一種具有環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶活性的酶的製作方法

2023-10-05 18:52:34

專利名稱：一種具有環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶活性的酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及編碼一種新型鹼性環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶(CGT酶)的DNA序列，這種新型鹼穩定的CGT酶，一種含有該CGT酶的酶組合物，以及該酶和酶組合物在若干工業應用中的用途。
背景技術：
環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶(E.C.2.4.1.19)，也被稱為環糊精葡聚糖轉移酶或環糊精糖基轉移酶，在後面稱之為CGT酶，它催化澱粉和類似底物經過一個分子內的轉糖基反應而變為環麥芽糖糊精的轉化，由此形成不同大小的環麥芽糖糊精，在後面稱之為環糊精(或CD)。商業上最重要的是6、7和8個葡萄糖單位的環糊精，分別命名為α-,β-和γ-環糊精。商業上重要性較小的是9、10和11個葡萄糖單位的環糊精，分別命名為δ-,ε-和ζ-環糊精。
因此環糊精是具有一個疏水內部洞穴的環狀葡萄糖寡聚體。它們能夠在水溶液中與許多小的疏水分子形成包涵體複合物，導致物理性質的改變，例如溶解性和穩定性增加，而化學反應性和揮發性降低。發現環糊精尤其可應用於食品、化妝品、化學和製藥工業。
大多數CGT酶具有降解澱粉活性和轉糖基反應活性。雖然一些CGT酶產生α-環糊精，一些CGT酶分別主要產生β-環糊精或γ-環糊精，CGT酶通常形成α-,β-和γ-環糊精的混合物。用有機溶劑進行選擇性沉澱步驟可用於分離單獨的α-,β-和γ-環糊精。為避免昂貴的和有害環境的方法，需要能夠產生比例增加的一種特定類型的環糊精的CGT酶。
本發明的目的是提供一種熱鹼穩定的，具有寬pH範圍的環糊精環化活性並主要產生α-CD的CGT酶。
同樣期望的是找到一種在相對高的溫度和pH值下保持穩定的CGT酶。
這使得此酶適合於許多需要在高pH值和高溫下進行的工業應用。CGT酶的結構CGT酶功能上與α-澱粉酶相關。CGT酶與α-澱粉酶均通過水解α-(1,4)-糖苷鍵降解澱粉，但各自產生本質不同的環狀和線性產物。
CGT酶家族成員具有高度的全部胺基酸序列一致性，高於CGT酶的60％。而且，CGT酶與α-澱粉酶具有30％的胺基酸序列一致性。已表徵過的CGT酶下面提到的是描述了目前表徵過的CGT酶的性質的參考文獻。
目前認為下面提到的CGT酶中沒有任何一個具有本發明的CGT酶所具有的特異性特點，尤其是主要產生α-CD的能力。
不同細菌來源的CGT酶，包括從芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、微球菌屬(Micrococcus)、熱厭氧桿菌屬(Thermonanaerobacter和Thermonanaerobacterium)得到的CGT酶已在文獻中描述。
Kimura等人[Kimura K,Kataoka S,Ishii Y,Takano T和YamaneK；細菌學雜誌(J.Bacteriol.)1987 169 4399-4402]描述了一種芽孢桿菌屬種1011的CGT酶，Kaneko等人[Kaneko T,Hamamoto T和Horikoshi K；普通微生物學雜誌(J.Gen.Microbiol.),1988 134 97-105]描述了一種芽孢桿菌屬種菌株38-2的CGT酶，Kaneko等人[Kaneko T,Song K B,Hamamoto T,Kudo T和Horikoshi K；普通微生物學雜誌，1989 1353447-3457]描述了一種芽孢桿菌屬種菌株17-1的CGT酶，Itkor等人[Itkor P,Tsukagoshi N和Udaka S；生物化學生物物理學研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)1990 166 630-636]描述了一種芽孢桿菌屬種菌株B1018的CGT酶，Schmid等人[Schmid G,Englbrecht A,Schmid D；第四屆國際環糊精研討會彙編(Proceedings of the FourthInternational Symposium on Cyclodextrins)(Huber O,Szejtli J，編)]描述了一種芽孢桿菌屬1-1的CGT酶，Kitamoto等人[Kitamoto N,KimuraT,Kito Y,Ohmiya K；發酵生物工程學雜誌(J.Ferment.Bioeng.)1992 74345-351]描述了一種芽孢桿菌屬種菌株KC201的CGT酶，Salai等人[Sakai S,Kubota M,Nakada T,Torigoe K，和o O和Sugimoto T；日本澱粉科學協會雜誌(J.Jpn.Soc.Starch.Sci)1987 34 140-147]描述了一種嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stear othermophilus)的CGT酶和一種浸麻類芽孢桿菌(Bacillus macerans)的CGT酶，Takano等人[rakano T,Fukuda M,Monma M,Kobayashi S,Kainuma K和Yamane K；細菌學雜誌1986 166(3) 118-1122]描述了一種浸麻類芽孢桿菌的CGT酶，Sin等人[Sin K A,Nakamura A,Kobayashi K,Masaki H和Uozumi T；微生物生物技術應用(Appl.Microbiol.Biotechnol.)1991 35 600-605]描述了一種Bacillus ohbensis的CGT酶，Nitschke等人[Nitschke L,HeegerK,Bender H和Schultz G；微生物生物技術應用1990 33 542-546]描述了一種環狀芽孢桿菌的(Bacillus circulans)CGT酶，Hill等人[Hill D E,Aldape R和Rozzell J D；核酸研究(Nucleic Acids Res.)1990 18 199]描述了一種地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的CGT酶，Tomita等人[Tomita K,Kaneda M,Kawamura K和Nakanishi K；發酵生物工程學雜誌1993 75(2)89-92]描述了一種Bacillus autolyticus的CGT酶，Jamuna等人[Jamuna R,Saswathi N,Sheela R和Ramalrishna S V；微生物生物技術應用1993 43 163-176]描述了一種蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)的CGT酶，Akimaru等人[Akimaru K,Yagi T和Yamamoto S；發酵生物工程學雜誌1991 71(5)322-328]描述了一種凝結芽孢桿菌菌(Bacilluscoagulans)的CGT酶，Schmid G[Schmid G；環糊精和衍生物的新趨向(New Trends in Cyclodextrins and Derivatives)(Duchene D，編)Editionsde Sante,Paris,1991,25-54]描述了一種堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)的CGT酶，Abelian等人[Abelian V A,Adamian M O,Abelian L A A,Balayan A M和Afrikian E K；生物化學(Biochememistry)(Moscow)199560(6)665-669]描述了一種Bacillus halophilus的CGT酶，以及Kato等人[Kato T和Horikoshi K；日本澱粉科學協會雜誌1986 33(2)137-143]描述了一種枯草芽孢桿菌的CGT酶。
EP 614971描述了一種短桿菌屬的CGT酶，Haeckel和Bahl[HaeckelK,Bahl H；(FEMS Microbiol.Lett.)1989 60 333-338]描述了熱產硫磺梭狀芽孢桿菌(Clostridium thermosulfurogenes)的CGT酶，PodkovyrovZeikus[Podkovyrov S M,Zeikus J G；細菌學雜誌(J.Bacteriol.)1992 1745400-5405]描述了一種熱硫化氫梭狀芽孢桿菌(Clostridiumthermohydrosulfuricum)的CGT酶，JP 7000183公開了一種棒桿菌屬的CGT酶，Binder等人[Binder F,Huber O和Bock A；基因(Gene)198647 269-277]描述了一種肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoiae)的CGT酶，US 4,317,881描述了一種微球菌屬的CGT酶，以及Wind等人[Wind R D,Liebl W,Buitelaar R M,Penninga D,Spreinat A,DijkhuizenL,Bahl H；應用環境微生物1995 61(4)1257-1265]描述了熱產硫磺熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes)的CGT酶。
Norman和Jorgensen[Norman B E,Jorgensen S T；(DenpunKagaku)1992 39 99-106,以及WO 89/03421]已經報導了熱厭氧桿菌屬種產生的一種CGT酶。
並且，還報導了來自於嗜熱放線菌的一種CGT酶[Abelian V A,AfvanK B,Avakian Z G,Melkumyan A G和Afrikian E G；生物化學(Moscow)1995 60(10)1223-1229]。
近來已經應用蛋白質工程來修飾特定的CGT酶以選擇性地產生更多或更少的某一特定的環糊精。
WO 96/33267(Novo Nordisk)描述了新的CGT酶變體，與前體酶相比，此變體具有增加的產物選擇性和/或降低的產物抑制作用。
發明概述本發明者意外地鑑定了一種環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶(CGT酶)，它來自於一種新的稱為Thermoalcalibacter bogoriae的屬於梭狀芽孢桿菌/芽孢桿菌亞門的中等熱嗜鹼性厭氧菌菌株。
本發明中的CGT酶已被充分表徵，並表明它主要產生α-環糊精(相對於β-和γ-環糊精)。
更進一步，部分DNA序列已經被克隆、分離和測序並進行了異源表達。
因此，本發明第一方面涉及一種分離的CGT酶，其特徵在於與支鏈澱粉在65℃,pH8.0下溫育2小時後產生至少75％的α-環糊精(相對於β-和γ-環糊精)。換句話說，是在環糊精的總量，即α-,β-和γ-環糊精的基礎上計算的75％的α-環糊精。
本發明中CGT酶在相對高溫下(65℃)產生至少75％的α-環糊精的能力非常有利於若干工業上的應用。
已表徵的CGT酶和CGT酶的變體或者產生相對於β或γ-CD的佔較少部分的α-環糊精(WO 96/33267)，或者當能產生相對高數量的α-環糊精時不是熱穩定的(即不能在65℃下表現出任何實際的活性)(Kitahata,S.和Okada,S.1982.來自於巨大芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和浸麻類芽孢桿菌的環糊精葡聚糖轉移酶作用的比較，日本澱粉科學協會雜誌29,1:13-18；和Lee,J.-H等人1992)。
