含有澱粉樣β1－6抗原陣列的疫苗組合物的製作方法

2023-10-05 20:20:39 1

專利名稱：含有澱粉樣β1－6抗原陣列的疫苗組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、病毒學、免疫學和醫學領域。本發明提供了包含有序重複抗原或抗原決定簇陣列的組合物，特別是Aβ1-6肽-VLP組合物。更具體地，本發明提供了包含病毒樣顆粒和與其結合的至少一個Aβ1-6肽的組合物。本發明也提供了用於產生此綴合物或有序重複陣列的方法。本發明組合物可用於阿爾茨海默氏病的治療性疫苗的生產和用作預防或治癒阿爾茨海默氏病及有效地誘導免疫應答，特別是抗體免疫應答的藥物。而且，本發明組合物特別可用於有效地誘導自身特異性免疫應答。
背景技術：
阿爾茨海默氏病(AD)是(65歲和更年長)老年人中痴呆的最常見原因，並且對於公眾健康是一個嚴重負擔。例如，在美國，報導有4百萬人患有這種疾病。預期該疾病的發病率將隨著人口老齡化而增加。
阿爾茨海默氏病的主要病理學徵兆是與年齡有關的行為改變、β澱粉狀蛋白沉積為不溶斑塊(稱為神經炎斑塊或AD斑塊)、神經元內由τ蛋白質組成的神經原纖維纏結和整個前腦的神經元損失。除了在(65歲或更年長)老年發生的晚發性AD外，還有35和60歲之間發生的早發性AD，家族性AD(FAD)。AD病理學異常在FAD中比在晚發或散發性AD中更普遍、嚴重和早發生。APP基因、早老素(presenilin)1和早老素2基因中的突變與FAD相關。
如所述，阿爾茨海默氏病(AD)中的一個關鍵性事件是澱粉樣蛋白沉積為不溶性纖維塊(澱粉樣病變，amyloidogenesis)，產生了細胞外神經炎斑塊和腦血管壁周圍的沉積物(綜述參見Selkoe，D.J.(1999)Nature.399，A23-31)。儘管神經炎斑塊和嗜剛果紅血管病含有其它蛋白質諸如糖胺聚糖和載脂蛋白，但是這些沉積物的主要組分是澱粉樣β肽(Aβ)。Aβ從稱為澱粉樣前體蛋白質(APP)的大得多糖蛋白蛋白酶解切下，APP包括具有單疏水跨膜區和695-770個胺基酸的多種同種型。Aβ形成了長度不超過43個胺基酸的一組肽，其顯示了相當大的氨基和羧基末端異質性(截短)及修飾(Roher，A.E.，Palmer，K.C.，Chau，V.， Ball，M.J.(1988)J.CellBiol.107，2703-2716.Roher，A.E.，Palmer，K.C.，Yurewicz，E.C.，Ball，M.J.， Greenberg，B.D.(1993)J.Neurochem.61，1916-1926)。主要的同種型是Aβ1-40和1-42。它具有形成β片層的高度傾向，而後者可聚集為原纖維，這最終導致澱粉樣蛋白質。
Aβ肽在阿爾茨海默氏病神經病理學中具有重要作用。Aβ肽的區域特異性細胞外積累伴隨著小神經膠質細胞增生(microgliosis)、細胞骨架改變、營養不良性神經炎和突觸損失。這些病理學改變被認為與定義該疾病的認知下降有關。
在EP 526』511中描述了在沒有任何佐劑且澱粉樣β蛋白質或Aβ1-28與載體沒有任何連接的情況下，以多達10-2mg/劑量的量施用澱粉樣β蛋白質，或者具體地是Aβ1-28，用於治療阿爾茨海默氏病。
其他人也已經通過Aβ肽聯合佐劑進行給藥的方式誘導了抗Aβ1-42的細胞或體液免疫應答。在阿爾茨海默氏病的轉基因小鼠模型中，動物超量表達含有突變APP(717)V-F的人類澱粉樣前體蛋白質(PDAPP-小鼠；Johnson-Wood，K.等，Proc.Natl.Acad.USA 941550-1555，Games，D.等，Nature 373523-527(1995a))，引起了Aβ1-42超量產生並出現了斑塊、營養不良性神經炎、突觸前末端損失、星形膠質細胞增生和小神經膠質細胞增生。在最近研究中，據Schenk，D.等(Nature 400173-77(1999)和WO99/27944)的報導，在最初4次免疫中向6周齡PDAPP小鼠給藥混合有人類中不能使用的強佐劑(CFA/IFA)的聚集Aβ1-42，接著在隨後免疫中，給藥PBS中聚集的Aβ1-42，基本上防止了斑塊形成和有關的營養不良性神經炎。相同作者還報導了利用相同策略免疫年長小鼠(11月齡)也顯著地降低了阿爾茨海默氏病(AD)樣神經病學的程度和進展。在WO 99/27944的實施例III(抗確立的AD的治療效力的篩選)中報導了從利用上述策略免疫的小鼠獲得的脾細胞的增殖，表明通過接種方法誘導了Aβ1-42特異性T細胞。WO 9927944中報導了Aβ片段與山羊抗小鼠IgG的偶聯，以及在佐劑CFA/IFA存在的情況下用所述偶聯片段進行的免疫。WO 99/27944中也公開了包含與多肽諸如白喉毒素連接的Aβ片段的組合物在促進抗Aβ免疫應答中的用途。然而，沒有提供免疫數據。
已經證明識別Aβ N末端(1-16)內表位的單克隆抗體(抗體6C6)保護PC12細胞免受纖維性β澱粉樣蛋白的神經毒性損害，並且體外使β澱粉樣蛋白解聚(Solomon B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997))。也已證明抗Aβ1-28形成的單克隆抗體可以體外抑制β澱粉樣蛋白聚集(Solomon B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996))。Frenkel等(J.Neuroimmunol.8885-90(1998))後來鑑定了兩個抗聚集抗體10D5和6C6的表位，即表位「EFRH」，也即Aβ3-6。相反，對Aβ1-7特異的抗體不能防止β澱粉樣蛋白聚集(Frenkel D.等，J.Neuroimmunol.95136-142(1999))。
Aβ1-42具有形成原纖維的性質，並且實際上WO 99/27944中所述的疫苗組合物利用的是經處理能形成聚集體的Aβ1-42。已經證明這些原纖維對神經元細胞培養物是毒性的(Yankner等.，Science 245417-420(1989))，並且當將其注射到動物大腦中時也觀察到了毒性作用(Sigurdson等，Neurobiol.Aging 17893-901(1996)；Sigurdson等，Neurobiol.Aging 18591-608(1997))。Walsh等，(Nature 416535-539(2002))報導了在細胞內小泡中形成Aβ天然寡聚體。這些寡聚體在大鼠體內抑制了長期的強化作用(potentiation)，並且當以在人類大腦和腦脊髓液中發現的濃度存在時破壞了突觸可塑性。
在另一個研究中，Bard，F.等.(Nature Medicine 6916-19(2000))報導了儘管相對適度的血清水平，但是抗Aβ1-42抗體的外周給藥能降低澱粉樣蛋白負擔。該研究利用了抗Aβ1-42多克隆抗體，或抗來源於Aβ不同區域的合成片段的單克隆抗體。因此，抗Aβ肽抗體的誘導具有作為阿爾茨海默氏病潛在治療法的希望。
WO99/27949中描述了與β澱粉樣斑塊有關的抗原(諸如β澱粉樣肽和Aβ1-40)的黏膜給藥。據說黏膜給藥可以抑制與阿爾茨海默氏病有關的一些細胞因子應答，並且增強與炎性應答抑制有關的另一些細胞因子應答，其中該炎性應答與該疾病有關。據認為通過「激發以抗炎性細胞因子模式為特徵的T細胞」可以抑制炎性應答。如WO9927949中所述適宜的抗原包括對AD特異並被人類或動物宿主的免疫T細胞識別的抗原。
WO 01/18169中描述了單克隆抗體所識別的Aβ表位與絲狀噬菌體外殼蛋白的融合。用在外殼蛋白VIII上顯示15mer表位VHEPHEFRHVALNPV(SEQ ID NO89)的絲狀噬菌體免疫小鼠，產生了識別Aβ1-16和Aβ1-40的抗體。利用Aβ肽在抑制性ELISA中證明了這點，並且發現用Aβ1-40抑制血清與Aβ1-16的結合具有1μM的IC50。然而，Solomon(WO 01/18169)沒有提示由帶有表位VHEPHEFRHVALNPV(SEQ ID NO89)的絲狀噬菌體引起的抗血清能結合AD澱粉樣斑塊或神經炎斑塊。
利用不同於待激發的免疫應答所要針對的抗原的序列進行免疫有大量的缺點。首先，可以誘導針對抗原或抗原決定簇以外的序列部分的抗體。其次，在外源側翼序列元件背景中的抗原構象可能不同於全長抗原背景中的抗原構象。因此，儘管可以激發與抗原交叉反應的抗體，但是它們對抗原的結合可能是次最佳的。這樣激發的抗體的精確特異性也可能不對應於抗抗原本身引起的抗體的特異性，因為表位中存在不同於全長Aβ上殘基的另外側鏈。最後，15mer胺基酸序列可以含有T細胞表位。WO 01/18169中也公開了絲狀噬菌體外殼蛋白質III上表位YYEFRH(SEQ ID NO90)的展示，其中每個噬菌體上通常只存在3-5個拷貝。當使用感染性噬菌體作為用於免疫的載體時出現了幾個問題。首先，對於大的免疫運動，大規模和足夠量生產感染劑是有問題的。其次，疫苗中含有抗生素抗性基因的噬菌體DNA的存在也是有問題的，並且是安全性問題。最後，在使用非感染性噬菌體作為疫苗的情況下，大量噬菌體輻射的可行性和效力尚未解決。
WO 01/62284已經描述了Aβ類似物，其中修飾Aβ以包括T輔助細胞表位。用Aβ類似物免疫具有人類APP轉基因的TgRND8+小鼠比在沒有佐劑情況下用Aβ1-42免疫產生了高4到7.5倍的抗體效價。
最近的研究證明通過免疫接種誘導大腦澱粉樣蛋白沉積物減少有改進認知功能的潛力(Schenk，D.，等Nature 400173-177(1999)；Janus，C.等，Nature 408979-982(2000)；Morgan，D.等，Nature 408982-985(2000))。
用佐劑QS21中聚集的Aβ1-42免疫的患者的屍體解剖表明，存在T淋巴細胞腦膜腦炎和巨噬細胞對腦白質的浸潤(Nicoll，J.A.等，Nature Med.9448-452(2003))。
最近，出版物已經報導了在用聚集的Aβ1-42和QS-21佐劑組成的疫苗AN1792免疫的患者中的18例腦膜腦炎(Orgogozo J.-M.等，Neurology6146-54(2003))。據報導T細胞活化是對該疾病負責的潛在機制，但在疾病和血清抗Aβ1-42效價之間沒有明顯的關係。
公認單獨給藥純化的蛋白質通常不足以激發強免疫應答；分離的抗原一般必需與稱為佐劑的輔助物質一起施用。在這些佐劑中，施用的抗原可以免於被快速降解，並且佐劑可以造成抗原的低水平延長釋放。在本發明中，Aβ肽通過結合VLP而具有免疫原性，並且不需要佐劑。
因此，改進接種效率的一種方法是增加所施用抗原的重複程度。不同於分離的蛋白質，在有和無T細胞輔助及不存在任何佐劑的情況下，病毒都可以誘導快速和有效的免疫應答(Bachmann Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol15235-270(1991))。儘管病毒常常由少數蛋白質組成，但是它們能觸發比它們的分離成分強得多的免疫應答。對於B細胞應答，已知病毒免疫原性的一個至關重要的因素是表面表位的重複性和有序性。許多病毒顯示了準晶體表面，該表面展示出一個有規則的表位陣列，這些表位可以有效地與B細胞上的表位特異性免疫球蛋白交聯(Bachmann Zinkernagel，Immunol.Today 17553-558(1996))。與B細胞上表面免疫球蛋白的這種交聯是直接誘導細胞周期進程和IgM抗體產生的強活化信號。而且，這種觸發的B細胞能活化T輔助細胞，接著在B細胞中誘導從IgM到IgG抗體產生的轉換和長壽記憶B細胞的產生——任何接種的目的(Bachmann Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol15235-270(1997))。病毒結構甚至可以與自身免疫病中抗-抗體的產生相聯繫，作為針對病原體的天然應答的一部分(參見，Fehr，T.等，J Exp.Med.1851785-1792(1997))。因此，通過高度有組織的病毒表面呈遞的抗體能誘導強抗-抗體應答。
然而，如所述的，免疫系統通常不能產生抗來源於自身的結構的抗體。對於低濃度存在的可溶抗原而言，這是由Th細胞水平上的耐受性所致。在這些條件下，將自身抗原與可以遞送T輔助的載體偶聯可以打破耐受性。對於高濃度存在的可溶蛋白質或低濃度的膜蛋白質，B和Th細胞可以是耐受性的。然而，B細胞的耐受性可能是可逆的(無反應性)，並且可以通過施用偶聯外源載體的高度有組織形式的抗原來破壞(BachmannZinkernagel，Ann.Rev.Immunol15235-270(1997))。如2002年1月18日提交的，正在審查的美國申請號10/050,902中所表明的，用包含與VLP結合的Aβ肽(Aβ1-15，Aβ1-27和Aβ33-42，其是小鼠的自身抗原)的組合物可以誘導強免疫應答。具體地，結合RNA噬菌體Qβ VLP的上述人類Aβ肽在人類APP轉基因小鼠中誘導了高Aβ特異性效價(實施例中所述)，這證明用結合VLP的Aβ肽免疫可以克服對自身抗原Aβ的耐受性。
因此，為了治療阿爾茨海默氏病，需要高免疫原性的安全組合物和疫苗，特別是，利用無可以激發副反應的T細胞表位和佐劑但仍能誘導結合澱粉樣斑塊的高抗體效價的免疫原。
發明概述我們發現Aβ1-6肽與具有固有重複組織結構的核心顆粒，特別是病毒樣顆粒(VLP)或VLP亞單位結合形成的高度有序和重複的綴合物，是用於誘導Aβ1-6特異性抗體的有效免疫原。因此，本發明提供了用於阿爾茨海默氏病治療的預防和治療手段，該手段基於有序和重複的Aβ1-6-核心顆粒陣列，特別是基於VLP-Aβ1-6肽綴合物或陣列。這種預防和治療劑能誘導高效價抗Aβ1-6肽抗體，該抗體與可溶Aβ交叉反應，並且能結合人類APP轉基因小鼠模型中的人類澱粉樣斑塊以及結合AD澱粉樣斑塊。而且，此激發的抗體不與大腦切片上的APP結合。
此外，本發明提供了用於AD治療的新的組合物、疫苗和方法。包含Aβ1-6肽的此組合物和疫苗無T細胞表位，並且能誘導結合AD斑塊和可溶Aβ的抗體。通過使Aβ1-6肽結合核心顆粒，優選地結合VLP，甚至更優選地結合RNA噬菌體的VLP，Aβ1-6肽以高度重複和有序的方式被呈遞給患者的免疫系統。
在優選的實施方式中，抗原或抗原決定簇是人類澱粉樣β肽Aβ1-6(DAEFRH；SEQ ID NO75)，其是Aβ(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO91)的片段，其中人類澱粉樣β肽Aβ1-6與核心顆粒或VLP結合。SEQ ID NO92中提供了澱粉樣β蛋白質。SEQ ID NO93中提供了澱粉樣β前體蛋白。
因此，本發明提供了組合物，該組合物包含(a)具有至少一個第一附著位點的核心顆粒；和(b)至少一個具有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽，並且其中所述第二附著位點選自(i)非天然存在於所述抗原或抗原決定簇中的附著位點；和(ii)所述抗原或抗原決定簇中天然存在的附著位點，其中所述第二附著位點能與所述第一附著位點締合(association)；並且其中所述抗原或抗原決定簇和所述核心顆粒通過所述締合相互作用以形成有序和重複的抗原陣列。適於本發明中使用的核心顆粒的優選實施方式是病毒、病毒樣顆粒、噬菌體、RNA噬菌體的病毒樣顆粒，細菌菌毛或鞭毛或具有能形成本發明的有序和重複抗原陣列的固有重複結構的任何其它核心顆粒。
本發明的Aβ片段是可溶的，並且一般地不形成團聚體。而且，它們與核心顆粒或VLP結合，並且優選地共價結合。因此，本發明組合物不具有誘導有毒作用，諸如作為澱粉樣沉積物的種子的危險。
用包含結合核心顆粒或VLP的Aβ1-6肽的組合物可以獲得與可溶Aβ和AD澱粉樣斑塊交叉反應的高效價抗體，這是本發明的意外發現。特別地，已經證明VLP可以介導抗自身抗原的抗體誘導，由此破壞自身耐受性(WO 02/056905，這裡整體將該文獻的公開內容併入為參考文獻)。而且，該表位的小尺寸也排除了T細胞表位的存在，因此提供了不誘導Aβ特異性T細胞應答的新組合物。此外，所激發的抗體不結合大腦切片上的APP。因此，本發明提供了用於AD預防和治療的安全疫苗組合物。
更具體地，本發明提供了包含有序重複抗原或抗原決定簇陣列，特別是Aβ1-6肽-VLP綴合物的組合物。更具體地，本發明提供了包含病毒樣顆粒和與其結合的至少一個Aβ1-6肽的組合物。本發明也提供了用於產生此綴合物或有序重複陣列的方法。本發明組合物可以用於生產治療阿爾茨海默氏病的疫苗，和用做藥物以預防或治癒阿爾茨海默氏病和有效地誘導免疫應答，特別是抗體應答。而且，在本上下文中，本發明組合物尤其可用於有效地誘導自身特異性免疫應答。
在本發明中，Aβ1-6肽典型地以定向方式結合核心顆粒或VLP，從而產生有序和重複的Aβ1-6肽抗原陣列。而且，核心顆粒或VLP的高度重複有組織結構可以介導Aβ肽以高度有序的重複方式進行展示，產生高度有組織的重複抗原陣列。而且，因為核心顆粒和VLP對用核心顆粒-Aβ1-6肽陣列或VLP-Aβ1-6肽陣列免疫的宿主是外源的，所以Aβ1-6肽與核心顆粒或VLP的結合也提供了T輔助細胞表位。這些陣列尤其在它們高度有組織的結構、維度和陣列表面抗原的重複性方面不同於現有技術的綴合物。
在本發明的一個方面，化學合成Aβ1-6肽，而從適於核心顆粒或VLP摺疊和裝配的表達宿主中表達和純化核心顆粒或VLP。然後，通過Aβ1-6肽與核心顆粒或VLP的結合，裝配Aβ1-6肽陣列。
在另一個方面，本發明提供了組合物，該組合物包含(a)病毒樣顆粒，和(b)至少一個抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽，並且其中所述至少一個抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結合。
在另一個方面，本發明提供了藥物組合物，該藥物組合物包含(a)本發明組合物，和(b)可接受的藥物學載體。
在另一個方面，本發明提供了包含如下組合物的疫苗組合物，其中所述組合物包含(a)病毒樣顆粒；和(b)至少一個抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽；並且其中所述至少一個抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結合。
在另一個方面，本發明提供了免疫方法，該方法包括向動物施用本發明組合物、本發明藥物組合物或本發明疫苗。
在再一方面，本發明提供了製備本發明組合物的方法，該方法包括(a)提供病毒樣顆粒；和(b)提供至少一個抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽；(c)混合所述病毒樣顆粒和所述至少一個抗原或抗原決定簇，使得所述至少一個抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結合。
相似地，本發明提供了製備權利要求1的組合物的方法，該方法包括(a)提供具有至少一個第一附著位點的核心顆粒；(b)提供至少一個具有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽；並且其中所述第二附著位點選自(i)非天然存在於所述抗原或抗原決定簇中的附著位點；和(ii)所述抗原或抗原決定簇中天然存在的附著位點；並且其中所述第二附著位點能締合所述第一附著位點；和(c)混合所述核心顆粒和所述至少一個抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇和所述核心顆粒通過所述締合相互作用以形成有序和重複的抗原陣列。
在另一方面，本發明提供了權利要求1的組合物用於製備治療阿爾茨海默氏病藥物的用途。
在另一方面，本發明提供了權利要求1的組合物用於製備預防或治療阿爾茨海默氏病的藥物的用途。而且，在另一方面，本發明提供了權利要求1的組合物單獨或聯合其它藥劑或者以明確缺少特殊物質諸如佐劑的形式用於製備治療或預防阿爾茨海默氏病和/或刺激哺乳動物免疫系統的組合物、藥物組合物、疫苗、藥劑或藥物的用途。
因此，特別地，本發明提供了適於預防和/或減輕阿爾茨海默氏病或其相關病症的疫苗組合物。本發明還提供了用於預防和/或減輕人類的阿爾茨海默氏病或其相關病症的免疫或接種方法。可以預防地或治療地施用本發明組合物。
在
具體實施例方式
中，本發明提供了預防和/或減弱由「自身」基因產物，即這裡所用的「自身抗原」引起或加重的阿爾茨海默氏病或其相關病症的方法。在相關實施方式中，本發明提供了在動物或個體中誘導免疫學應答的方法，該方法導致可以預防和/或減弱由「自身」基因產物引起或加重的阿爾茨海默氏病或其相關病症的抗體產生。
如本領域普通技術人員所理解的，當向動物或人類給藥本發明組合物時，它們可以是含有鹽、緩衝液、佐劑或期望用於改進組合物效力的其它物質的組合物。大量的文獻包括Remington′s Pharmaceutical Sciences(Osol，A，編輯，Mack Publishing Co.(1990))中提供了適於在藥物組合物製備中使用的物質的例子。
如果受體個體可以耐受本發明組合物的施用，那麼稱本發明組合物是「藥理學可接受的」。而且，將以「治療有效量」(即，產生期望的生理學作用的量)施用本發明組合物。
可以用本領域已知的各種方法給藥本發明組合物，但是正常地，通過注射、輸注、吸入、口服或其它適合的物理方法給藥。做為可替代方案，可以肌內地、靜脈內地、或皮下地給藥該組合物。用於給藥的組合物成分包括無菌水性(例如，生理鹽水)或非水性溶液和懸浮液。非水溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油諸如橄欖油和可注射的有機酯諸如油酸乙酯。載體或封閉敷料可以用於增加皮膚滲透性和增強抗原吸收。
基於本領域已知的現有技術、下面的附圖、本發明說明書和權利要求，本發明的其它實施方式對本領域普通技術人員將顯而易見。


圖1描述了還原條件下電泳的SDS-PAGE凝膠，表明Aβ1-6肽(NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(SEQ ID NO77)與Qβ外殼蛋白的VLP偶聯的結果。
圖2表示在用偶聯Qβ外殼蛋白的VLP的Aβ1-6肽免疫的小鼠血清中，對Aβ1-6特異性抗體的ELISA分析。
圖3表示在用偶聯Qβ外殼蛋白的VLP的Aβ1-6肽免疫的小鼠血清中，對Aβ1-40特異性抗體的ELISA分析。
圖4A-B表示用偶聯Qβ外殼蛋白的VLP的Aβ1-6肽免疫的小鼠的血清染色的APP23小鼠大腦切片(A)和AD患者entorhinalcortex切片(B)。
圖5A-E表示用偶聯Qβ外殼蛋白VLP的Aβ1-6肽免疫的小鼠的血清或者用對人或小鼠APP之C末端特異的多克隆兔抗血清染色的APP23小鼠大腦切片。
圖6表示用ELISA試驗測得的、用偶聯Qβ VLP的人類Aβ1-6肽免疫恆河猴的結果。
圖7表示通過組織學在人類AD和轉基因小鼠斑塊上測定到的、斑塊與血清的結合結果，其中所述血清來源於用偶聯Qβ VLP的人類Aβ1-6肽免疫的猴子。
圖8描述了對鼠Aβ1-6與AP205 VLP偶聯的SDS-PAGE分析。
圖9表示ELISA中測定到的、用偶聯AP205的鼠Aβ1-6免疫小鼠的結果。
圖10表示在用QβhAβ1-6免疫的9.5至19個月齡的「Swedish/London」轉基因小鼠的血清中，抗Aβ40和抗Aβ42效價的ELISA分析。
