣蛋白酶是一種細胞質中的蛋白水解酶，其廣泛分布在活體中，並被鈣離子激活。目前，已經闡明該該蛋白酶的異常激活涉及各種疾病，如中風，蛛網膜下出血，阿爾茨海默氏病，缺血性疾病，肌肉萎縮症，白內障，血小板凝集，關節炎等[Trends in Pharmacological Sciences，第15卷，第412頁(1994)]。在另一方面，已經闡明鈣蛋白酶抑制劑在實驗性的白內障模型中通過晶狀體培養有效用於保持晶狀體的透明度[Curr.Eye Res.，第10卷，第657-666頁(1994)]，並用作白內障(WO93/23032)等的治療劑。關於此前報導的鈣蛋白酶抑制劑，可以提及肽滷代甲烷衍生物(JP-B-6-29229)，肽重氮甲烷衍生物[Biochem.J.，第253卷，第751-758頁(1988)，J.Med.Chem.，第35卷，第216-220頁(1992)]，肽醯醛衍生物(EP771565，USP6057290等)等。然而，由於條件所限，這些抑制劑還未付諸實踐。

發明內容
本發明旨在提供一種具有鈣蛋白酶抑制活性的化合物。
本發明人已經進行深入研究以努力解決上述問題，獲得具有強烈鈣蛋白酶抑制活性的化合物，並進一步研究而完成本發明。
因此，本發明涉及(1)由式(I)表示的化合物
其中R1是低級烷基，R2是氫，滷素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，並且n為0或1，(2)上述(1)的化合物，其中R1是含有3或4個碳原子的低級烷基，(3)上述(1)或(2)的化合物，其中R1是選自異丙基，異丁基和仲丁基的基團，(4)上述(1)的化合物，其中R1是異丁基並且R2是選自氫，滷素，氰基，低級烷基和低級烷氧基的基團，(5)(2S)-4-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺，(6)一種包含由式(I)表示的化合物的藥物 其中R1是低級烷基，R2是氫，滷素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，並且n為0或1，(7)上述(6)的藥物，其是鈣蛋白酶抑制劑，(8)上述(6)的藥物，其是用於預防或治療涉及鈣蛋白酶的疾病的藥劑，(9)一種藥物組合物，其包含由式(I)表示的化合物和藥用載體， 其中R1是低級烷基，R2是氫，滷素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，並且n為0或1，(10)上述(9)的藥物組合物，其是鈣蛋白酶抑制劑，(11)一種治療涉及鈣蛋白酶的疾病的方法，其包含向需要治療的哺乳動物施用有效量的由式(I)表示的化合物，
其中R1是低級烷基，R2是氫，滷素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，並且n為0或1，和(12)由式(I)表示的化合物作為鈣蛋白酶抑制劑的應用， 其中R1是低級烷基，R2是氫，滷素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，並且n為0或1。
在上述式(I)中，由R1表示的低級烷基是直鏈或支鏈的含有1-4個碳原子的基團，如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，異丁基，仲丁基，叔丁基等。優選含有3-4個碳原子的低級烷基，更優選異丙基，異丁基或仲丁基，特別優選異丁基。在上述(I)中，關於由R2表示的滷素，可以提及氟，氯，溴和碘，特別優選氟。在上述式(I)中，關於由R2表示的低級烷基，可以提及類似於上述由R1表示的低級烷基的那些，特別優選甲基。在上述式(I)中，由R2表示的低級烷氧基是含有1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，如甲氧基，乙氧基，丙氧基，異丙氧基，丁氧基，異丁氧基，仲丁氧基和叔丁氧基等，特別優選甲氧基。
此外，本發明包含由式(I)表示的化合物(以下有時稱為本發明的化合物)以及本發明化合物的各種溶劑化物，具有結晶多晶型的物質和前藥。
本發明的化合物可以通過例如下列反應路線製備
其中每個符號定義如上。由式(II)表示的化合物(以下有時稱為化合物(II))是其中氨基被由R3表示的保護基保護的α-胺基酸。關於由R3表示的保護基，例如，可以提及通常用於肽合成領域的那些，如叔丁氧羰基(以下有時稱為Boc基團)，苄氧羰基等。
通過將化合物(II)和N-羥基琥珀醯亞胺溶解在常規使用的有機溶劑中並在縮合劑的存在下攪拌獲得的溶液，可以獲得由式(III)表示的化合物(以下有時稱為化合物(III))。作為常規使用的有機溶劑，例如，可以提及不有害地影響反應的常規溶劑，如四氫呋喃，二氯甲烷，N，N-二甲基甲醯胺，乙酸乙酯等，及其混合溶劑，優選二氯甲烷。關於縮合劑，例如，優選使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，N，N-二環己基碳二亞胺等。反應溫度是通常在冷卻下，室溫或在加熱下，優選在冰冷卻至室溫的範圍內。
通過將化合物(III)溶解在常規使用的有機溶劑中，向其中加入α-氨基-γ-丁內酯或其鹽(鹽酸鹽或氫溴酸鹽)並在鹼存在或不存在下攪拌混合物，可以獲得由式(IV)表示的化合物(以下有時稱為化合物(IV))。關於通常使用的有機溶劑，可以提及不有害地影響反應的常規溶劑，如N，N-二甲基甲醯胺，二甲亞碸，四氫呋喃，二氯甲烷，甲醇，乙醇，苯，甲苯，乙酸乙酯等，及其混合溶劑，優選N，N-二甲基甲醯胺。關於鹼，可以提及例如，三甲胺，三乙胺，甲基吡啶，N-甲基吡咯烷，N-甲基嗎啉，1，5-二氮雜雙環[4，3，0]壬-5-烯，1，4-二氮雜雙環[2，2，2]壬-5-烯，1，8-二氮雜雙環[5，4，0]-7-十一烯等，優選三乙胺。儘管不具體限制反應溫度，它通常在冷卻下，室溫或在加熱下，優選冰冷卻至室溫。
通過適當地選擇和應用用於R3的氨基保護基(化合物(IV)的保護基)的消除反應的常規方法，可以獲得由(V)表示的化合物(以下有時稱為化合物(V))。例如，當將叔丁氧羰基用作保護基時，將化合物(IV)溶解在常規使用的有機溶劑中並在酸的存在下攪拌得到的溶液以消除R3。作為通常使用的有機溶劑，可以提及例如不有害地影響反應的常規溶劑，如四氫呋喃，二氯甲烷，乙酸乙酯等，及其混合溶劑。關於酸，可以提及鹽酸，三氟乙酸，對甲苯磺酸等。還可以使用可商購的鹽酸在乙酸乙酯或二噁烷等中的溶液用於消除。儘管不具體限制反應溫度，它通常在冷卻下，室溫或在加熱下，優選冰冷卻至室溫。當使用苄氧羰基時，在常規金屬催化劑的存在下進行催化還原(例如披鈀碳，阮內鎳，氧化鉑等)。氫氣壓通常約1atm-約50atm，優選約1atm-約5atm。關於溶劑，可以使用醇類(甲醇，乙醇等)，酯類(四氫呋喃等)，有機酸(乙酸等)，及其混合溶劑。不具體限制反應溫度，只要不優選的副反應不發生，反應通常在冷卻下，在室溫下或在加熱下進行。化合物(V)可以不分離或純化用於下一個反應，只要下一個反應不受影響。
通過將各種異硫氰酸酯試劑加入化合物(V)並在通常使用的有機溶劑中在鹼存在或不存在下攪拌混合物，可以獲得由式(VI)表示的化合物(以下有時稱為化合物(VI))。作為通常使用的有機溶劑，可以提及不有害地影響反應的常規溶劑，如四氫呋喃，二氯甲烷，N，N-二甲基甲醯胺，乙酸乙酯等，及其混合溶劑，優選乙酸乙酯。關於鹼，例如，可以提及三甲胺，三乙胺，甲基吡啶，N-甲基吡咯烷，N-甲基嗎啉，1，5-二氮雜雙環[4，3，0]壬-5-烯，1，4-二氮雜雙環[2，2，2]壬-5-烯，1，8-二氮雜雙環[5，4，0]-7-十一烯等，優選三乙胺。儘管不具體限制反應溫度，它通常在冷卻下，室溫或在加熱下，優選冰冷卻下至室溫的範圍。