此外，目前相信本發明中的CGT酶是第一個描述並表徵的來源於熱嗜鹼性厭氧菌的細胞外澱粉分解酶。
因而，本發明第二方面涉及從Thermoalcalibacter屬種菌株獲得的分離的細胞外CGT酶。
因而，本發明第三方面涉及同源地產生本發明的CGT酶的方法，此方法包含在允許產生此酶的條件下培養Thermoalcalibacter bogoriae菌株，以及從培養物中回收此酶。
此外，本發明涉及一種酶或酶組合物，以及這種酶或酶組合物在若干工業應用中的用途。
本發明還涉及編碼表現CGT酶活性的酶的分離的DNA序列，包含SEQ ID No.13所示的部分序列；包含編碼具有SEQ ID No.13所示序列的該CGT酶的表達載體；導入了本發明的表達載體的一種宿主細胞，此細胞表達包含SEQ ID No.13所示DNA序列的DNA序列所編碼的CGT酶。附圖簡述本發明進一步參考附圖加以說明，其中

圖1多種純化步驟的SDS-PAGE。圖1顯示了在澱粉上生長的Thermoalcalibacter bogoriae的蛋白質的電泳分離。經過PD-10處理的濃縮上清液(泳道1+2),α-澱粉酶(泳道3、4、5)，純化的α-澱粉酶(泳道5),CGT酶(泳道6+7)，銀染(泳道1、3、5、6)，活性染色(泳道2、4、7)。
圖2顯示了來自於Thermoalcalibacter bogoriae的CGT酶的最適pH。為確定最適pH，用含有0.5％(重量/體積)可溶性澱粉的通用緩衝液(BrittonRobinson),pH 4.0-11.0，在65℃下溫育30分鐘。確定了CGT酶所示水解活性(J)和環化活性(C)。100％殘留活性分別相當於0.12U/ml的轉化為低聚糖(·)或500U/ml的環化活性(Δ)。
圖3顯示了來自於Thermoalcalibacter bogoriae的CGT酶的最適溫度。在含有0.5％(重量/體積)可溶性澱粉的pH8.0的100mM磷酸鈉緩衝液中進行30分鐘的溫育。100％殘留活性相當於0.11U/ml測得的轉化為低聚糖的活性。
圖4顯示了來自於Thermoalcalibacter bogoriae的CGT酶與可溶性澱粉(A)，及支鏈澱粉(B)在pH9.0溫育長達16小時後水解產物的HPLC分析。預純化的CGT酶與不同底物在pH8.0及65℃下溫育長達16小時。
圖5顯示了預純化的CGT酶作用產生的環糊精的比例。定義在更具體地討論本發明之前，首先需要限定下列術語。
「一段克隆的DNA序列」術語「一段克隆的DNA序列」是指經用於基因工程的標準克隆步驟進行克隆的DNA序列，以使其從自身天然位點轉移到它可以被複製的另一位點的一段DNA序列。克隆過程包括所需DNA片段的切除和分離，或者用PCR擴增製備，將DNA片段插入載體分子，以及重組載體整合入此DNA片段的多拷貝或克隆可以複製的細胞的過程。
本發明中「克隆的DNA序列」也可以稱為「DNA構件」或「分離的DNA序列」。
「獲自」為本發明的目的，術語「獲自」用於此處與特定的微生物來源相關聯，表示此酶由特定來源產生，或由已插入了來自該來源的基因的細胞產生。
「一段經分離的多肽」用於本發明中的關於CGT酶的術語「一段經分離的多肽」或「經分離的CGT酶」，如此處所限定的那樣，是指本質上不含非CGT酶多肽的一種CGT酶或CGT酶的部分，即它經SDS-PAGE測定至少約20％純度，優選地至少約40％純度，更優選地約60％純度，更更優選地約80％純度，最優選地約90％純度，進一步最優選地約95％純度。術語「經分離的多肽」或者可以稱為「純化的多肽」。
「同源雜質」術語「同源雜質」用於此處表示本發明中的酶最初獲自的同源細胞所產生的任何雜質(例如，不同於本發明中的酶的另一種多肽)。在本發明中同源細胞可以例如是Thermoalcalibacter bogoriae菌株。
「環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶(CGT酶)」在本文中CGT酶是按IUB酶命名法命名為EC2.4.1.19。其它名稱環糊精轉糖基轉移酶。環糊精葡聚糖轉移酶通過形成1,4-α-D-糖苷鍵將澱粉降解為環糊精。
「分解澱粉的」在本文中，術語「分解澱粉的」或「澱粉分解活性」是用來表示所指的酶具有澱粉降解能力。具有澱粉水解活性的酶的特定實例即澱粉分解酶，包括α-澱粉酶，支鏈澱粉酶，新支鏈澱粉酶，異澱粉酶，β-澱粉酶，CGT酶，產麥芽糖酶(maltogenase)以及G-4和G-6澱粉酶。
「中等熱嗜鹼性」術語「中等熱嗜鹼性」涉及能在相對高的溫度下，即高於55℃例如高於60℃或65℃，並且在相對高的pH水平高於8.5，例如高於9或10時能夠生存的細胞。
「細胞外的」術語「細胞外的」用於此處與一種酶相聯繫，此酶是一種由產生此酶的細胞排出的酶，即它被分泌或擴散出此細胞外。這種酶通常包含一段信號肽來引導此酶的分泌(即排出細胞)。
「序列比較」術語「序列比較」用於此處與一系列DNA序列和/或胺基酸序列比較相關聯，表示將目標序列排列在一起，以鑑定目標序列之間的同源/等同的共同/共有的序列。此過程用於確定目標序列之間的共有「保守區域」。序列比較適合運用本領域已知的電腦程式進行測定，例如GCG程序包中提供的ClusterW或PILEUP(Wisconsin程序包的程序手冊，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin，美國53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物學雜誌(Journal of Molecular Biology),48,443-453)。
術語「保守區域」用於此處與位於目標DNA序列和/或胺基酸序列之間的「保守區域」相關聯，表示目標序列的一個共同的共有序列區域，其中目標序列之間具有相對高度的序列一致性。本文中一段保守序列優選地至少10個鹼基對(bp)/3個胺基酸(a.a)，更優選地至少20bp/7a.a，甚至更優選地至少30bp/10a.a.。使用電腦程式GAP(Wisconsin程序包的程序手冊，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group,575 ScienceDrive,Madison,Wisconsin，美國53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物學雜誌，48,443-453)(參見上文)，用下列設置進行DNA序列比較GAP產生罰5.0,GAP延伸罰0.3，保守區域內的DNA序列一致性優選地至少為80％，更優選地至少85％，更優選地至少90％，甚至更優選地至少95％。
術語「引物」用於此處尤其是與PCR反應相關聯，它是按照本領域已知的通用的標準規範來限定和構建的一段寡核苷酸(尤其是「PCR-引物」)(「PCR實踐入門」(「PCR A practical approach」)IRL Press,(1991))。
術語「針對一段序列的引物」表示此引物(優選地應用於PCR反應)被構建以表現出與目標序列部分至少80％的一致性，更優選地與目標序列部分至少90％的一致性，因而該引物可以「針對」此序列。此引物被設計使其在其所針對的區域和給定的溫度下發生特異性的退火。尤其是在引物3』末端的一致性對聚合酶的功能，即聚合酶延伸經退火的引物的能力是很重要的。
術語「表達載體」表示一個線性或環狀的DNA分子，此分子含有編碼目標多肽的片段，此片段有效地與供其轉錄的附加片段相連接。此附加片段可以包含啟動子和終止子序列，也可以選擇性地包含一或多個複製起點，一或多個選擇性標記，一個增強子，一個多聚腺苷酸化信號等。表達載體通常衍生於質粒或病毒DNA，或可以包含兩者的元件。本發明的表達載體可以是任何方便於進行重組DNA操作的表達載體，載體的選擇通常依賴於載體所要導入的宿主細胞。因而，載體可以是自主複製載體，即作為染色體外單位存在的載體，其複製獨立於染色體複製，例如質粒。載體也可以是這樣的載體，當它導入宿主細胞後，整合到宿主細胞基因組中並隨它整合進的染色體一起複製。
術語「重組性表達」或「重組性地表達」用於此處與按照本領域的標準定義進行限定的多肽或蛋白質的表達相關聯。通常用上面剛描述的表達載體進行蛋白質的重組性表達。
術語「經分離的」，當用於DNA時，表示此DNA已經從它原來的遺傳環境轉移出來，因而沒有其它外來或不需要的編碼序列，並且以適合應用於遺傳工程蛋白質製備系統的形式存在。此分離的DNA是那些從其天然環境分離出來的，包括cDNA和基因組克隆。本發明中分離的DNA分子沒有它們通常與之相連的其它基因，但可以包含天然存在的5』和3』非翻譯區例如啟動子和終止子。相關區域的確定對於一個本領域的普通專業人員是顯而易見的。(例如參見，Dynan和Tijan，自然(Nature)316:774-78,1985)。術語「經分離的多聚核苷酸」也可以稱為「克隆的多聚核苷酸」。
當應用於蛋白質時，術語「經分離的」表示此蛋白質是在不同於它的天然環境的條件下得到的。經分離的蛋白質的優選形式是基本上沒有其它蛋白質，尤其是其它同源蛋白質(即「同源雜質」(見下面))。優選的是提供高於40％純度形式的蛋白質，更優選的是高於60％純度的形式。甚至更優選的是提供高度純化形式的蛋白質，即高於80％純度，更優選的是高於95％純度，甚至更優選的是高於99％純度，純度用SDS-PAGE測定。
術語「經分離的蛋白質/多肽」也可以被稱為「經純化的蛋白質/多肽」。
術語「部分DNA序列」表示包含在一段更長的DNA序列中的一部分DNA序列，該更長的DNA序列包含編碼具有目標活性的多肽的足夠信息。
術語「部分多肽序列」表示包含在一段更長的多肽序列中的部分多肽序列，其中該更長的多肽序列具有目標活性。
術語「同源雜質」指本發明中的多肽最初所獲自的同源細胞產生的任何雜質(例如不同於本發明中的多肽的另一種多肽)。
術語「獲自」用於此處與特定的微生物來源相關聯，表示此多聚核苷酸和/或多肽由特定來源產生，或由已插入了來自此來源的基因的細胞產生。
術語「有效地連接」，當指DNA片段時，表示排列這些片段以使它們的功能符合所需的目的，例如轉錄從啟動子開始，沿編碼片段進行直到終止子。發明詳述獲自Thermoalcalibaeter bogoriae的CGT酶此處的有效實施例(參見下文)中描述了用於測定本發明的CGT酶產生的α-環糊精相對量的方法，並且圖5顯示了實驗結果。
簡言之，為測定CGT酶活性的水解產物，將酶與不同底物(例如支鏈澱粉)在65℃和pH8.0溫育1、2以及直至16小時。測定環化活性，定性地確定底物的特異性，從定量HPLC分析中闡明產生的CD之間的比例。
當支鏈澱粉被用作底物且在65℃,pH8.0溫育2小時時，本發明的CGT酶優選地產生至少75％的α-環糊精(相對於β或γ-環糊精)，更優選地至少80％的α-環糊精(相對於β或γ-環糊精)，或者甚至更優選地至少85％的α-環糊精(相對於β或γ-環糊精)。
應當理解，除了主要為α-環糊精之外，本發明的CGT酶能產生少量的β或γ-環糊精。
在另一實施方案中，本發明的CGT酶具有的分子量優選為67±10kD(即57-77kD)，更優選分子量67±5kD(即62-72kD)，甚至更優選分子量67±3kD(即64-70kD)，並且最優選分子量67±2kD(即65-69kD)。通過下面「材料和方法」部分(見下)描述的SDS-PAGE電泳來測定分子量。