圖11表示用QβhAβ1-6或PBS免疫的「Swedish/London」轉基因小鼠的大腦切片的免疫組織化學染色。
圖12表示在用QβhAβ1-6、Qβ或PBS免疫的9.5至19個月齡「Swedish/London」轉基因小鼠中對斑塊沉積物的定量。
圖13表示在用QβhAβ1-6或PBS免疫的13.5至19個月齡「Swedish/London」轉基因小鼠中對斑塊沉積物的定量。
圖14表示在用Qβh Aβ1-6免疫的「Swedish」轉基因小鼠血清中，針對抗Aβ40和抗Aβ42效價的ELISA分析。
圖15表示用Qβh Aβ1-6或PBS免疫的「Swedish」轉基因小鼠的大腦切片的免疫組織化學染色。
圖16表示在用Qβh Aβ1-6或PBS免疫的「Swedish」轉基因小鼠中對斑塊沉積物的定量。
發明詳述除非另外定義，這裡所用的所有科技術語具有和本發明所屬技術領域普通技術人員所通常理解的意思相同的意思。儘管在本發明實踐或試驗中可以使用與這裡所述相似或等同的任何方法和材料，但是，此後描述的是優選的方法和材料。
1定義Aβ1-6肽這裡所用的Aβ1-6肽指具有與人類Aβ1-6序列相應的序列或與人類Aβ1-6序列同源的序列的肽。與人類Aβ1-6序列同源的序列包括，但不限於其它物種的Aβ1-6序列，因此包括但不限於靈長類、兔子、豚鼠、光滑爪蟾(xenopus Laevis)、青蛙、小鼠和大鼠Aβ1-6序列。儘管來源於爪蟾或青蛙的Aβ1-6序列在兩個位置不同於人類Aβ1-6，但是它們具有保守性突變(Ala-Ser，Phe-Tyr)，因此根據該定義認為它們與Aβ1-6同源。然而，根據本發明，通常修飾Aβ1-6肽使得第二附著位點附著於其上。優選地，用包含第二附著位點的接頭或胺基酸接頭修飾第二附著位點，以便結合核心顆粒或VLP。當這裡提到Aβ1-6肽時，應該包括上述修飾的Aβ1-6肽，即具有附著於其上的第二附著位點的Aβ1-6肽。然而，通常地，本申請文件中明確地指出這種修飾。而且，隨著本說明書的進行，作為本發明抗原或抗原決定簇的Aβ1-6肽的其它優選實施方式將變得顯而易見。
佐劑這裡所用術語「佐劑」指免疫應答的非特異性刺激物或允許在宿主中產生貯庫(depot)的物質，當其與本發明疫苗或藥物組合物聯合時可以提供更強的免疫應答。可以使用各種佐劑。例子包括完全和不完全弗氏佐劑，氫氧化鋁和修飾的胞壁醯二肽。其它佐劑是礦物凝膠諸如氫氧化鋁、表面活性物質諸如溶血卵磷脂、pluronie polyol、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔槭血藍蛋白、二硝基苯酚和潛在有用的人類佐劑諸如BCG(卡介菌)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。這些佐劑也是本領域已知的。可以與本發明組合物一起給藥的其它佐劑包括但不限於單磷醯脂質免疫調節劑，AdjuVax 100a，QS-21，QS-18，CRL1005，鋁鹽(Alum)，MF-59，OM-174，OM-197，OM-294和病毒體佐劑技術。佐劑也可以包含這些物質的混合物。
來源於南美洲樹Quillaja Saponaria Molina樹皮的具有佐劑活性的免疫學活性皂苷級分是本領域已知的。例如QS21，也稱為QA21，是來源於Quillaja Saponaria Molina樹的Hplc純化級分，並且在美國專利號5,057,540中公開了它的生產方法(做為QA21)。Scott等，Int.Archs.AllergyAppl.Immun.，1985，77，409也公開了Quillaja皂苷作為一種佐劑。單磷醯脂質A和其衍生物是本領域已知的。優選的衍生物是3-脫氧-醯化單磷醯脂質A，見英國專利號2220211。WO00/00462中描述了其它優選的佐劑，這裡將這篇文獻的公開內容併入為參考文獻。
然而，本發明有利的特徵是本發明組合物高度的免疫原性。如這裡已概述的或者隨著本說明書的進行將變得顯而易見的，本發明在備選的或優選的實施方案中提供了無佐劑的疫苗和藥物組合物，從而產生了用於治療AD的疫苗和藥物組合物，該疫苗和藥物組合物無佐劑並且因此具有優良的安全性質，因為佐劑可能引起副作用。在涉及用於治療AD的疫苗和藥物組合物時，這裡所用的術語「無」指所使用的疫苗和藥物組合物沒有佐劑。
胺基酸接頭如這裡所使用的，本說明書中 「胺基酸接頭」，或也稱為「接頭」在於連接第二附著位點與抗原或抗原決定簇，或者更優選地，其已經包含或含有第二附著位點，典型地，但不是必需地，所述第二附著位點為一個胺基酸殘基，優選地為半胱氨酸殘基。然而，即使由胺基酸殘基組成的胺基酸接頭是本發明優選的實施方式，但是這裡使用的術語「胺基酸接頭」並沒有意指這種胺基酸接頭專門地由胺基酸殘基組成。胺基酸接頭的胺基酸殘基優選地由本領域已知的天然胺基酸或非天然胺基酸，全L或全D或其混合物組成。然而，包含具有巰基或半胱氨酸殘基的分子的胺基酸接頭也包括在本發明中。這種分子優選地包含C1-C6烷基-、環烷基(C5，C6)、芳基或雜芳基組成部分。然而，除了胺基酸接頭外，優選地包含C1-C6烷基-、環烷基-(C5，C6)、芳基或雜芳基組成部分並且無任何胺基酸的接頭也包括在本發明範圍內。抗原或抗原決定簇或可選地第二附著位點和胺基酸接頭之間的連接優選地通過至少一個共價鍵，更優選地通過至少一個肽鍵進行。
動物這裡使用的術語「動物」意在包括例如人類、綿羊、麋鹿、鹿、黑尾鹿、貂、哺乳動物、猴子、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥、雞、爬行動物、魚、昆蟲和蛛形綱動物。
抗體這裡所用術語「抗體」指能結合表位或抗原決定簇的分子。該術語意在包括整個抗體和其抗原結合片段，包括單鏈抗體。最優選地，抗體是人抗原結合抗體片段，並且包括，但不限於Fab，Fab′和F(ab′)2，Fd，單鏈Fvs(scFv)，單鏈抗體，二硫鍵連接的Fvs(sdFV)及含有VL或VH結構域的片段。抗體可以來源於任何動物來源，包括鳥類和哺乳動物。優選地，抗體是人、鼠、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞抗體。這裡所用術語「人」抗體包括具有人類免疫球蛋白胺基酸序列的抗體，並包括從人類免疫球蛋白文庫分離的抗體或者從具有一種或多種人類免疫球蛋白轉基因並且不表達內源免疫球蛋白的動物分離的抗體，例如，參見Kucherlapati等的美國專利號5,939,598。
抗原這裡所用術語「抗原」指能被抗體結合或者在被MHC分子呈遞後能被T細胞受體(TCR)結合的分子。這裡所用術語「抗原」也包括T-細胞表位。抗原還能被免疫系統識別和/或能誘導體液免疫應答和/或細胞免疫應答，從而激活B-和/或T-淋巴細胞。然而，這可能要求，至少在一些情況下，抗原含有或連接有Th細胞表位，並且在佐劑中給出。抗原可以有一個或多個表位(B-和T-表位)。上述特異性反應意思是指抗原典型地以高度選擇性方式優先地與其相應抗體或TCR反應，而不與可能由其它抗原激發的大量其它抗體或TCR反應。這裡所用抗原也可以是幾種單獨抗原的混合物。
抗原決定簇這裡所用術語「抗原決定簇」意指B或T淋巴細胞特異地識別的抗原部分。B-淋巴細胞應答抗原決定簇產生抗體，而T淋巴細胞通過增殖和建立對細胞和/或體液免疫的介導起決定作用的效應子功能來應答抗原決定簇。
締合(association)這裡所用術語「締合」當用於第一和第二附著位點時，指第一和第二附著位點的結合，優選地通過至少一個非肽鍵結合。締合的性質可以是共價的、離子的、疏水的、極性的或它們的任何組合，優選地締合的性質是共價的。
第一附著位點這裡所用短語「第一附著位點」指非天然或天然來源的元件，位於抗原或抗原決定簇上的第二附著位點可以與其締合。第一附著位點可以是蛋白質、多肽、胺基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物，次生代謝物或化合物(生物素、螢光素、視黃醇、地高辛配基、金屬離子、苯甲基磺醯氟化合物)，或它們的聯合或者它們的化學反應基團。通常地和優選地，第一附著位點位於核心顆粒諸如，優選地病毒樣顆粒的表面。多個第一附著位點通常以重複構型存在於核心或病毒樣顆粒的表面。
第二附著位點這裡所用短語「第二附著位點」指與抗原或抗原決定簇連接的元件，位於核心顆粒或病毒樣顆粒表面上的第一附著位點可以與其締合。抗原或抗原決定簇的第二附著位點可以是蛋白質、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次生代謝物或化合物(生物素、螢光素、視黃醇、地高辛配基、金屬離子、苯甲基磺醯氟化合物)，或它們的聯合或者它們的化學反應基團。至少一個第二附著位點存在於抗原或抗原決定簇上。因此，術語「具有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇」指包含至少該抗原或抗原決定簇和該第二附著位點的抗原或抗原性構建體。然而，特別是對於非天然來源，即，不天然出現在抗原或抗原決定簇中的第二附著位點，這些抗原或抗原性構建體包含「胺基酸接頭」。
結合這裡所用術語「結合」指可以是共價的(例如通過化學偶聯)或非共價的(例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等)結合或附著。共價鍵可以是例如酯、醚、磷酸酯、醯胺、肽、二醯亞胺、碳-硫鍵、碳-磷鍵等等。術語「結合」更廣義，並且包括術語諸如「偶聯」、「融合」和「附著」。
外殼蛋白這裡所用術語「外殼蛋白」指能摻入噬菌體或RNA噬菌體的衣殼裝配物中的噬菌體或RNA噬菌體蛋白質。然而，當指RNA噬菌體外殼蛋白基因的具體基因產物時，使用術語「CP」。例如，RNA噬菌體Qβ外殼蛋白基因的具體基因產物稱為「Qβ CP」，而噬菌體Qβ的「外殼蛋白」包括「Qβ CP」及A1蛋白質。噬菌體Qβ的衣殼主要由Qβ CP組成，具有少量的A1蛋白質。同樣地，VLP Qβ外殼蛋白主要包含Qβ CP，具有少量的A1蛋白質。
核心顆粒這裡所用術語「核心顆粒」指具有固有重複組織的剛性結構。這裡所用核心顆粒可以是合成過程的產物或者是生物學過程的產物。
偶聯的這裡所用術語「偶聯的」指通過共價鍵或通過強的非共價相互作用的附著，通常和優選地指通過共價鍵的附著。本發明中可以使用本領域技術人員通常用於生物活性材料偶聯的任何方法。
有效量這裡所用術語「有效量」指實現期望的生物學作用所必需的量或足以實現期望的生物學作用的量。組合物的有效量將是達到選定結果的量，並且該量可以由本領域技術人員常規地確定。例如，治療免疫系統缺陷的有效量可以是引起免疫系統活化所必需的量，一旦暴露於抗原，這種量將引起抗原特異性免疫應答形成。該術語也與「足夠量」同義。
表位這裡所用術語「表位」指在動物，優選哺乳動物，最優選人中，具有抗原或免疫原活性的多肽的連續或不連續部分。在MHC分子背景中表位可以被T細胞通過其T細胞受體識別，或者表位可以被抗體識別。這裡所用術語「免疫原性表位」定義為通過本領域已知的任何方法進行測定，可以在動物中激發抗體應答或誘導T細胞應答的多肽部分(參見，例如，Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002(1983))。如這裡所用術語「抗原性表位」定義為通過本領域已知的任何方法進行測定，抗原蛋白質中可以與抗體免疫特異性結合的部分。免疫特異性結合排除了非特異性結合，但是不一定排除與其它抗原的交叉反應性。抗原性表位不必一定是免疫原性的。抗原性表位也可以是T細胞表位，在這種情況下，它們可以在MHC背景下，免疫特異性地結合T細胞受體。
表位可以在表位獨特的空間構象中包含3個胺基酸。一般地，表位由至少約5個這種胺基酸組成，更一般地，由至少約8-10個這種胺基酸組成。如果表位是有機分子，那麼它可以如硝基苯基一樣小。
融合這裡所用術語「融合」指不同來源的胺基酸序列通過它們的編碼核苷酸序列的讀框內組合而在一個多肽鏈中組合。術語「融合」明確地包含內部融合，即，不同來源的序列除了融合在多肽鏈一個末端外，還可以插入到多肽鏈中。
免疫應答這裡所用術語「免疫應答」指引起B和/或T-淋巴細胞和/或抗原呈遞細胞激活或增殖的體液免疫應答和/或細胞免疫應答。然而，在一些情況下，免疫應答可能具有低的強度，並且只有當使用至少一種本發明物質時才可檢測。「免疫原性」指用於刺激活生物體免疫系統的試劑，由此免疫系統的一種或多種功能將被增強並且定向於此免疫原性劑。「免疫原性多肽」是在佐劑存在或不存在的情況下，單獨地或是以連接載體的形式激發細胞和/或體液免疫應答的多肽。優選地，可以活化抗原呈遞細胞。
「增強」免疫應答的物質是這樣的一種物質，即當與沒有添加該物質時測定的相同免疫應答比較，添加該物質時觀察到免疫應答被增強或強化或發生偏離。例如，可以在免疫期間利用或不利用該物質並獲取樣品，然後可以在樣品中利用51Cr釋放試驗測定細胞毒性T細胞的裂解活性。與沒有該物質時的CTL裂解活性比較，該物質增強CTL裂解活性時的量稱為足以增強動物對抗原的免疫應答的量。在優選的實施方式中，免疫應答增強至少2倍，更優選地增強至少約3倍或更多。也可以改變所分泌的細胞因子的量和類型。做為可以替代的方案，可以改變誘導的抗體或其亞型的量。
免疫這裡所用術語「免疫「或相關術語指賦予產生抗靶抗原或表位的實質性免疫應答(包括抗體和/或細胞免疫諸如效應CTL)的能力。這些術語不要求產生完全的免疫，而是要求產生實質上比基線大的免疫應答。例如，如果本發明方法應用後，出現了對靶抗原的細胞和/或體液免疫應答，那麼就認為哺乳動物被免疫了。
天然來源這裡所用術語「天然來源」意指物質的整體或其部分不是合成的，而是自然界中存在或產生的。
非天然的這裡所用術語「非天然的」一般意指不是來源於自然界的，更具體地，該術語意指來源於人工的。
非天然來源這裡所用術語「非天然來源」一般意指合成的或者不是來源於自然界的；更具體地，該術語意指來源於人工的。
有序和重複的抗原或抗原決定簇陣列這裡所用術語「有序重複的抗原或抗原決定簇陣列」一般地指抗原或抗原決定簇的重複模式，其特徵在於抗原或抗原決定簇相對於核心顆粒或病毒樣顆粒為一種典型地且優選地一致的空間排列。在本發明一個實施方式中，重複模式可以是幾何學模式。適宜的有序重複抗原或抗原決定簇陣列的典型和優選例子是具有嚴格重複的抗原或抗原決定簇次晶晶序的陣列，優選地具有0.5到30納米晶面間距(spacing)，優選地5到15納米晶面間距。
菌毛這裡所用術語「菌毛」指細菌細胞的細胞外結構，其由組織成有序重複模式的蛋白質單體(例如菌毛蛋白單體)組成。而且，菌毛是參與諸如細菌細胞附著宿主細胞表面受體、細胞間遺傳交換和細胞-細胞識別等過程的結構。菌毛的例子包括類型1菌毛、P菌毛、F1C菌毛、S菌毛和987P菌毛。下面列出了菌毛的其它例子。
菌毛樣結構這裡所用短語「菌毛樣結構」指與菌毛具有相似特徵並由蛋白質單體組成的結構。「菌毛樣結構」的一個例子是表達修飾的菌毛蛋白的細菌細胞形成的結構，該修飾的菌毛蛋白不形成與天然菌毛相同的有序重複陣列。
多肽這裡所用術語「多肽」指由通過醯胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(胺基酸)組成的分子。它指胺基酸的分子鏈，並且不指產物的特定長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白質都包括在多肽定義中。該術語也意指多肽的表達後修飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化等。重組或衍生多肽不一定從指定核酸序列翻譯而成。其也可以通過任何方法，包括化學合成來產生。
殘基這裡所用術語「殘基」意指多肽主鏈或側鏈中具體的胺基酸。
自身抗原這裡所用術語「自身抗原」指宿主DNA編碼的蛋白質，並且通過宿主DNA編碼的蛋白質或RNA產生的產物也定義為自身的。此外，由2種或幾種自身分子聯合產生的蛋白質，或者是作為自身分子一部分的蛋白質，及與上述兩種自身分子具有高度同源性(＞95％，優選地＞97％，更優選地＞99％)的蛋白質也可以認為是自身的。
治療這裡所用術語「治療」或「治療的」指預防和/或治療。例如，當在感染性疾病方面使用該術語時，該術語指預防性治療(該預防性治療增加個體對病原體感染的抗性，或者換而言之，減少個體被病原體感染或個體顯示出由感染引起的病徵的可能性)，以及個體感染後的治療(以戰勝感染，例如減少或消除感染或者防止其變得更嚴重)。
疫苗這裡所用術語「疫苗」指含有本發明組合物並具有能向動物給藥的形式的製劑。通常地，疫苗包含常規鹽水或緩衝水性溶液介質，而本發明組合物懸浮或溶解於其中。以這種形式，可以方便地使用本發明組合物以預防、改善或治療病症。一旦將該疫苗引入到宿主中，該疫苗就能激發免疫應答，包括但不限於抗體和/或細胞因子的產生和/或細胞毒性T細胞、抗原呈遞細胞、輔助T細胞、樹突細胞的活化和/或其它細胞應答。
可選地，本發明的疫苗還包含佐劑，該佐劑可以相對於本發明化合物以次要或主要比例存在。
病毒樣顆粒(VLP)這裡所用術語「病毒樣顆粒」指類似病毒顆粒的結構。而且，本發明病毒樣顆粒由於缺少所有或部分病毒基因組，特別是病毒基因組中的複製和感染元件，所以它是非複製和非感染性的。本發明病毒樣顆粒可以含有不同於其基因組的核酸。本發明病毒樣顆粒的典型和優選的實施方式是病毒衣殼，諸如病毒，噬菌體或RNA噬菌體的病毒衣殼。這裡可交換地使用的術語「病毒衣殼」和「衣殼」指由病毒蛋白質亞單位組成的大分子裝配物。典型並優選地，病毒蛋白質亞單位裝配成病毒衣殼或衣殼，所述衣殼的結構具有固有的重複組織，其中所述結構通常是球形或管狀。例如，RNA噬菌體或HBcAg的衣殼具有二十面對稱的球形。這裡所用術語「衣殼樣結構」指由病毒蛋白質亞單位組成的大分子裝配物，其形態類似上述意義的衣殼，但是偏離典型的對稱裝配，而是維持了足夠程度的有序和重複性。
噬菌體的病毒樣顆粒這裡所用術語「噬菌體的病毒樣顆粒」指類似噬菌體結構的病毒樣顆粒，其是非複製和非感染性的，並且缺少至少一種或多種編碼噬菌體複製機器的基因，並且典型地也缺少一種或多種編碼負責病毒附著或進入到宿主中的蛋白質的基因。然而，該定義也應該包括這樣的噬菌體病毒樣顆粒，其中前述一種或多種基因仍舊存在但是已失活，因此也導致非複製和非感染性的噬菌體病毒樣顆粒。
RNA噬菌體外殼蛋白的VLP從RNA噬菌體外殼蛋白的180個亞單位自裝配形成的、可選地含有宿主RNA的衣殼結構稱為「RNA噬菌體外殼蛋白的VLP」。一個具體例子是Qβ外殼蛋白的VLP。在這種特定情況下，Qβ外殼蛋白的VLP可以僅由Qβ CP亞單位裝配(Qβ CP亞單位通過Qβ CP基因表達產生，該基因含有例如TAA終止密碼子，從而通過阻抑作用排除了更長A1蛋白質的任何表達，參見Kozlovska，T.M.，等，Intervirology 399-15(1996))，或者還可以在衣殼裝配物中含有A1蛋白質亞單位。
病毒顆粒這裡所用術語「病毒顆粒」指病毒的形態學形式。在一些病毒類型中，它包括蛋白質衣殼環繞的基因組；其它病毒還具有另外的結構(例如，包膜，尾等)。
一個/一種除非另有說明，當在本公開中使用術語「一個/一種」時，它們意指「至少一個/一種」或者「一個/種或多個/種」。
如本領域技術人員所清楚的，本發明一些實施方式涉及到使用重組核酸技術諸如克隆、聚合酶鏈式反應、DNA和RNA的純化、原核生物和真核生物細胞中重組蛋白質的表達等。這些方法是本領域技術人員公知的，並且在出版的實驗室方法手冊中可以方便地找到(例如，Sambrook，J.等，編輯，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等，編輯，Current Protocols in Molecular Biology，John H.WileySons，Inc.(1997))。在文獻中也充分描述了與組織培養細胞系有關的基本實驗技術(Celis，J.，編輯，Cell Biology，Academic Press，第二版，(1998))和抗體技術(Harlow，E.和Lane，D.，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，″Guide to Protein Purification，″Meth.Enzymol.128，Academic Press SanDiego(1990)；Scopes，R.K.，Protein Purification Principles and Practice，第三版，Springer-Verlag，New York(1994))，這裡將這些文獻併入為參考文獻。
2.增強免疫應答的組合物和方法本公開的發明提供了用於在動物中誘導抗Aβ1-6肽免疫應答，誘導能結合Aβ澱粉樣斑塊和可溶Aβ的抗體的組合物和方法。本發明組合物包含，或者可替代地其組成為(a)具有至少一個第一附著位點的核心顆粒；和(b)至少一個具有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽，並且其中所述第二附著位點選自(i)非天然存在於所述抗原或抗原決定簇中的附著位點；和(ii)所述抗原或抗原決定簇中天然存在的附著位點，其中所述第二附著位點能與所述第一附著位點締合；並且其中所述抗原或抗原決定簇和所述核心顆粒通過所述締合相互作用以形成有序和重複的抗原陣列。更具體地，本發明組合物包含或者可替代地其組成為病毒樣顆粒和至少一個抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽，並且其中所述至少一個抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結合以形成有序和重複的抗原-VLP陣列。而且，本發明能使實施者方便地構建這種組合物，特別是用於阿爾茨海默氏病治療和/或預防。本申請範圍中的病毒樣顆粒指類似於病毒顆粒但是沒有致病性的結構。一般地，病毒樣顆粒缺少病毒基因組，因此是非感染性的。而且，通過異源表達可以大量產生病毒樣顆粒，並且可以容易地進行純化。
在一個實施方式中，核心顆粒包含或者選自病毒、細菌菌毛、從菌毛蛋白形成的結構、噬菌體、病毒樣顆粒、RNA噬菌體病毒樣顆粒、病毒衣殼顆粒或其重組形式。本領域已知的具有有序和重複外殼和/或核心蛋白質結構的任何病毒都可以選作本發明的核心顆粒；適宜病毒的例子包括新培斯病毒和其它甲病毒，彈狀病毒(例如，水泡性口膜炎病毒)，細小核糖核酸病毒(例如人鼻病毒，Aichi病毒)，披膜病毒(例如，風疹病毒)，正粘病毒(例如，Thogoto病毒，Batken病毒，家禽瘟疫病毒)，多瘤病毒(例如，多瘤病毒BK，多瘤病毒JC，禽多瘤病毒BFDV)，細小病毒，輪狀病毒，諾沃克病毒，口蹄疫病毒、逆轉錄病毒，B型肝炎病毒，菸草花葉病毒，FlockHouse Virus，和人乳頭瘤病毒，並且優選RNA噬菌體，噬菌體Qβ，噬菌體R17，噬菌體M11，噬菌體MX1，噬菌體NL95，噬菌體fr，噬菌體GA，噬菌體SP，噬菌體MS2，噬菌體f2，噬菌體PP7(例如，參見Bachmann，M.F.和Zinkernagel，R.M.，Immunol.Today 17553-558(1996)中的表1)。
