ZEB2基因表達變異在胰腺癌化療預後診斷中的應用的製作方法

2023-10-05 16:10:44 2

本發明涉及zeb2基因在製備胰腺癌診斷和/或預後試劑盒中的用途以及zeb2阻斷劑在製備治療胰腺癌藥物中的用途，屬於醫藥生物技術領域。

背景技術：

胰腺癌是一種惡性程度很高，診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，約90％為起源於腺管上皮的導管腺癌。其發病率和死亡率近年來明顯上升。5年生存率<1％，是預後最差的惡性腫瘤之一。胰腺癌早期的確診率不高，手術死亡率較高，而治癒率很低。本病發病率男性高於女性，男女之比為1.5～2:1，男性患者遠較絕經前的婦女多見，絕經後婦女的發病率與男性相仿。胰腺癌因其惡性程度高，早期診斷困難，預後差成為腫瘤病學的一大挑戰。儘管目前臨床上將小於2cm的胰腺癌視為早期癌，但此時約有30％～40％的患者已有淋巴結轉移。因此，僅根據腫瘤大小對胰腺癌分期有其局限性。關於胰腺癌的高危因素與胰腺癌發病間的關係尚有爭議，但對這些人群宜定期b超檢查。出現胰腺癌的警報症狀，如消瘦、腹瀉、消化不良等應高度疑診胰腺癌。

目前常規的胰腺癌診斷方法包括影像學診斷，比如b超、ct等。腫瘤標誌物反映了癌的發生、發展過程及基因激活程度，可在腫瘤宿主的組織、體液及排洩物中檢出。有多種胰腺癌腫瘤標誌物已用於臨床，但其敏感性、特異性尚不理想。常見的標誌物癌胚抗原(cea)：在胰腺癌患者血清中有較高的表達率，但其特異性低，其增高也見於肝、結直腸、胃、膽囊癌及非消化道癌。因而限制了其應用價值。另外一個標誌物ca19-9：是目前公認的胰腺癌相關腫瘤標誌物，常作為標準標誌物來判斷其他腫瘤標誌物對胰腺癌診斷的實用價值，目前巳廣泛用於臨床。ca19-9診斷胰腺癌的敏感性為69％～93％，特異性為81％～85％。對高危患者可用ca19-9作為篩選檢查，其結果優於cea。除膽管癌外，與其他消化道惡性腫瘤均有良好的鑑別診斷意義，而且對早期胰腺癌的診斷亦有一定價值，但是診斷效果還有改進的空間。

zeb2基因在現有技術中分別與其它的小分子一起在乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、宮頸癌和鼻咽癌中均有一定的指示作用，但是在胰腺癌中還沒有相關報導。特別是在胰腺癌化療預後診斷中的應用還沒有涉及。

技術實現要素：

zeb2基因表達水平預測胰腺癌患者預後的標誌物用途，基於zeb2基因表達水平可以預測胰腺癌患者的預後，zeb2表達水平低的患者預後好，表達水平高的患者預後差。

基於zeb2基因表達水平預測胰腺癌患者預後的檢測及應用方法，a.提取腫瘤患者原發癌組織標本的細胞總rna；以rna為模板逆轉錄合成cdna；以cdna為模板，用zeb2基因和管家基因的特異性引物和螢光標記探針進行實時定量pcr擴增，計算zeb2基因mrna的相對表達量；b.根據胰腺癌患者復發轉移陽性病例和復發轉移陰性病例的zeb2mrna表達量，確定預後判斷的臨界值。

zeb2mrna表達量低於臨界值的患者預後好，而高於臨界值的患者預後差。

所述的檢測方法，以原發癌組織中zeb2mrna表達量對腫瘤患者預後判斷，表達量低的患者則判斷為預後好，表達量低高的則判斷為預後差。

本發明通過研宄證實zeb2可應用於診斷胰腺癌治療效果的指標預測預後；zeb2可作為胰腺癌治療新藥和生物免疫治療的新靶點。阻斷zeb2表達可抑制胰腺腫瘤生長，抑制胰腺腫瘤細胞，可作為胰腺癌治療新藥和生物免疫治療的新靶點。

另外，本發明提供一種特異性抑制zeb2基因表達的sirna，其序列如seqidno：1和2所示。

另外，本發明提供一種基因幹擾慢病毒載體，為將編碼特異性抑制zeb2基因表達的幹擾小分子rna的基因片段克隆入慢病毒載體後獲得，能產生人zeb2基因小分子幹擾rna。