通過將化合物(VI)進行還原反應，可以獲得由式(I)表示的化合物。該還原反應可以通過已知的方法自身(per se)進行，如用金屬氫化物還原，用氫-金屬絡合化合物還原，用乙硼烷或取代的硼烷還原，催化氫化等。換句話說，該反應通過用還原劑處理化合物(VI)來進行。關於還原劑，可以提及氫-金屬絡合化合物如鹼金屬硼氫化物(例如硼氫化鈉，硼氫化鋰等)，氫化鋁鋰等，金屬氫化物如氫化鈉等，金屬或金屬鹽如有機錫化合物(氫化三苯基錫等)，鎳化合物，鋅化合物等，使用過渡金屬催化劑(例如鈀，鉑，銠等)催化還原劑和氫，和乙硼烷等。特別是，優選使用氫化二異丁基鋁進行反應。該反應在不影響反應的有機溶劑中進行。例如，可以提及不有害地影響反應的常規溶劑，如N，N-二甲基甲醯胺，二甲亞碸，四氫呋喃，二氯甲烷，甲醇，乙醇，苯，甲苯，乙酸乙酯等，及其混合溶劑，優選二氯甲烷。反應溫度為約-100℃至約150℃，特別優選約-80℃至約-10℃，反應時間約1至約24小時。通過已知的分離和純化方法，如濃縮，減壓下濃縮，溶劑萃取，結晶，重結晶，相轉移，色譜法等可以分離或純化如此獲得的環狀半縮醛衍生物。
關於通過上述方法可以製備的式(I)表示的化合物，例如，可以提及(2S)-4-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺，(2S)-3-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺，(2S)-3-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)丁醯胺，(2S)-2-(((苄基氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺，(2S)-2-((((4-氟苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺，(2S)-2-((((4-甲氧基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺，(2S)-2-((((3-氰基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺，(2S)-2-((((4-氰基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺，(2S)-4-甲基-2-((((2-甲苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺，(2S)-4-甲基-2-((((3-甲苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺，(2S)-4-甲基-2-((((4-甲苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺等。
本發明的化合物是沒有在任何參考文獻中描述的新化合物，因為它具有優越的鈣蛋白酶抑制活性，如以下實驗實施例中所示，該化合物用作鈣蛋白酶抑制劑的藥物，其如果需要通過組合作為活性成分的該化合物和下述載體等獲得。在下面所示實施例中公開的化合物的結構式在表1中顯示。
表1.實施例化合物的結構式 化合物號 nR1R21 0異丁基H2 0仲丁基H3 0異丙基H4 1異丁基H5 0異丁基4-氟6 0異丁基4-甲氧基7 0異丁基3-氰基8 0異丁基4-氰基9 0異丁基2-甲基100異丁基3-甲基110異丁基4-甲基包含本發明化合物的藥物用作預防或治療缺血性疾病，免疫疾病，阿爾茨海默氏病，骨質疏鬆症，缺血性腦疾病，白內障，青光眼，視網膜(脈絡膜)疾病，由光凝固法導致的眼後段併發症(例如斑點水腫，視網膜剝離，視神經炎，視野異常，光覺異常，色覺異常等)等的藥物製劑，或用於預防或治療哺乳動物(例如人，大鼠，小鼠，兔子，牛，豬，狗，貓等)中血管生成，視網膜剝離等的藥物。另外，因為本發明的化合物在水溶性方面大多優於相同種類的常規化合物，這使得可以將本發明化合物用作通常難以提供的水成液。此外，本發明的化合物在對組織的滲透和吸收性方面優越，顯示極低的毒性並在安全性方面優越。
可以系統或局部施用包含本發明化合物的藥物。對於系統給藥，通過口服施用或靜脈內注射、皮下注射、肌內注射等腸胃外施用。典型地，經皮膚，肌肉，鼻內，眼內等施用。
關於包含本發明化合物的藥物的劑型，可以提及固體藥劑如散劑，顆粒劑，片劑，膠囊劑，栓劑等，液體如糖漿，注射劑，滴眼劑，滴鼻劑等，等等。關於顆粒劑或片劑的製備，例如，通過使用賦形劑(乳糖，蔗糖，葡萄糖，澱粉，結晶纖維素等)，潤滑劑(硬脂酸鎂，滑石，硬脂酸，硬脂酸鈣等)，崩解劑(澱粉，羧甲基纖維素鈉，碳酸鈣等)，粘合劑(澱粉液體，羥丙基纖維素液體，羧甲基纖維素液體，阿拉伯膠液體，明膠液體，海藻酸鈉液體等)等可以獲得任何劑型。對於顆粒劑和片劑，可以用適當的包衣劑(明膠，蔗糖，阿拉伯膠，巴西棕櫚蠟等)，腸包衣劑(例如醋酞纖維素，甲基丙烯酸共聚物，羥丙基纖維素鄰苯二甲酸酯，羧甲基乙基纖維素等)等形成包衣。
為了製備膠囊，將適當的賦形劑，如用於改善流動性和潤滑性的硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石、輕質無水矽酸等，用於壓縮流動性的結晶纖維素、乳糖等，以及上述崩解劑等適當地加入並均勻混合或加工成顆粒劑或顆粒形式，用適當的包衣劑形成包衣，將得到的產品填充於膠囊，或者可以使用膠囊基質形成包囊，所述膠囊基質通過將甘油，山梨糖醇等加入適當的膠囊基質(明膠等)以提高可塑性獲得。如果需要這些膠囊可以包含著色劑，防腐劑[二氧化硫，對羥基苯甲酸酯類(對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸乙酯，對羥基苯甲酸丙酯)]等。膠囊還可以製備成常規膠囊，以及腸包衣膠囊，胃內抗性膠囊或緩釋膠囊。當製備腸溶膠囊時，將已經用腸包衣劑包被的化合物或包含上述適當賦形劑的化合物填充到常規膠囊中，或者膠囊本身可以用腸包衣劑包被，或者腸溶性聚合物可以用作形成的基質。
當製備栓劑時，可以適當地選擇和使用栓劑基質(例如可可脂，聚乙二醇等)。
當製備糖漿時，例如，可以適當選擇和使用穩定劑(乙二胺四乙酸二鈉等)，懸浮劑(阿拉伯膠，羧甲纖維素等)，矯味劑(單糖漿，葡萄糖等)，芳香劑等。
當製備注射劑，滴眼劑或滴鼻劑時，可以通過將化合物溶解或分散在溶液中製備，該溶液適當地含有藥用添加劑，如等滲劑(氯化鈉，氯化鉀，甘油，甘露醇，山梨糖醇，硼酸，硼砂，葡萄糖，丙二醇等)，緩衝液(磷酸鹽緩衝液，乙酸鹽緩衝液，硼酸鹽緩衝液，碳酸鹽緩衝液，檸檬酸鹽緩衝液，Tris緩衝液，穀氨酸，ε-氨基己酸等)，防腐劑(對-羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯甲醇，苯扎氯銨，脫水乙酸鈉，乙二胺四乙酸二鈉，硼酸，硼砂等)，增稠劑(羥基乙基纖維素，羥基丙基纖維素，聚乙烯醇，聚乙二醇等)，穩定劑(亞硫酸氫鈉，硫代硫酸鈉，乙二胺四乙酸二鈉，檸檬酸鈉，抗壞血酸，二丁基羥基甲苯等)，pH調節劑(鹽酸，氫氧化鈉，磷酸，乙酸等)等。
在本發明的化合物中，具有藥品期望的適當水溶性的化合物可以有利地用作水溶性液體，特別用於上述藥物製劑如糖漿，注射劑，滴眼劑，滴鼻液等。
儘管包含在上述糖漿，注射劑，滴眼劑或滴鼻劑中的添加劑的量根據所用添加劑的種類，應用等而變化，僅需要以能夠實現添加劑目的的濃度加入，其中等滲劑通常以約0.5至約5.0w/v％加入以使滲透壓為約229至約343mOsm。以約0.01至約2.0w/v％加入緩衝液；以約0.01至約1.0w/v％加入增稠劑；以約0.001至約1.0w/v％加入穩定劑。適當加入pH調節劑並通常調節至約pH 3至約9，優選約4至約8。