在另一實施方式中，本發明利用病毒基因工程，在有序和重複的病毒包膜蛋白和第一附著位點之間產生融合，所述第一附著位點包含或者可替代地或優選地其是選定的異源蛋白質、肽、抗原決定簇或反應性胺基酸殘基。本發明組合物的構建還可能使用本領域已知的其它基因操作；例如，可能期望通過基因突變限制重組病毒的複製能力。而且，由於化學或物理失活作用，或者如所述，由於缺少能複製的基因組，本發明所用病毒不能複製。選定用於和第一附著位點融合的病毒蛋白質應該具有有組織的重複結構。這種有組織的重複結構包括病毒表面上的準晶體組織，具有5-30nm，優選地5-15nm晶面間距。這種類型融合蛋白質的產生將在病毒表面上導致許多有序重複的第一附著位點，並且反映天然病毒蛋白質的正常組織。如本領域技術人員所理解的，第一附著位點可以是任何適宜的蛋白質、多肽、糖、多核苷酸、肽(胺基酸)、天然或合成聚合物、次級代謝物或它們的聯合，或者它們的一部分，它們可以用來特異性附著抗原或抗原決定簇，從而形成有序和重複抗原陣列。
在本發明另一個實施方式中，核心顆粒是重組甲病毒，並且更具體地，是重組新培斯病毒。甲病毒是正鏈RNA病毒，它們在感染細胞的胞質中完整地複製它們的基因組RNA，並且沒有DNA中間體(Strauss，J.和Strauss，E.，Microbiol.Rev.58491-562(1994))。甲病毒科的幾個成員，新培斯病毒(Xiong，C.等，Science 2431188-1191(1989)；Schlesinger，S.，Trends Biotechnol.1118-22(1993))，塞姆利基森林病毒(Semliki forestvirus，SFV)(Liljestrm，P. Garoff，H.，Bio/Technology 91356-1361(1991))和其它病毒(Davis，N.L.等，Virology 171189-204(1989))已經接受了相當多的關注，其被用做各種不同蛋白質的病毒基表達載體(Lundstrom，K.，Curr.Opin.Biotechnol.8578-582(1997)；Liljestrm，P.，Curr.Opin.Biotechnol.5495-500(1994))和用做疫苗研製的候選者。最近，已經授予了涉及甲病毒在異源蛋白質表達和疫苗研製中的用途的大量專利(參見美國專利號5,766,602；5,792,462；5,739,026；5,789,245和5,814,482)。如這裡併入為參考文獻的前述文獻所述，通過重組DNA技術領域一般已知的方法，可以構建本發明的甲病毒核心顆粒。
可以使用各種不同的重組宿主細胞來產生用於抗原或抗原決定簇附著的基於病毒的核心顆粒。例如，已知甲病毒具有廣泛的宿主範圍；新培斯病毒感染培養的哺乳動物、爬行動物和兩棲動物細胞及一些昆蟲細胞(Clark，H.，J.Natl.Cancer Inst.51645(1973)；Leake，C.，J.Gen.Virol.35335(1977)；Stollar，V.in THE TOGAVIRUSES，R.W.Schlesinger，編輯，Academic Press，(1980)，583-621頁)。因此，在本發明實踐中可以使用多種重組宿主細胞。BHK，COS，Vero，HeLa和CHO細胞特別適於異源蛋白質的產生，因為它們有潛能以與人類細胞相似的方式糖基化異源蛋白質(Watson，E.等，Glycobiology 4227，(1994))，並且可以經選擇(Zang，M.等，Bio/Technology 13389(1995))或者基因工程改造(Renner W.等，Biotech.Bioeng.4476(1995)；Lee K.等.Biotech.Bioeng.50336(1996))在無血清培養基中及懸浮液中生長。
通過標準實驗室手冊(參見，例如Sambrook，J.等，編輯，MOLECULARCLONING，A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，9章；Ausubel，F.等，編輯，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John H.Wiley Sons，Inc.(1997)，16章)中所述方法，包括諸如電穿孔、DEAE葡聚糖介導的轉染、轉染、顯微注射、陽離子脂質介導的轉染、轉導、scrape loading、生物彈道引入和感染，可以實現將多核苷酸載體引入到宿主細胞中。在Felgner，P.等，美國專利號5,580,859中討論了將外源DNA序列引入到宿主細胞中的方法。
包裝的RNA序列也可以用於感染宿主細胞。可以通過將這些包裝的RNA序列添加到培養基中，以便將其引入宿主細胞中。例如，在大量文獻，包括「新培斯病毒表達系統」，C版本(Invitrogen目錄號.K750-1)中描述了非感染性甲病毒顆粒的製備。
當哺乳動物細胞用作產生基於病毒的核心顆粒的重組宿主細胞時，一般地，將在組織培養基上培養這些細胞。在培養基中培養細胞的方法是本領域已知的(參見，例如Celis，J.，編輯，CELL BIOLOGY，Academic Press，第二版，(1998)；Sambrook，J.等，編輯，MOLECULAR CLONING，ALABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等，編輯，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John H.WileySons，Inc.(1997)；Freshney，R.，CULTURE OF ANIMAL CELLS，Alan R.Liss，Inc.(1983))。
適於用做本發明核心顆粒的其它RNA病毒例子包括，但不限於下面的病毒呼腸病毒科成員，包括正呼腸病毒屬(哺乳動物和禽逆轉錄病毒的多種血清型)，環狀病毒屬(藍舌病病毒，Eugenangee病毒，Kemerovo病毒，非洲馬瘟病毒和科羅拉多蜱傳熱病毒)，輪狀病毒屬(人類輪狀病毒，內布拉斯加小牛腹瀉病毒，鼠輪狀病毒，猿猴輪狀病毒，牛或綿羊輪狀病毒，禽輪狀病毒)；小RNA病毒科，包括腸道病毒屬(脊髓灰質炎病毒，柯薩奇病毒A和B，埃可病毒(ECHO)，甲、丙、丁、戊和已型肝炎病毒，猿猴腸道病毒，鼠科腦脊髓炎(ME)病毒，Poliovirus muris，牛腸道病毒，豬腸道病毒)，心病毒屬(腦心肌炎病毒(EMC)，Mengovirus)，鼻病毒屬(人類鼻病毒，包含至少113種亞型；其它鼻病毒)，Apthovirus屬(口蹄疫病毒(FMDV)；Calciviridae科，包括豬水皰疹病毒，San Miguel海獅病毒，貓小RNA病毒和諾沃克病毒；披膜病毒科，包括甲病毒屬(東方馬腦炎病毒，Semlikforest病毒，新培斯病毒，屈曲病毒，，O′Nyong-Nyong病毒，羅斯河病毒，委內端拉馬腦炎病毒，西部馬腦炎病毒)，黃病毒屬(蚊傳播的黃熱病毒，登革病毒，日本腦炎病毒，St.Louis腦炎病毒，Murray河谷腦炎病毒，西尼羅病毒，Kunjin病毒，中歐蜱傳病毒，遠東蜱傳病毒，Kyasanur森林病毒，羊跳躍病III病毒，Powassan病毒，Omsk出血熱病毒)，風疹病毒屬(風疹病毒)，瘟病毒屬(黏膜病病毒，豬霍亂病毒，Border disease病毒)；布尼亞病毒科，包括布尼亞病毒屬(Bunyamwera病毒和相關病毒，加利福尼亞腦炎病毒組)，白蛉病毒屬(白蛉熱Sicillian病毒，山谷熱病毒)，納伊羅病毒屬(克裡米亞-剛果出血熱病毒，奈洛比綿羊病病毒)，和烏庫病毒屬(Uukuniemi和相關病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒屬(甲型流感病毒，許多人類亞型)，豬流感病毒，禽和馬流感病毒，乙型流感病毒(許多人類亞型)，和丙型流感病毒(可能單獨的屬)；副粘病毒科，包括副粘病毒屬(1型副流感病毒，仙臺病毒，血細胞吸附病毒，副流感病毒2到5型，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒屬(麻疹病毒，亞急性硬化全腦炎病毒，犬瘟病毒，牛瘟病毒)，肺病毒屬(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；森林病毒，新培斯病毒，屈曲病毒，O′Nyong-Nyong病毒，羅斯河病毒，委內端拉馬腦炎病毒，西部馬腦炎病毒)，黃病毒屬(蚊傳播的黃熱病毒，登革病毒，日本腦炎病毒，St.Louis腦炎病毒，Murray河谷腦炎病毒，西尼羅病毒，Kunjin病毒，中歐蜱傳病毒，遠東蜱傳病毒，Kyasanur森林病毒，羊跳躍病III病毒，Powassan病毒，Omsk出血熱病毒)，風疹病毒屬(風疹病毒)，瘟病毒屬(黏膜病病毒，豬霍亂病毒，Boder disease病毒)；布尼亞病毒科，包括布尼亞病毒屬(Bunyamwera和相關病毒，加利福尼亞腦炎病毒組)，白蛉病毒屬(白蛉熱Sicillian病毒，山谷熱病毒)，納伊羅病毒屬(克裡米亞-剛果出血熱病毒，奈洛比綿羊病病毒)，和烏庫病毒屬(Uukuniemi和相關病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒屬(甲型流感病毒，許多人類亞型)；豬流感病毒，禽和馬流感病毒；乙型流感病毒(許多人類亞型)，和丙型流感病毒(可能單獨的屬)；副粘病毒科，包括副粘病毒屬(副流感病毒1型，仙臺病毒，血細胞吸附病毒，副流感病毒2到5型，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒屬(麻疹病毒，亞急性硬化全腦炎病毒，犬瘟病毒，牛瘟病毒)，肺病毒屬(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；彈狀病毒科，包括水泡性病毒(VSV)屬，Chandipura病毒，Flanders-Hart Park病毒)，狂犬病毒屬(狂犬病病毒)，魚類彈狀病毒和線狀病毒(馬爾堡病毒和伊波拉病毒)；沙粒病毒科，包括淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCM)，Tacaribe病毒複合物和拉沙病毒；冠狀病毒科，包括傳染性支氣管炎病毒(IBV)，小鼠肝炎病毒，人類腸冠狀病毒和貓傳染性腹膜炎(貓冠狀病毒)。
可以用做核心顆粒的示例性DNA病毒包括，但不限於痘病毒科，包括正痘病毒屬(大天花，類天花，猴痘痘苗，牛痘，Buffalopox，野兔痘，Ectromelia)，野兔痘病毒屬(粘液瘤，纖維瘤)，禽痘病毒屬(禽痘病毒，其它禽類痘病毒)，山羊痘病毒屬(綿羊痘，山羊痘)，豬痘病毒屬(豬痘)，副痘病毒屬(傳染性小膿皰皮炎病毒，假牛痘，牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲豬熱病毒，蛙病毒2和3，魚淋巴囊腫病毒)；皰疹病毒科，包括α-皰疹病毒(單純皰疹1和2型，水痘-帶狀皰疹病毒，馬流產病毒，馬皰疹病毒2和3，假狂犬病毒，傳染性牛角膜結膜炎病毒，傳染性牛鼻氣管炎病毒，貓鼻氣管炎病毒，傳染性喉氣管炎病毒)；β-皰疹病毒(人巨細胞病毒和豬、猴和齧齒動物的巨細胞病毒)；γ-皰疹病毒(EB病毒(EBV)，馬立克氏病病毒，松鼠猴皰疹病毒，Herpesvirus ateles，Herpesvirussylvilagus，豚鼠皰疹病毒，Lucke腫瘤病毒)；腺病毒科，包括Mastadenovirus屬(人類亞組A，B，C，D和E及未分組的；猿猴腺病毒(至少23種血清型)，犬傳染性肝炎，和牛、豬、綿羊、青蛙和許多其它物種的腺病毒，禽腺病毒屬(禽類腺病毒)；和不可培養的腺病毒；乳多空病毒科，包括乳頭瘤病毒屬(人乳頭瘤病毒，牛乳頭瘤病毒，兔乳頭瘤病毒和其它物種的各種致病性乳頭瘤病毒)，多瘤病毒屬(多瘤病毒，猿猴空泡病毒(SV-40)，野兔空泡病毒(RKV)，K病毒，BK病毒，JC病毒，和其它靈長類多瘤病毒諸如嗜淋巴細胞乳頭瘤病毒)；細小病毒科，包括腺相關病毒屬，細小病毒屬(貓泛白細胞減少病毒，牛細小病毒，犬細小病毒，阿留申貂病病毒等)。最後，DNA病毒可以包括諸如慢性傳染性神經病病毒(CHINA病毒)之類的病毒。
在其它實施方式中，細菌菌毛蛋白、細菌菌毛蛋白的亞部分，或者含有細菌菌毛蛋白或其亞部分的融合蛋白質被用於製備本發明組合物或疫苗組合物。菌毛蛋白的例子包括由大腸桿菌(Escherichia coli)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)產生的菌毛蛋白。適於本發明使用的菌毛蛋白胺基酸序列包含GenBank報導AJ000636，AJ132364，AF229646，AF051814，AF051815和X00981中所述胺基酸序列，這裡將這些文獻所有公開的內容併入為參考文獻。
在將細菌菌毛蛋白輸出到細菌外周質以前，通常加工該蛋白質以移除N末端前導序列。而且，如本領域技術人員將認識到的，用於製備本發明組合物或疫苗組合物的細菌菌毛蛋白通常將沒有天然存在的前導序列。
適於本發明使用的菌毛蛋白的一個具體例子是大腸桿菌(E.coli)P菌毛蛋白(GenBank報導AF237482(SEQ ID NO1))。適於本發明使用的類型1大腸桿菌菌毛蛋白的一個例子是具有GenBank報導P04128(SEQ IDNO2)中所述胺基酸序列的菌毛蛋白，其由具有GenBank報導M27603(SEQ ID NO3)中所述核苷酸序列的核酸編碼。這裡將這些GenBank報導所有公開的內容併入為參考文獻。而且，一般地，上述蛋白質的成熟形式將被用於製備本發明的組合物或疫苗組合物。
適於本發明實踐中使用的細菌菌毛蛋白或菌毛蛋白亞部分一般將能締合以形成有序和重複的抗原陣列。
體外製備菌毛和菌毛樣結構的方法是本領域已知的。例如，Bullitt等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9312890-12895 (1996)描述了大腸桿菌(E.coli)P菌毛亞單位的體外重建。而且，Eshdat等，J.Bacteriol.148308-314 (1981)描述了適於解離大腸桿菌類型1菌毛和重建菌毛的方法。簡而言之，這些方法如下在飽和鹽酸胍中37℃溫育以解離菌毛。然後，通過層析純化菌毛蛋白，隨後通過用5mM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸(pH 8.0)透析形成菌毛蛋白二聚體。Eshdat等也發現一旦用含有5mM MgCl2的5mM三(羥甲基)氨基甲烷(pH 8.0)透析後菌毛蛋白二聚體將重新裝配形成菌毛。
而且，利用，例如常規的基因工程和蛋白質修飾方法，可以修飾菌毛蛋白以含有第一附著位點，其中抗原或抗原決定簇通過第二附著位點連接此第一附著位點。可替代地，抗原或抗原決定簇可以通過第二附著位點直接連接這些蛋白質中天然存在的胺基酸殘基。然後，這些修飾的菌毛蛋白可以用在本發明疫苗組合物中。
可以用這裡所述用於HBcAg的相似方法修飾用於製備本發明組合物或疫苗組合物的細菌菌毛蛋白。例如，可以缺失或用其它胺基酸殘基置換半胱氨酸和賴氨酸殘基，並且可以向這些蛋白質添加第一附著位點。而且，可以以修飾形式表達菌毛蛋白或者可以在表達後化學修飾菌毛蛋白。相似地，可以從細菌收集完整的菌毛，然後化學修飾之。
在另一個實施方式中，從細菌(例如大腸桿菌)收集菌毛或菌毛樣結構，並且用於形成本發明的組合物或疫苗組合物。適於製備組合物或疫苗組合物的菌毛的一個例子是大腸桿菌類型1菌毛，其是從具有SEQ IDNO2中所示胺基酸序列的菌毛蛋白單體形成的。
本領域已知多種方法可用於收集細菌菌毛。例如，Bullitt和Makowski(Biophys.J.74623-632(1998))描述了用於從大腸桿菌收集P菌毛的菌毛純化方法。根據該方法，從含有P菌毛質粒的超菌毛化大腸桿菌剪切菌毛，並且通過溶解和MgCl2(1.0M)沉澱循環純化。
一旦收穫後，菌毛或菌毛樣結構就可以用各種方法修飾。例如，可以向菌毛添加第一附著位點，其中抗原或抗原決定簇可以通過第二附著位點附著第一附著位點。換而言之，可以收集和修飾細菌菌毛蛋白或菌毛樣結構以產生有序和重複的抗原陣列。
抗原或抗原決定簇可以與菌毛或菌毛樣結構中存在的天然半胱氨酸殘基或賴氨酸殘基連接。在這種情況下，天然胺基酸殘基的高度有序和重複性將引導抗原或抗原決定簇與菌毛或菌毛樣結構偶聯。例如，可以利用異雙官能交聯劑使菌毛或菌毛樣結構與抗原或抗原決定簇的第二附著位點連接。
當使用生物體天然合成的結構(例如，菌毛蛋白)製備本發明組合物和疫苗組合物時，基因工程改造這些生物體以使它們產生具有期望特徵的結構常常是有利的。例如，當使用大腸桿菌類型1菌毛時，可以修飾這些菌毛的來源大腸桿菌使之產生具有特定特徵的結構。可能的菌毛蛋白修飾的例子包括一個或多個賴氨酸殘基的插入，一個或多個天然存在的賴氨酸殘基的缺失或置換，和一個或多個天然存在的半胱氨酸殘基(例如，SEQ IDNO2中位置44和84的半胱氨酸殘基)的缺失或置換。
而且，可以對菌毛蛋白基因進行其它修飾，以產生含有第一附著位點(例如，FOS或JUN結構域)而不是賴氨酸殘基的表達產物。當然，適宜的第一附著位點一般將限於那些不會阻止菌毛蛋白形成適於用在本發明疫苗組合物中的菌毛或菌毛樣結構的第一附著位點。
可以體內(例如，通過同源重組)修飾細菌細胞中天然存在的菌毛蛋白基因，或者可以將具有特定特徵的菌毛蛋白基因插入到這些細胞中。例如，菌毛蛋白基因可以作為可複製克隆載體或插入到細菌染色體中的載體的一個成分被引入到細菌細胞中。插入的菌毛蛋白基因也可以連接表達調節控制序列(例如lac操縱基因)。
在大多數情況下，本發明組合物或疫苗組合物中使用的菌毛或菌毛樣結構將由單一類型的菌毛蛋白亞單位組成。一般地將使用由相同亞單位組成的菌毛或菌毛樣結構，因為預期它們將形成可以呈遞高度有序和重複抗原陣列的結構。
然而，本發明組合物也包括這樣的組合物和疫苗，該組合物和疫苗包含由異質菌毛蛋白亞單位形成的菌毛或菌毛樣結構。可以從細菌細胞中天然存在的基因表達能形成這些菌毛或菌毛樣結構的菌毛亞單位，或者可以將形成這些菌毛或菌毛樣結構的菌毛蛋白亞單位引入到細胞中。當在形成菌毛或菌毛樣結構的細胞中表達天然存在的菌毛蛋白基因和引入的基因時，結果一般是從這些菌毛蛋白混合物形成的結構。而且，當在細菌細胞中表達兩種或多種菌毛蛋白基因時，每種菌毛蛋白基因的相對表達量典型地將是決定菌毛或菌毛樣結構中不同菌毛蛋白亞單位比率的因素。
當期望菌毛或菌毛樣結構具有特定的混合菌毛蛋白亞單位組成時，可以通過異源誘導型啟動子調節至少一種菌毛蛋白基因的表達。這種啟動子及其它遺傳元件可以用於調節細菌細胞中產生的不同菌毛蛋白亞單位的相對量，並由此調節菌毛或菌毛樣結構的組成。
此外，抗原或抗原決定簇可以通過非肽鍵的鍵連接細菌菌毛或菌毛樣結構，可以基因工程改造產生本發明組合物中使用的菌毛或菌毛樣結構的細菌細胞以產生融合抗原或抗原決定簇的菌毛蛋白。形成菌毛或菌毛樣結構的這種融合蛋白質適於本發明疫苗組合物中使用。
在優選的實施方式中，核心顆粒是病毒樣顆粒，其中病毒樣顆粒是重組病毒樣顆粒。利用重組DNA技術和公眾容易得到的病毒編碼序列，本領域技術人員可以製備VLP。例如，利用商購杆狀病毒載體，同時對序列進行適當修飾以允許編碼序列和調節序列功能性連接，可以基因工程改造病毒包膜或核心蛋白的編碼序列使之在杆狀病毒表達載體中於病毒啟動子調節控制下表達。也可以基因工程改造病毒包膜或核心蛋白的編碼序列使之在例如細菌表達載體中表達。
VLP的例子包括但不限於B型肝炎病毒衣殼蛋白(Ulrich，等，VirusRes.50141-182(1998))，麻疹病毒(Warnes，等，Gene 160173-178(1995))，新培斯病毒，輪狀病毒(US 5,071,651和US 5,374,426)，口蹄疫病毒(Twomey，等，Vaccine 131603-1610，(1995))，諾沃克病毒(Jiang，X.，等，Science 2501580-1583(1990)Matsui，S.M.，等，J.Clin.Invest.871456-1461(1991))，逆轉錄病毒GAG蛋白質(WO 96/30523)，逆轉錄轉座子Ty蛋白質p1，B型肝炎病毒表面蛋白質(WO 92/11291)，人類乳頭瘤病毒(WO98/15631)，RNA噬菌體，Ty，fr-噬菌體，GA-噬菌體，AP205-噬菌體和Qβ-噬菌體。
對本領域技術人員顯而易見，本發明VLP不限於任何特定的形式。可以化學地或通過生物學方法合成該顆粒，該顆粒可以是天然或非天然的。例如，這種類型的實施方式包括病毒樣顆粒或其重組形式。
在一個更具體的實施方式中，VLP可以包含重組多肽或其片段，或者可替代地基本上由，或者可替代地由重組多肽或其片段組成，所述重組多肽可以選自輪狀病毒重組多肽，諾沃克病毒重組多肽，甲病毒重組多肽，口蹄疫病毒重組多肽，麻疹病毒重組多肽，新培斯病毒重組多肽，多瘤病毒重組多肽，逆轉錄病毒重組多肽，B型肝炎病毒重組多肽(例如，HBcAg)，菸草花葉病毒重組多肽，獸棚病毒(Flock House Virus)重組多肽，人乳頭瘤病毒重組多肽，噬菌體重組多肽，RNA噬菌體重組多肽，Ty重組多肽，fr噬菌體重組多肽，GA噬菌體重組多肽和Qβ噬菌體重組多肽。病毒樣顆粒還可以包含這些多肽的一個或多個片段及這些多肽的變體，或者可替代地基本上由或可替代地由這些多肽的一個或多個片段及這些多肽的變體組成。多肽變體與它們的野生型對應物在胺基酸水平上可以共有例如至少80％，85％，90％，95％，97％或99％的同一性。
在優選的實施方式中，病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體蛋白質或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由重組RNA噬菌體蛋白質或其片段組成。優選地，RNA噬菌體選自a)噬菌體Qβ；b)噬菌體R17；c)噬菌體fr；d)噬菌體GA；e)噬菌體SP；f)噬菌體MS2；g)噬菌體M11；h)噬菌體MX1；i)噬菌體NL95；k)噬菌體f2；l)噬菌體PP7和m)噬菌體AP205。
在本發明另一個優選實施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體Qβ或RNA噬菌體fr或RNA噬菌體AP205的重組蛋白質或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體Qβ或RNA噬菌體fr或RNA噬菌體AP205的重組蛋白質或其片段組成。
在本發明進一步優選的實施方式中，重組蛋白質包含RNA噬菌體外殼蛋白，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體外殼蛋白組成。
因此，形成衣殼或VLP的RNA噬菌體外殼蛋白，或與自裝配為衣殼或VLP相容的噬菌體外殼蛋白片段是本發明的其它優選實施方式。例如，可以在大腸桿菌(E.coli)中重組表達噬菌體Qβ外殼蛋白。而且，一旦進行這種表達後，這些蛋白質將自發地形成衣殼。此外，這些衣殼將形成具有固有重複組織的結構。