在另一實施方案中，本發明的CGT酶具有的最適溫度優選為65±10℃(即55-75℃)，更優選最適溫度65±5℃(即60-70℃)，並且更更優選65±2℃(即63-67℃)。通過將酶與溶於100mM磷酸鈉緩衝液的0.5％(重量/體積)的底物溶液(可溶性澱粉；Merck)在pH8.0時共同溫育來測定最適溫度。在30-80℃之間的溫度下進行30分鐘的溫育。進一步的細節見此處的有效實施例(見下)。微生物來源本發明的CGT酶或編碼本發明的CGT酶的DNA序列可獲自相應於梭狀芽孢桿菌/芽孢桿菌亞門內的Thermoalcalibacter系的細菌，尤其是如下描述的Thermoalcalibacter bogoriae菌株Thermoalcalibacter bogoriae的表徵細胞為杆狀，寬0.3-0.5μm且長3-5μm。菌落直徑3-5mm，蒼白色，透鏡狀。專性厭氧菌。生長溫度範圍30℃到65℃，最適約為50℃到55℃。生長pH範圍從pH6到10.5，最適為pH9.5；在從0到4％的NaCl中生長，最適為1％的NaCl，表明最適Na+濃度為230mM。有蛋白腖時異養生長。在硫酸鹽、硫代硫酸鹽或硫存在時生長。硫代硫酸鹽增強在可發酵底物諸如葡萄糖和澱粉上的生長，導致H2S的形成。在澱粉和硫代硫酸鹽上的發酵產物為乙酸鹽和乙醇。細胞壁類型為革蘭氏陽性，但細胞壁為非典型的較薄。細胞分隔部分有片狀結構。經常出現分枝的細胞，可以觀察到外表層的部分。
16S rRNA分析顯示Thermoalcalibacter bogoriae為梭狀芽孢桿菌/芽孢桿菌亞門的一個新品系。在德意志微生物和細胞培養物保藏中心(DSMZ)進行16S rRNA的測序分析。
本發明的CGT酶或編碼本發明的CGT酶的DNA序列所來源的Thermoalcalibacter bogoriae菌株的一種分離物，已經被發明者按照以專利申請為目的的關於微生物保藏的國際公約的布達佩斯條約。在德意志微生物及細胞培養物保藏中心保藏(DSMZ),Mascheroder Weg 1b,D-38124Braunschweic，德國。
保藏日期1996年9月11日保藏人代號NN049260DSM No.:Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380.製備CGT酶的方法本發明的CGT酶可通過培養同源菌株來生產，例如在合適培養基中培養上面所述的保藏菌株，形成允許產生此酶的條件。
用於培養該菌株的培養基可為任何適合於該菌生長的傳統培養基。分泌到培養基中的CGT酶可以用眾所周知的方法從中回收，包括通過離心或過濾從培養基中分離細胞，通過諸如硫酸銨的鹽沉澱培養基的蛋白質組分，隨後進行層析步驟，諸如離子交換層析、親和層析或類似方法。CGT酶的克隆從Thermoalcalibacter bogoriae中能克隆編碼本發明CGT酶的DNA序列。
若干合適的標準DNA克隆方法已經被例如Sambrook等人進行了描述(分子克隆實驗手冊(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室；冷泉港，紐約，(1989)。
DNA序列的克隆可以通過純化酶(例如此處有效實施例所描述的(見下))，測定胺基酸序列，以及依據此胺基酸序列製備適合的探針或PCR引物來進行。
本發明的CGT酶可以通過任何常用方法克隆，包括-在合適的載體上從任何期望產生目標CGT酶的微生物中克隆DNA文庫，-用該載體轉化合適的宿主細胞，-在合適的條件下培養宿主細胞，以表達由DNA文庫中的一個克隆編碼的CGT酶，-通過測定這些克隆產生的酶的任何CGT酶活性篩選陽性克隆，以及-從這種克隆中分離編碼CGT酶的DNA。
如以下實施例3和4中將要描述的那樣，一段部分DNA序列(見包含SEQ ID No.10的SEQ ID No.13)被分離、克隆和測序。通過比較SEISSPROT資料庫公開結構域的若干已知CGT酶確定了已知CGT酶的前三個保守區域。根據對這些保守區域的認識設計了三個引物。然後以獲自Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380的純化的基因組DNA進行PCR擴增，得到1.15kb的PCR產物並對其測序。SEQ ID No.10顯示了上述編碼CGT酶的部分DNA序列。
然後該顯示於SEQ ID No.10的部分序列被作為確定CGT酶序列的下一部分的出發點。通過用反向PCR(見M.J.MCPherson等人「PCR實踐入門」(「PCR A practical approach」)Information Press Ltd.,Oxford，英國)延伸SEQ ID No.10得到SEQ ID No.13所示序列。
依據SEQ ID No.10或SEQ ID No.13中所示部分DNA序列，本領域的技術人員能很容易地克隆編碼本發明的完整CGT酶的DNA序列。
一旦知道了基因的全序列，可以通過PCR擴增步驟將全部基因克隆進合適的表達載體，例如源自pUB110(Gryczan，等人(1978)，細菌學雜誌134,318-329),pE194(Horinouchi等人(1982)細菌學雜誌150,815-825)或pC194(Horinouchi等人(1982)細菌學雜誌150,804-814)的用於芽孢桿菌類的質粒。
依據此處公開的序列信息(SEQ ID No.13和SEQ ID No.14)，對於本領域技術人員來說，通過利用獲自相關微生物的基因文庫，尤其是獲自其它梭狀芽孢桿菌/芽孢桿菌亞門的基因文庫，尤其是Thermoalcalibacter，以類似策略來分離編碼本發明的同源CGT酶的同源多聚核苷酸序列只是常規工作。
期待編碼同源酶的DNA序列(即類似的DNA序列)可以從其它細菌獲得，例如下列屬中的菌株芽孢桿菌屬，短小桿菌屬，梭狀芽孢桿菌屬，棒桿菌屬，克雷伯氏桿菌屬，微球菌屬，熱厭氧桿菌屬，諸如前面「已表徵過的CGT酶」部分提到的種類。DNA構件本發明也涉及包含一種DNA序列的DNA構件，該DNA序列包含a)包含了SEQ ID No.13所示部分DNA序列的編碼CGT酶的DNA序列，或b)a)中定義的DNA序列的類似物，其ⅰ)與包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定義的DNA序列至少70％同源，或ⅱ)與和包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定義的DNA序列相同的寡核苷酸探針雜交，或ⅲ)編碼一段與包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定義的DNA序列編碼的多肽至少70％同源的多肽，或ⅳ)編碼與一種抗體發生免疫反應的多肽，此抗體抗純化的源自Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380的CGT酶，其由包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定義的DNA序列編碼。
在本文中，包含SEQ ID No.13所示部分序列的所定義之DNA序列「類似物」這一說法意在表示編碼具有上述ⅰ)至ⅳ)特性的多肽之DNA序列。典型地，此類似的DNA序列-以包含SEQ ID No.13所示部分序列所定義之DNA序列為依據，用此處描述的方法被從另一種或相關的(例如相同的)已知或推定為產生具有CGT酶活性的生物中分離出來，或-以包含SEQ ID No.13所示部分序列所定義之DNA序列為依據進行構建，例如通過引入核苷酸替換，這不會產生與包含SEQ ID No.13所示部分序列的DNA序列編碼的CGT酶的另一種胺基酸序列，但這與用於產生此酶的宿主生物的密碼子選擇相對應，或者通過引入核苷酸替換導致產生不同的胺基酸序列，並且因此可能產生不同的蛋白質結構，這可能導致產生具有與天然不同特性的變體。其它可能的修改實例是將一或多個核苷酸插入序列中，在序列的任一末端加上一或多個核苷酸，或在序列的任一末端或序列內部缺失一或多個核苷酸。例如，類似的DNA序列可以是SEQ ID No.13所示部分DNA序列的亞序列。
上述ⅰ)中提到的同源性用兩個序列之間的相同程度確定，表明第一個序列衍生自第二個。通過利用本領域已知的電腦程式例如GCG程序包中提供的GAP(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物學雜誌，48,443-453)，可以合適地測定同源性。用GAP按照下列設置進行DNA序列比較GAP產生罰5.0,GAP延伸罰0.3,DNA序列的編碼區與SEQ ID No.13所示部分DNA序列的編碼區的一致性優選地至少為70％，更優選地至少80％，更更優選地至少85％，更更優選地至少90％，甚至更更優選地至少95％，尤其至少99％。
上述ⅱ)中提到的雜交意在指出類似的DNA序列與和該DNA序列相同的探針雜交，此序列包含SEQ ID No.13所示部分序列，在特定的特異性條件下編碼本發明的CGT酶，這些條件在此處之後的材料和方法部分中有詳細描述。
通常，類似的DNA序列與該DNA序列高度同源，例如與上述定義的包含SEQ ID No.13所示部分序列的DNA序列至少70％同源，例如至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或甚至至少99％同源。
上述ⅲ)中提到的同源程度用兩個序列之間的相同程度確定，表明第一個序列衍生自第二個。通過利用本領域已知的電腦程式可以合適地測定同源性。典型地，由類似的DNA序列編碼的多肽與上述定義的包含了一段含有SEQ ID No.13所示部分DNA序列之DNA序列的DNA構件所編碼的酶表現出至少70％的同源性，例如至少80％、85％、90％、95％、99％的同源性。
用下面材料和方法部分描述的方法可以確定免疫反應性。表達載體隨後可以將上述定義的包含了一段含有SEQ ID No.13所示部分DNA序列的DNA序列插入到重組表達載體中。其可以是任何方便於進行重組DNA步驟的載體，而且載體的選擇常常依賴於它將要導入的宿主細胞。因此，載體可以為自主複製載體，即作為染色體外單位存在的載體，其複製獨立於染色體複製，例如質粒。或者，載體可以為當導入宿主細胞時，整合進宿主細胞基因組並與其整合進的染色體一起複製的載體。
在載體中，編碼本發明的CGT酶的DNA序列應當有效地連接於合適的啟動子和終止子序列。啟動子可以為在所選宿主細胞中表現轉錄活性的任何DNA序列，並且可以衍生自編碼與宿主細胞同源或者異源的蛋白質基因。
優選使用受獲自地衣芽孢桿菌和/或地衣芽孢桿菌信號的產麥芽糖α-1,4-澱粉酶的啟動子控制的載體。
分別連接編碼酶/蛋白質、啟動子和終止子的DNA序列並且將它們插入到合適載體的步驟，對於本領域的技術人員是眾所周知的(參見，例如Sambrook等人(1989)，(分子克隆實驗手冊，冷泉港，紐約)。宿主細胞能被編碼本發明的CGT酶的DNA序列轉化的宿主細胞可以為真核或原核細胞。
合適的原核宿主細胞為細菌細胞。
經培養能產生本發明的新型酶的細菌宿主細胞的例子為革蘭氏陽性菌，例如芽孢桿菌屬的菌株，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)，遲緩芽孢桿菌(B.lentus)，短芽孢桿菌(B.brevis)，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜鹼芽孢桿菌(B.alkalophilus)，解澱粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，凝結芽孢桿菌(B.coagulans)，環狀芽孢桿菌(B.circulans)，燦爛芽孢桿菌(B.lautus)，巨大芽孢桿菌(B.megaterium)或蘇雲金芽孢桿菌(B.thuringiensis)，或者鏈黴菌屬(Streptomyces)的菌株，如淺青紫鏈黴菌(S.lividans)或鼠灰鏈黴菌(S.murinus)，或者革蘭氏陰性菌如大腸桿菌。用原生質體轉化或按照自知的方法利用感受態細胞(參見Sambrook等人，(1989)出處同前)可以有效地進行細菌的轉化。
當在諸如大腸桿菌的細菌中表達CGT酶時，多肽一般作為不溶性顆粒(已知為包涵體)保留在細胞質中，或可被細菌的分泌序列引導到胞質間隙。在前一種情況下，裂解細胞並且回收和變性顆粒，然後稀釋變性劑使多肽重新摺疊。在後一種情況下，通過破裂細胞可以從胞質間隙回收多肽，例如通過超聲波處理或滲透壓衝擊以釋放胞質間隙的內容物並回收多肽。
合適的真核細胞尤其為真菌細胞，例如酵母或絲狀真菌細胞。