儘管本發明的化合物的劑量根據目標疾病，症狀，給藥受試者，給藥方法等而變化，例如，在內服的藥物情形中，將約1至約100mg的單劑量1天數次施用於成人，在注射劑的情形中，將約0.1至約30mg一天一次施用於成人。對於眼的局部給藥，優選將含有約0.001至約1.0w/v％，優選約0.01至約0.5w/v％的本發明化合物的滴眼劑滴注到眼中，1天數次，每次滴注約20至約50μL。


圖1是顯示化合物1在大鼠晶狀體培養物中晶狀體混濁預防作用的圖，其中每個值顯示平均值±標準誤差(n＝5)，*表示通過Student’s T檢驗(兩側)與對照組的顯著差異p＜0.01。
圖2是顯示在向兔子眼內給藥以後化合物1在眼房水中的濃度的圖表，其中每個值顯示平均值±標準誤差(n＝4)。
圖3是顯示化合物在大鼠視網膜局部缺血模型中對神經節細胞損傷的抑制作用的圖表，其中每個值顯示平均值±標準誤差(n＝6)，*表示通過Student’s T檢驗與對照組的顯著差異p＜0.05。
具體實施例方式
通過參照下列參考實施例，實施例，實驗實施例和配製實施例更詳細地解釋本發明，其不應當被認為是限制性的。
在實施例中討論的化合物的分析值中，使用由Yanaco LID有限公司製備的MP-500V(未校正)測量熔點。使用由Varian公司製備的Gemini2000測量核磁共振譜(NMR)。由於異頭碳的存在，化合物1-11的NMR譜是複雜的，當相同質子的主峰和次峰(minor peak)可以區分時，分別描述它們。使用由PerSeptive Biosystems公司製備的Voyager DE PRO測量基質輔助雷射解吸附離子化-飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS)。使用Horiba有限公司製備的SEPA-2000測量比旋光([α]D)。
參考實施例1 N-(叔丁氧基)羰基-L-亮氨酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(參考化合物1)將叔丁氧羰基-L-亮氨酸(27g，110mmol)和N-羥基琥珀醯亞胺(16g，140mmol)溶解在四氫呋喃(180mL)中。在冰冷卻下向其中加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(27g，140mmol)在二氯甲烷(180mL)中的懸浮液。在室溫下攪拌該反應混合物18小時，並在減壓下濃縮。將殘渣溶解在乙酸乙酯中，用1M鹽酸，飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鎂乾燥，在減壓下濃縮。將獲得的固體從己烷中結晶以產生參考化合物(33g，93％)，其為無色結晶。mp 74.1-75.5℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.88(d，3H，J＝6.3Hz)，0.91(d，3H，J＝6.3Hz)，1.39(s，9H)，1.54-1.75(m，3H)，2.80(s，4H)，4.32(m，1H)，7.62(d，1H，J＝8.4Hz)。
參考實施例2 N-(叔丁氧基)羰基-L-異亮氨酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(參考化合物2)以與參考實施例1相同的方式操作和使用叔丁氧基-L-異亮氨酸代替1的叔丁氧基-L-亮氨酸提供參考化合物2，其為白色固體。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ0.97(t，3H，J＝7.5Hz)，1.04(d，3H，J＝6.9Hz)，1.26(m，1H)，1.45(s，9H)，1.60(m，1H)，1.98(m，1H)，2.83(s，4H)，4.62(dd，1H，J＝8.7，5.1Hz)，5.01(d，1H，J＝8.7Hz)。
參考實施例3 N-(叔丁氧基)羰基-L-纈氨酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(參考化合物3)以與參考實施例1相同的方式操作和使用叔丁氧基-L-纈氨酸代替1的叔丁氧基-L-亮氨酸提供參考化合物3，其為無色固體。mp 125.7-127.4℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.99(d，6H，J＝6.9Hz)，1.4(s，9H)，2.15(m，1H)，2.81(s，4H)，4.22(dd，1H，J＝8.1，6.6Hz)，7.58(d，1H，J＝8.4Hz)。
參考實施例4(2S)-2-((叔丁氧基)羰基氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊醯胺(參考化合物4)將參考化合物1(20g，61mmol)溶解在N，N-二甲亞碸(120mL)中，在冰冷卻下加入(S)-(-)-α-氨基丁內酯氫溴酸鹽(17g，91mmol)和三乙胺(18g，180mmol)。在室溫下攪拌該溶液18小時。用乙酸乙酯稀釋反應混合物，用1M鹽水，飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和鹽水洗滌該溶液，用無水硫酸鎂乾燥，在減壓下濃縮。從己烷中結晶殘渣以產生參考化合物4(19g，99％)，其為無色結晶。mp 92.5-93.3℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.85(d，3H，J＝6.3Hz)，0.88(d，3H，J＝6.6Hz)，1.28-1.50(m，2H)，1.38(s，9H)，1.61(m，1H)，2.14(m，1H)，2.39(m，1H)，3.96(m，1H)，4.20(m，1H)，4.34(m，1H)，4.60(m，1H)，6.88(d，1H，J＝8.4Hz)，8.30(d，1H，J＝8.4Hz)。
參考實施例5(2S)-2-((叔丁氧基)羰基氨基)-3-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊醯胺(參考化合物5)以與參考實施例4相同的方式操作和使用參考化合物2代替參考化合物1提供參考化合物5，其為白色粉末。mp 156.4-159.2℃.1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ0.90(t，3H，J＝7.5Hz)，0.95(d，3H，J＝6.6Hz)，1.15(m，1H)，1.43(S，9H)，1.50(m，1H)，1.88(m，1H)，2.21(m，1H)，2.73(m，1H)，4.01(m，1H)，4.26(m，1H)，4.46(td，1H，J＝9.0，1.2Hz)，4.54(m，1H)，5.11(d，1H，J＝8.7Hz)，6.87(m，1H)。
參考實施例6(2S)-2-((叔丁氧基)羰基氨基)-3-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)丁醯胺(參考化合物6)以與參考實施例4相同的方式操作和使用參考化合物3代替參考化合物1提供參考化合物6，其為無色結晶。mp 113.9-114.9℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.84(d，3H，J＝6.9Hz)，0.87(d，3H，J＝6.9Hz)，1.38(s，9H)，1.93(m，1H)，2.17(m，1H)，2.39(m，1H)，3.78(dd，1H，J＝8.9，7.2Hz)，4.21(m，1H)，4.40(m，1H)，4.60(m，1H)，6.68(d，1H，J＝8.9Hz)，8.37(d，1H，J＝7.8Hz)。