可以用於製備本發明組合物的噬菌體外殼蛋白的具體優選例子包括RNA噬菌體的外殼蛋白諸如噬菌體Qβ的外殼蛋白(SEQ ID NO4PIR資料庫，記錄號VCBPQβ，稱為Qβ CP和SEQ ID NO5記錄號AAA16663，稱為Qβ A1蛋白質)，噬菌體R17的外殼蛋白(SEQ ID NO6PIR記錄號VCBPR7)，噬菌體fr外殼蛋白(SEQ ID NO7；PIR記錄號VCBPFR)，噬菌體GA外殼蛋白(SEQ ID NO8；GenBank記錄號NP-040754)，噬菌體SP外殼蛋白(SEQ ID NO9；GenBank記錄號CAA30374，稱為SP CP和SEQ ID NO10；記錄號NP 695026，稱為SPA1蛋白質)，噬菌體MS2外殼蛋白(SEQ ID NO11；PIR記錄號VCBPM2)，噬菌體M11外殼蛋白(SEQ ID NO12；GenBank記錄號AAC06250)，噬菌體MX1外殼蛋白(SEQ ID NO13；GenBank記錄號AAC14699)，噬菌體NL95外殼蛋白(SEQ ID NO14；GenBank記錄號AAC14704)，噬菌體f2外殼蛋白(SEQ ID NO15；GenBank記錄號P03611)，噬菌體PP7外殼蛋白(SEQ ID NO16)，和噬菌體AP205外殼蛋白(SEQ ID NO28)。而且，在Qβ外殼蛋白的衣殼裝配物中可以摻入噬菌體Qβ的A1蛋白質(SEQ IDNO5)或從其C末端缺失多達100，150或180個胺基酸的C末端截短形式。一般地，將限制衣殼裝配中Qβ A1蛋白質相對於Qβ CP的百分比以確保衣殼形成。
此外，已發現當在大腸桿菌(E.coli)中表達Qβ外殼蛋白時，其自裝配為衣殼(Kozlovska TM.等，GENE 137133-137(1993))。所獲得的衣殼或病毒樣顆粒顯示了具有25nm直徑和T＝3準對稱的二十面噬菌體樣衣殼結構。而且，噬菌體Qβ的晶體結構已經解析。衣殼含有180個拷貝的外殼蛋白，它們通過二硫鍵以共價五聚體和六聚體形式連接(Golmohammadi，R.等，Structure 4543-5554(1996))，使Qβ外殼蛋白形成的衣殼具有顯著穩定性。然而，從重組Qβ外殼蛋白製備的衣殼或VLP可以含有不通過或不完全通過二硫鍵連接衣殼中其它亞單位的亞單位。然而，VLP中，通常約80％以上亞單位通過二硫鍵互相連接。因此，一旦將重組Qβ衣殼加樣到非還原性SDS-PAGE上，就可以觀察到對應於單體Qβ外殼蛋白的條帶及對應於Qβ外殼蛋白六聚體或五聚體的條帶。在非還原性SDS-PAGE中，不完全二硫鍵連接的亞單位可以表現為二聚體、三聚體或甚至四聚體條帶。Qβ衣殼蛋白對有機溶劑和變性劑還顯示了異常的抗性。意外地，我們觀察到DMSO和乙腈濃度高達30％和胍鹽濃度高達1M不影響衣殼穩定性。Qβ外殼蛋白形成的衣殼的高度穩定性特別有利於它們在本發明的哺乳動物和人類免疫和接種中的使用。
如我們通過Stoll，E.等.J.Biol.Chem.252990-993(1977)中所述的N末端Edaman測序所觀察到的，一旦在大腸桿菌(E.coli)中表達後，通常Qβ外殼蛋白的N末端甲硫氨酸將被移除。由沒有移除N末端甲硫氨酸的Qβ外殼蛋白組成的VLP，或者含有存在或不存在N末端甲硫氨酸的Qβ外殼蛋白的混合物的VLP也在本發明範圍內。
WO 02/056905中公開了本發明的其它優選的RNA噬菌體(特別是Qβ)的病毒樣顆粒，這裡將該公開內容整體併入為參考文獻。
也已經證明了其它RNA噬菌體外殼蛋白一旦在細菌宿主中表達就可以自裝配(Kastelein，RA.等，Gene 23245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287452-455(1986)，Adhin，MR.等，Virology170238-242(1989)，Ni，CZ.，等，Protein Sci.52485-2493(1996)，Priano，C.等，J.Mol.Biol.249283-297(1995))。Qβ噬菌體衣殼除了包含外殼蛋白外，還包含通常所說的通讀蛋白質A1和成熟蛋白質A2。A1通過在UGA終止密碼子處的抑制而產生，並且其具有329個胺基酸的長度。本發明中所用的噬菌體Qβ重組外殼蛋白的衣殼無A2裂解蛋白，並且含有來源於宿主的RNA。RNA噬菌體外殼蛋白是RNA結合蛋白，其與複製酶基因的核糖體結合位點的莖環相互作用，在病毒生命周期中充當翻譯阻遏物。相互作用的序列和結構元件是已知的(Witherell，GW.Uhlenbeck，OC.Biochemistry 2871-76(1989)；Lim F.等，J.Biol.Chem.27131839-31845(1996))。一般地，已知莖環和RNA參與病毒裝配(Golmohammadi，R.等，Structure 4543-5554(1 996))。
在本發明進一步優選的實施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體重組蛋白質或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體重組蛋白質或其片段組成，其中重組蛋白質包含RNA噬菌體突變外殼蛋白，優選地上述RNA噬菌體的突變外殼蛋白，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體突變外殼蛋白，優選地上述RNA噬菌體的突變外殼蛋白組成。在另一個優選的實施方式中，通過置換的方法移除至少一個，或者可替代地至少兩個賴氨酸殘基，或者通過置換的方法添加至少一個賴氨酸殘基，修飾了RNA噬菌體突變外殼蛋白；做為可替代的方案，通過至少一個賴氨酸殘基，或者可替代地至少兩個賴氨酸殘基的缺失，或者通過插入的方法添加至少一個賴氨酸殘基，修飾了RNA噬菌體突變外殼蛋白。至少一個賴氨酸殘基的缺失、置換或添加允許改變偶聯的程度，即， 每個RNA噬菌體VLP的每個亞單位上偶聯的Aβ1-6肽量，特別地以便滿足和適應疫苗的要求。
在另一個優選的實施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體Qβ重組蛋白質或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體Qβ重組蛋白質或其片段組成，其中重組蛋白質包含具有SEQ ID NO4胺基酸序列的外殼蛋白，或者具有SEQ ID NO4和SEQ ID NO5或SEQ ID NO5突變體的胺基酸序列的外殼蛋白混合物，或者可替代地基本由或可替代地由具有SEQ ID NO4胺基酸序列的外殼蛋白，或者具有SEQ ID NO4和SEQID NO5或SEQ ID NO5突變體的胺基酸序列的外殼蛋白混合物組成，並且其中優選地切割了N末端甲硫氨酸。
在本發明進一步優選的實施方式中，病毒樣顆粒包含Qβ重組蛋白質或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由Qβ重組蛋白質或其片段組成，其中重組蛋白質包含突變Qβ外殼蛋白，或者可替代地基本由或可替代地由突變Qβ外殼蛋白組成。在另一個優選的實施方式中，通過置換的方法移除至少一個賴氨酸殘基，或者通過置換的方法添加至少一個賴氨酸殘基，修飾了這些突變外殼蛋白質。可替代地，通過至少一個賴氨酸殘基的缺失，或者通過插入的方法添加至少一個賴氨酸殘基，修飾了這些突變外殼蛋白。
4個賴氨酸殘基暴露於Qβ外殼蛋白衣殼的表面上。用精氨酸置換了暴露的賴氨酸殘基的Qβ突變體也可以用於本發明。因此，下面的Qβ外殼蛋白突變體和突變Qβ VLP可以用在本發明實踐中「Qβ-240」(Lys13-Arg；SEQ ID NO17)，「Qβ-243」(Asn 10-Lys；SEQ ID NO18)，「Qβ-250」(Lys2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO19)，「Qβ-251」(SEQ ID NO20)和「Qβ-259」(Lys 2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO21)。因此，在本發明進一步優選的實施方式中，病毒樣顆粒包含突變Qβ外殼蛋白的重組蛋白質，或者基本由或可替代地由突變Qβ外殼蛋白的重組蛋白質組成，該突變Qβ外殼蛋白的重組蛋白質包含具有選自下面的胺基酸序列的蛋白質a)SEQ ID NO17胺基酸序列；b)SEQ ID NO18胺基酸序列；c)SEQ ID NO19胺基酸序列；d)SEQ ID NO20胺基酸序列；和e)SEQ ID NO21胺基酸序列。在WO 02/056905中描述了上述Qβ外殼蛋白、突變Qβ外殼蛋白VLP和衣殼的構建、表達和純化。在此，特別提及上述申請的實施例18。
在本發明另一優選的實施方式中，病毒樣顆粒包含Qβ重組蛋白質或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由Qβ重組蛋白質或其片段組成，其中該重組蛋白質包含任何一個前述Qβ突變體和相應A1蛋白質的混合物，或者可替代地基本由或可替代地由任何一個前述Qβ突變體和相應A1蛋白質的混合物組成。
在本發明進一步優選的實施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體AP205的重組蛋白質或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體AP205重組蛋白質或其片段組成。
AP205基因組由成熟蛋白質、外殼蛋白、複製酶和相關噬菌體中不存在的2個開放讀框組成；所述兩個開放讀框是在成熟蛋白基因的翻譯中起作用的一個開放讀框和裂解基因(Klovins，J.，等，J.Gen.Virol.831523-33(2002))。可以從質粒pAP283-58(SEQ ID NO27)表達AP205外殼蛋白，所述質粒是pQb10(Kozlovska，T.M..等，Gene 137133-37(1993))的衍生物，並且其含有AP205核糖體結合位點。AP205外殼蛋白也可以克隆到pQb185中，位於載體中存在的核糖體結合位點下遊。如2002年7月17日提交，名稱為「分子抗原陣列」(Atty.Docket No.1700.0310000)的同時待審美國臨時專利申請中所述，兩種方法都導致蛋白質表達和衣殼形成，特此將這篇專利申請的整體併入為參考文獻。載體pQb10和pQb185是來源於pGEM載體的載體，並且通過trp啟動子控制這些載體中克隆基因的表達(Kozlovska，T.M.等，Gene 137133-37(1993))。質粒pAP283-58(SEQID NO27)包含下面序列的推定的AP205核糖體結合位點，該核糖體結合位點位於XbaI位點下遊及AP205外殼蛋白ATG起始密碼子緊上遊tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg(SEQ ID NO57)。載體pQb185包含位於XbaI位點下遊和起始密碼子上遊的SD序列(tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg(SEQ ID NO58)，下劃線的是SD序列)。
在本發明另一個優選的實施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體AP205的重組外殼蛋白或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體AP205的重組外殼蛋白或其片段組成。
因此，本發明的該優選實施方式包含形成衣殼的AP205外殼蛋白。這種蛋白質可以從天然來源製備或重組表達。如電子顯微鏡術(EM)和免疫擴散所證明的，細菌中產生的AP205外殼蛋白自發形成衣殼。當在EM下觀察時，AP205外殼蛋白(SEQ ID NO28)形成的衣殼的結構特徵和AP205 RNA噬菌體外殼蛋白形成的衣殼的結構特徵幾乎不能區分。AP205VLP是高度免疫原性的，並且可以連接抗原和/或抗原決定簇以產生疫苗構建體，該疫苗構建體展示了以重複方式定向的抗原和/或抗原決定簇。激發的抗所展示抗原的高效價表明，結合的抗原和/或抗原決定簇易於接近以和抗體分子發生相互作用，並且具有免疫原性。
在本發明另一優選的實施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體AP205的重組突變外殼蛋白或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體AP205的重組突變外殼蛋白或其片段組成。
AP205 VLP的能裝配的突變體形式，包括在胺基酸位置5具有脯氨酸到蘇氨酸置換的AP205外殼蛋白(SEQ ID NO29)也可以用在本發明實施中，並且產生了本發明另一優選的實施方式。這些VLP、來源於天然來源的VLP或AP205病毒顆粒可以結合抗原以產生本發明的有序重複抗原陣列。
可以從質粒pAP281-32(SEQ ID No.30)表達AP205 P5-T突變外殼蛋白，該質粒直接來源於pQb185，並含有代替Qβ外殼蛋白基因的突變AP205外殼蛋白基因。將用於AP205外殼蛋白表達的載體轉染到大腸桿菌(E.coli)中用於AP205外殼蛋白的表達。
實施例1中描述了自裝配為VLP的外殼蛋白和突變外殼蛋白的表達方法。適合的大腸桿菌(E.coli)株系包括但不限於大腸桿菌K802，JM 109，RR1。通過用SDS-PAGE檢測外殼蛋白和突變外殼蛋白的表達，並且通過可選地首先用凝膠過濾純化衣殼並隨後在免疫擴散試驗(Ouchterlony試驗)中或電子顯微鏡下(Kozlovska，T.M..等，Gene 137133-37(1993)檢測衣殼的形成和裝配，可以鑑定適宜的載體及株系和它們的聯合。
從載體pAP283-58和pAP281-32表達的AP205外殼蛋白可以由於大腸桿菌(E.coli)胞質中的加工而無最初的甲硫氨酸胺基酸。切割的、未切割形式的AP205VLP或其混合物是本發明另外優選的實施方式。
在本發明另一優選的實施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體AP205的重組外殼蛋白或其片段和RNA噬菌體AP205重組突變外殼蛋白或其片段的混合物，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體AP205重組外殼蛋白或其片段和RNA噬菌體AP205重組突變外殼蛋白或其片段的混合物組成。
在本發明另一優選的實施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體AP205重組外殼蛋白或重組突變外殼蛋白的片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體AP205重組外殼蛋白或重組突變外殼蛋白的片段組成。
能裝配為VLP或衣殼的重組AP205外殼蛋白片段也可以用在本發明實踐中。可以通過在外殼蛋白或突變外殼蛋白內部或末端缺失，產生這些片段。在外殼蛋白和突變外殼蛋白序列中的插入，或者抗原序列與外殼蛋白或突變外殼蛋白序列的融合，只要與裝配為VLP相容，均是本發明的實施方式，它們將導致嵌合AP205外殼蛋白或顆粒。通過電子顯微鏡術可以檢測插入、缺失及與外殼蛋白序列融合的結果，以及其是否與裝配為VLP相容。
通過利用沉澱的分級步驟和利用凝膠過濾(利用例如SepharoseCL-4B，Sepharose CL-2B，Sepharose CL-6B柱子或它們的聯合)的純化步驟，可以分離純化形式的由上述AP205外殼蛋白、外殼蛋白片段和嵌合外殼蛋白形成的顆粒。分離病毒樣顆粒的其它方法是本領域已知的，並且可以用於分離噬菌體AP205病毒樣顆粒(VLP)。例如，美國專利號4,918,166中描述了超離心用於分離酵母逆轉錄轉座子Ty VLP的用途，這裡將這篇文獻整體併入為參考文獻。
已經測定了幾種RNA噬菌體的晶體結構(Golmohammadi，R.等，Structure 4543-554(1996))。利用這些信息，可以鑑定表面暴露的殘基，由此可以修飾RNA噬菌體外殼蛋白，以便可以通過插入或置換的方法插入一個或多個反應性胺基酸殘基。結果，這些修飾形式的噬菌體外殼蛋白也可以用於本發明。因此，形成衣殼或衣殼樣結構的蛋白質(例如，噬菌體Qβ，噬菌體R17，噬菌體fr，噬菌體GA，噬菌體SP，噬菌體AP205和噬菌體MS2的外殼蛋白)的變體也可以用於製備本發明組合物。
儘管上述變體蛋白質的序列不同於它們的野生型對應物，但是這些變體蛋白質一般地將保留形成衣殼或衣殼樣結構的能力。因此，本發明還包括組合物或疫苗組合物，該組合物或疫苗組合物還包含形成衣殼或衣殼樣結構的蛋白質的變體；本發明還包括用於製備這種組合物或疫苗組合物的方法、用於製備這種組合物的單個蛋白質亞單位，和編碼這些蛋白質亞單位的核酸分子。因此，本發明範圍內包括可以形成衣殼或衣殼樣結構並且保留了締合和形成衣殼或衣殼樣結構的能力的野生型蛋白質的變體形式。
由此，本發明還包括包含如下蛋白質的組合物或疫苗組合物，該蛋白質包含與野生型蛋白質至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同的胺基酸序列，或者可替代地基本由或可替代地由與野生型蛋白質至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同的胺基酸序列組成，該蛋白質形成有序陣列並具有固有的重複結構。
本發明範圍中還包括核酸分子，該核酸分子編碼用於製備本發明組合物的蛋白質。
在其它實施方式中，本發明還包括包含如下蛋白質的組合物，該蛋白質包含與SEQ ID Nos4-21中所示任一氨酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，97％，或99％相同性的胺基酸序列，或者可替代地基本由或可替代地由與SEQ ID Nos4-21中所示任一氨酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，97％，或99％相同性的胺基酸序列組成。
適於本發明中使用的蛋白質也包括可以形成衣殼或衣殼樣結構或VLP的蛋白質C末端截短突變體。這種截短突變體的具體例子包括具有SEQ IDNos4-21之任一中所示的胺基酸序列的蛋白質，其中已經從C末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15或17個胺基酸。通常地，這些C末端截短突變體將保留形成衣殼或衣殼樣結構的能力。
適於本發明中使用的其它蛋白質也包括可以形成衣殼或衣殼樣結構的蛋白質N末端截短突變體。這種截短突變體的具體例子包括具有SEQ IDNos4-21任何一個中所示胺基酸序列的蛋白質，其中已經從N末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15或17個胺基酸。通常地，這些N末端截短突變體將保留形成衣殼或衣殼樣結構的能力。
適於本發明中使用的其它蛋白質包括可以形成衣殼或衣殼樣結構的N和C末端截短突變體。適合的截短突變體包括具有SEQ ID Nos4-21任何一個中所示胺基酸序列的蛋白質，其中已經從N末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15或17個胺基酸，並且已經從C末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15或17個胺基酸。通常地，這些N末端和C末端截短突變體將保留形成衣殼或衣殼樣結構的能力。
本發明還包括包含如下蛋白質的組合物，該蛋白質包含與上述截短突變體具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的胺基酸序列，或者可替代地基本由或可替代地由與上述截短突變體具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的胺基酸序列組成。
因此，本發明包括從可以形成衣殼或VLP的蛋白質製備的組合物和疫苗組合物，從單個蛋白質亞單位和VLP或衣殼製備這些組合物的方法，製備這些單個的蛋白質亞單位的方法，編碼這些亞單位的核酸分子，和利用本發明組合物接種個體和/或在個體中激發免疫應答的方法。
如前所述，本發明包括病毒樣顆粒或其重組形式。在一個另外優選的實施方式中，本發明組合物中所使用的顆粒由B型肝炎病毒核心蛋白質(HBcAg)或HBcAg片段組成。在另一實施方式中，本發明組合物中所使用的顆粒由經修飾除去了或減少了自由半胱氨酸殘基數量的B型肝炎病毒核心蛋白質(HBcAg)或HBcAg蛋白質片段組成。Zhou等.(J.Virol.665393-5398(1992))證明了經修飾移除了天然存在的半胱氨酸殘基的HBcAg可以保留締合併形成衣殼的能力。因此，適於本發明組合物中使用的VLP包括含有修飾的HBcAg或其片段的VLP，其中已經缺失或用另一種胺基酸殘基(例如，絲氨酸殘基)置換了一個或多個天然存在的半胱氨酸殘基。
HBcAg是通過B型肝炎核心抗原前體蛋白質加工產生的蛋白質。已經鑑定了多種HBcAg同種型，並且本領域技術人員容易獲得它們的胺基酸序列。在大多數情況下，將利用加工形式的HBcAg(即，其中已經移除了B型肝炎核心抗原前體蛋白質的N末端前導序列的HBcAg)製備本發明的組合物或疫苗組合物。
而且，當在不會發生加工的條件下產生HBcAg時，一般地以「加工的」形式表達HBcAg。例如，當將指導蛋白質胞質表達的大腸桿菌表達系統用於產生本發明HBcAg時，一般地將以B型肝炎核心抗原前體蛋白質的N末端前導序列不存在的方式表達這些蛋白質。
例如，WO 00/32227中，特別是實施例17到19和21到24中，及WO 01/85208中，特別是實施例17到19，21到24，31和41中以及WO02/056905中公開了可以用於本發明的B型肝炎病毒樣顆粒的製備。對於後面的申請，特別地參考實施例23，24，31和51。這裡明確地將所有這3篇文獻併入為參考文獻。
本發明也包括經修飾缺失或置換了一個或多個額外的半胱氨酸殘基的HBcAg變體。自由半胱氨酸殘基可以參與多種化學側鏈反應，這是本領域已知的。這些側鏈反應包括二硫化物交換，與化學物質或代謝物(注射的或在和其它物質的聯合治療中形成的)反應，或者直接氧化和與核苷酸在暴露於UV光後反應。特別是考慮到HBcAg具有結合核酸的強烈傾向這一事實，由此可能產生毒性加成物。這些毒性加成物將以多種形成分布，每種毒性加成物可能單獨地以低濃度存在，但是當每種毒性加成物集合在一起時就達到毒性水平。
鑑於上述，疫苗組合物中應用移除了天然半胱氨酸殘基的修飾HBcAg的一個優點是，當與抗原或抗原決定簇結合後，將在數量上減少或完全地消除有毒物可以結合的位點。