合適的酵母細胞的例子包括酵母屬(Saccharomyces)的細胞，尤其是釀酒酵母(S.cerevisiae)，克魯維酵母(S.kluyveri)，葡萄汁酵母(S.uvarum)，或者裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)的細胞，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharumyces pomb)。用異源DNA轉化酵母細胞和由其生產異源多肽的方法在以下出處中描述，例如在US 4,599,311,US 4,931,373,US 4,870,008,5,037,743，和US 4,845,075，所有這些在此引入作為參考。被轉化細胞通過選擇性標記決定的表型來篩選，通常是抗藥性或能在缺乏特定的營養成分如亮氨酸存在時生長的能力。用於酵母的一種優選載體是US 4,931,373公開的POT1載體。信號序列或者任選地前導序列可位於編碼本發明多肽的DNA序列之前，例如如前所述。合適的酵母細胞的其它例子有克魯維酵母菌屬，例如乳酸克魯維酵母(K.lactis)，或者漢遜酵母屬(Hansenulla)，例如多形漢遜酵母(H.polymorpha)，或者畢氏酵母屬(Pichia)，例如巴斯德畢氏酵母(P.pastoris)，或者Yarrowia spp.，例如Yarrowia lipolytica(參見，Gleeson等人(1986)，普通微生物學雜誌132,p.3459-3465；US 4,882,279)。
其它真菌細胞的例子有絲狀真菌細胞，例如麴黴屬(Aspergillus)，脈孢菌屬(Neurospora)，鐮孢屬(Fusarium)或木黴屬(Trichoderma)，尤其是米麴黴(A.oryzae)，構巢麴黴(A.nidulans)或黑麴黴(A.niger)。用於蛋白質表達的麴黴屬用途在例如EP 272 277,EP 238 023和EP 184 438中進行了描述。例如，可依據Malardier等人(1989)基因(Gene)78,p.147-156的描述進行尖鐮孢黴(F.oxysporum)的轉化。
當絲狀真菌用作宿主細胞時，可以被本發明的DNA構件轉化，即通過將此DNA構件整合入宿主染色體可方便地獲得重組宿主細胞。這一整合通常被認為具有優勢，因為此DNA序列更易於穩定維持於細胞中。可以依據傳統方法，例如同源或異源重組將DNA構件整合進宿主染色體。本發明的CGT酶的重組或異源表達然而另一方面，本發明涉及一種生產本發明的CGT酶的方法，在此方法中，在允許產生CGT酶的條件下，培養用編碼CGT酶的DNA序列轉化的合適的宿主細胞，並且從培養物中回收產生的CGT酶。
用於培養細胞的培養基可以是任何適合生長宿主細胞的傳統培養基，例如基本培養基或含適宜補充物的複合培養基。合適的培養基可以從供應商得到或按照公開的配方進行製備(例如在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。
細胞產生的所表達的CGT酶可再通過傳統步驟從培養基中獲取，根據目標多肽的類型，包括通過離心或過濾從培養基中分離宿主細胞，通過用鹽如硫酸銨來沉澱上清或濾液的蛋白質組分，通過不同的層析步驟，諸如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析或類似方法進行純化。CGT酶的重組表達在又一方面，本發明涉及一種CGT酶，其a)由本發明的DNA構件編碼，b)利用本發明的方法生產，並且/或者c)與抗經純化的CGT酶的抗體發生免疫反應，此CGT酶由包含有源自Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380的SEQ ID No.13所示DNA序列的DNA序列編碼。酶組合物另一方面，本發明涉及一種含有上述同源或異源表達的CGT酶的酶組合物。
根據本領域已知方法可製備酶組合物，它可以為流體或乾燥複合物的形式。例如，酶組合物可為顆粒或微粒的形式(US 4106991,US5324649)。組合物中包含的酶可以按照本領域已知的方法穩定。
下面給出了本發明的酶組合物優選的應用例子。根據本領域中已知方法來確定本發明的酶組合物的劑量以及此組合物應用的其它條件。
按照本發明此酶和/或酶組合物至少可應用於下列目的之一。本發明的CGT酶的工業應用本發明的CGT酶在用於不同工業用途的環糊精生產過程中得到應用，尤其是食品、化妝品、化學、農業化學和製藥工業。
因此，另一方面，本發明涉及在生產環糊精，尤其是α-環糊精過程中本發明的CGT酶的用途。
本發明的CGT酶也可用於生產線性寡糖，尤其是2到12個葡萄糖單位的線性寡糖，優選2到9個葡萄糖單位的線性寡糖的過程中。
在另一優選實施方案中，本發明的CGT酶可用於環糊精的原位產生。在此方法中，可將本發明的CGT酶加到含底物的培養基中，其中酶能產生期望的環糊精。此用途尤其適合於應用在生產焙烤產品的方法中，應用在化學產物生產過程中穩定化學產物的方法中，以及應用在去汙劑組合物中。
已知特定的環糊精可提高焙烤產品的質量。因此本發明的CGT酶可用於加入到麵包改良的添加劑中，例如麵團組合物，麵團添加劑，麵團軟化劑，預製粉(premixes)，以及在製作麵包或其它焙烤產品過程中加入到麵粉和/或麵團的傳統生產過程中的類似的製劑。
因此，一方面本發明涉及麵包改良和/或麵團改良組合物，還涉及在這些組合物中本發明的CGT酶的使用，還涉及包含有本發明的麵包改良和/或麵團改良組合物的麵團或焙烤產物。
在本文中術語「麵包改良組合物」和「麵團改良組合物」意在表示這樣一種組合物，它除了酶組分外，可包括焙烤中傳統應用的用於提高麵團和/或焙烤產品品質的其它物質。後面給出了這些組分的例子。
在本文中術語「改善的品質」意在表示經CGT酶酶作用後得以改善的任何性質。尤其是，應用CGT酶使體積增加，麵包結構改善和焙烤產品軟化，以及麵團的強度、穩定性增加和黏度降低，因而改善了它的機器生產性能。發現使用質量較差的麵粉時對麵團的效果尤其好。機器生產性能的改善對工業化生產的麵團尤其重要。
通過與未加入按照本發明的CGT酶的麵團和/或焙烤產品比較，評價了品質的改善。
本發明的麵包改良和/或麵團改良組合物還可包括其它酶。其它酶的例子有纖維素酶，半纖維素酶，戊聚糖酶(用於部分水解戊聚糖來提高麵團的伸展性)，葡萄糖氧化酶(用於強化麵團)，脂酶(用於修飾麵團或麵團成分中存在的脂質以軟化麵團)，過氧化物酶(用於麵團改良的密度)，蛋白質酶(用於弱化麵筋，尤其是使用硬小麥麵粉時)，肽酶和/或澱粉酶，例如α-澱粉酶(用於提供可供酵母發酵的糖)。
除了其它酶組分之外，或者作為其它酶組分的替代物，麵包改良和/或麵團改良組合物可以包括傳統使用的焙烤劑，例如下列成分中的一或多個奶粉(產生外表的顏色)，麵筋(用於改善軟麵粉的氣體保留能力)，乳化劑(用於麵團改良的伸展性和一定程度地增加生產的麵包的密度)，顆粒化脂質(用於麵團軟化和麵包的密度)，氧化劑(加入以增強麵筋的結構，例如抗壞血酸、溴化鉀、偶氮二醯胺、過氧化鈣、碘化鉀或過硫酸銨)，胺基酸(例如半胱氨酸)，糖以及鹽(例如氯化鈉、乙酸鈣、硫酸鈉或硫酸鈣，用於使麵團更堅固)，麵粉或澱粉。
合適的乳化劑的例子有甘油單酯和甘油二酯，甘油單酯和甘油二酯的二乙醯基酒石酸酯，脂肪酸的糖酯，脂肪酸的多甘油酯，甘油單酯的乳酸酯，甘油單酯的乙酸酯，多氧乙烯硬脂酸酯，磷酯，卵磷脂和溶血卵磷脂。
本文中術語「焙烤產品」意在包括由麵團或(做糕餅時用雞蛋、麵粉等製成的)糊狀物製備的具有或軟或脆的特點的任何產品。用本發明方法有利的生產的白色、淺色或深色焙烤產品的例子有麵包(尤其是白麵包、全麥麵粉麵包、黑麥麵包或混合物)，典型的形式是麵包條或麵包卷、法式狹長方形麵包、過水麵包圈、皮塔餅、炸玉米卷、玉米面餅、蛋糕、薄煎餅、pannetone、餅乾、比薩餅、香脆麵包、饅頭等等。
本發明的麵團可以是上面討論的任何一類並且可以是新鮮的、預焙烤的(par-baked)或冷凍的。
從上述公開內容可以明顯看出，本發明的麵團通常是發酵過的麵團或糊狀物或者將要發酵的麵團或糊狀物。麵團或糊狀物可利用多種方式來發酵，例如用化學發酵試劑，酸性培養物/麵團，和/或酵母，但優選通過加入合適的酵母培養物如釀酒酵母(麵包酵母)培養物來發酵麵團。可以使用任何商業途徑獲取的釀酒酵母菌株。
進一步考慮可以利用本發明有效地製備糊劑(pasta)麵團，優選地用硬粒小麥麵粉或質量類似的麵粉製備。利用傳統技術以及類似上述方法中採用的CGT酶製備麵團。相信當用於糊劑的製備時，CGT酶導致麵筋結構的增強和因而引起的麵團粘性的降低和麵團強度的增加。
環糊精具有包括穩定作用及增溶作用等等的能力，因而環糊精能使氧化劑和光解物質穩定，使揮發性物質不揮發，使難溶物質溶解，並且使有味物質無味等等，因此可用於膠囊香水、維生素、染料、藥物、殺蟲劑和殺真菌劑。環糊精也能結合親脂性物質諸如膽固醇，以將它們從蛋黃、黃油等中去除。
環糊精也在有關塑料和橡膠產品和其生產過程中得到應用，其中它們被用於塑料薄片、膠片、膜等不同的目的。環糊精還被用於生物可降解塑料的生產。
本發明以下列實施例進一步詳細描述，其不意在限制所要求的本發明的範圍。材料與方法保藏的生物Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380含有本發明的CGT酶。電泳及分子量的測定按照Laemmi(Laemmi等人)用11.5％的聚丙烯醯胺凝膠在Mini ProteanⅡ電泳系統(Bio-Rad)中以24mA的穩定電流和高電壓進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。蛋白質按照Blum等人(Blum等人)的方法進行銀染。為測定分子量，用寬範圍的分子量蛋白質混合物(Bio-Rad)作為標準。SDS-PAGE上的澱粉分解酶活性的活性染色活性染色之前，在2.5％Triton X-100溶液中將SDS凝膠溫育30分鐘以除去SDS。通過在補加0.5％可溶性澱粉(Merck)的100mM,pH8.0的磷酸鈉緩衝液中，在65℃下將凝膠溫育10分鐘來檢測分解澱粉的蛋白質區帶。通過用KJ-J2(每升aquadest.3g KJ,2g J2)將凝膠染色使有分解澱粉活性的蛋白質區帶可見，產生棕色背景中的白色活性區帶。澱粉分解鑑定用分別預純化的酶和溶於pH9.0,100mM磷酸鈉緩衝液中的含0.5％的可溶性澱粉(Merck,Darmstadt，德國)或0.2％的直鏈澱粉或0.2％的支鏈澱粉(均為重量/體積)的底物溶液達到0.1ml的終體積，由此得到的酶溶液經常規的酶分析。如果無另外說明，在65℃下進行30分鐘的溫育。用Somogyi-Nelson方法(Somogyi,M.生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)(1945)160:61-68；Nelson,N.生物化學雜誌(1944)153:375-380)估計還原糖的量，使用以0-1％(重量/體積)麥芽糖製作的標準曲線計算酶活性。一個單位(U)的澱粉分解活力定義為在標準條件下(pH9.0；65℃)每分鐘釋放1μmol還原糖的酶量。CGT酶(環麥芽糖糊精糖基轉移酶)鑑定為測定CGT酶的活性，採用了一個度量環化活性的β-CD產生特異性實驗(Vikmon,1982)。用含有預純化的CGT酶溶液和溶於pH8.0,100mM磷酸鈉緩衝液中的含0.5％的可溶性澱粉(Merck,Darmstadt，德國)或0.2％的直鏈澱粉或0.2％的支鏈澱粉(均為重量/體積)的底物溶液以達到0.1ml的終鑑定體積。在65℃下進行30分鐘的溫育。由於β-CD能與通常紫色的酚酞形成穩定的無色包合配合物，可據此檢測到β-CD。紫色的減少與由於CGT酶活性產生的β-CD成正比。1單位(U)的CGT酶活性在標準條件下(pH8.0；65℃)每分鐘催化1μmol β-CD形成。由HPLC，還原糖也作為CGT酶作用的產物被檢測到(見下)。因此，由還原糖的量可闡明CGT酶的水解活性。蛋白質測定用Lowry方法測定蛋白質濃度。進行微量分析並以牛血清白蛋白為標準蛋白質。pH和溫度的影響為研究pH和溫度對澱粉酶和CGT酶活性的影響，使用預先純化的酶溶液。將10ml酶溶液和90ml pH4.0-11.0，溶於120mM通用緩衝液(BrittonRobinsson)中的0.5％(重量/體積)的底物溶液(可溶性澱粉；Merck)相混合。