參考實施例7(2S)-4-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊醯胺(參考化合物7)將參考化合物4(3.4g，11mmol)溶解在乙酸乙酯(100mL)中，在冰冷卻下加入4N鹽酸/乙酸乙酯溶液(8.0mL)。在室溫下攪拌該溶液18小時(證實油在下面(oil-down))，在減壓下去除溶劑。向其中加入乙酸乙酯，再次在減壓下去除溶劑(重複兩次)。將殘渣懸浮在乙酸乙酯中，向其中加入異硫氰酸苯酯(1.5g，11mmol)和三乙胺(3.3g，32mmol)。在室溫下攪拌該溶液3小時。用1M鹽酸，飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和鹽水洗滌反應混合物，用無水硫酸鎂乾燥，在減壓下濃縮。從己烷中結晶殘渣，用己烷洗滌以產生參考化合物7(1.8g，48％)，其為無色結晶。mp 77.7-78.8℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.92(d，3H，J＝6.3Hz)，0.93(d，3H，J＝6.6Hz)，1.55-1.70(m，3H)，2.20(m，1H)，2.40(m，1H)，4.22(m，1H)，4.36(m，1H)，4.62(m，1H)，4.96(m，1H)，7.10(m，1H)，7.29-7.34(m，2H)，7.51-7.54(m，2H)，7.78(d，1H，J＝8.1Hz)，8.64(d，1H，J＝8.1Hz)，9.70(s，1H)。
參考實施例8(2S)-3-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊醯胺(參考化合物8)以與參考實施例7相同方式的操作和使用參考化合物5代替參考化合物4提供參考化合物8，其為白色固體。mp 71.9-72.7℃.1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ0.91(t，3H，J＝7.4Hz)，0.96(d，3H，J＝6.7Hz)，1.10-1.22(m，1H)，1.48-1.59(m，1H)，1.94-2.02(m，1H)，2.18-2.33(m，1H)，2.63-2.76(m，1H)，4.20-4.29(m，1H)，4.44(t，1H，J＝9.0Hz)，4.59(ddd，1H，J＝7.2，8.9，11.3Hz)，4.92(t，1H，J＝7.5Hz)，6.77(brs，1H)，6.98(brs，1H)，7.26-7.44(m，5H)，8.17(brs，1H)。
參考實施例9(2S)-3-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)丁醯胺(參考化合物9)以與參考實施例7相同方式的操作和使用參考化合物6代替參考化合物4提供參考化合物9，其為無色結晶。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ0.97(d，3H，J＝6.9Hz)，1.00(d，3H，J＝6.9Hz)，1.75(brs，1H)，2.15-2.33(m，2H)，2.63-2.72(m，1H)，4.45(t，1H，J＝9.0Hz)，4.61(ddd，1H，J＝11.4，8.8，7.3Hz)，4.89(t，1H，J＝7.4Hz)，6.75(d，1H，J＝8.1Hz)，7.01(d，1H，J＝6.7Hz)，7.21-7.50(m，5H)，8.17(brs，1H)。
參考實施例10(2S)-2-(((苄基氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊醯胺(參考化合物10)以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸苄酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物10，其為無色油。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.92(d，3H，J＝6.0Hz)，0.93(d，3H，J＝6.0Hz)，1.56-1.72(m，3H)，2.18(m，1H)，2.41(m，1H)，4.22(m，1H)，4.36(m，1H)，4.63(m，1H)，5.00(m，1H)，7.49-7.98(m，8H)，8.60(d，1H，J＝8.1Hz)，9.75(s，1H)。
參考實施例11(2S)-2-((((4-氟苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊醯胺(參考化合物11)以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸4-氟苯酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物11，其為淡黃色結晶。mp 47.5-48.4℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.92(d，3H，J＝6.3Hz)，0.93(d，3H，J＝6.3Hz)，1.55-1.72(m，3H)，2.18(m，1H)，2.39(m，1H)，4.21(m，1H)，4.35(m，1H)，4.60(m，1H)，4.95(m，1H)，7.12-7.18(m，2H)，7.49-7.55(m，2H)，7.78(d，1H，J＝7.8Hz)，8.62(d，1H，J＝7.8Hz)，9.65(s，1H)。
參考實施例12(2S)-2-((((4-甲氧基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊醯胺(參考化合物12)以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸4-甲氧基苯酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物12，其為淡黃色結晶。mp 44.5-46.1℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.92(d，6H，J＝6.6Hz)，1.54-1.67(m，3H)，2.18(m，1H)，2.39(m，1H)，3.74(s，3H)，4.20(m，1H)，4.33(m，1H)，4.58(m，1H)，4.96(m，1H)，6.84-6.91(m，2H)，7.32-7.35(m，2H)，7.54(d，1H，J＝8.4Hz)，8.59(d，1H，J＝8.1Hz)，9.50(s，1H)。
參考實施例13(2S)-2-((((3-氰基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊醯胺(參考化合物13)以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸3-氰基苯酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物13，其為白色固體。mp 72.0-73.2℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.92(d，3H，J＝6.1Hz)，0.92(d，3H，J＝6.1Hz)，1.56-1.72(m，3H)，2.11-2.25(m，1H)，2.36-2.44(m，1H)，4.17-4.26(m，1H)，4.35(dt，1H，J＝8.8，1.7Hz)，4.57-4.66(m，1H)，4.93(dd，1H，J＝14.2，7.2Hz)，7.49-7.53(m，2H)，7.71-7.77(m，1H)，8.10(d，1H，J＝8.1Hz)，8.17(brs，1H)，8.64(d，1H，J＝8.1Hz)，9.91(brs，1H)。