已經鑑定了適於本發明實踐中使用的大量天然HBcAg變體。例如，Yuan等，(J.Virol.7310122-10128(1999))描述了其中用亮氨酸殘基或苯丙氨酸殘基置換了位於與SEQ ID NO22中位置97對應的位置的異亮氨酸殘基的變體。在GenBank報導AAF121240，AF121239，X85297，X02496，X85305，X85303，AF151735，X85259，X85286，X85260，X85317，X85298，AF043593，M20706，X85295，X80925，X85284，X85275，X72702，X85291，X65258，X85302，M32138，X85293，X85315，U95551，X85256，X85316，X85296，AB033559，X59795，X85299，X85307，X65257，X85311，X85301(SEQ ID NO23)，X85314，X85287，X85272，X85319，AB010289，X85285，AB010289，AF121242，M90520(SEQ ID NO24)，P03153，AF110999，和M95589中公開了大量HBcAg變體及幾種B型肝炎核心抗原前體變體的胺基酸序列，這裡將每個GenBank報導公開的內容併入為參考文獻。WO01/85208中SEQ ID NOs89-138中進一步公開了上述B型肝炎核心抗原前體變體的序列。這些HBcAg變體在胺基酸序列的多個位置存在差異，包括對應於SEQ ID NO25中12，13，21，22，24，29，32，33，35，38，40，42，44，45，49，51，57，58，59，64，66，67，69，74，77，80，81，87，92，93，97，98，100，103，105，106，109，113，116，121，126，130，133，135，141，147，149，157，176，178，182和183位置胺基酸殘基的胺基酸殘基。WO 00/198333，WO 00/177158和WO 00/214478中描述了適於本發明組合物中使用並且可以根據本申請公開內容進行進一步修飾的其它HBcAg變體。
如上所述，本發明組合物或疫苗組合物中將使用通常加工的HBcAg(即，缺少前導序列的HBcAg)。本發明包括利用上述變體HBcAg的疫苗組合物及使用這些組合物的方法。
利用已知的電腦程式諸如Bestfit程序可以常規地確定是否多肽的胺基酸序列有與一種上述野生型胺基酸序列或其亞部分至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同的胺基酸序列。當使用Bestfit或任何其它序列比對程序以檢測是否特定序列與參照胺基酸序列具有例如95％相同性時，設定參數，以便計算和全長參照胺基酸序列相比的同一性百分數，並且允許達到參照序列中胺基酸殘基總數5％的同源性空位。
上述HBcAg變體和前體的胺基酸序列相互相對地相似。因此，提到位於對應於SEQ ID NO25中特定位置的位置的HBcAg變體胺基酸殘基時，指在SEQ ID NO25所示胺基酸序列中在該位置存在此胺基酸殘基。在感染哺乳動物的B型肝炎病毒中這些HBcAg變體之間大部分存在足夠高的同源性，這樣本領域技術人員幾乎毫無困難即可檢閱SEQ ID NO25中所示胺基酸序列和特定HBcAg變體的胺基酸序列，並鑑定出「相應的」胺基酸殘基。而且，SEQ ID NO24中所示HBcAg胺基酸序列(顯示來源於感染旱獺的病毒的HBcAg胺基酸序列)與具有SEQ ID NO25中所示胺基酸序列的HBcAg有足夠的同源性，因此顯而易見在SEQ ID NO25中，在SEQ ID NO25的胺基酸殘基155和156之間存在3個胺基酸殘基插入。
本發明也包括包含感染鳥類的B型肝炎病毒HBcAg變體的疫苗組合物，及包含這些HBcAg變體的片段的疫苗組合物。對於這些HBcAg變體，在將它們包含在本發明疫苗組合物中之前，可以缺失或用另外胺基酸殘基置換這些多肽中天然存在的1個、2個、3個或更多個半胱氨酸殘基。
如上所述，自由半胱氨酸殘基的去除可以減少可能導致有毒成分與HBcAg結合的位點的數量，並且也消除可能導致相同或鄰近HBcAg分子的賴氨酸和半胱氨酸殘基發生交聯的位點。因此，在本發明另一個實施方式中，已缺失或用另外的胺基酸殘基置換了B型肝炎病毒衣殼蛋白質的一個或多個半胱氨酸殘基。
在其它實施方式中，本發明組合物或疫苗組合物將包含其中移除了C末端區域(即，SEQ ID NO25的胺基酸殘基145-185或150-185)的HBcAg。因此，適於本發明實踐中使用的其它修飾的HBcAg包括C末端截短突變體。適宜的截短突變體包括其中已經從C末端移除了1，5，10，15，20，25，30，34，35個胺基酸的HBcAg。
適於本發明實踐中使用的HBcAg也包括N末端截短突變體。適宜的截短突變體包括其中已從N末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15或17個胺基酸的修飾的HBcAg。
適於本發明實踐中使用的其它HBcAg包括N和C末端截短突變體。適宜的截短突變體包括已從N末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15和17個胺基酸及從C末端移除了1，5，10，15，20，25，30，34，35個胺基酸的HBcAg。
本發明還包括包含HBcAg多肽的組合物或疫苗組合物，該HBcAg多肽包含與上述截短突變體具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的胺基酸序列，或者可替代地基本由或可替代地由與上述截短突變體具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的胺基酸序列組成。
在本發明一些實施方式中，將賴氨酸殘基引入HBcAg多肽中以介導Aβ1-6肽與HBcAg的VLP的結合。在優選的實施方式中，利用包含SEQID NO25胺基酸1-144或1-149，1-185，或者可替代地由SEQ ID NO25胺基酸1-144或1-149，1-185組成的HBcAg製備本發明組合物，其中所述HBcAg被修飾，以致對應於位置79和80的胺基酸由具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO33)胺基酸序列的肽置換，產生了具有SEQ ID NO26中所示序列的HBcAg多肽。這些組合物對於抗原決定簇偶聯HBcAg VLP的實施方式特別有用。在另外優選的實施方式，將SEQ IDNO25位置48和107的半胱氨酸殘基突變為絲氨酸。本發明還包括包含如下相應多肽的組合物，該多肽具有任何一個上述B型肝炎核心抗原前體變體中所示的胺基酸序列並具有上述胺基酸改變。進一步包括在本發明範圍中的是能締合形成衣殼或VLP並且具有上述胺基酸改變的其它HBcAg變體。因此，本發明還包括包含HBcAg多肽或這些蛋白質的適當時被加工以移除N末端前導序列並用上述改變進行修飾的形式的組合物或疫苗組合物，其中所述HBcAg多肽包含與任何一種野生型胺基酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的胺基酸序列，或者可替代地由與任何一種野生型胺基酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的胺基酸序列組成。
本發明組合物或疫苗組合物可以包含不同HBcAg的混合物。因此，這些疫苗組合物可以由胺基酸序列不同的HBcAg組成。例如，可以製備包含「野生型」HBcAg和修飾的HBcAg的疫苗組合物，在修飾的HBcAg中已改變(例如，缺失、插入或置換)了一個或多個胺基酸殘基。而且，本發明優選的疫苗組合物是呈現高度有序和重複抗原陣列的疫苗組合物，其中抗原是Aβ1-6肽。
在本發明另一優選的實施方式中，至少一個Aβ1-6肽通過至少一個共價鍵與所述病毒樣顆粒或核心顆粒結合。優選地，至少一個Aβ1-6肽通過至少一個非肽鍵的共價鍵與所述病毒樣顆粒或核心顆粒結合，從而產生Aβ1-6肽陣列或Aβ1-6肽-VLP綴合物。該Aβ1-6肽陣列或綴合物通常並優選地具有重複和有序的結構，因為至少一個Aβ1-6肽以定向方式與VLP或核心顆粒結合。至少一個Aβ1-6肽與VLP或核心顆粒以定向有控制的確定方式結合和附著，確保了重複和有序的Aβ1-6肽-VLP陣列或綴合物的形成，這在下文所述中將顯而易見。而且，VLP或和核心顆粒的典型固有高度重複和有組織的結構也有利於促進Aβ1-6肽以高度有序和重複方式展示，形成高度有組織和重複的Aβ1-6肽-VLP陣列或綴合物。
因此，優選的本發明綴合物或陣列在它們高度有組織的結構、維度方面，和陣列表面上抗原的重複性方面不同於現有綴合物。而且，本發明優選的實施方式允許在表達宿主中表達顆粒，從而保證了VLP正確的摺疊和裝配，然後，抗原，即Aβ1-6肽進一步偶聯該VLP。
本發明公開了Aβ1-6肽結合VLP的方法。如所述，在本發明的一個方面，通過化學交聯方法，通常和優選地通過利用異雙官能交聯劑，使Aβ1-6肽結合VLP。幾種異雙官能交聯劑是本領域已知的。在優選的實施方式中，異雙官能交聯劑含有可以與優選的第一附著位點(即VLP或至少一個VLP亞單位的賴氨酸殘基的側鏈氨基)反應的官能團，和可以與優選的第二附著位點(即與Aβ1-6肽融合的和可選地通過還原反應獲得的半胱氨酸殘基)反應的另一個官能團。該方法的第一步，通常稱為衍生，是VLP和交聯劑反應。該反應的產物是活化的VLP，也稱為活化的載體。在第二步中，利用通常的方法諸如凝膠過濾或透析移除未反應的交聯劑。在第三步中，Aβ1-6肽與活化的VLP反應，並且該步驟通常稱為偶聯步驟。可選地可以在第四步中，例如通過透析，移除未反應的Aβ1-6肽。幾種異雙官能交聯劑是本領域已知的。這些交聯劑包括優選的交聯劑SMPH(Pierce)，磺基-MBS，磺基-EMCS，磺基-GMBS，磺基-SIAB，磺基-SMPB，磺基-SMCC，SVSB，SIA和可從例如Pierce Chemical Company(Rockford，IL，USA)獲得的其它交聯劑(這些交聯劑具有對氨基有活性的一個官能團和對半胱氨酸殘基有活性的一個官能團)。所有上述交聯劑引起了硫醚鍵的形成。適於本發明實踐的另一類交聯劑的特徵在於一旦偶聯，就在Aβ1-6肽和VLP之間引入二硫鍵。屬於該類的優選交聯劑包括例如SPDP和磺基-LC-SPDP(Pierce)。可以通過改變試驗條件諸如每種反應組分的濃度，一種試劑相對於另一種試劑的過量、pH、溫度和離子強度來影響交聯劑對VLP的衍生程度。可以通過改變上述試驗條件調整偶聯程度，即每個VLP亞單位的Aβ1-6肽數量，以滿足疫苗要求。
Aβ1-6肽結合VLP的一個特別有利的方法是VLP表面上的賴氨酸殘基和Aβ1-6肽上的半胱氨酸殘基的連接。在一些實施方式中，可能需要將含有半胱氨酸殘基的胺基酸接頭(半胱氨酸殘基作為第二附著位點或作為接頭的一部分)融合到Aβ1-6上以便偶聯VLP。
一般地，柔性胺基酸接頭是有利的。胺基酸接頭的例子選自(a)CGG；(b)N-末端γ1接頭；(c)N-末端γ3接頭；(d)Ig鉸鏈區；(e)N-末端甘氨酸接頭；(f)(G)kC(G)n，n＝0-12且k＝0-5(SEQ ID NO34)；(g)N-末端甘氨酸-絲氨酸接頭；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2(SEQ ID NO35)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C-末端γ1接頭；(m)C-末端γ 3接頭；(n)C-末端甘氨酸接頭；(o)(G)nC(G)k，n＝0-12且k＝0-5(SEQ IDNO36)；(p)C-末端甘氨酸-絲氨酸接頭；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，且o＝0-8(SEQ ID NO37)。
胺基酸接頭的其它例子是免疫球蛋白鉸鏈區，甘氨酸絲氨酸接頭(GGGGS)n(SEQ ID NO38)，和甘氨酸接頭(G)n，所有這些接頭還都包含做為第二附著位點的半胱氨酸殘基和可選地甘氨酸殘基。所述胺基酸接頭的典型優選例子是N-末端γ1CGDKTHTSPP(SEQ ID NO39)；C-末端γ1DKTHTSPPCG(SEQ ID NO40)；N-末端γ3CGGPKPSTPPGSSGGAP(SEQ ID NO41)；C-末端γ3PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQ ID NO42)；N-末端甘氨酸接頭GCGGGG(SEQ ID NO43)和C-末端甘氨酸接頭GGGGCG(SEQ IDNO44)。
當疏水性Aβ肽結合VLP時，特別適於本發明實踐中的其它胺基酸接頭是N末端接頭CGKKGG(SEQ ID NO46)或CGDEGG(SEQ ID NO31)，或C末端接頭GGKKGC(SEQ ID NO45)和GGEDGC(SEQ ID NO32)。對於C末端接頭，可選地在C末端醯胺化末端半胱氨酸。
在本發明優選的實施方式中，優選在肽C末端以GGCG(SEQ ID NO47)、GGC或GGC-NH2(″NH2″代表醯胺化)接頭作為胺基酸接頭，或在N末端以CGG作為胺基酸接頭。一般地，將甘氨酸殘基插入到大的胺基酸和將要用做第二附著位點的半胱氨酸之間，以避免在偶聯反應中較大胺基酸可能的空間位阻。在本發明最優選的實施方式中，胺基酸接頭GGC-NH2與Aβ1-6的C末端融合。
Aβ1-6肽上存在的半胱氨酸殘基必須是還原狀態以便與活化的VLP上的異雙官能交聯劑反應，也就是說必須有可用的自由半胱氨酸或具有自由巰基的半胱氨酸殘基。在起結合位點作用的半胱氨酸殘基是氧化形式，例如如果它形成二硫鍵時，需要用例如DTT，TCEP或β-巰基乙醇還原該二硫鍵。WO 02/056905中描述了低濃度還原試劑與偶聯相容，而如本領域技術人員所知道的，高濃度將抑制偶聯反應，在這種情況下，在偶聯前，必須例如通過透析、凝膠過濾或反相HPLC移除還原劑或降低它的濃度。
根據上述優選的方法，通過利用異雙官能交聯劑使Aβ1-6肽與VLP結合，將允許Aβ1-6肽以定向方式偶聯VLP。Aβ1-6肽偶聯VLP的其它方法包括利用碳二亞胺EDC和NHS使Aβ1-6肽交聯VLP的方法。在另一些方法中，利用同雙官能交聯劑諸如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)或者具有對VLP的氨基或羧基有反應性的官能團的其它已知同雙官能交聯劑，使Aβ1-6肽附著VLP。
VLP結合Aβ1-6肽的其它方法包括生物素醯化VLP並且將Aβ1-6肽作為鏈黴抗生物素蛋白-融合蛋白表達的方法，或者例如WO 00/23955中所述，生物素醯化Aβ1-6肽和VLP的方法。在這種情況下，Aβ1-6肽可以首先結合鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，通過調整Aβ1-6肽與鏈黴抗生物素蛋白的比率，使自由結合位點仍舊可獲得用於與下一步添加的VLP結合。做為可替代的方案，可以在「一個容器」反應中混合所有成分。其它配體-受體對也可以用做結合試劑用於結合Aβ1-6肽和VIP，條件是可得到該受體和配體的可溶形式，並且它們能與VLP或Aβ1-6肽交聯。做為可替代的方案，配體或受體可以與Aβ1-6肽融合，並由此介導與化學結合或融合了受體或配體的VLP結合。通過插入或置換也可以實現融合。
如所述，在本發明有利的實施方式中，VLP是RNA噬菌體VLP，並且在更優選的實施方式中，VLP是RNA噬菌體Qβ外殼蛋白的VLP。
如果空間上允許，優選地通過RNA噬菌體VLP上暴露的賴氨酸殘基，一個或幾個抗原分子，即Aβ1-6肽可以與RNA噬菌體外殼蛋白的衣殼或VLP的一個亞單位結合。因此，RNA噬菌體外殼蛋白，特別是Qβ外殼蛋白的VLP的特定特徵是每個亞單位可以偶聯幾個抗原。這樣可以產生密集的抗原陣列。
在本發明優選的實施方式中，至少一個Aβ1-6肽與病毒樣顆粒通過病毒樣顆粒的至少一個第一附著位點和抗原或抗原決定簇的至少一個第二附著位點之間的相互作用或締合而實現結合或附著。
Qβ外殼蛋白的VLP或衣殼在它們的表面展示了確定數量的賴氨酸殘基，具有確定的拓撲結構，該拓撲結構具有指向衣殼內部並且與RNA相互作用的3個賴氨酸殘基，和暴露於衣殼外部的另外4個賴氨酸殘基。這些確定的特性有利於抗原附著到顆粒外部，而不是附著到賴氨酸殘基與RNA相互作用的顆粒內部。其它RNA噬菌體外殼蛋白的VLP在它們表面也具有確定數量的賴氨酸殘基，且這些賴氨酸殘基具有確定的拓撲結構。
在本發明其它優選的實施方式中，第一附著位點是賴氨酸殘基和/或第二附著位點包含巰基或半胱氨酸殘基。在本發明非常優選的實施方式中，第一附著位點是賴氨酸殘基，並且第二附著位點是半胱氨酸殘基。
在本發明非常優選的實施方式中，Aβ1-6肽通過半胱氨酸殘基結合RNA噬菌體外殼蛋白的VLP(特別是Qβ外殼蛋白的VLP)的賴氨酸殘基。
來源於RNA噬菌體的VLP的另一個優點是它們在細菌中高的表達產率，該高的表達產率使得可以以可擔負得起的花費生產大量物質。
如所述，本發明綴合物或陣列在它們高度有組織的結構、維度方面，和陣列表面上抗原的重複性方面不同於現有綴合物。而且將VLP用作載體使得可以形成具有可變抗原密度的穩固抗原陣列或綴合物。具體地，RNA噬菌體VLP的應用，特別是RNA噬菌體Qβ外殼蛋白VLP的應用允許獲得非常高的表位密度。特別地，通過偶聯人類Aβ1-6肽和Qβ外殼蛋白VLP可以達到每個亞單位1.5個以上表位的密度。利用本申請的教導可以實現具有高表位密度的RNA噬菌體外殼蛋白VLP組合物的製備。在本發明優選的實施方式中，當Aβ1-6肽偶聯Qβ外殼蛋白VLP時，優選每個亞單位具有0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9或更高的平均Aβ1-6肽數量。
這裡所定義的第二附著位點可以天然或非天然存在於抗原或抗原決定簇上。在抗原或抗原決定簇上不存在適宜的天然第二附著位點的情況下，必須進行抗原改造使其具有非天然第二附著位點。
如上所述，4個賴氨酸殘基暴露在Qβ外殼蛋白VLP表面上。通常地，這些殘基通過與交聯劑分子反應而衍生化。在不是所有暴露的賴氨酸殘基都偶聯抗原的情況下，衍生作用步驟後，留下了與交聯劑反應的賴氨酸殘基，其中交聯劑分子附著ε氨基。這引起了對VLP溶解度和穩定性可能有害的一個或幾個正電荷的消失。如在以下公開的Qβ外殼蛋白突變體中，通過用精氨酸置換一些賴氨酸殘基，可以阻止正電荷過量的消失，因為精氨酸殘基不與交聯劑反應。而且，用精氨酸置換賴氨酸殘基可以產生更確定的抗原陣列，因為較少的位點可用於和抗原反應。
因此，在本申請中下面公開的Qβ外殼蛋白突變體和突變Qβ VLP中，用精氨酸置換了暴露的賴氨酸殘基Qβ-240(Lys13-Arg；SEQ ID NO17)，Qβ-250(Lys 2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO19)和Qβ-259(Lys 2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO21)。克隆構建體，表達蛋白質，純化VLP並且用於偶聯肽和蛋白質抗原。也構建了Qβ-251(SEQ ID NO20)，並且在本申請中可以找到如何表達、純化和偶聯Qβ-251外殼蛋白VLP的指導。
在另一實施方式中，我們公開了具有一個額外賴氨酸殘基的Qβ突變體外殼蛋白，其適用於獲得甚至更高密度的抗原陣列。克隆該突變體Qβ外殼蛋白，Qβ-243(Asn 10-Lys；SEQ ID NO18)，表達蛋白質，並且分離和純化了衣殼或VLP，表明額外賴氨酸殘基的引入與亞單位自裝配為衣殼或VLP相容。因此，利用Qβ外殼蛋白突變體的VLP可以製備Aβ1-6肽陣列或綴合物。使抗原附著VLP，特別是附著RNA噬菌體外殼蛋白的VLP的一個特別有利方法是RNA噬菌體外殼蛋白VLP表面上存在的賴氨酸殘基與添加在抗原(即，Aβ1-6肽)上的半胱氨酸殘基連接。為了半胱氨酸殘基有效地做為第二附著位點，必須有用於偶聯的巰基。因此，半胱氨酸殘基必須是還原狀態，即，必須有可用的具有自由巰基的半胱氨酸殘基或自由半胱氨酸。在起第二附著位點作用的半胱氨酸殘基是氧化形式，例如如果它形成二硫鍵時，需要用例如DTT，TCEP或β-巰基乙醇還原該二硫鍵。必須針對每種抗原調整還原劑濃度和還原劑相對抗原的摩爾過量。如果需要，檢測從10μM或更低濃度開始直到10-20mM或更高濃度的還原劑滴定範圍，並評價抗原與載體的偶聯。儘管如WO 02/056905中所述低濃度還原劑與偶聯反應相容，但是高濃度將抑制偶聯反應，這是本領域技術人員所知道的，在這種情況下，必須例如通過透析、凝膠過濾或反相HPLC移除還原劑或降低它的濃度。有利地，透析或平衡緩衝液的pH低於7，優選地6。必須檢測低pH緩衝液與抗原活性或穩定性的相容性。
通過交聯劑和其它反應條件的選擇可以調節RNA噬菌體外殼蛋白VLP上的表位密度。例如，交聯劑磺基-GMBS和SMPH通常允許達到高表位密度。高濃度反應劑正面影響衍生作用，並且反應條件的操縱可以用於控制偶聯RNA噬菌體外殼蛋白VLP，特別是Qβ外殼蛋白VLP的抗原數量。
在設計非天然第二附著位點之前，必須選擇它應該融合、插入或一般地進行基因工程改造的位置。例如，可以根據抗原晶體結構選擇第二附著位點的位置。這種抗原晶體結構可以提供關於分子C或N末端可用性(例如，從它們與溶劑的可接近性來確定)的信息，或者關於適於用做第二附著位點的殘基，諸如半胱氨酸殘基暴露於溶劑的信息。如Fab片段情況下，暴露的二硫鍵也可以是第二附著位點的來源，因為一般地通過用例如2-巰基乙胺、TCEP、β-巰基乙醇或DTT溫和還原，它們可以轉化為單個的半胱氨酸殘基。選擇不影響抗原免疫原性的溫和還原條件。一般地，在用自身抗原免疫旨在抑制該自身抗原和它的天然配體相互作用的情況下，第二附著位點的添加方式將允許抗與天然配體相互作用的位點的抗體產生。因此，將要選擇第二附著位點的位置以避免來源於第二附著位點或含有它的任何胺基酸接頭的空間位阻。在其它實施方式中，期望定向於不同於自身抗原與其天然配體的相互作用位點的位點的抗體應答。在這種實施方式中，可以選擇第二附著位點以使它能夠阻止抗自身抗原與其天然配體的相互作用位點的抗體產生。
選定第二附著位點位置的其它標準包括抗原的寡聚化狀態，寡聚化位點，輔因子的存在，和是否可以獲得抗原結構和序列中如下位點的公開試驗證據，其中在所述位點的抗原修飾與自身抗原的功能相容，或者與識別自身抗原的抗體的產生相容。
在最優選的實施方式中，Aβ1-6肽包含能與核心顆粒和VLP或VLP亞單位上第一附著位點締合的單一第二附著位點或單一活性附著位點。這確保了至少一個，但是通常是一個以上，優選地10，20，40，80，120，150，180，210，240，270，300，360，400，450個以上抗原與核心顆粒或VLP進行確定的一致結合和締合。因此，在抗原上提供單一第二附著位點或單一活性附著位點將確保可以導致非常高度有序和重複陣列的單一和一致類型的結合或締合。例如，如果通過賴氨酸(做為第一附著位點)和半胱氨酸(做為第二附著位點)相互作用實現結合或締合，根據本發明該優選實施方式，不管該半胱氨酸殘基是天然的或是非天然存在於抗原上的，都將確保每個抗原僅僅一個半胱氨酸殘基能結合或締合VLP或核心顆粒的第一附著位點。
在一些實施方式中，抗原上第二附著位點的改造需要融合胺基酸接頭，該胺基酸接頭含有適於做為根據本發明的第二附著位點的胺基酸。因此，在本發明優選的實施方式中，胺基酸接頭通過至少一個共價鍵結合抗原或抗原決定簇。優選地，胺基酸接頭包含第二附著位點，或者可替代地基本由第二附著位點組成。在進一步優選的實施方式中，胺基酸接頭包含巰基或半胱氨酸殘基。在另一個優選的實施方式中，胺基酸接頭是半胱氨酸。上面已經提到了本發明胺基酸接頭的一些選擇標準及胺基酸接頭的其它優選實施方式。
在本發明另一優選的實施方式中，至少一個抗原或抗原決定簇，即Aβ1-6肽與病毒樣顆粒融合。如上所述，VLP典型地由至少一種裝配為VLP的亞單位組成。因此，在本發明另一個優選的實施方式中，抗原或抗原決定簇，優選地至少一個Aβ1-6肽與病毒樣顆粒的至少一種亞單位或能摻入VLP的蛋白質融合，產生嵌合VLP-亞單位-Aβ1-6肽蛋白質融合物。