所述慢病毒載體可以選自：plko.1-puro、plko.1-cmv-tgfp、plko.1-puro-cmv-tgfp、plko.1-cmv-neo、plko.1-neo、plko.1-neo-cmv-tgfp、plko.1-puro-cmv-tagcfp、plko.1-puro-cmv-tagyfp、plko.1-puro-cmv-tagrfp、plko.1-puro-cmv-tagfp635、plko.1-puro-ubc-turbogfp、plko.1-puro-ubc-tagfp635、plko-puro-iptg-1xlaco、plko-puro-iptg-3xlaco、plp1、plp2、plp/vsv-g、pentr/u6、plenti6/block-it-dest、plenti6-gw/u6-laminshrna、pcdna1.2/v5-gw/lacz、plenti6.2/n-lumio/v5-dest、pgcsil-gfp或plenti6.2/n-lumio/v5-gw/lacz中的任一。

本發明通過檢測zeb2基因的表達情況針對胰腺癌治療患者進行預後，具有較好的預測效果，為後期進一步的治療提供初步的指導。同時本發明提供了一種阻斷zeb2基因表達的sirna，具有較好的抑制zeb2基因表達的效果。本發明具有較好的抑制效果以及應用前景。

附圖說明

圖1為qrt-pcr對比正常胰腺組織，胰腺炎，胰腺腫瘤組織和胰腺腫瘤幹細胞中zeb2的表達水平變化對比圖。

圖2為胰腺癌病人的zeb2表達水平及預後關係圖。

圖3為sirna幹擾zeb2基因表達效果圖。

具體實施方式

實施例1檢測zeb2在胰腺癌細胞，胰腺肺轉移瘤細胞和正常胰腺細胞中表達水平

臨床標本入選標準：接受外科手術切除病例，術後病理診斷為胰腺導管腺癌；穿刺活檢術獲得完整組織學標本，病理診斷為胰腺導管腺癌。參與本研宄的患者手術或活檢前均未接受化、放療以及免疫治療，患者籤署了知情同意書，並經過倫理委員會審核。

方法：獲取術後和活檢正常胰腺組織，胰腺腫瘤組織。抽提rna後進行qrt-pcr，qrt-pcr操作步驟為本領域常規的操作方法，所需的引物分別為：zeb2上遊引物：5』-agccaaggaatgctaccaa-3』、下遊引物：5』-ggccccagagcatcataatc-3』；β-actin上遊引物：5』-cagctgagagggaaatcgtg-3』、下遊引物：5』-cgttgccaatagtgatgacc-3』。

zeb2上遊引物：5』-caagaggcgcaaacaagcc-3』

下遊引物：5』-ggttggcaataccgtcatcc-3』

β-actin上遊引物：5』-catgtacgttgctatccaggc-3』、

下遊引物：5』-ctccttaatgtcacgcacgat-3』。

qrt-pcr對比正常胰腺組織、胰腺腫瘤組織和胰腺肺轉移瘤細胞中zeb2的表達水平變化。

結果：如圖1所示，定量pcr數據發現zeb2的表達水平在正常胰腺組織中較低，相對正常組織，胰腺癌組織中升高接近9倍，在胰腺癌肺轉移組織中升高近9.5倍。定量pcr每組分析8例標本，β-actin作為內參指示檢測準確，符合要求。

免疫組織化學染色採用美國dako公司envisiontm二步法檢測系統檢測zeb2蛋白表達。根據本領域常用的irs進行標本的陽性細胞百分率統計。應用irs可兼顧染色強度和陽性細胞百分率。

如表1所示，免疫組化檢查發現正常胰腺組織只有2.9％為zeb2陽性，胰腺癌組織為86.9％，胰腺癌肺轉移組織為90.5％(表1)。免疫組化檢查每組為10例標本。

從以上結果可以看出，zeb2定量pcr和免疫組化檢查可用來診斷胰腺癌。

實施例2檢測zeb2在胰腺腫瘤細胞陽性水平和預後的關係

選擇具有完整隨訪記錄30例胰腺癌病人，獲取病理切片進行zeb2免疫組化檢查，免疫組化操作步驟如上。所選患者均術後只進行常規吉西他濱化療，無其他治療記錄。30例胰腺癌病人的zeb2免疫組化檢查分為三組(強陽性為3.5，陽性為2.5，弱陽性為1.5)，每組10例，進行預後跟蹤，跟蹤病人的生存時間。