參考實施例14(2S)-2-((((4-氰基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊醯胺(參考化合物14)
以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸4-氰基苯酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物14，其為白色固體。mp 71.9-73.4℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.90(d，3H，J＝6.1Hz)，0.91(d，3H，J＝6.1Hz)，1.56-1.69(m，3H)，2.14-2.25(m，1H)，2.36-2.44(m，1H)，4.17-4.25(m，1H)，4.35(dt，1H，J＝8.0，1.7Hz)，4.56-4.65(m，1H)，4.92(dd，1H，J＝14.5，7.5Hz)，7.73(d，2H，J＝8.5Hz)，7.86(d，2H，J＝8.7Hz)，8.18(d，1H，J＝8.1Hz)，8.66(d，1H，J＝8.1Hz)，10.08(brs，1H)。
參考實施例15(2S)-4-甲基-2-((((2-甲基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊醯胺(參考化合物15)以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸2-甲基苯酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物15，其為淡黃色結晶。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.92(d，6H，J＝6.3Hz)，1.54-1.71(m，3H)，2.18(s，3H)，2.20(m，1H)，2.42(m，1H)，4.22(m，2H)，4.36(m，2H)，7.14-7.40(m，4H)，7.55(d，1H，J＝8.1Hz)，8.58(d，1H，J＝8.1Hz)，9.21(s，1H)。
參考實施例16(2S)-4-甲基-2-((((3-甲基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊醯胺(參考化合物16)以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸3-甲基苯酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物16，其為白色固體。mp 59.1-62.2℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.86(d，3H，J＝6.3Hz)，0.91(d，3H，J＝6.3Hz)，1.51-1.72(m，2H)，2.10-2.25(m，1H)，2.27(s，3H)，2.33-2.44(m，1H)，4.15-4.25(m，1H)，4.30-4.38(m，1H)，4.54-4.65(m，2H)，4.92-4.99(m，1H)，6.91(d，1H，J＝7.3Hz)，7.18(t，1H，J＝7.8Hz)，7.30(d，1H，J＝9.2Hz)，7.31(s，1H)，7.72(d，1H，J＝8.2Hz)，8.61(d，1H，J＝8.2Hz)，9.62(s，1H)。
參考實施例17(2S)-4-甲基-2-((((4-甲基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊醯胺(參考化合物17)以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸4-甲基苯酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物17，其為無色結晶。mp 107.9-111.2℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.89(d，3H，J＝6.5Hz)，0.90(d，3H，J＝6.5Hz)，1.40-1.51(m，2H)，1.52-1.70(m，1H)，2.09-2.27(m，1H)，2.20(s，3H)，2.32-2.43(m，1H)，4.16-4.29(m，2H)，4.34(dd，1H，J＝8.8，7.5Hz)，4.55-4.64(m，1H)，6.27(d，1H，J＝8.6Hz)，7.01(d，2H，J＝8.2Hz)，7.24(d，2H，J＝8.4Hz)，8.44(s，1H)，8.57(d，1H，J＝8.2Hz)。
實施例1(2S)-4-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺(化合物1)將參考化合物7(1.7g，4.9mmol)溶解在二氯甲烷(200mL)中，在-78℃下加入1M氫化二異丁基鋁/甲苯溶液(17mL，17mmol)。在-70℃或以下攪拌該溶液3小時，加入飽和氯化銨水溶液(4.0mL)並在室溫下攪拌混合物30分鐘。向其中加入無水硫酸鎂和乙酸乙酯，通過硅藻土濾去無機物質。將該濾液在減壓下濃縮並通過HPLC(柱；YMC-Pack ODS-A 250×20mm I.D.，洗脫液；乙腈/水/三氟乙酸＝30∶70∶0.1)純化殘渣。收集主要級分並用乙酸乙酯萃取。用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和鹽水洗滌該溶液，用無水硫酸鎂乾燥，在減壓下濃縮。從己烷中結晶殘渣以產生化合物1(0.46g，27％)，其為無色結晶。mp 62.0-63.8℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.91(d，6H，J＝6.0Hz)，1.49-1.91(m，4H)，2.14(m，1H)，3.64-4.00(m，3H)，4.91(m，1H)，5.00/5.11(d/t，1H，J＝4.5/4.7Hz)，6.16/6.34(d/d，1H，J＝4.8/4.8Hz)，7.10(m，1H)，7.29-7.34(m，2H)，7.49-7.53(m，2H)，7.72/7.78(d/d，1H，J＝8.4/8.7Hz)，8.26/7.87(d/d，1H，J＝6.3/7.5Hz)，9.69(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.85。MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值358.174，實驗值358.169.[α]D25+23.6°(c＝0.211)。
實施例2(2S)-3-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺(化合物2)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物8代替參考化合物7提供化合物2，其為無色結晶。mp 51.3-52.9℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.81-0.87(m，6H)，1.03(m，1H)，1.48(m，1H)，1.68-1.86(m，2H)，2.11(m，1H)，3.48/3.86(m/m，1H)，3.91-3.96(m，2H)，4.88(m，1H)，4.99/5.10(d/t，1H，J＝4.5/4.5Hz)，6.13/6.27(d/d，1H，J＝4.5/4.2Hz)，7.07(m，1H)，7.27-7.32(m，2H)，7.49-7.52(m，2H)，7.70/7.71(d/d，1H，J＝8.4/8.1Hz)，7.85/8.21(d/d，1H，J＝7.8/6.6Hz)，9.76(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.77.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值374.151，實驗值374.185.[α]D25+33.6°(c＝0.208)。