通過插入到VLP亞單位序列中，或者通過融合到VLP亞單位或能摻入VLP的蛋白質的N或C末端可以實現Aβ1-6肽的融合。此後，當提到肽與VLP亞單位的融合蛋白時，包括與亞單位序列任一末端的融合或亞單位序列中肽的內部插入。
通過將Aβ1-6肽序列插入到VLP亞單位變體中也可以實現融合，該VLP亞單位變體中已經缺失了部分亞單位序列，也稱為截短突變體。截短突變體可以具有VLP亞單位序列的部分N或C末端或內部缺失。例如，具有胺基酸殘基79到81缺失的具體VLP HBcAg是具有內部缺失的截短突變體。Aβ1-6肽與截短突變體VLP亞單位N或C末端的融合也產生了本發明的實施方式。同樣，通過置換也可以在VLP亞單位序列中實現表位的融合，其中例如對於具體的VLP HBcAg，用外源表位置換胺基酸79-81。因此，通過將Aβ1-6肽序列插入到VLP亞單位序列中，通過用Aβ1-6肽置換VLP亞單位的部分序列，或者通過缺失、置換或插入的聯合可以實現此後所稱的融合。
嵌合的Aβ1-6肽-VLP亞單位一般能自裝配為VLP。這裡也將展示出與其亞單位融合的表位的VLP稱作嵌合VLP。如所述，病毒樣顆粒包含至少一種VLP亞單位，或者可替代地由至少一種VLP亞單位組成。在本發明另一實施方式中，病毒樣顆粒包含嵌合VLP亞單位和非嵌合VLP亞單位的混合物，或者可替代地由嵌合VLP亞單位和非嵌合VLP亞單位的混合物組成，從而產生了所謂的鑲嵌顆粒，其中該非嵌合VLP亞單位為沒有與抗原融合的VLP亞單位。這對於確保VLP形成和裝配可能是有利的。在這些實施方式中，嵌合VLP亞單位的比例可以是1，2，5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，95％或更高。
可以向肽或表位序列任一末端添加側翼胺基酸殘基，其中該肽或表位序列將融合到VLP亞單位序列任一末端，或者插入到VLP亞單位序列內部。甘氨酸和絲氨酸殘基是在側翼序列中使用的特別有利的胺基酸，其中向待要融合的肽添加該側翼序列。甘氨酸殘基賦予了額外的柔性，其可以減小外源序列融合到VLP亞單位序列中引起的潛在去穩定作用。
在本發明具體實施方式
中，VLP是B型肝炎核心抗原VLP。已經描述了在HBcAg N末端(Neyrinck，S.等，Nature Med.51157-1163(1999))或在所謂的主要免疫優勢區(MIR)中插入Aβ1-6肽的融合蛋白(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))，WO 01/98333)，並且它們是本發明優選的實施方式。也已經描述了MIR中有缺失的天然HBcAg變體(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，明確地將這篇文獻整體併入為參考文獻)，與N或C末端的融合，及與野生型HBcAg比較在對應於缺失位點的MIR位置的插入是本發明另外的實施方式。也已經描述了與C末端的融合(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))。本領域技術人員很容易發現關於如何利用經典分子生物學技術構建融合蛋白的指導(Sambrook，J等，編輯，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Habor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)，Ho等，Gene 7751(1989))。已經描述了編碼HBcAg和HBcAg融合蛋白並且可用於HBcAg和HBcAg融合蛋白表達的載體和質粒(Pumpens，P. Grens，E.Intervirology 4498-114(2001)，Neyrinck，S.等，Nature Med.51157-1163(1999))，這些載體和質粒可以用於本發明實踐中。我們也通過實施例的方式(實施例6)描述了在HBcAg MIR中插入表位，產生嵌合的自裝配HBcAg。對自裝配效率和待要插入到HBcAg MIR中的表位的展示進行優化的一個重要因素是插入位點的選擇，及一旦插入，將要從HBcAg的MIR序列中缺失的胺基酸數目(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)；EP 0 421 635；U.S.專利號.6,231,864)，或者換而言之，HBcAg中哪些胺基酸將用新表位置換。例如，已經描述了用外源表位置換HBcAg胺基酸76-80，79-81，79-80，75-85或80-81(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)；EP0421635；US 6』231』864)。HBcAg含有長精氨酸尾部(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology4498-114(2001))，其不是衣殼裝配所必需的，並且能結合核酸(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))。包含或缺少該精氨酸尾部的HBcAg都是本發明的實施方式。
在本發明另一優選的實施方式中，VLP是RNA噬菌體VLP。一旦在細菌中，特別是在大腸桿菌(E.coli)中表達RNA噬菌體主要外殼蛋白，其就自發裝配為VLP。可以用於製備本發明組合物的噬菌體外殼蛋白的具體例子包括RNA噬菌體諸如噬菌體Qβ(SEQ ID NO4；PIR資料庫，記錄號VCBPQβ，稱為Qβ CP和SEQ ID NO5；記錄號AAA16663，稱為QβA1蛋白質)和噬菌體fr(SEQ ID NO7；PIR記錄號VCBPFR)的外殼蛋白。
在更優選的實施方式中，至少一個Aβ1-6肽與Qβ外殼蛋白融合。已經描述了將表位融合到截短形式的Qβ A1蛋白質C端，或者插入到A1蛋白質中的融合蛋白構建體(Kozlovska，T.M.，等，Intervirology，399-15(1996))。A1蛋白質通過在UGA終止密碼子處的抑制產生，並且其有329個胺基酸或328個(如果考慮N末端甲硫氨酸的切割)胺基酸的長度。通常在大腸桿菌(E.coli)中發生丙氨酸(Qβ CP基因編碼的第二個胺基酸)之前的N末端甲硫氨酸的切割，並且這與Qβ外殼蛋白N末端的情況相同。UGA琥珀密碼子3』的A1基因部分編碼195個胺基酸長度的CP延伸物。(在此CP延伸物的位置72和73之間插入至少一個Aβ1-6肽產生了本發明另一實施方式(Kozlovska，T.M.，等.，Intervirology 399-15(1996))。在C末端截短的Qβ A1蛋白質C末端融合Aβ1-6肽產生了本發明另外的優選實施方式。例如，Kozlovska等，(Intervirology，399-15(1996))描述了Qβ A1蛋白質融合物，其中在位置19截短的Qβ CP延伸物的C末端融合表位。
如Kozlovska等(Intervirology，399-15(1996))所述，展示融合表位的顆粒的裝配通常需要A1蛋白質-Aβ1-6肽融合物和野生型CP同時存在以形成鑲嵌顆粒。然而，包含僅由融合了至少一個Aβ1-6肽的VLP亞單位組成的病毒樣顆粒，特別是RNA噬菌體Qβ外殼蛋白的VLP的實施方式也包括在本發明範圍中。
可以通過多種方法實現鑲嵌顆粒的產生。Kozlovska等，Intervirology，399-15(1996)描述了3種方法，這3種方法都可以用在本發明實踐中。在第一種方法中，在含有編碼克隆的UGA抑制型tRNA的質粒(pISM3001質粒(Smiley B.K.，等.，Gene 13433-40(1993)))的大腸桿菌(E.coli)株系中，表達編碼Qβ A1蛋白質融合物的質粒以介導融合表位在VLP上的有效展示，其中所述Qβ A1蛋白質融合物在CP和CP延伸之間具有UGA終止密碼子，而所述克隆的UGA抑制型tRNA將導致UGA密碼子翻譯為Trp。在另一個方法中，將CP基因終止密碼子修飾為UAA，並且共轉化表達A1蛋白質-Aβ1-6肽融合物的第二質粒。此第二質粒編碼不同的抗生素抗性，並且複製起點與第一質粒相容(Kozlovska，T.M.，等，Intervirology399-15(1996))。在第三種方法中，以雙順反子方式編碼CP和A1蛋白質-Aβ1-6肽融合物，其可操作地連接啟動子諸如Trp啟動子，參見Kozlovska等，Intervirology，399-15(1996)的圖1中所述。
在另一實施方式中，Aβ1-6肽插入到fr CP的胺基酸2和3(切割後的CP，即切除了N末端甲硫氨酸的CP的編號)之間，由此產生了Aβ1-6肽-fr CP融合蛋白。已經描述了可用於本發明實踐中自裝配為VLP的fr CP融合蛋白質的構建和表達用載體和表達系統(Pushko P.等.，Prot.Eng.6883-891(1993))。在一個具體實施方式
中，Aβ1-6肽序列插入到fr CP缺失突變體中位於胺基酸2後，在所述突變體中已經缺失了fr CP的殘基3和4(Pushko P.等，Prot.Eng.6883-891(1993))。
也已描述了在RNA噬菌體MS-2外殼蛋白N末端突出的β髮夾中融合表位和之後融合表位在RNA噬菌體MS-2自裝配的VLP上的呈遞(WO92/13081)，並且通過插入或置換將Aβ1-6肽融合到MS-2 RNA噬菌體的外殼蛋白中也落入本發明的範圍中。
在本發明另一個實施方式中，Aβ1-6肽融合到乳頭瘤病毒衣殼蛋白上。在一個更具體的實施方式中，Aβ1-6肽融合到牛乳頭瘤病毒1型(BPV-1)的主要衣殼蛋白L1上。已經描述了杆狀病毒/昆蟲細胞系統中用於BPV-1融合蛋白構建和表達的載體和表達系統(Chackerian，B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO 00/23955)。用Aβ1-6肽置換BPV-1L1胺基酸130-136產生了BPV-1 L1-Aβ1-6肽融合蛋白，其是本發明優選的實施方式。已經描述了在杆狀病毒載體中的克隆和在杆狀病毒感染的Sf9細胞中的表達，並且它們可以用在本發明實踐中(Chackerian，B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO 00/23955)。可以用多種方法諸如，凝膠過濾或蔗糖梯度超離心進行展示融合Aβ1-6肽的裝配顆粒的純化(Chackerian，B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO00/23955)。
在本發明另一實施方式中，Aβ1-6肽與能摻入到Ty VLP中的Ty蛋白質融合。在一個更具體的實施方式中，Aβ1-6肽與TYA基因編碼的p1或衣殼蛋白(Roth，J.F.，Yeast 16785-795(2000))融合。已經從釀酒酵母(Saccharomyces Serevisiae)分離了酵母逆轉錄轉座子Ty1，2，3和4，而且已經從粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombae)分離了逆轉錄轉座子Tf1(Boeke，J.D.和Sandmeyer，S.B.，「Yeast Transposable elements，」《The molecular and Cellular Biology of the Yeast SaccharomycesGenome dynamics，Protein Synthesis，and Energetics》，193頁，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1991))。逆轉錄轉座子Ty1和2與copia類植物和動物元件有關，而Ty3屬於gypsy逆轉錄轉座子家族，其與植物和動物逆轉錄病毒有關。在Ty1逆轉錄轉座子中，p1蛋白質也稱為Gag或衣殼蛋白，具有440個胺基酸的長度。在VLP成熟期間，在位置408切割p1產生p2蛋白質，其是VLP的必需成分。
已經描述了p1融合蛋白和用於酵母中所述融合蛋白表達的載體(Adams，S.E.，等，Nature 32968-70(1987))。因此，例如通過將編碼Aβ1-6肽的序列插入到pMA5620質粒的BamHI位點中，Aβ1-6肽可以與p1融合(Adams，S.E.，等，Nature 32968-70(1987))。編碼外源表位的序列克隆到pMA5620載體中導致融合蛋白表達，該融合蛋白包含以C末端融合在外源表位N末端的Ty1-15 p1的胺基酸1-381。同樣，用Aβ1-6肽進行N末端融合，或者內部插入到p1序列中，或者置換部分p1序列也落入本發明範圍中。特別地，Aβ1-6肽插入到Ty蛋白質p1胺基酸30-31，67-68，113-114和132-133之間的Ty序列中(EP0677111)產生了本發明優選的實施方式。
適於Aβ1-6肽融合的其它VLP是例如逆轉錄病毒樣顆粒(WO9630523)，HIV2 Gag(Kang，Y.C.，等，Biol.Chem.380353-364(1999))，豇豆花葉病毒(Taylor，K.M.等.，Bio1.Chem.380387-392(1999))，細小病毒VP2 VLP(Rueda，P.等，Virology 26389-99(1999))，HBsAg(US4,722,840，EP0020416B1)。
適於本發明實踐的嵌合VLP例子還有在Intervirology 391(1996)中描述的嵌合VLP。本發明中可以考慮使用的其它VLP例子是HPV-1，HPV-6，HPV-1 1，HPV-16，HPV-18，HPV-33，HPV-45，CRPV，COPV，HIV GAG，菸草花葉病毒。已經製備了SV-40，多瘤病毒，腺病毒，單純皰疹病毒，輪狀病毒和諾沃克病毒的病毒樣顆粒，並且包含Aβ1-6肽的這些VLP的嵌合VLP也在本發明範圍中。
在本發明優選的實施方式中，用胺基酸接頭修飾適於產生本發明疫苗的Aβ1-6肽以便與VLP結合。這些Aβ1-6肽包括但不限於在C末端融合到接頭GGC上的Aβ1-6肽。適於融合到Aβ1-6片段N末端的胺基酸接頭包括但不限於序列CGG和CGHGNKS。適於融合到Aβ1-6的C末端的接頭包括但不限於序列GGC。在優選的實施方式中，當接頭融合到Aβ或Aβ片段C末端時，醯胺化C末端半胱氨酸。在優選的實施方式中，Aβ1-6與胺基酸接頭融合，並且具有序列NH2-DAEFRHGGC-CONH2，其中醯胺化C末端半胱氨酸(這用C末端的「-CONH2」標明)，並且肽N末端是游離的(進一步用「NH2-」標明)。優選地，該胺基酸接頭是短的，以避免誘導抗所述接頭胺基酸的免疫應答，但是其應該允許誘導與可溶Aβ和AD斑塊交叉反應的抗體，並且可以有利於抗體和Aβ1-6肽相互作用。胺基酸接頭的其它適宜特性是柔性，優選地缺少大胺基酸，大胺基酸可能干擾偶聯和/或引起抗接頭本身的免疫應答。在更優選的實施方式中，含有做為第二附著位點的半胱氨酸殘基的胺基酸接頭融合到Aβ1-6肽的C末端。
本發明實踐中適宜的其它Aβ片段包括來源於其它動物物種、經上述修飾的對應於前述片段的Aβ片段，其中該Aβ片段激發與人澱粉樣斑塊和可溶性人Aβ交叉反應的抗體。這種片段的例子是來源於靈長類(DAEFRH；SEQ ID NO84)，野兔(DAEFRH；SEQ ID NO85)，豚鼠(DAEFRH；SEQID NO88)，小鼠(DAEFGH；SEQ ID NO76)，大鼠(DAEFGH；SEQ IDNO87)和xaenopus laevis(DSEYRH；SEQ ID NO86)的Aβ1-6。
已經報導了基於超表達人類APP突變形式的轉基因小鼠的大量AD動物模型(Games，D.等，Nature 373523-527(1995a)；Sturchler-Pierrat等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413287-13292(1997)；Hsiao，K.，等，Science27499-102(1996)；Chen，G.等，Nature 408975-979(2000)；Janus，C.等.，Nature 408979-982(2000)；Morgan，D.等，Nature 408982-985(2000))。這些小鼠模型在轉基因超表達水平、轉基因上存在的AD突變和指導轉基因超表達的啟動子方面互相不同。這些動物模型不能顯示AD所有的病理症兆，特別是與年齡相關的行為改變、β澱粉狀蛋白沉積為不溶斑塊、神經元內的神經原纖維纏結和整個前腦的神經元損失(Chapman，P.F.Nature 408915-916(2000))。然而，記憶缺陷和鑑定它們的方法可以在這些模型中進行確定，並且它們可以在動物模型中用於檢測本發明組合物的作用(Chen，G.等，Nature 408975-979(2000)；Janus，C.等，Nature 408979-982(2000)；Morgan，D.等，Nature 408982-985(2000))。而且，可以在還出現星形膠質細胞增生和小神經膠質細胞增生的那些模型中研究與年齡相關的Aβ沉積為澱粉樣斑塊。
相關領域技術人員將理解，對這裡所述方法和應用的其它適應性更改和修改是顯而易見的，並且能夠進行這樣的更改和修改而不背離本發明的範圍或其任何實施方式。現在已經詳細地描述了本發明，通過參考下面的實施例將更清楚地理解本發明，這裡所包括的實施例僅僅是示例的目的，不意在限制本發明。
實施例實施例1優選的RNA噬菌體VLP或核心顆粒的克隆、構建、表達和純化A.突變Qβ外殼蛋白的構建和表達，及突變Qβ外殼蛋白VLP或衣殼的純化突變外殼蛋白的質粒構建和克隆pQβ-240的構建質粒pQβ10(Kozlovska，TM，等，Gene 137133-137)用做pQβ-240構建的起始質粒。通過反向PCR產生突變Lys13→Arg。以倒轉尾對尾方向設計反轉引物5′-GGTAACATCGGTCGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3′(SEQ ID NO48)和5′-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3′(SEQ ID NO49)。
第一次PCR的產物用做第二次PCR反應的模板，其中使用上遊引物5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′(SEQ ID NO50)，和下遊引物
5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′(SEQ ID NO51)。用XbaI和Mβh1103I消化第二次PCR的產物，並且克隆到用相同限制酶切割的pQβ10表達載體中。利用PCR試劑盒試劑，根據生產者的方案進行這些PCR反應(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
利用定向標記摻入方法進行測序，證實期望的突變。包含pQβ-240的大腸桿菌(E.coli)細胞支持14kD蛋白質的有效合成，該蛋白質與從Qβ噬菌體顆粒分離的對照Qβ外殼蛋白在SDS-PAGE上共遷移。
所得到胺基酸序列(SEQ ID NO17)AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYpQβ-243的構建質粒pQβ10用做pQβ-243構建的起始質粒。通過反向PCR產生突變Asn10→Lys。以反轉尾對尾方向設計反轉引物5′-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG-3′(SEQ ID NO52)和5′-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC-3′(SEQ ID NO53)。
第一次PCR產物用做第二次PCR反應的模板，其中使用上遊引物5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′(SEQ ID NO50)，和下遊引物5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′(SEQ ID NO51)。用XbaI和Mph1103I消化第二次PCR產物，並且克隆到用相同限制酶切割的pQβ10表達載體中。利用PCR試劑盒試劑，根據生產者的方案進行這些PCR反應(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
利用定向標記摻入方法測序，證實期望的突變。包含pQβ-243的大腸桿菌(E.coli)細胞支持14kD蛋白質的有效合成，該蛋白質與從Qβ噬菌體顆粒分離的對照Qβ外殼蛋白在SDS-PAGE上共遷移。
所得到胺基酸序列(SEQ ID NO18)AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYpQβ-250的構建質粒pQβ-240用做pQβ-250構建的起始質粒。通過定點誘變產生突變Lys2→Arg。上遊引物5′-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3′(SEQ ID NO54)和下遊引物5′-GATTTAGGTGACACTATAG-3′(SEQ ID NO55)用於突變PCR片段的合成，在pQβ-185表達載體中在唯一限制位點NcoI和HindIII引入該突變PCR片段。利用PCR試劑盒試劑，根據生產者的程序進行這些PCR反應(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
利用定向標記摻入方法測序，證實期望的突變。包含pQβ-250的大腸桿菌(E.coli)細胞支持14kD蛋白質的有效合成，該蛋白質與從Qβ噬菌體顆粒分離的對照Qβ外殼蛋白在PAGE上共遷移。
所得到的胺基酸序列(SEQ ID NO19)ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYpQβ-251的構建質粒pQβ10用做pQβ-251構建的起始質粒。通過反向PCR產生突變Lys16→Arg。以反轉尾對尾方向設計反轉引物5′-GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG-3′(SEQ ID NO56)和5′-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC-3′(SEQ ID NO57)。
第一次PCR產物用做第二次PCR反應的模板，其中使用上遊引物5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′(SEQ ID NO50)，和下遊引物5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′(SEQ ID NO51)。用XbaI和Mph1103I消化第二次PCR產物，並且克隆到用相同限制酶切割的pQβ10表達載體中。利用PCR試劑盒試劑，根據生產者的程序進行這些PCR反應(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