測量由於酶溶液和底物溶液相混合而導致的pH的變化。此混合物在冰上預溫育30分鐘後，在65℃進行30分鐘酶鑑定。以產生的還原糖對各自的pH值作圖。使用預先純化的酶研究溫度對澱粉酶和CGT酶活性的影響。將10ml酶溶液和90ml分別在最適pH9.0或8.0，溶於100mM磷酸鈉緩衝液中的0.5％(重量/體積)的底物溶液(可溶性澱粉；Merck)相混合。在30℃和80℃之間的溫度下溫育30分鐘。為檢測溫度穩定性，帶螺旋蓋的Eppendorf管中的酶溶液在60℃、70℃和80℃溫育長達21小時，並且在一定的時間間隔取出樣品用於檢測殘留澱粉酶或CGT酶活性。底物特異性為檢測α-澱粉酶或CGT酶的底物特異性，將酶與含有可溶性澱粉(Merck)(0.5％)、直鏈澱粉(0.2％)、支鏈澱粉(0.2％)、普魯蘭(0.2％)、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖(均為0.2％)(均為重量/體積)的底物溶液一起溫育。在標準條件下(pH8.0；65℃)溫育30分鐘。通過測定酶作用產生的環糊精的量來確定酶活性。水解產物的分析用帶有Aminex-HPX-42 A柱(300×7.8mm；Bio-Rad,Hercules,Calif.)的高效液相色譜(HPLC)(Knauer GmbH,Berlin，德國)分析澱粉酶和CGT酶對不同底物作用的水解模式。1份預先純化的特定酶與9份pH8.0的底物溶液在65℃一起溫育長達16上時。溫育後，將樣品保存於-20℃直到進行分析。使用按照重量/體積溶於100mM磷酸鈉緩衝液中的(對於澱粉酶和CGT酶分別為pH9.0和pH8.0)，可溶性澱粉(0.5％)，普魯蘭(0.5％)直鏈澱粉(0.2％)，支鏈澱粉(0.2％)，麥芽寡糖DP1到DP5(DP=多聚化程度)，環糊精混合物(0.1％)和純環糊精(α,β,γ)作為底物溶液。
由於γ-CD和DP2滯留時間相同，為區別它們進行如下實驗。在標準條件下(pH8.0；65℃)將作為底物的可溶性澱粉(0.5％)與CGT酶一起溫育60分鐘，然後100℃煮5分鐘。分析液冷卻並與0.125U的酵母α-葡萄糖苷酶(Boehringer,Mannheim，德國)在25℃溫育30分鐘，以將麥芽糖和麥芽三糖降解為葡萄糖。在約30分鐘保留時間的提示檢測信號此時僅為γ-CD，可以正確地測定CD之間的比例。化學試劑普魯蘭環糊精和麥芽寡聚糖獲自Sigma(St.Louis,Mo.)。用於電泳的化學試劑購自Serva(Heidelberg，德國)。其它化學試劑獲自Merck(Darmstadt，德國)。Southern印跡雜交分析條件依據Sambrook等人(1989)，出處同前描述的方法，在尼龍濾膜(Hybond-N,Amersham)上進行與32P標記的PCR探針的Southern印跡雜交。將膜置於塑膠袋中，在50％(v/v)甲醯胺，6×SSC,0.05×BLOTTO,1mM EDTA中，42℃預雜交1-2小時。然後將膜與放射性標記的變性DNA探針在50％(v/v)甲醯胺，6×SSC,0.5％(w/v)SDS,1mM EDTA中，42℃雜交過夜(雜交溶液中無甲醯胺的，相應溫度為68℃)。雜交後，在50℃首先用2×SSC,0.5％(w/v)SDS,然後用0.1×SSC,0.5％(w/v)SDS在50℃洗膜。然後將膜包在Saran Wrap中，按照所要求的時間在-70℃進行X-射線膠片曝光。免疫交叉反應性利用經純化的CGT酶可以製備用於確定免疫交叉反應性的抗體。更具體地，按照N.Axelsen等人在定量免疫電泳手冊BlackwellScientific Publications,1973,23章，或A.Johnstone和R.Thorpe，實用免疫化學，Blackwell Scientific Publications,1982(更具體地p.27-31)中描述的步驟，通過免疫兔可以產生抗本發明的CGT酶的抗血清。純化的免疫球蛋白質可以獲自抗血清，例如通過鹽沉澱((NH4)2SO4)，然後進行透析和例如用DEAE-Sephadex的離子交換層析。蛋白質的免疫化學特性可以用正交雙擴散分析(O.Ouchterlony在實驗免疫學手冊，(D.M.Weir，編)Blackwell Scientific Publications,(1967),p.655-706)，或者交叉免疫電泳(N.Axelsen等人，出處同前，3和4章)，或者火箭免疫電泳(N.Axelsen等人，2章)來完成。實施例1包含本發明的CGT酶的Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380在厭氧條件下在下面的培養基中培養(NH4)2SO4,1.0；NH4Cl,0.4；Na2S2O4,0.1；K2HPO4,0.5；MgSO4,0.1；CaCl2,0.05；NaCl,10.0；胰化蛋白質腖，0.25；酵母提取物，0.25；FeCl3,0.01；刃天青，0.001；NaHCO3,2.2；Na2CO3,2.2；Cystein,0.5；澱粉，5.0，均以克/升為濃度單位。微量元素溶液141,10ml/l和維生素溶液141,10ml，均按1993年DSM的菌株目錄描述來製備。
大規模培養在19升發酵罐(Bioengineering,Wald，瑞士)，pH調節在9.0,50℃條件下進行。培養物以300轉/分攪動，並以10升/小時的量通入N2。發酵罐接種需用1升在50℃,2升搖瓶中不振搖生長8小時的預培養物。澱粉分解酶的純化除非有其它說明，所有純化步驟都在室溫進行。在19升發酵罐中經過8小時培養，16升培養液在41℃,12,000轉/分轉速的連續流動離心頭(Heraeus,Osterode，德國)中離心，直到細胞由培養基上清中分離出來。然後培養基上清用10kD的過濾器(Filtron)錯流過濾使終體積濃縮至1升。再用帶10kD濾膜的Amicon濾室(Amicon)進一步完成濃縮。為了去除產生幹擾的H2S並改變緩衝液，將濃縮的上清液過PD-10的離子交換柱(Pharmacia)，並用100mM,PH 9.0的磷酸鈉緩衝液洗脫。收集包含澱粉分解活性的洗脫液並用Amicon濾室(10kD濾膜Amicon)濃縮10倍。將這種溶液樣品用於經100mM,pH 9.0的磷酸鈉緩衝液預平衡的Q-Sepharose陰離子交換層析柱(15×2.5cm)(Pharmacia)。柱子用90ml平衡緩衝液洗.酶溶液用含1M NaCl的平衡緩衝液洗脫，所用NaCl濃度梯度0到300mM及300到500mM，流速0.2ml/分鐘。收集各級分(每管2ml)並依照前面「材料和方法」部分測定它們的澱粉水解活性。將活性級分收集，合併然後用Amicon濾室濃縮10倍。將這種預提純的澱粉酶樣品加到經50mM,pH 9.0的磷酸鈉緩衝液預平衡的Superose 75凝膠過濾柱(Pharmacia)中。酶用流速0.1ml/分鐘的平衡緩衝液洗脫。收集各級分(1ml/管)，合併活性級分，然後用帶有10kDa膜的Amicon濾室濃縮。CGT酶的純化/分離培養後濃縮70倍的培養液上清中澱粉酶/CGT酶的特異性活性經測定為0.096U/mg。如前所述，由於發酵過程中產生H2S，為了去除H2S、硫化物和其它活性幹擾物質，必須應用PD-10離子交換柱進行純化。經過這步處理，檢測出的活性提高到0.48U/mg。在以前檢測還原糖的方法中這種影響未被考慮(數據沒有給出)。濃縮的培養液上清經活性染色在SDS-PAGE電泳膠上呈現三個活性區帶(圖1，泳道2)。具有57±3kDa表觀分子量的最低活性帶顯示出α-澱粉酶活性。將濃縮10倍的PD-10洗脫液樣品用於Q-Sepharose陰離子交換層析柱(Pharmacia，瑞典；25×200mm)，此柱子用Bio-Rad Econo系統以1.0ml/分鐘速度用平衡緩衝液(100mM,pH 8.0的磷酸鈉)洗脫。將這種含澱粉酶的濃縮10倍的樣品(圖1，泳道3)用於Superdex 75凝膠過濾柱(Pharmacia，瑞典；15×300mm)並用Bio-Rad Econo系統以0.1ml/分鐘流速，用100mM,pH 8.0的磷酸鈉緩衝液洗脫。在NaCl濃度約400mM時洗脫下CGT酶的活性，混合包含活性酶的級分，然後用帶有10kDa排阻體積膜的Amicon濾室濃縮10倍。這種預提純的具有2443U/mg環化活性的CGT酶溶液被用於酶的進一步表徵。銀染的單一蛋白質區帶與經活性染色測定的活性澱粉酶區帶的遷移率相一致(圖1，泳道6和7)。實施例2CGT酶的表徵；分子量的測定CGT酶的分子量用活性染色的SDS-PAGE凝膠測定，顯示為67±2kDa(圖1，泳道6+7)。pH和溫度對CGT酶活性的影響當用澱粉為底物分別檢測還原糖(水解作用)或環糊精產生(環化作用)時，預提純的CGT酶顯示不同的最適pH值。在標準分析條件(65℃,pH 8.0,30分鐘)下溫育後，由水解活性得到的數據顯示出在pH 8.0時的最適pH值(圖2)。在pH範圍pH 6.0到pH 9.2之間可檢測出大於40％的殘留活性。如果將CGT酶的環化活性數據對各自的pH值作圖，則顯示出活性的寬pH範圍(圖2)。顯示出在pH 4.0到pH 10.0之間產生CD。觀察發現，於pH 5到pH7之間由CGT酶活性產生幾乎相同的最高水平的CD產物，在高pH值時產生更高產量的CD。
CGT酶的最適溫度在pH 8.0，溫育60分鐘內測量為65℃(圖3)。分別在50℃和75℃檢測50％殘留活性，表明CGT酶活性具有寬的溫度範圍。在65℃，即它的最適溫度，酶可保持穩定2小時以上，但在70℃,1小時內酶失活(數據沒有給出)。水解產物分析。為了測定預提純的CGT酶作用的水解產物，在65℃,pH 8.0時將酶與不同底物溫育至16小時。通過檢測環化活性可定量測定底物特異性，且用定量HPLC分析可闡明產生的CD的比例。在本發明的CGT酶作用下，澱粉(Merck)和支鏈澱粉(圖4)均被充分水解。當澱粉由CGT酶作用水解時，經20分鐘溫育時間作為主產物的α-CD被檢測出(圖4A)，與經120分鐘溫育時間一樣；用支鏈澱粉溫育120分鐘也可得到同樣的結果(圖4B)。16小時的溫育時間將產生不同的CD-寡聚物比率，這是除圖5之外又經HPLC分析(圖4,B)證明的，表明CD-比例的不同是由於溫育時間。經過2小時溫育後每一種分析液的優勢水解產物是α-CD，而在延長溫育時間後，主水解產物為α-CD和β-CD，兩者產生比例大致相同。僅極少量產生γ-CD。實施例3測定T.bogoriae DMS No.9380的部分CGT酶序列為了製備T.bogoriae DSM No.9380 CGT酶的PCR產物，對許多由SWISS PROT資料庫獲得的已知CGT酶進行序列比較以確定CGT酶的保守區域。在已確定的相互之間具有合適距離的保守區域(見下)的基礎上，設計了3個針對編碼保守區域的序列的引物(引物1-3見下)。
基於已確定的保守區域的知識設計P1:TDVIYQI(SEQ ID No.1)。P1是一種N-末端引物。設計P1以掩蓋CGT酶序列的一些不同處。這通過整合入脫氧肌苷或簡併的鹼基實現。相對於蛋白質序列P1在下遊。
基於已確定的保守區域的知識設計P2:RWINNDV(SEQ ID No.2)。相對於蛋白質序列P2在上遊。P2引物亦被簡併化以掩蓋一定程度的序列多樣性。
基於已確定的保守區域的知識設計P3:TSYHGYWA(SEQ IDNo.3)。P3類似P1，在蛋白質序列的下遊。
第一輪測序後，在引物P1-P3基礎上設計了另外3個命名為P4-P6的引物。
P15′ACNGAYGTGATITAYCARAT′3(SEQ ID NO.4)P25′ACRTCRTTRTTDATCCANCG′3(SEQ ID NO.5)P35′CATCNTAYCAYGGNTAYTGGGC′3(SEQ ID NO.6)P45′CTTTATTCTGAGGACGGGGCTGATTTGC′3(SEQ ID NO.7)P55′GTTCTCTAAAATCATTTACATCCCC′3(SEQ ID NO.8)P65′GCATTTTTACTAACATCAAGGGG′3(SEQ ID NO.9)D=A、G或T；R=A或G；Y=T或C；N=A、C、T或G；I=脫氧肌苷用引物對P1和P2或引物對P2和P3，用依實施例4(見下)描述的方法對從T.bogoriae提純的基因組DNA進行PCR。根據生產商說明在緩衝液條件下應用Ampli-Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer inc.)。在94℃變性2分鐘，以退火溫度35℃,2分鐘延伸時間進行5輪反應，再以退火溫度50℃，2分鐘延伸時間進行25輪反應。