結果：如圖2所示，預後跟蹤數據表明胰腺腫瘤細胞陽性水平和預後生存期呈反比關係，強陽性患者預後差，生存期短，而弱陽性患者預後較好，生存期較長。結論，zeb2免疫組化檢查水平可用來預測預後，並可作為預測治療效果的指標。

實施例3zeb2幹擾對於腫瘤的影響

1、人zeb2基因rnai慢病毒的製備

(1).篩選針對人zeb2基因的有效的sirna靶點

從genbank調取人zeb2(bc127102)基因信息；利用dnaman設計針對zeb2基因的有效的sirna靶點。在zeb2基因的編碼序列(cds)區域內，設計了2條針對zeb2基因的有效sirna靶點序列。分別為：zeb2-1：cccagaagcccctgaggagctg；zeb2-2：tactgcaagcgggaggcggagg。

針對sirna靶點合成兩端含agei和ecori酶切位點粘端的雙鏈dnaoligo序列；以agei和ecori限制性內切酶作用於pgcsil-gfp載體，使其線性化，瓊脂糖凝膠電泳鑑定酶切片段。並構建含有zeb2-1或zeb2-2的rnai載體，命名為pgcsil-gfp-zeb2-1-shrna以及pgcsil-gfp-zeb2-2-shrna，同時還按照本領域常規的試驗方法構建pgcsil-gfp-control陰性對照質粒。同時將所述載體導入到慢病毒中備用。

2、實時螢光定量rt-pcr法檢測zeb2基因的沉默效率

處於對數生長期的人胰腺癌panc-1細胞和正常人口腔上皮細胞進行胰酶消化，製成細胞懸液(細胞數約為6.0×104/ml)接種於6孔板中，培養至細胞融合度達到約40％。根據侵染複數(panc-1的moi為20)值，加入適宜量的的病毒，培養24h後更換培養基，待侵染時間達到5天後，收集細胞。根據invitrogen公司的trizol操作說明書，抽提總rna。根據promega公司的m-mlv操作說明書，將rna逆轉錄獲得cdna(逆轉錄反應體系見表7，42℃反應1h，然後在70℃水浴鍋中水浴10min使逆轉錄酶失活)。

採用abi7500型realtimepcr儀(life)進行實時定量檢測。基因的引物如上述實施例所述。實驗結果(圖3)表明，實驗組中人胰腺癌panc-1細胞的zeb2mrna表達水平分別下降了99.3％和99.5％，具有較好的抑制表達效果。

3、檢測侵染zeb2-shrna慢病毒的腫瘤細胞的增殖能力

將上述實驗2製備的細胞，待侵染時間達到5天後，收集處於對數生長期的各實驗組細胞。完全培養基重懸成細胞懸液(2×104/ml)，以細胞密度約為2000個/孔，接種96孔板。每組5個復孔，每孔100μl。鋪好板後，置37℃、5％co2培養箱培養。從鋪板後第二天開始，每天用cellomics儀器(thermofisher)檢測讀板一次，連續檢測讀板5天。通過調整cellomicsarrayscan的輸入參數，準確地計算出每次掃描孔板中的帶綠色螢光的細胞的數量，對數據進行統計繪圖，繪出細胞增殖曲線。結果表明，二個zeb2shrna慢病毒侵染的人胰腺癌panc-1細胞在體外培養5天後，活力細胞數目分別下降了88.9％和86.4％，表明zeb2基因沉默導致腫瘤細胞增殖能力被抑制。

上面通過具體實施例詳細說明本發明。本領域技術人員應清楚，本發明並不限於此處所列出的實施例，其保護範圍由所附權利要求書限定，下面的實施例僅僅是以示例的方式說明本發明，以使本發明更易於理解。

序列表

〈110〉申請人

〈120〉zeb2基因表達變異在胰腺癌化療預後診斷中的應用

〈210〉1

〈211〉22

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉zeb2-1sirna

cccagaagcccctgaggagctg

〈210〉2

〈211〉22

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉zeb2-2sirna

tactgcaagcgggaggcggagg

〈210〉3

〈211〉19

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉zeb2上遊引物

5』-agccaaggaatgctaccaa-3』

〈210〉4

〈211〉20

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉zeb2下遊引物

5』-ggccccagagcatcataatc-3』

〈210〉5

〈211〉20

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉β-actin上遊引物

5』-cagctgagagggaaatcgtg-3』

〈210〉6

〈211〉20

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉β-actin下遊引物

5』-cgttgccaatagtgatgacc-3』。