利用定向標記摻入方法測序，證實期望的突變。包含pQβ-251的大腸桿菌(E.coli)細胞支持14kD蛋白質的有效合成，該蛋白質與從Qβ噬菌體顆粒分離的對照Qβ外殼蛋白在SDS-PAGE上共遷移。SEQ ID NO20中示出了該構建體編碼所得的胺基酸序列。
pQβ-259的構建質粒pQβ-251用做pQβ-259構建的起始質粒。通過定點誘變產生突變Lys2→Arg。使用上遊引物5′-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3′(SEQ ID NO54)和下遊引物5′-GATTTAGGTGACACTATAG-3′(SEQ ID NO55)用於突變PCR片段的合成，在pQβ-185表達載體中在唯一限制位點NcoI和HindIII引入該突變PCR片段。利用PCR試劑盒試劑，根據生產者的程序進行這些PCR反應(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
利用定向標記摻入方法測序，證實期望的突變。包含pQβ-259的大腸桿菌(E.coli)細胞支持14kD蛋白質的有效合成，該蛋白質與從Qβ噬菌體顆粒分離的對照Qβ外殼蛋白在SDS-PAGE上共遷移。
所得到的胺基酸序列(SEQ ID NO21)AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY用於Qβ和Qβ突變體表達和純化的一般方法表達用Qβ外殼蛋白表達質粒轉化大腸桿菌(E.coli)JM109。使用以Qβ外殼蛋白表達質粒轉化的克隆接種含有20μg/ml氨苄青黴素的5ml LB液體培養基。在37℃溫育該接種培養物16到24小時，不要振蕩。隨後在含有20μg/ml氨苄青黴素的100-300ml新鮮LB培養基中以1100稀釋製備的接種物，並且不要振蕩，在37℃過夜溫育。在燒瓶中，在含有1％酪蛋白胺基酸和0.2％葡萄糖的M9培養基中，以1∶50稀釋由此得到的第二次接種物，並且在振蕩條件下，在37℃過夜溫育。
純化用於純化方法的溶液和緩衝液1.裂解緩衝液LB50mM Tris-HClpH8.0，5mM EDTA，0.1％tritonX100和5微克/ml濃度新製備的PMSF。沒有溶菌酶和DNAse。
2.SAS水中飽和的硫酸銨。
3.緩衝液NET。
20mM Tris-HCl，pH 7.8和5mM EDTA和150mM NaCl。
4.PEGNET中40％(w/v)聚乙二醇6000。
破碎和裂解以2ml/g細胞，在LB中重懸浮冷凍的細胞。用22kH超聲處理混合物5次，15秒，各次間有1分鐘間隔以在冰上冷卻溶液。然後利用Janecki K60轉子，以14000rpm離心裂解液1小時。除非有另外說明，利用相同轉子進行所有下述離心步驟。在4℃ 貯藏上清液，用LB衝洗細胞殘渣2次。離心後，合併裂解液的上清液和洗滌級分。
分級分離在對上述合併的裂解液攪拌的條件下，逐滴地添加飽和的硫酸銨溶液。將SAS體積調整到1/5總體積，以獲得20％的飽和度。放置溶液過夜，並且第二天以14000rpm離心該溶液20分鐘。用少量20％硫酸銨洗沉澱，並且再次離心。合併所獲得的上清液，逐滴地添加SAS以獲得40％飽和度。放置溶液過夜，並且第二天以14000rpm離心該溶液20分鐘。在NET緩衝液中溶解所獲得的沉澱。
層析在Sepharose CL-4B柱子上加樣NET緩衝液中重溶解的衣殼或VLP蛋白質。層析期間洗脫了3個峰。第一個峰主要含有膜和膜片段，沒有收集該峰。衣殼包含在第二個峰中，而第三個峰含有其它大腸桿菌(E.coli)蛋白質。
合併峰級分，並且調整NaCl濃度到0.65M的終濃度。在攪拌條件下逐滴地添加體積相應於二分之一合併的峰級分的PEG溶液。不要攪拌，放置溶液過夜。通過以14000rpm離心20分鐘沉降衣殼蛋白。然後，在最小體積NET中溶解它，並且將它再一次加樣到Sepharose CL-4B柱子上。合併峰級分，並且用60％(w/v)飽和度的硫酸銨沉澱。在NET緩衝液中離心和重溶解後，在Sepharose CL-6B柱子上加樣衣殼蛋白以再次層析。
透析和乾燥合併上述獲得的峰級分，利用大量無菌水進行透析，並且冷幹貯藏。
Qβ-240的表達和純化在LB中重懸浮細胞(用質粒pQβ-240轉化的大腸桿菌(E.coli)JM109)，超聲處理5次，15秒(水冰夾套)，並且以13000rpm離心1小時。在進一步處理前，在4℃貯藏上清液，而用9ml LB洗殘渣2次，最後用9ml LB中的0.7M尿素洗殘渣。合併所有上清液，並且加樣到SepharoseCL-4B柱子上。用硫酸銨沉澱合併的峰級分，並且離心。然後，在Sepharose2B柱子上進一步純化重溶解的蛋白質，並且最後在Sepharose 6B柱子上純化重溶解的蛋白質。如上所述，最後用大量水透析衣殼峰，並且凍幹。通過電子顯微鏡術證實衣殼蛋白裝配為衣殼。
Qβ-243的表達和純化在LB中重懸浮細胞(大腸桿菌RR1)和如一般方法所述處理該細胞。通過在Sepharose CL-4B柱子上和最後在Sepharose CL-2B柱子上的兩步連續凝膠過濾純化蛋白質。如上所述，合併峰級分並凍幹。通過電子顯微鏡術證實衣殼蛋白裝配為衣殼。
Qβ-250的表達和純化在LB中重懸浮細胞(用pQβ-250轉化的大腸桿菌JM 109)和如上所述處理該細胞。通過在Sepharose CL-4B柱子上和最後在Sepharose CL-2B柱子上凝膠過濾純化蛋白質，並如上所述凍幹該蛋白質。通過電子顯微鏡術證實衣殼蛋白裝配為衣殼。
Qβ-259的表達和純化在LB中重懸浮細胞(用pQβ-259轉化的大腸桿菌JM 109)並超聲處理。用10ml LB洗殘渣1次，並且用10ml LB中的0.7M尿素再次洗殘渣。通過在Sepharose CL-4B柱子上的2個凝膠過濾層析步驟純化該蛋白質。如上所述，透析和凍幹該蛋白質。通過電子顯微鏡術證實衣殼蛋白裝配為衣殼。
B.重組AP205 VLP的克隆，表達和純化AP205外殼蛋白基因的克隆通過利用逆轉錄PCR技術和在用於測序的商購質粒pCR 4-TOPO中克隆，從產生自噬菌體AP205 RNA的兩個cDNA片段裝配AP205外殼蛋白(CP)的cDNA(SEQ ID NO28)。逆轉錄技術是相關領域普通技術人員熟知的。質粒p205-246中含有的第一片段包含CP序列上遊269個核苷酸和編碼CP最開始24個N末端胺基酸的74個核苷酸。質粒p205-262中含有的第二片段包含編碼CP胺基酸12-131的364個核苷酸和CP序列下遊另外162個核苷酸。p205-246和p205-262都來源於J.Klovins的惠贈。
通過兩步PCR設計質粒283.-58以在一個全長CP序列中融合來源於質粒p205-246和p205-262的兩個CP片段。
使用含有用於克隆到質粒pQb185中的NcoI位點的上遊引物p1.44，或含有用於克隆到質粒pQb10中的XbaI位點的上遊引物p1.45，和含有HindIII限制位點的下遊引物p1.46(下劃線是限制酶的識別序列)p1.44 5』-AACC ATG GCA AAT AAG CCA ATG CAA CCG-3』(SEQID NO79)p1.45 5』-AATCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGG-3』(SEQ ID NO80)p1.46 5』-AAAAGC TTA AGC AGT AGT ATC AGA CGA TAC G-3』(SEQ ID NO81)。
兩個另外引物，在p205-262中所含片段的5』末端退火的引物p1.47，和在質粒p205-246中所含片段的3』末端退火的引物p1.48用於擴增第一次PCR中的片段。引物p1.47和p1.48相互互補。
p1.475』-GAGTGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTT-TCAGCAAGTCTG-3』(SEQ ID NO82)p1.485』-CAGACTTGCTGAAAATGTAGTTGATAAACGA-GTTGGATCACTC-3』(SEQ ID NO83)。
在開始的兩個PCR反應中，產生兩個片段。用引物p1.45和p1.48和模板p205-246產生第一片段。用引物p1.47和p1.46和模板p205-262產生第二片段。這兩個片段都用做第二次PCR反應的模板，其中用引物聯合p1.45和p1.46或p1.44和p1.46進行拼接重疊延伸。用XbaI或NcoI和HindIII消化兩個第二步PCR反應的產物，並且用相同限制位點分別克隆到源於pGEM的表達載體pQb10或pQb185中，位於大腸桿菌色氨酸操縱子啟動子控制下。
獲得了兩個質粒，pAP283-58(SEQ ID NO27)--其在pQb10中含有編碼野生型AP205 CP(SEQ ID NO28)的基因，和pAP281-32(SEQ IDNO30)一一其在pQb185中具有突變Pro5→Thr(SEQ ID NO29)。通過DNA測序證實外殼蛋白序列。PAP283-58含有位於CP的ATG密碼子上遊及XbaI位點下遊的49個核苷酸，並且含有該外殼蛋白mRNA推定的原始核糖體結合位點。
重組AP205 VLP的表達和純化A.重組AP205VLP的表達用質粒pAP283-58轉化大腸桿菌JM109。用單菌落接種具有20μg/ml氨苄青黴素的5ml LB液體培養基，並且不要振蕩，在37℃溫育16-24小時。
在含有20μg/ml氨苄青黴素的100-300ml LB培養基中以1∶100稀釋製備的接種物，並且不要振蕩，在37℃溫育過夜。在含有用於緩衝的0.2％葡萄糖和磷酸鹽的2TY培養基中以1∶50稀釋所得到的第二次接種物，並且在37℃，在振蕩器上溫育過夜。通過離心收集細胞，並且在-80℃冷凍。B.重組AP205 VLP的純化溶液和緩衝液裂解緩衝液50mM Tris-HCl pH 8.0，5mMEDTA，0.1％tritonX100和5微克/mlPMSF。
SAS水中飽和的硫酸銨。
緩衝液NET20mM Tris-HCl，pH 7.8和5mM EDTA和150mM NaCl。
PEGNET中40％(w/v)聚乙二醇6000。
裂解以2ml/g細胞，在裂解緩衝液中重懸浮冷凍的細胞。用22kH超聲處理混合物5次，15秒，各次間有1分鐘間隔以在冰上冷卻溶液。然後利用F34-6-38(Ependorf)轉子，以12000rpm離心裂解液20分鐘。除非有另外說明，利用相同轉子進行所有下述離心步驟。在4℃貯藏上清液，用裂解緩衝液洗細胞殘渣2次。離心後，合併裂解液的上清液和洗滌級分。
硫酸銨沉澱可以進一步用於純化AP205 VLP。在第一步中，選擇AP205VLP不沉澱的硫酸銨濃度。棄去所得到的沉澱。在下一步中，選擇定量沉澱AP205 VLP的硫酸銨濃度，通過離心(14000rpm，20分鐘)，從該沉澱步驟的沉澱物分離AP205 VLP。在NET緩衝液中溶解所得到的沉澱。層析將來源於合併的上清液的衣殼蛋白加樣到Sepharose 4B柱子上(2.8×70cm)，並且以4ml/小時/級分，用NET緩衝液洗脫。收集級分28-40，並且用60％飽和度的硫酸銨沉澱。在沉澱前，通過SDS-PAGE和Western印跡(用對AP205特異的抗血清進行)分析級分。在NET緩衝液中重溶解通過離心分離的沉澱，並且將其加樣到Sepharose 2B柱子上(2.3×65cm)，以3ml/小時/級分洗脫。通過SDS-PAGE分析級分，之後收集級分44-50，合併，並且用60％飽和度的硫酸銨沉澱。在NET緩衝液中重溶解通過離心分離的沉澱，並且在Sepharose 6B柱子上(2.5×47cm)純化，以3ml/小時/級分洗脫。通過SDS-PAGE分析該級分。收集級分23-27，調整鹽濃度到0.5M，並且用PEG6000(其中從水中40％母液添加PEG6000，並且添加到13.3％的終濃度)沉澱。在NET緩衝液中重溶解通過離心分離的沉澱，並且如上所述加樣到相同Sepharose 2B柱子上，以相同方式洗脫。收集級分43-53，並且用60％飽和度的硫酸銨沉澱。在水中重溶解通過離心分離的沉澱，並且利用大量水透析所獲得的蛋白質溶液。每克細胞可以分離約10mg純化的蛋白質。
利用電子顯微鏡術對病毒樣顆粒檢查，表明它們與噬菌體顆粒相同。
實施例2含有賴氨酸殘基的肽插入到HBcAg(1-149)的c/el表位中HBcAg的c/el表位(殘基72到88)位於B型肝炎病毒衣殼(HBcAg)表面的頂部區域。用肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO33)遺傳地置換該區域的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)，產生了HBcAg-Lys構建體(SEQID NO26)。所引入的賴氨酸殘基在其側鏈含有反應性的氨基，該反應性氨基可以用於HBcAg顆粒與含有自由半胱氨酸基團的任何抗原的分子間化學交聯。
通過PCRs產生具有SEQ ID NO78中所示胺基酸序列的HBcAg-LysDNA通過PCR分別地擴增編碼HBcAg片段的兩個片段(胺基酸殘基1到78和81到149)。用於這些PCRs的引物也引入了編碼Gly-Gly-Lys-Gly-Gly肽(SEQ ID NO33)的DNA序列。利用引物EcoRIHBcAg(s)和Lys-HBcAg(as)，從pEco63擴增HBcAg(1到78)片段。利用引物Lys-HBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)，從pEco63擴增HBcAg(81到149)片段。引物Lys-HBcAg(as)和Lys-HBcAg(s)在兩個PCR產物末端引入互補DNA序列，從而允許在隨後PCR裝配中兩個PCR產物的融合。利用引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)，通過PCR擴增裝配的片段。
對於PCRs，在具有2單位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的50ml反應混合物中使用每種寡聚物各100pmol及50ng模板DNAs。對於兩個反應，實施溫度循環如下94℃，2分鐘；94℃(1分鐘)，50℃(1分鐘)，72℃(2分鐘)，30個循環。
引物序列EcoRIHBcAg(s)(5』-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3』)(SEQ ID NO58)；Lys-HBcAg(as)(5』-CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAG-TACCCACCCAGGTAGC-3』)(SEQ ID NO59)；Lys-HBcAg(s)(5』-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACC-TAGTAGTCAGTTATGTC-3』)(SEQ ID NO60)；HBcAg(1-149)Hind(as)(5』-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3』)(SEQ ID NO61)。
為了通過PCR融合兩個PCR片段，在含有2單位Pwo聚合酶、0.1mMdNTPs和2mM MgSO4的50ml反應混合物中使用100pmol引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)和100ng兩種純化的PCR片段。PCR循環條件是94℃，2分鐘；94℃(1分鐘)，50℃(1分鐘)，72℃(2分鐘)，30個循環。通過瓊脂糖凝膠電泳分析及純化裝配的PCR產物，並且用EcoRI和HindIII限制酶，在適合的緩衝液中消化19小時。消化的DNA片段連接到EcoRI/HindIII消化的pKK載體中以產生pKK-HBcAg-Lys表達載體。通過EcoRI/HindIII限制分析和插入片段的DNA測序，分析PCR產物是否插入到載體中。
實施例3HBcAg-Lys的表達和純化用pKK-HBcAg-Lys轉化大腸桿菌株系K802或JM109。1ml細菌過夜培養物用於接種含有100μg/ml氨苄青黴素的100ml LB培養基。在37℃，培養該培養物4小時直到在600nm時，OD值達到約0.8。通過添加IPTG達到終濃度1mM進行HBcAg-Lys合成的誘導。誘導後，在37℃，進一步振蕩細菌4小時。通過以5000×g離心15分鐘收集細菌。在-80℃冷凍沉澱。融解沉澱，並且在補加有200μg/ml溶菌酶和10μl Benzonase(Merck)的細菌裂解緩衝液(10mM Na2HPO4，pH 7.0，30mM NaCl，0.25％Tween-20，10mM EDTA)中重懸浮。在室溫下溫育細胞30分鐘，並且通過超聲處理破碎。利用含有pKK-HBcAg-Lys表達質粒或對照質粒的大腸桿菌細胞，以IPTG誘導HBcAg-Lys表達。在添加IPTG前，從帶有pKK-HBcAg-Lys質粒的細菌培養物和從帶有對照質粒的培養物取樣品。IPTG添加後4小時，再一次從含有pKK-HBcAg-Lys的培養物和從對照培養物取樣品。通過SDS-PAGE接著用考馬斯亮藍染色監測蛋白質表達。
然後以12,000×g離心裂解物30分鐘以移除不溶細胞殘渣。利用抗HBcAg的單克隆抗體(YVS1841，購自Accurate Chemical and ScientificCorp.，Westbury，NY，USA)，通過Western印跡分析上清液和沉澱，表明顯著數量的HBcAg-Lys蛋白質是可溶的。簡而言之，以14,000×g離心來源於表達HBcAg-Lys的大腸桿菌細胞和來源於對照細胞的裂解物30分鐘。分離上清液(＝可溶級分)和沉澱(＝不溶級分)，並且用SDS樣品緩衝液稀釋到相同體積。通過SDS-PAGE分析樣品，接著用抗HBcAg單克隆抗體YVS1841以Western印跡分析樣品。
利用由4ml 65％蔗糖溶液，其上覆蓋有3ml 15％蔗糖溶液，之後為4ml細菌裂解物組成的蔗糖分級梯度，分級梯度離心澄清細胞裂解物。在4℃，以100,000×g離心樣品3小時。離心後，自梯度頂部收集1ml級分，並且通過SDS-PAGE和隨後的考馬斯亮藍染色分析。通過考馬斯亮藍染色檢測HBcAg-Lys蛋白質。
HBcAg-Lys蛋白質在15％和65％蔗糖界面富集，表明該蛋白質已經形成了衣殼顆粒。大多數細菌蛋白質保留在沒有蔗糖的梯度上層，因此，HBcAg-Lys顆粒的分級梯度離心導致了顆粒的富集和部分純化。
如下所述大規模進行HBcAg-Lys的表達和純化。通過在含有100μg/ml氨苄青黴素的100ml LB中接種單菌落，在37℃過夜培養該培養物，製備過夜培養物。第二天，在800ml LB氨苄青黴素培養基中稀釋25ml預培養物，並且培養培養物到0.6-0.8 OD600的光密度。然後，用1mM IPTG誘導培養物，並且使其生長另外4小時。基本如上所述，收集細胞並且裂解。
然後，通過用硫酸銨(30％飽和度)首先從澄清的細胞裂解物沉澱蛋白質，然後在凝膠過濾柱子(Sephacryl S-400，Pharmacia)上加樣重溶解的沉澱，純化HBcAg-Lys。用硫酸銨再一次沉澱合併的級分，第二次重溶解沉澱並在相同凝膠過濾柱子上加樣。最後合併和濃縮級分，並且用Bradford試驗(BioRad)估測濃度。
實施例4無自由半胱氨酸殘基但含有插入的賴氨酸殘基的HBcAg的構建利用下面方法，構建這裡稱為HBcAg-lys-2cys-Mut的肝炎核心抗原(HBcAg)，其在對應於SEQ ID NO25中48和107的位置沒有半胱氨酸殘基，但含有插入的賴氨酸殘基。
通過用下面的PCR引物聯合，首先分別擴增如上述實施例2中所述製備的HBcAg-Lys基因的3個片段，以引入兩個突變。利用PCR方法和常規克隆技術製備HBcAg-lys-2cys-Mut基因。簡言之，下列引物用於製備片段1引物1EcoRIHBcAg(s)CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG(SEQ ID NO58)引物248asGTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC(SEQID NO62)
下面引物用於製備片段2引物348sGSGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC(SEQID NO63)引物4107asCTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC(SEQ ID NO64)下面引物用於製備片段3引物5HBcAg149hind-asCGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGC-GTTGATAG(SEQ ID NO65)引物6107sGTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG(SEQ ID NO66)。
然後，用PCR引物EcoRIHBcAg(s)和107as聯合片段1和2以產生片段4。然後用引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg149hind-as聯合片段4和片段3以產生全長基因。然後，用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化全長基因，並且克隆到在相同限制位點切割的pKK載體(Pharmacia)中。如實施例3中所述進行HBcAg-lys-2cys-Mut的表達和純化。
實施例5HBcAg1-185-Lys的構建如實施例2中所述修飾肝炎核心抗原(HBcAg)1-185。用肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO33)通過遺傳方式置換c/e1表位(殘基72到88)區域的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)，產生HBcAg-Lys構建體(SEQID NO26)。所引入的賴氨酸殘基在其側鏈含有反應性氨基，該氨基可以用於HBcAg顆粒與含有自由半胱氨酸基團的任何抗原的分子間化學交聯。PCR方法和常規克隆技術用於製備HBcAg1-185-Lys基因。
如上述實施例2中所述，從pEco63擴增HBcAg基因的兩個單獨的片段，並且隨後通過PCR融合兩個片段以裝配全長基因，從而插入Gly-Gly-Lys-Gly-Gly序列(SEQ ID NO33)。使用下面PCR引物聯合片段1引物1EcoRIHBcAg(s)(SEQ ID NO58)(參見實施例2)引物2Lys-HBcAg(as)(SEQ ID NO59)(參見實施例2)片段2引物3Lys-HBcAg(s)(SEQ ID NO60)(參見實施例2)引物4HBcAgwtHindIIIICGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG(SEQID NO67)裝配引物1EcoRIHBcAg(s)(SEQ ID NO58)(參見實施例2)引物2HBcAgwtHindIIII(SEQ ID NO67)。