實施例3(2S)-3-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)丁醯胺(化合物3)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物9代替參考化合物7提供化合物3，其為無色結晶。mp 50.9-51.9℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.86-0.92(m，6H)，1.80(m，1H)，2.03-2.26(m，2H)，3.69/3.89(m/m，1H)，3.93-3.97(m，2H)，4.92(m，1H)，5.02/5.13(d/t，1H，J＝4.5/4.7Hz)，6.16/6.31(d/d，1H，J＝4.5/4.8Hz)，7.10(m，1H)，7.29-7.34(m，2H)，7.52-7.55(m，2H)，7.71(m，1H)，8.24/7.92(d/d，1H，J＝6.6/7.5Hz)，9.82(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.83.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值360.136，實驗值360.137.[α]D25+39.8°(c＝0.201)。
實施例4(2S)-2-(((苄基氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺(化合物4)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物10代替參考化合物7提供化合物4，其為無色結晶。mp 62.2-64.4℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.84-0.89(m，6H)，1.44-1.82(m，4H)，2.14(m，1H)，3.68/4.03(m/m，2H)，3.85-3.97(m，2H)，4.66(bs，1H)，4.85(m，1H)，4.99/5.11(d/t，1H，J＝4.5/4.4Hz)，6.12/6.34(d/bs，1H，J＝4.8Hz)，7.22-7.36(m，5H)，7.58(m，1H)，7.68/8.13(bs，1H)，7.96(bs，1H)，主∶次＝1.0∶0.80.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值388.167，實驗值388.162.[α]D25+18.9°(c＝0.211)。
實施例5(2S)-2-((((4-氟苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺(化合物5)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物11代替參考化合物7提供化合物5，其為無色結晶。mp 77.2-78.3℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.90(d，6H，J＝6.3Hz)，1.48-1.91(m，4H)，2.14(m，1H)，3.69/3.95(m/m，1H)，3.86-3.91(m，2H)，4.93(m，1H)，5.00/5.12(d/t，1H，J＝5.1/4.5Hz)，6.15/6.34(d/d，1H，J＝4.8/3.9Hz)，7.12-7.18(m，2H)，7.46-7.52(m，2H)，7.73/7.77(d/d，1H，J＝8.1/7.8Hz)，7.84/8.25(d/d，1H，J＝7.8/7.2Hz)，9.64(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.85.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值392.142，實驗值392.141.[α]D25+20.1°(c＝0.199)。
實施例6(2S)-2-((((4-甲氧基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺(化合物6)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物12代替參考化合物7提供化合物6，其為無色結晶。mp 67.9-68.8℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.88-0.91(m，6H)，1.47-1.87(m，4H)，2.14(m，1H)，3.69/3.94(m/m，1H)，3.74(s，3H)，3.86-3.90(m，2H)，4.89(m，1H)，4.99/5.11(d/t，1H，J＝4.8/4.4Hz)，6.15/6.35(d/d，1H，J＝4.8/4.2Hz)，6.88-6.91(m，2H)，7.28-7.33(m，2H)，7.47/7.53(d/d，1H，J＝8.1/6.9Hz)，8.22/7.81(d/d，1H，J＝6.6/7.8Hz)，9.49(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.78.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值404.162，實驗值404.166.[α]D25+19.9°(c＝0.200)。
實施例7(2S)-2-((((3-氰基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺(化合物7)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物13代替參考化合物7提供化合物7，其為無色結晶。mp 54.1-55.1℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.90-0.92(m，6H)，1.45-1.90(m，4H)，2.15(m，1H)，3.69/3.96(m/m，1H)，3.86-3.91(m，2H)，4.93(m，1H)，5.01/5.12(d/t，1H，J＝4.8/4.5Hz)，6.16/6.34(d/d，1H，J＝4.8/4.5Hz)，7.48-7.54(m，2H)，7.75(m，1H)，8.06-8.18(m，2H)，8.30/7.92(d/d，1H，J＝6.9/7.5Hz)，9.93(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.75.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值399.147，實驗值399.167.[α]D25+23.8°(c＝0.210)。