用P1-P2引物對得到1.2kb的一段PCR帶，而用P2-P3引物對得到0.9kb的一段PCR帶。這與期望得到的CGT酶大小相符。
PCR產物的測序通過應用染料-終止子混合物(Perkin-Elmer，美國)進行循環測序和應用P1-P6引物的自動測序完成。此法可測定P1到P2引物間的1.15kb DNA序列。
SEQ ID NO.10顯示了由T.bogoriae CGT酶內部的PCR片段測序獲得的DNA序列。
進一步序列測定由實施例4中描述的反向PCR完成。實施例4CGT酶進一步測序在實施例3中，測定了一段由T.bogoriae DSM No.9380 CGT酶編碼基因經PCR擴增得到的長1.15kb的DNA序列片段。這段序列作為應用反向PCR方法測定CGT酶基因序列其它部分的起點。由此，製備了如下兩個相應於已測序的1.15kb DNA序列的兩個末端附近的區域，且從各自讀起的寡聚核苷酸引物。引物101304:5『-TCGTAAGCCTATGTCGTC-3』(SEQ ID NO.11)引物101305:5『-ACCTCTCCAATCTCCACC-3』(SEQ ID NO.12)從T.bogoriae細胞中提取染色體DNA(溶菌酶處理/酚抽提)。在第一次嘗試時，酚抽提後用限制性酶PstⅠ消化這部分DNA，並連接，然後此樣品的一部分再用BglⅡ消化。以此物作為應用引物101304和引物101305(退火溫度49℃)進行PCR擴增的模板。未見擴增產物。
然後用PstⅠ+BamHⅠ+EcoRⅠ+HindⅢ+NsiⅠ+SaⅡ酶消化連接混合物，並將消化後的樣品連接。連接後，用Bg1Ⅱ進行消化。這一產物用作PCR反應的模板。這次獲得1kb、1.4kb和2kb的片段。這些片段經過凝膠提純，用作新的PCR反應的模板。再次獲得1kb和1.4kb的片段。將這些片段進行凝膠提純，DNA測序，應用與PCR擴增相同的引物進行測序。
1kb片段的DNA序列揭示出這個片段衍生自CGT酶基因，所獲得的序列可用於延伸實施例3中確定的序列。
所確定的總DNA序列，以及它翻譯成的胺基酸序列見SEQ ID NO:13和14。
應用GCG版本9的程序軟體包中的BLASTP和FASTA程序將推導出的胺基酸序列SEQ ID NO.14與資料庫序列相比較。應用任一種程序均確定同樣的三段序列得分最高。它們是SW:AMY-THETU！P26827(熱產硫磺熱厭氧桿菌)SW:CDGT-BACST！P31797(嗜熱脂肪芽孢桿菌)SW:CDGT-BACOH！P27036(Bacillus ohbensis)應用GCG版本8程序軟體包的程序區間測定SEQ ID 14與這些序列的同源性。測得百分比一致性如下圖。
應用GCG版本9的程序軟體包中的BLASTP和FASTA程序將DNA序列SEQ ID NO.13與資料庫序列相比較。用任一研究中發現三個得分最高的序列在以下四段序列之間GB-BA:TTPULSA！M57692(熱產硫磺熱厭氧桿菌基因)GB-BA:BSCGT5！X59043(嗜熱脂肪芽孢桿菌)GB-BA:BSCGT232！X59044(嗜熱脂肪芽孢桿菌)GB-BA:BSCGT1！X59042(嗜熱脂肪芽孢桿菌)應用GCG版本8程序軟體包的程序區間測定SEQ ID 13與這些序列的同源性。測得百分比一致性如下圖。
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序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)姓名Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國家丹麥(F)郵政編碼(ZIP):DK 2880(G)電話+45 4444 8888(H)傳真+45 44493256(ⅱ)發明名稱一種具有CGT酶活性的酶(ⅲ)序列數目14(ⅳ)計算機可讀信息(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度7個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)其它信息/desc「保守區」(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述Tnr Asp Val Ile Tyr GlnIle1 5(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度7個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)其它信息/desc「保守區」(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述Arg Trp Ile Asn Asn Asp Val1 5(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度8個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)其它信息/desc「保守區」(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala1 5(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)其它信息/desc「引物1」(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置3,6,12,15,18(C)其它信息R=A或G；Y=T或C；N=A,C,T或G；I=脫氧肌苷(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述ACNGAYGTGA TITAYCARAT 20(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc-feature
(B)其它信息/desc「引物2」(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置3,6,12,18(C)其它信息D=A,G或T；R=A或G；N=A,C,T或G；(ⅹⅰ)SEQ ID NO:5的序列描述ACRTCRTTRT TDATCCANCG 20(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度21個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)其它信息/desc「引物3」(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置5,8,11,14,17(C)其它信息Y=T或C；N=A,C,T或G；(ⅹⅰ)SEQ ID NO:6的序列描述CATCNTAYCA YGGNTAYTGG GC 22(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度28個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)其它信息/desc「引物4」(ⅹⅰ)SEQ ID NO:7的序列描述CTTTATTCTG AGGACGGGGC TGATTTGC28(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)其它信息/desc「引物5」(ⅹⅰ)SEQ ID NO:8的序列描述GTTCTCTAAA ATCATTTACA TCCCC 25(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度23個鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)其它信息/desc「引物6」(ⅹⅰ)SEQ ID NO:9的序列描述GCATTTTTAC TAACATCAAG GGG 23(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度1155個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅵ)初始來源(B)菌株Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380(ⅹⅰ)SEQ ID NO:10的序列描述CCACCGATGT GATGTATCAG ATTGTAACAG ATCGTTTTTT AGATGGCGAT AAATATAATA 60ATCCAACTTG TGAAAACCTT TATTCTGAGG ACGGGGCTGA TTTGCGTAAA TATTTAGGTG 120GAGATTGGAG AGGTATTATA CAAAAAATTG AGGATGGATA TTTACCTGAT ATGGGAATTT 180CAGCTATTTG GATTTCTTCA CCAGTAGAAA ATATATATGC TGTTCATCCG CAATTTGGAA 240CATCTTATCA TGGTTATTGG GCAAGGGATT TTAAAAGAAA TAATCCTTTT TTTGGGGATC 300TAAATGATTT TAGAGAACTT ATAGCGGTTG CTAATGAACA TGATATAAAA GTAATTATTG 360ATTTTGCACC TAATCATACT TCTCCAGCAG AAGTTAATAA TCCTAACTAT GCTGAAGATG 420GTAATTTGTA TAATAACGGA GAATTTGTAG CTTCTTATTC TAATGATTTA AATGAAATTT 480TTTACCATTT TGGAGGAACT GATTTTTCAA CTTATGAAGA TAGTATATAT AGAAACCTGT 540TTGATTTAGC AGGATTAAAT TTAAATAATA ATTTTGTTGA TCAATATTTA CGTGATTCGA 600TAAAATTTTG GTTAGATCTC GGTGTTGATG GTATTAGAGT GGATGCTGTT AAACATATGC 660CGTTAGGATG GCAAAAATCT TTTGTGGATA CCATTTATAA TCATAAACCT GTATTTGTTT 720TTGGTGAGTG GTATTTAGGT AAAGATGAAT ATGATCCTAA TTATTATCAT TTTGCAAATA 780ATAGTGGTAT GAGTTTATTA GACTTTGAAT TTGCTCAAAC AACACGTAGT GTGTTTCGAA 840ATCATGAAAA AAATATGTTT GACTTATATG ACATGCTAAA AAATACGGAA AACAACTATG 900AACGTGTTGT AGATCAGGTA ACTTTTATTG ATAATCATGA TATGGATCGC TTTCACTATG 960ATGGAGCAAC TAAAAGAAAT GTAGAAATTG GATTAGCATT TTTACTAACA TCAAGGGGAG 1020TTCCAACTAT TTATTATGGT ACTGAACAAT ATTTAACAGG AAATGGTGAT CCATATAATC 1080GTAAGCCTAT GTCGTCTTTT GATCAAAATA CAAAAGCATA TAAAATTATT CAAAAATTAG 1140CACCTTTAAG GAAGT1155(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度18個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)其它信息/desc「引物101304」(ⅹⅰ)SEQ ID NO:11的序列描述TCGTAAGCCT ATGTCGTC 18(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度18個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)其它信息/desc「引物101305」(ⅹⅰ)SEQ ID NO:12的序列描述ACCTCTCCAA TCTCCACC18(2)SEQ ID NO:13的信息