實施例8(2S)-2-((((4-氰基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺(化合物8)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物14代替參考化合物7提供化合物8，其為無色結晶。mp 80.0-82.9℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.89-0.92(m，6H)，1.50-1.90(m，4H)，2.14(m，1H)，3.69/3.96(m/m，1H)，3.86-3.91(m，2H)，4.93(m，1H)，5.01/5.12(d/t，1H，J＝5.1/4.5Hz)，6.16/6.33(d/d，1H，J＝4.5/4.2Hz)，7.73-7.76(m，2H)，7.84-7.88(m，2H)，8.18(m，1H)，8.31/7.95(d/d，1H，J＝6.6/7.8Hz)，10.10(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.75.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值399.147，實驗值399.150.[α]D25+51.2°(c＝0.195)。
實施例9(2S)-4-甲基-2-((((2-甲基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺(化合物9)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物15代替參考化合物7提供化合物9，其為無色結晶。mp 57.9-58.9℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.88-0.91(m，6H)，1.48-1.86(m，4H)，2.16(m，1H)，2.17(s，3H)，3.69/3.94(m/m，1H)，3.86-3.90(m，2H)，4.91(m，1H)，4.98/5.11(d/t，1H，J＝4.5/4.5Hz)，6.15/6.36(d/d，1H，J＝4.8/3.9Hz)，7.12-7.31(m，4H)，7.46/7.52(d/d，1H，J＝8.4/9.9Hz)，7.78/8.19(d/d，1H，J＝7.2/6.6Hz)，9.20(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.89.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值388.167，實驗值388.176.[αα]D25+9.8°(c＝0.203)。
實施例10(2S)-4-甲基-2-((((3-甲基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺(化合物10)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物16代替參考化合物7提供化合物10，其為無色結晶。mp 61.4-61.9℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.91(d，6H，J＝6.3Hz)，1.47-1.88(m，4H)，2.12(m，1H)，2.28(s，3H)，3.69/3.95(m/m，1H)，3.86-3.91(m，2H)，4.92(m，1H)，5.00/5.11(d/t，1H，J＝4.8/4.5Hz)，6.15/6.34(d/d，1H，J＝4.8/4.5Hz)，6.92(m，1H)，7.17-7.30(m，3H)，7.68/7.74(d/d，1H，J＝8.4/7.8Hz)，8.24/7.84(d/d，1H，J＝6.6/7.5Hz)，9.63(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.87.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值388.167，實驗值388.175.[α]D25+4.8°(c＝0.208)。
實施例11(2S)-4-甲基-2-((((4-甲基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺(化合物11)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物17代替參考化合物7提供化合物11，其為無色結晶。mp 87.3-88.7℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.89(d，6H，J＝6.6Hz)，1.36-1.85(m，4H)，2.14(m，1H)，2.21(s，3H)，3.68/3.94(m/m，1H)，3.85-3.90(m，2H)，4.28(m，1H)，4.98/5.10(d/t，1H，J＝4.8/4.7Hz)，6.14/6.33(d/d，1H，J＝4.5/3.6Hz)，6.24(m，1H)，7.01-7.03(m，2H)，7.23-7.26(m，2H)，8.19/7.84(d/d，1H，J＝7.2/7.8Hz)，8.46(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.46.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值388.167，實驗值388.165.[α]D25+23.9°(c＝0.209)。
實驗實施例1 μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶抑制活性的測定按照參考文獻[Anal.Biochem.208卷，387-392(1993)]所述方法測定μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶抑制活性。更具體地，將包含0.5mg/mL酪蛋白，50mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.4)，20mM二硫蘇糖醇和0.03酶單位的μ-鈣蛋白酶(來源於人紅細胞，由Cosmo Bio Co.，Ltd.製備)或m-鈣蛋白酶(來源於豬腎，由Cosmo Bio Co.，Ltd.製備)反應混合物(200μL)，包含各種濃度的試驗藥物的二甲亞碸溶液(2.5μL)和20mM氯化鈣水溶液(50μL)加入96孔平板。在30℃下反應60分鐘後，將反應混合物(100μL)轉移至不同的96孔平板，加入淨化水(50μL)和50％考馬斯亮藍溶液(100μL)。將平板放在室溫下15分鐘，測量在595nm下的吸光度。使用不用試驗藥物以相同方式處理以後的值作為對照，和通過加入1mM EDTA代替20mM氯化鈣水溶液獲得的值作為空白值，從下列公式計算抑制率，測定50％抑制所需的量(IC50)。
抑制率(％)＝{1-(測量值-空白值)/(對照值-空白值)}×100試驗結果1
其結果在表2中顯示。
表2.本發明化合物的μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶抑制活性

結果，本發明的化合物顯示優越的鈣蛋白酶抑制活性。
實驗實施例2 在大鼠晶狀體培養物中晶狀體混濁預防作用將獲自SD大鼠(5周齡)的晶狀體分成3組，如下培養。
(1)對於正常組，在整個實驗期間將晶狀體培養在基本培養液[Eagle’s無血清極限基本培養基(MEM，GIBCO)，含有10％胎牛血清(FBS，GIBCO)]中。
(2)對於對照組，將晶狀體培養在基本培養液中。
(3)對於藥物組，將晶狀體培養在培養液中，其中已經將溶解在乙醇中的化合物1加入基本培養液(加藥培養液；在培養液中化合物1的濃度100μM，乙醇濃度0.5％)。
對於對照組和藥物組，在培養後2小時的培養液加入鈣離子載體(A23187，由Calbiochem-Novabiochem製備)的乙醇溶液(將A23187(1mg)溶解在乙醇(955μL)中)，使A23187濃度為10μM。在24小時後，對於藥物組將培養基換成加藥培養液，對於對照組，換成基本培養液。在培養4天後，在立體顯微鏡下進行觀察，使用計算機使用圖像分析儀(NIH圖像1.62)測量晶狀體的混濁度(象素)。
試驗結果2結果在圖1中表示。正常組的晶狀體是透明的。對照組的晶狀體在中央是不透明的白色。在加化合物1的組(藥物組)中，混濁度被顯著抑制。
上述結果提示本發明的化合物1有效用於預防晶狀體混濁。
實驗實施例3 眼房水滲透試驗將50μL後述配製實施例4的懸浮液滴注到日本白兔(體重約2kg，購自Fukusaki Rabbit Union)的兩隻眼睛中。在滴注0.25，0.5，1和3小時後，用戊巴比妥殺死兔子，回收眼房水。使用柱轉換系統HPLC，測量在眼房水中化合物1的濃度。
試驗結果3其結果在圖2中表示。眼房水中化合物1的濃度在滴注後0.5小時達到最大值(Cmax)，其濃度為2903.6nM。在滴注後0-3小時內滲透至水狀體的化合物1的量的藥物濃度-時間曲線下面積(AUC)為4786.2nM·h。
實驗實施例4 對大鼠視網膜缺血性疾病的作用使用雄性SD大鼠(體重150-200g，購自Charles River Japan，Inc.)。關於麻醉，在局部缺血前，將等量50mg/mL氯胺酮注射劑和20mg/mL賽拉嗪注射劑以1.0mL/kg體重肌內施用於大鼠腿節中。為了完成局部缺血，使用Sugita微型夾(No.98)綁紮包括視網膜中央動脈的視神經，阻斷血流55分鐘。對於正常組，僅暴露視網膜中央動脈，不設置局部缺血。在局部缺血再灌注7天後，製備組織樣本。為了製備組織樣本，腹膜內施用過量的戊巴比妥溶液以殺死動物，摘除左眼球。在2％多聚甲醛和2.5％戊二醛的固定液(0.1M磷酸鹽緩衝液，pH 7.4)中固定摘除的眼球24小時。在固定後，製備石蠟包埋塊，在通過視神經盤中央的部分以3μm的厚度切片，並用蘇木精和曙紅(HE)染色。在光學顯微鏡下對離視神經盤中央1-2mm的視網膜部分每0.25mm寬度的神經節細胞計數。
在局部缺血開始之前15分鐘和在局部缺血釋放之後即刻，將通過將羧基纖維素鈉溶解在蒸餾水中至0.5％的濃度獲得的溶液(CMC溶液)口服施用於對照組，將通過將化合物1以1.0％懸浮在CMC溶液中獲得的溶液口服施用於藥物組，結果化合物1以100mg/kg體重施用。
試驗結果4其結果在圖3中顯示。由於局部缺血，神經節細胞數降低至約正常組(對照組)的1/4。與此對比，化合物1給藥(藥物組)顯著抑制由於局部缺血導致的神經節細胞數的降低。
上述結果提示本發明的化合物1具有改善視網膜缺血性疾病的作用。
實驗實施例5 細胞毒性試驗將小鼠成神經細胞瘤來源的細胞系(N1E-115細胞)以104/孔接種在96孔微型板中，並在含有10％FBS的Dulbecco’s改進的Eagle’s極限基本培養基(100μL，DMEM，GIBCO)中在37℃下在5％CO2下培養過夜。去除全部量的培養液，將培養基換成各種濃度的試驗藥物溶液(100μL，通過將化合物1溶解在99.5％乙醇和用DMEM將乙醇終濃度調整至1％製備)，培養細胞24小時。分別回收培養物上清液和細胞。將細胞超聲處理以產生可溶性級分，用LDH細胞毒性檢測試劑盒(MK401，由Takara Bio Inc.製備)測定它們中每個的乳酸脫氫酶(LDH)活性。通過下列公式確定LDH釋放率，並當作遭受細胞毒性的細胞比例。
LDH釋放率(％)＝{培養物上清液的LDH活性/(培養物上清液的LDH活性+胞內LDH活性)}×100通過SAS臨床前程序包(6.12版)的LD50/ED50概率單位法，從每個試驗藥物濃度下的LDH釋放率確定LD50。
試驗結果5其結果在表3中顯示。
表3.N1E-115胞外釋放LDH試驗藥物濃度(化合物1) LDH釋放率(％)0.1mM 9.32±0.070.5mM 11.05±0.721mM 14.22±1.142mM 47.73±1.66從表3中LDH釋放率測定的化合物1的LD50為2.191±0.079mM。
製劑實施例1 片劑化合物105g澱粉12g乳糖27.2g硬脂酸鎂0.4g將化合物10，乳糖和澱粉充分混合以產生顆粒，其按照溼式片劑製備方法用於壓片。加入硬脂酸鎂並將混合物壓片以產生400片。如果需要用腸包衣劑包被片劑(甲基丙烯酸共聚物)。
製劑實施例2 注射劑化合物5 100mg氯化鈉 900mg1N氫氧化鈉 適量注射用蒸餾水總量100mL將上述成分通過常規方法無菌混合以提供注射劑。
製劑實施例3 滴眼劑化合物1 100mg硼酸700mg
硼砂適量氯化鈉 500mg乙二酸四乙胺二鈉0.05mg苯扎氯銨0.0005mg無菌淨化水 總量100mL將上述成分通過常規方法無菌混合以提供滴眼劑。
製劑實施例4 滴眼劑化合物1 500mg聚山梨酯80 100mg磷酸二氫鈉二水合物 100mg苯扎氯銨5mg氯化鈉 900mg氫氧化鈉適量PH 7.0無菌淨化水 總量100mL將上述成分通過常規方法無菌混合以提供滴眼混懸劑。
工業適用性因為本發明的式(I)表示的化合物具有優越的鈣蛋白酶抑制活性，它用作預防或治療各種涉及鈣蛋白酶的疾病的藥物，所述疾病如缺血性疾病，免疫疾病，阿爾茨海默氏病，骨質疏鬆症，腦組織疾病導致的疾病，白內障，青光眼，視網膜疾病，由光凝固法導致的眼後段併發症，與血管生成有關的疾病等。
儘管在前面已經詳細描述本發明的一些具體實施方案，本領域普通技術人員可以在基本上不偏離本發明新教導和利益的範圍內不同地修改和改變本文所示的具體實施方案。因此，在後附權利要求所限定的本發明的精神和範圍內，本發明包括所有這些修改和改變。
本申請是基於在日本提出的專利申請2002-072762，其內容由此通過參考結合於此。
權利要求
1.由式(I)表示的化合物 其中R1是低級烷基，R2是氫，滷素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，並且n為0或1。
2.權利要求1的化合物，其中R1是含有3或4個碳原子的低級烷基。
3.權利要求1或2的化合物，其中R1是選自異丙基，異丁基和仲丁基的基團。
4.權利要求1的化合物，其中R1是異丁基並且R2是選自氫，滷素，氰基，低級烷基和低級烷氧基的基團。
5.(2S)-4-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊醯胺。
6.一種包含由式(I)表示的化合物的藥物 其中R1是低級烷基，R2是氫，滷素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，並且n為0或1。
7.權利要求6的藥物，其是鈣蛋白酶抑制劑。
8.權利要求6的藥物，其是用於預防或治療涉及鈣蛋白酶的疾病的藥劑。
9.一種藥物組合物，其包含由式(I)表示的化合物和藥用載體， 其中R1是低級烷基，R2是氫，滷素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，並且n為0或1。
10.權利要求9的藥物組合物，其是鈣蛋白酶抑制劑。
11.一種治療涉及鈣蛋白酶的疾病的方法，其包含向需要治療的哺乳動物施用有效量的由式(I)表示的化合物， 其中R1是低級烷基，R2是氫，滷素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，並且n為0或1。
12.由式(I)表示的化合物作為鈣蛋白酶抑制劑的應用， 其中R1是低級烷基，R2是氫，滷素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，並且n為0或1。
全文摘要
提供由右式(I)表示的化合物其中R
文檔編號C07D307/22GK1642933SQ03806110
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月14日 優先權日2002年3月15日
發明者中村雅之, 井上淳 申請人:千壽製藥株式會社