(ⅰ)序列特徵(A)長度1580個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅵ)初始來源(B)菌株Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..1580(ⅹⅰ)SEQ ID NO:13的序列描述GAT GTG ATG TAT CAG ATT GTA ACA GAT CGT TTT TTA GAT GGC GAT AAA 48Asp Val Met Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Leu Asp Gly Asp Lys1 5 10 15TAT AAT AAT CCA ACT TGT GAA AAC CTT TAT TCT GAG GAC GGG GCT GAT 96Tyr Asn Asn Pro Thr Cys Glu Asn Leu Tyr Ser Glu Asp Gly Ala Asp20 25 30TTG CGT AAA TAT TTA GGT GGA GAT TGG AGA GGT ATT ATA CAA AAA ATT 144Leu Arg Lys Tyr Leu Gly Gly Asp Trp Arg Gly Ile Ile Gln Lys Ile35 40 45GAG GAT GGA TAT TTA CCT GAT ATG GGA ATT TCA GCT ATT TGG ATT TCT 192Glu Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Met Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Ser50 55 60TCA CCA GTA GAA AAT ATA TAT GCT GTT CAT CCG CAA TTT GGA ACA TCT 240Ser Pro Val Glu Asn Ile Tyr Ala Val His Pro Gln Phe Gly Thr Ser65 70 75 80TAT CAT GGT TAT TGG GCA AGG GAT TTT AAA AGA AAT AAT CCT TTT TTT 288Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Arg Asn Asn Pro Phe Phe85 90 95GGG GAT CTA AAT GAT TTT AGA GAA CTT ATA GCG GTT GCT AAT GAA CAT 336Gly Asp Leu Asn Asp Phe Arg Glu Leu Ile Ala Val Ala Asn Glu His100 105 110GAT ATA AAA GTA ATT ATT GAT TTT GCA CCT AAT CAT ACT TCT CCA GCA 384Asp Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala115 120125GAA GTT AAT AAT CCT AAC TAT GCT GAA GAT GGT AAT TTG TAT AAT AAC 432Glu Val Asn Asn Pro Asn Tyr Ala Glu Asp Gly Asn Leu Tyr Asn Asn130 135 140GGA GAA TTT GTA GCT TCT TAT TCT AAT GAT TTA AAT GAA ATT TTT TAC 480Gly Glu Phe Val Ala Ser Tyr Ser Asn Asp Leu Asn Glu Ile Phe Tyr145 150 155 160CAT TTT GGA GGA ACT GAT TTT TCA ACT TAT GAA GAT AGT ATA TAT AGA 528His Phe Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Tyr Glu Asp Ser Ile Tyr Arg165 170 175AAC CTG TTT GAT TTA GCA GGA TTA AAT TTA AAT AAT AAT TTT GTT GAT 576Asn Leu Phe Asp Leu Ala Gly Leu Asn Leu Asn Asn Asn Phe Val Asp180 185 190CAA TAT TTA CGT GAT TCG ATA AAA TTT TGG TTA GAT CTC GGT GTT GAT 624Gln Tyr Leu Arg Asp Ser Ile Lys Phe Trp Leu Asp Leu Gly Val Asp195 200 205GGT ATT AGA GTG GAT GCT GTT AAA CAT ATG CCG TTA GGA TGG CAA AAA 672Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Lys His Met Pro Leu Gly Trp Gln Lys210 215 220TCT TTT GTG GAT ACC ATT TAT AAT CAT AAA CCT GTA TTT GTT TTT GGT 720Ser Phe Val Asp Thr Ile Tyr Asn His Lys Pro Val Phe Val Phe Gly225 230 235 240GAG TGG TAT TTA GGT AAA GAT GAA TAT GAT CCT AAT TAT TAT CAT TTT768Glu Trp Tyr Leu Gly Lys Asp Glu Tyr Asp Pro Asn Tyr Tyr His Phe245 250 255GCA AAT AAT AGT GGT ATG AGT TTA TTA GAC TTT GAA TTT GCT CAA ACA 816Ala Asn Asn Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Glu Phe Ala Gln Thr260 265 270ACA CGT AGT GTG TTT CGA AAT CAT GAA AAA AAT ATG TTT GAC TTA TAT 864Thr Arg Ser Val Phe Arg Asn His Glu Lys Asn Met Phe Asp Leu Tyr275 280 285GAC ATG CTA AAA AAT ACG GAA AAC AAC TAT GAA CGT GTT GTA GAT CAG 912Asp Met Leu Lys Asn Thr Glu Asn Asn Tyr Glu Arg Val Val Asp Gln290 295 300GTA ACT TTT ATT GAT AAT CAT GAT ATG GAT CGC TTT CAC TAT GAT GGA960Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe His Tyr Asp Gly305 310 315 320GCA ACT AAA AGA AAT GTA GAA ATT GGA TTA GCA TTT TTA CTA ACA TCA1008Ala Thr Lys Arg Asn Val Glu Ile Gly Leu Ala Phe Leu Leu Thr Ser325 330 335AGG GGA GTT CCA ACT ATT TAT TAT GGT ACT GAA CAA TAT TTA ACA GGA1056Arg Gly Val Pro Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Gly340 345 350AAT GGT GAT CCA TAT AAT CGT AAG CCT ATG TCG TCT TTT GAT CAA AAT1104Asn Gly Asp Pro Tyr Asn Arg Lys Pro Met Ser Ser Phe Asp Gln Asn355 360 365ACA AAA GCA TAT AAA ATT ATT CAA AAA TTA GCA CCT TTA AGG AAG TCT1152Thr Lys Ala Tyr Lys Ile Ile Gln Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser370 375 380AAC CCA GCC CTT GCT TAC GGA ACA ACA CAA CAA CGC TGG TTG AAT AAT1200Asn Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Thr Thr Gln Gln Arg Trp Leu Asn Asn385 390 395 400GAT GTT ATT ATT TAT GAA CGT AAA TTT GGA AAT AAT ATT GTT TTA GTG1248Asp Val Ile Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Gly Asn Asn Ile Val Leu Val405 410 415GCA ATA AAT AGA AAT TTA AGT CAA TCT TAC TCT ATA ACT GGT CTC AAT1296Ala Ile Asn Arg Asn Leu Ser Gln Ser Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Asn420 425 430ACC AAA CTT CCT GAG GGT TAT TAT TAT GAT GAG CTA GAC GGA TTG TTA1344Thr Lys Leu Pro Glu Gly Tyr Tyr Tyr Asp Glu Leu Asp Gly Leu Leu435 440 445TCA GGT AAA AGT ATT ACT GTT AAC CCT GAT GGT TCA GTG AAT CAA TTT1392Ser Gly Lys Ser Ile Thr Val Asn Pro Asp Gly Ser Val Asn Gln Phe450 455 460ATA ATT AAT CCT GGA GAA GTA AGT ATA TGG CAA TTT GCA GGG GAA ACT1440Ile Ile Asn Pro Gly Glu Val Ser Ile Trp Gln Phe Ala Gly Glu Thr465 470 475 480ATT ACT CCA CTT ATT GGG CAA GTT GGA CCT ATT ATG GGT CAA GTA GGC1488Ile Thr Pro Leu Ile Gly Gln Val Gly Pro Ile Met Gly Gln Val Gly485 490 495AAT AAA GTG ACT ATT AAT GGT GTT GGT TTT GGT GAT AAA AAA GGT ACA1536Asn Lys Val Thr Ile Asn Gly Val Gly Phe Gly Asp Lys Lys Gly Thr500 505 510GTA AAT TTT GGA CAA ATA GAT GCA ACA ATT ATT AGT TGG ACT AA1580Val Asn Phe Gly Gln Ile Asp Ala Thr Ile Ile Ser Trp Thr515 520 525(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度526個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)SEQ ID NO:14的序列描述Asp Val Met Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Leu Asp Gly Asp Lys1 5 10 15Tyr Asn Asn Pro Thr Cys Glu Asn Leu Tyr Ser Glu Asp Gly Ala Asp20 25 30Leu Arg Lys Tyr Leu Gly Gly Asp Trp Arg Gly Ile Ile Gln Lys Ile35 40 45Glu Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Met Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Ser50 55 60Ser Pro Val Glu Asn Ile Tyr Ala Val His Pro Gln Phe Gly Thr Ser65 70 75 80Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Arg Asn Asn Pro Phe Phe85 90 95Gly Asp Leu Asn Asp Phe Arg Glu Leu Ile Ala Val Ala Asn Glu His100 105 110Asp Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala115 120 125Glu Val Asn Asn Pro Asn Tyr Ala Glu Asp Gly Asn Leu Tyr Asn Asn130 135 140Gly Glu Phe Val Ala Ser Tyr Ser Asn Asp Leu Asn Glu Ile Phe Tyr145 150 155 160His Phe Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Tyr Glu Asp Ser Ile Tyr Arg165 170 175Ash Leu Phe Asp Leu Ala Gly Leu Asn Leu Asn Asn Asn Phe Val Asp180 185 190Gln Tyr Leu Arg Asp Ser Ile Lys Phe Trp Leu Asp Leu Gly Val Asp195 200 205Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Lys His Met Pro Leu Gly Trp Gln Lys210 215 220Ser Phe Val Asp Thr Ile Tyr Asn His Lys Pro Val Phe Val Phe Gly225 230 235 240Glu Trp Tyr Leu Gly Lys Asp Glu Tyr Asp Pro Asn Tyr Tyr His Phe245 250 255Ala Asn Asn Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Glu Phe Ala Gln Thr260 265 270Thr Arg Ser Val Phe Arg Asn His Glu Lys Asn Met Phe Asp Leu Tyr275 280 285Asp Met Leu Lys Asn Thr Glu Asn Asn Tyr Glu Arg Val Val Asp Gln290 295 300Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe His Tyr Asp Gly305 310 315 320Ala Thr Lys Arg Asn Val Glu Ile Gly Leu Ala Phe Leu Leu Thr Ser325 330 335Arg Gly Val Pro Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Gly340 345 350Asn Gly Asp Pro Tyr Asn Arg Lys Pro Met Ser Ser Phe Asp Gln Asn355 360 365Thr Lys Ala Tyr Lys Ile Ile Gln Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser370 375 380Asn Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Thr Thr Gln Gln Arg Trp Leu Asn Asn385 390 395 400Asp Val Ile Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Gly Asn Asn Ile Val Leu Val405 410 415Ala Ile Asn Arg Asn Leu Ser Gln Ser Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Asn420 425 430Thr Lys Leu Pro Glu Gly Tyr Tyr Tyr Asp Glu Leu Asp Gly Leu Leu435 440 445Ser Gly Lys Ser Ile Thr Val Asn Pro Asp Gly Ser Val Asn Gln Phe450 455 460Ile Ile Asn Pro Gly Glu Val Ser Ile Trp Gln Phe Ala Gly Glu Thr465 470 475 480Ile Thr Pro Leu Ile Gly Gln Val Gly Pro Ile Met Gly Gln Val Gly485 490 495Asn Lys Val Thr Ile Asn Gly Val Gly Phe Gly Asp Lys Lys Gly Thr500 505 510Val Asn Phe Gly Gln Ile Asp Ala Thr Ile Ile Ser Trp Thr515 520 52權利要求
1．一種經分離的CGT酶，其特徵為在與支鏈澱粉於65℃,pH8.0條件下溫育2小時後產生至少75％的α-環糊精(相對於β和γ-環糊精)。
2．根據權利要求1的CGT酶，其中CGT酶獲自Thermoalcalibacter屬種的菌株。
3．一種獲自Thermoalcalibacter屬種菌株的經分離的胞外CGT酶。
4．根據權利要求2或3的CGT酶，其中Thermoalcalibacter屬種菌株是一種中等熱嗜鹼性厭氧菌。
5．根據權利要求4的CGT酶，其中菌株是Thermoalcalibacterbogoriae，尤其是Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380。
6．根據權利要求1-5中任一項的CGT酶，其中CGT酶具有ⅰ)由SDS-PAGE測定的67±10kD的分子量，和/或ⅱ)於pH8.0測量的65±10℃的最適溫度。
7．一種製備根據權利要求1-4中任一項的CGT酶的方法，該方法包含在允許該酶產生的條件下培養Thermoalcalibacter屬種的菌株，並從培養物中回收該酶。
8．根據權利要求7的方法，其中Thermoalcalibacter屬種是菌株Thermoalcalibacter bogoriae，尤其是Thermoalcalibacter bogoriae DSMNo.9380。
9．一種DNA構件，包含編碼CGT酶的DNA序列，此DNA序列包含a)包含SEQ ID No.13中所示部分DNA序列的編碼CGT酶之DNA序列，或b)a)中定義的DNA序列的類似物，其ⅰ)與包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定義的DNA序列至少70％同源，或ⅱ)與和包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定義的DNA序列相同的寡核苷酸探針雜交，或ⅲ)編碼一段與包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定義的DNA序列編碼的多肽至少70％同源的多肽，或ⅳ)編碼與一種抗體發生免疫反應的多肽，此抗體抗源自Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380的純化的CGT酶，其由包含SEQ ID No.13所示部分序列的a)中定義的DNA序列編碼。
10．根據權利要求9的DNA構件，其中該DNA序列是從一種Thermoalcalibacter屬種菌株，如Thermoalcalibacter bogoriae，尤其是Thermoalcalibacter bogoriae DSM No.9380獲得。
11．一種重組表達載體，其包含根據權利要求9或10的任一項DNA構件。
12．一種細胞，其包含根據權利要求1-8中任一項的DNA構件，或一種根據權利要求9至12中任一項的重組表達載體。
13．根據權利要求12的細胞，該細胞是微生物細胞，如細菌細胞，真菌細胞，如絲狀真菌細胞或酵母細胞。
14．根據權利要求13的細胞，其中細胞是細菌細胞，是芽孢桿菌屬的一種菌株，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或蘇雲金芽孢桿菌，或鏈黴菌屬的一種菌株，如淺青紫鏈黴菌或鼠灰鏈黴菌，或腸桿菌屬的菌株，如大腸桿菌。
15．一種製備CGT酶的方法，其包括在允許該酶產生的條件下培養根據權利要求12至14中任一項的細胞，並從培養物中回收該酶。
16．一種經分離的CGT酶，其a)是由根據權利要求9至10中任一項的DNA構件所編碼的，b)根據權利要求15的方法生產。
17．一種包含根據權利要求1-6或16中任一項的CGT酶的酶組合物。
18．一種麵包改良和/或麵團改良組合物，包括根據權利要求1-6或權利要求16的任一項的一種CGT酶。
19．一種根據權利要求1-6或權利要求16中任一項的CGT酶或一種根據權利要求17的酶組合物在生產環糊精，特別是α-環糊精的方法中的用途。
20．一種根據權利要求1-6或權利要求16中任一項的CGT酶或一種根據權利要求17的酶組合物在麵包改良或麵團改良組合物中的用途。
21．一種麵團或焙烤產品，其包括根據權利要求18的麵包改良和/或麵團改良組合物。
全文摘要
本發明涉及一種新型鹼穩定的CGT酶,其主要產生α－環糊精,一種包含該CGT酶的酶組合物,以及該酶和酶組合物用於多數工業應用,如麵團改良組合物中的用途。
文檔編號C12N9/10GK1231691SQ97198278
公開日1999年10月13日 申請日期1997年9月26日 優先權日1996年9月26日
發明者C·斯約霍穆, S·普羅威, G·安特拉尼吉安 申請人:諾沃挪第克公司