然後，用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化裝配的全長基因，並且克隆到在相同限制位點切割的pKK載體(Pharmacia)中。
實施例6HBcAg MIR區域中肽表位的融合用具有序列VNLTWSRASG(SEQ ID NO68)的表位CεH3置換HBcAg1-185殘基79和80。CεH3序列來源於人IgE重鏈第三恆定區的序列。利用裝配PCR方法，將表位插入到HBcAg1-185序列中。在第一PCR步驟中，來源於ATCC克隆pEco63，並且用引物HBcAg-wt EcoRI fwd和引物HBcAg-wt Hind III rev擴增的HBcAg1-185基因用做兩個單獨反應中的模板，以擴增含有編碼CεH3序列的序列元件的兩個片段。然後在第二PCR步驟中，在裝配PCR反應中裝配這兩個片段。
第一PCR步驟中的引物聯合CεH3 fwd和HBcAg-wt Hind III rev，及HBcAg-wt EcoRI fwd和CεH3 rev。在裝配PCR反應中，在沒有外部引物的3輪PCR循環中，首先裝配第一PCR步驟中分離的兩個片段，之後將外部引物添加到反應混合物中進行下面25輪循環。外部引物HBcAg-wt EcoRI fwd和HBcAg-wt Hind III rev。
利用EcoRI和HindIII位點，將PCR產物克隆到pKK223.3中，以在大腸桿菌(E.coli)中表達(參見實施例2)。如實施例2中所述，在大腸桿菌(E.coli)中表達嵌合VLP和純化該嵌合VLP。從凝膠過濾洗脫HBcAg1-185-CεH3的洗脫體積表明融合蛋白和嵌合VLP實現裝配。
引物序列CεH3fwd5′GTT AAC TTG ACC TGG TCT CGT GCT TCT GGT GCA TCC AGG GAT CTA GTA GTC 3′(SEQ ID NO69)V N L T W S R A S G A80 S R D L V V86(SEQ ID NO70)CεH3rev5′ACC AGA AGC ACG AGA CCA GGT CAA GTT AAC ATC TTC CAA ATT ATT ACC CAC 3′(SEQ ID NO71)D78 E L N N G V72(SEQ ID NO72)HBcAg-wt EcoRI fwd5』CCGgaattcATGGACATTGACCCTTATAAAG(SEQ ID NO73)HBcAg-wt Hind III rev5』CGCGTCCCaagcttCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG(SEQ ID NO74)實施例7HBcAg MIR區域中Aβ1-6肽的融合用Aβ1-6肽序列DAEFRH(SEQ ID NO75)或DAEFGH(SEQ ID NO76)置換HBcAg1-185的殘基79和80。利用實施例6中所述相同的策略設計兩個重疊引物，並且通過裝配PCR構建融合蛋白質。將PCR產物克隆到pKK223.3載體中，並且在大腸桿菌(E.coli)K802中表達。如實施例3中所述表達嵌合VLP，並且純化該嵌合VLP。
實施例8Aβ1-6肽與在CP延伸的位置19截短的Qβ A1蛋白質的C末端融合在使用pQβ10做為模板的PCR反應中，使用在Qβ A1基因5』末端退火的引物和在A1基因3』末端退火的引物，並且該引物還包含編碼具有序列DAEFRH(SEQ ID NO75)或DAEFGH(SEQ ID NO76)的Aβ1-6肽的序列元件。PCR產物克隆到pQβ10(Kozlovska T.M.等，Gene 137133-37(1993))中，並且如實施例1中所述表達和純化嵌合VLP。
實施例9在fr外殼蛋白的位置2和3之間插入Aβ1-6肽通過標準分子生物學技術，在pFrd8載體(Pushko，P.et al.，Prot.Eng.6883-91(1993))的Bsp119I位點中插入互補引物，所述互補引物編碼具有DAEFRH(SEQ ID NO75)或DAEFGH(SEQ ID NO76)的Aβ1-6肽序列，並且含有Bsp119I匹配末端及能引起讀框內插入的另外核苷酸。做為可替代方案，用Bsp119I消化後，用Klenow補平pFrd8載體的突出端，並且在Klenow處理後，在pFrd8中連接編碼Aβ1-6肽序列的寡核苷酸和用於符合讀框克隆的另外核苷酸。通過測序分析具有正確方向插入片段的克隆。如Pushko，P.等，Prot.Eng.6883-91(1993)中所述進行大腸桿菌JM109或大腸桿菌K802中嵌合融合蛋白的表達和純化，但是用SepharoseCL-4B或Sephacryl S-400(Pharmacia)柱子進行層析步驟。與實施例1中所述用於Qβ的方法相似，用硫酸銨沉澱細胞裂解物，並且通過兩個連續的凝膠過濾純化步驟純化。
實施例10在載體pOGS8111中於Ty1蛋白質p1的位置67和68之間插入Aβ1-6肽合成編碼序列DAEFRH(SEQ ID NO75)或DAEFGH(SEQ ID NO76)的Aβ1-6肽的兩個互補寡核苷酸，該寡核苷酸末端與pOGS8111的NheI位點匹配。根據EP 677』111的描述，添加另外核苷酸以允許編碼Aβ1-6肽的序列以符合讀框的方式插入。由pOGS8111的TyA(d)基因中寡核苷酸插入造成的改變的NheI位點編碼位於插入表位側翼的胺基酸AS和SS。
如EP0677111和其中參考文獻中所述，將pOGS8111轉化到釀酒酵母(S.cervisiae)株系MC2中用於嵌合Ty VLP的表達。如EP 677』111中所述，通過蔗糖梯度超離心純化嵌合Ty VLP。
實施例11Aβ1-6肽插入到乳頭瘤病毒1型(BPV-1)的主要衣殼蛋白L1中如所述(Chackerian，B.等，Proc.Natl.Acad.USA 962373-2378(1999))，用編碼具有序列DAEFRH(SEQ ID NO75)或DAEFGH(SEQID NO76)的Aβ1-6肽的序列置換pFastBac1(GIBCO/BRL)載體中克隆的BPV-1 L1基因胺基酸130-136的編碼序列。通過核苷酸序列分析證實構建體序列。如製造商所述，利用GIBCO/BRL杆狀病毒系統產生重組杆狀病毒。如Kirnbauer，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.8912180-84(1992)和Greenstone，H.L.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.951800-05(1998)所述，從杆狀病毒感染的Sf9細胞純化嵌合VLP。
實施例12用融合VLP的Aβ1-6肽免疫小鼠如實施例13和14中所述，使用實施例7-11中產生的展示序列DAEFRH(SEQ ID NO75)或DAEFGH(SEQ ID NO76)的Aβ1-6肽的嵌合VLP，免疫人轉基因APP小鼠或C57/BL6小鼠。如實施例13中所述，在Aβ1-6肽或Aβ1-40肽或Aβ1-42肽特異的ELISA中分析從免疫小鼠獲得的血清。
如實施例14中所述，通過免疫一大組人APP轉基因小鼠檢查疫苗的保護作用。
實施例13Aβ1-6肽和Qβ VLP的偶聯(QβAβ1-6)，及用QβAβ1-6免疫小鼠A.Aβ1-6肽和Qβ VLP的偶聯化學合成Aβ1-6肽(序列NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(SEQ ID NO77)；開始的NH2基團表示該肽具有自由N末端，並且末端NH2基團表示該肽具有醯胺化的羧基末端。如實施例1中所述，表達和純化Qβ VLP。在室溫(RT)下，在20mM Hepes，150mM NaCl，pH 8.2(HBS，pH 8.2)中使Qβ VLP以2mg/ml濃度(Bradford測定法中測定的)與1.43mMSMPH(Pierce，Rockford IL)(自DMSO中的母液稀釋)反應30分鐘。然後，在4℃，用HBS，pH 8.2緩衝液透析該反應混合物，並且與反應混合物中稀釋的0.36mM Aβ1-6肽(來自DMSO中的50mM母液)反應。在15℃，使偶聯反應進行2小時，並且用pH 8.2的1000倍體積HBS透析反應混合物2×2小時，並且在液氮中等份急驟冷凍，在使用前在-80℃貯藏。
融解等份試樣，並且通過SDS-PAGE估測Aβ1-6肽與Qβ VLP亞單位的偶聯，並且在Bradford測定法中測定蛋白質濃度。圖1中示出了偶聯反應的結果。
圖1表示Aβ1-6肽與Qβ VLP偶聯反應的SDS-PAGE分析。在16％Tris甘氨酸凝膠上，在還原條件下，對樣品進行電泳，用考馬斯亮藍染色。泳道1是蛋白質標記，在凝膠左側邊界標出了相應的分子量；泳道2，衍生的Qβ VLP蛋白質；泳道3，Qβ VLP蛋白質與Aβ1-6肽偶聯反應的上清液；泳道4，Qβ VLP蛋白質與Aβ1-6肽偶聯反應的沉澱；在圖中，用箭頭指示對應於每個單體偶聯1，2和3個肽的偶聯產物。平均每個亞單位偶聯1.5以上的個肽；幾乎沒有亞單位沒有被偶聯。
B.用偶聯Qβ VLP的Aβ1-6肽免疫小鼠和免疫應答分析在第0和14天，在小鼠(3隻小鼠)中皮下注射偶聯Aβ1-6肽的Qβ VLP(這裡命名為Qb-Ab-1-6)。如上所述，使Aβ1-6肽偶聯Qβ VLP蛋白質。用在PBS中稀釋到200μl的10μg疫苗免疫每隻小鼠(C57BL/6)。在21天，從小鼠眼眶後取血，並且在抗Aβ1-6肽的ELISA中測定對Aβ1-6肽特異的抗體效價。利用化學交聯劑磺基-SPDP，Aβ1-6肽偶聯牛RNAase A。用偶聯的RNAase製備物，以10μg/ml濃度包被ELISA板。封閉該板，然後與系列稀釋的小鼠血清溫育。用酶促標記的抗小鼠IgG抗體檢測結合的抗體。做為對照，也檢測了相同小鼠的免疫前血清。結果如圖2中所示。
圖2表示在用偶聯Qβ VLP的Aβ1-6肽免疫的小鼠的血清中，針對Aβ1-6肽特異性IgG抗體的ELISA分析。結果表示免疫的3隻小鼠(A1-A3)，在圖中免疫前血清表示為「Pre」；示出了一個免疫前血清的結果。免疫前血清和用「Qb-Ab-1-6」免疫的小鼠血清的比較表明，在沒有佐劑情況下，可以獲得抗肽Aβ1-6的強特異性抗體應答。C.抗Aβ1-40肽的ELISA在DMSO中製備人Aβ1-40或Aβ1-42肽母液，並且使用前，在包被緩衝液中稀釋該母液。用0.1μg/孔Aβ1-40肽包被ELISA板。封閉該板，然後與上述獲得小鼠血清的系列稀釋物溫育。用酶學標記的抗小鼠IgG抗體檢測結合的抗體。做為對照，也包括接種前獲得的血清。計算表現出高於基線平均3個標準偏差的血清稀釋度，並且定義為「ELISA效價」。在免疫前血清中沒有檢測到特異性抗體。針對3隻小鼠獲得的效價是1∶100000，表明抗Aβ1-40的強特異性免疫應答。因此，用偶聯Qβ VLP的Aβ1-6肽免疫可以激發與Aβ1-40交叉反應的強抗體效價。
圖3表示ELISA結果。針對用如上所述偶聯Qβ VLP的Aβ1-6肽免疫的3隻小鼠(A1-A3)的血清，獲得以405nm光密度表示的ELISA信號，針對X軸上表示的每個稀釋度對該信號繪圖。示出了於21天取血時，來自3隻小鼠的結果。也包括免疫前的血清。如上所述檢測血清中抗體的效價，所有3隻小鼠的效價均是1∶100000。
實施例14人APP轉基因小鼠的免疫帶有人APP轉基因的8月齡雌性APP23小鼠(Sturchler-Pierrat等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413287-13292(1997))用於接種。用在無菌PBS中稀釋的25μg疫苗皮下注射小鼠，並且14天後，用相同量的疫苗加強免疫。在開始免疫前和加強免疫注射後7天，從小鼠尾靜脈取血。如實施例13中所述，通過ELISA，分析血清中對Aβ1-6、Aβ1-40和Aβ1-42特異的抗體的存在。
實施例15鼠Aβ1-6肽與Qβ VLP的偶聯，小鼠中疫苗的注射，和免疫應答的分析化學合成鼠Aβ1-6肽(序列NH2-DAEFGHGGC-CONH2)(SEQ IDNO78)，並且用於如實施例13中所述偶聯Qβ VLP。在C57BL/6小鼠中注射疫苗，測定激發的抗鼠Aβ1-6、鼠Aβ1-40和鼠Aβ1-42的抗體的效價。如實施例13中所述進行免疫和ELISA測定。
實施例16激發的抗Aβ1-6的血清與人APP轉基因小鼠斑塊和AD斑塊的結合大腦切片中的免疫組織化學18月齡雜合APP23小鼠的連續石蠟大腦切片和來源於Braak III期AD患者的entorhinalcortex切片(Institute of Pathology，University Basel)用於染色。通過用濃甲酸處理人大腦切片5分鐘，和在90℃用微波加熱小鼠大腦切片3分鐘，以增強抗原性。在具有3％山羊血清的PBS中以1∶1000稀釋抗人Aβ1-6激發的小鼠血清(如實施例13中所述獲得)，並且溫育過夜。漂洗後，用在PBS中以1∶200稀釋的生物素醯化抗小鼠第二抗體溫育切片1小時。漂洗後，用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶技術(ABC-Elite Kit PK6100；Vector Laboratories)進一步處理切片。最後，切片與二氨基聯苯胺(DAB)金屬加強的底物(Boehringer，Code 1718096)反應，用蘇木精明礬對染，脫水，在二甲苯中透明並蓋上蓋玻片。
在圖4A和B中示出了組織學染色的結果。用經偶聯Qβ VLP的人類Aβ1-6免疫的3隻小鼠的血清染色切片。每種血清都陽性染色來源於轉基因小鼠和AD的澱粉樣斑塊。示出了3種血清之一種的結果。抗人類Aβ1-6激發的血清明顯地染色了轉基因人APP23小鼠的澱粉樣斑塊，及來源於AD患者的澱粉樣斑塊。免疫前的血清是陰性的。抗體染色細胞外澱粉樣斑塊和分離的血管。
實施例1 7通過小鼠斑塊組織學評價抗人類Aβ1-6激發的血清的特異性腦切片的免疫組織化學用如實施例13中所述抗人類Aβ1-6激發的代表性小鼠血清，或者用對鼠或人APP的最後20個胺基酸具特異性並且因此不識別Aβ的兔多克隆抗體，如實施例16中所述染色超表達人類APP的3月齡和18月齡雜合APP23小鼠的連續石蠟腦切片。除了使用生物素醯化的抗兔第二抗體(BA1000，Vector Laboratories)外，如實施例16中所述，處理與兔多克隆抗體溫育的切片。
在圖5A，B，C，D和E上示出了組織學染色的結果。標記在切片左下部的Aβ1-6表示抗Aβ1-6激發的血清已經被用於染色，而「Pab」表示切片已經用對鼠或人類APP最後20個胺基酸(對應於APP695中位置676-695)特異的多克隆抗體染色。
對來源於18月齡小鼠的切片的染色比較(圖5A和C)，表明抗Aβ1-6激發的血清不與大腦中表達的APP交叉反應，但是APP被對照多克隆抗體染色。圖5B表示來源於3月齡小鼠(在沒有觀察到澱粉狀蛋白沉積的時間點)的大腦切片被對APP特異的多克隆抗體染色。圖5D和5E分別表示圖5A和圖5B中的海馬CA1錐體層的放大圖。
實施例18A.Aβ1-6肽和fr衣殼蛋白的偶聯在25℃，在搖擺振蕩器上，20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的120μM fr衣殼蛋白溶液與從DMSO中母液稀釋的10倍摩爾過量的SMPH(Pierce)反應30分鐘。隨後，在4℃，利用1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析反應溶液2次2小時。然後，在16℃，在搖擺振蕩器上，透析的fr反應混合物與5倍摩爾過量的Aβ1-6肽(序列NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(SEQ ID NO77)反應2小時。通過SDS-PAGE分析偶聯產物。
B.Aβ 1-6肽和HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶聯在25℃，在搖擺振蕩器上，20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的1ml 120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut溶液與從DMSO中母液稀釋的10倍摩爾過量的SMPH(Pierce)反應30分鐘。隨後，在4℃，利用1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析反應溶液2次2小時。然後，在16℃，在搖擺振蕩器上，透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反應混合物與5倍摩爾過量的Aβ1-6肽(序列NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(SEQ ID NO77)反應2小時。通過SDS-PAGE分析偶聯產物。
C.Aβ1-6肽和菌毛的偶聯在室溫，在搖擺振蕩器上，20mM Hepes，pH 7.4中的125μM1型大腸桿菌菌毛溶液與50倍摩爾過量的交聯劑SMPH(Pierce)(從DMSO中的母液稀釋)反應60分鐘。在PD-10柱子(Amersham-Pharmacia Biotech)上使反應混合物脫鹽。合併從柱子上洗脫的含有蛋白質的級分，並且在16℃，在搖擺振蕩器上，使脫鹽並衍生化的菌毛蛋白質與5倍摩爾過量的Aβ1-6肽(序列NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(SEQ ID NO77)反應2小時。通過SDS-PAGE分析偶聯產物。
D.用偶聯fr衣殼蛋白、HBcAg-Lys-2cys-Mut或菌毛的Aβ1-6肽免疫小鼠在第0和14天，在小鼠(3隻小鼠)中皮下注射上述偶聯fr衣殼蛋白、HBcAg-Lys-2cys-Mut或菌毛的Aβ1-6肽。用在PBS中稀釋到200μ1的10μg疫苗免疫每隻小鼠(C57BL/6)。在第21天從小鼠眼眶後取血，並且如實施例13中所述通過ELISA測定對Aβ1-6肽或Aβ1-40或Aβ1-42特異的抗體的效價。
實施例19用Qβh Aβ1-6免疫恆河猴因為人類和恆河猴之間Aβ序列相同，所以為了檢測在Aβ1-6是自身抗原的情況下基於人類Aβ1-6肽的疫苗對於抗人類Aβ抗體的誘導，用Qβh Aβ1-6免疫恆河猴。如實施例13中所述製備Qβh Aβ1-6疫苗。在0天，用50μg疫苗免疫10至15步齡的4隻恆河猴，並且在28和56天，用25μg疫苗加強免疫2次。背部皮下免疫猴子。在0天(取血前)、42天和70天從動物取血。從頭前臂靜脈(V.cephalica antebrachii)收集4ml血液。通過基本如實施例13中所述的ELISA，利用對猴子IgG特異的第二抗體，測定對Aβ1-40特異的抗體的效價。
因為人類和恆河猴共有相同的Aβ序列，所以恆河猴中對Aβ1-40特異的高效價抗體的產生表明用偶聯Qβ的hAβ1-6免疫打破了對自身抗原Aβ的耐受性。而且，在靈長類中，用偶聯的Aβ1-6片段可以產生識別全長Aβ的抗體。
圖6中示出了ELISA結果。圖中所示的是在用QβhAβ1-6免疫的4隻猴子(1-4)血清中測定的Aβ1-40特異性抗體的效價和該4隻猴子的平均效價。效價表示為OD50效價。OD50是信號達到最大信號值一半時的抗體稀釋度。從來源於用QβhAβ1-27免疫的猴子並識別Aβ1-40的參照血清獲得最大值(OD最大值)，並且該最大值是在相同ELISA平板上測定的。
在第97，110，117，124，138，143，152，159，166天，從兩隻猴子(上述)取血，並且在110天，用25μg疫苗進行第三次加強免疫。合併血清(99ml)，並且用於Aβ1-6特異性抗體的親和純化。這些抗體以1.5μg/ml濃度用於免疫組織化學染色，並且生物素醯化的第二抗猴子抗體用於檢測。18月齡雜合APP23小鼠和Braak III期AD患者的石蠟腦切片用於染色。在APP23小鼠腦切片中和AD患者腦切片中均觀察到斑塊特異性染色(圖7)。
圖7A和B中示出了組織學分析的結果。圖7A中所示的是用上述對Aβ1-6特異的親和純化抗血清染色人APP轉基因小鼠斑塊(APP23株系)。圖7B表示用相同的純化抗血清染色人類AD斑塊。在兩種情況下，都使用1.5μg/ml濃度的純化抗血清。兩圖上均以箭頭指示典型斑塊。
實施例20鼠Aβ1-6與AP205 VLP的偶聯，小鼠的免疫和免疫應答的分析A.鼠Aβ1-6肽與AP205 VLP的偶聯化學合成鼠Aβ1-6肽(mAβ1-6，序列NH2-DAEFGHGGC-CONH2(SEQ ID NO78)；開始的NH2基團表示該肽具有自由N末端，並且末端NH2基團表示該肽具有醯胺化的羧基末端)。在室溫下，20mM Hepes，150mM NaCl，pH 8.0(HBS，pH 8.0)中(如實施例1中表達和純化的)AP205VLP以(在Bradford測定法中測定的)2mg/ml濃度與從DMSO中100mM母液稀釋的2.86mM SMPH(Pierce，Rockford IL)反應30分鐘。然後，在4℃，用pH 7.4的1000倍體積HBS透析反應混合物2次2小時；在液氮中急驟冷凍所得到的經透析和衍生化的AP205 VLP，並且在-20℃過夜貯藏。用1體積pH 7.4，20mM HBS稀釋衍生的AP205 VLP，並且在15℃，在振蕩條件下與反應混合物中稀釋的719μM mAβ1-6肽(來源於DMSO中的50mM母液)反應2小時。用pH 7.4，1000倍體積HBS透析偶聯反應物2次2小時，並且過夜。在液氮中急驟冷凍等分的透析的反應混合物，在使用前，在-80℃貯藏。
融解等份試樣，並且通過SDS-PAGE估測mAβ1-6肽與AP205 VLP亞單位的偶聯，並且在Bradford測定法中測定蛋白質濃度。圖8中示出了偶聯反應的結果。
圖8表示mAβ1-6肽與AP205 VLP偶聯反應的SDS-PAGE分析。在16％Tris甘氨酸凝膠上，在還原條件下，對樣品進行電泳，並且用考馬斯亮藍染色。泳道1是蛋白質標記，在凝膠左側邊界標出了相應的分子量；泳道2，AP205 VLP蛋白質；泳道3，衍生的AP205 VLP；泳道4，AP205VLP與mAβ1-6肽偶聯反應的上清液；泳道5，AP205 VLP與mAβ1-6肽偶聯反應的沉澱。在凝膠上沒有檢測到未偶聯的AP205 VLP亞單位，而觀察到了對應於每個亞單位幾個肽的條帶，證明了非常高的偶聯效率。特別地，每個AP205 VLP亞單位具有遠多於一個的Aβ1-6肽。
B.用偶聯AP205 VLP的mAβ1-6肽免疫小鼠和免疫應答分析在0和14天，在小鼠(3隻小鼠)中皮下注射偶聯mAβ1-6肽的AP205VLP。如上所述，mAβ1-6肽偶聯AP205 VLP。用在PBS中稀釋到200μl的25μg疫苗免疫每隻小鼠(C57BL/6)。在21天，從小鼠眼眶後取血，並且在抗mAβ1-6肽的ELISA中測定對mAβ1-6肽特異的抗體的效價。利用化學交聯劑磺基-SPDP，mAβ1-6肽偶聯牛RNAse A。用RNAse-mAβ1-6製備物，以10μg/ml濃度包被ELISA板。封閉該板，然後與系列稀釋的小鼠血清溫育。用酶學標記的抗小鼠IgG抗體檢測結合的抗體。做為對照，也檢測了相同小鼠的免疫前血清。結果如圖9中所示。
圖9表示在用偶聯AP205 VLP的mAβ1-6肽免疫的小鼠的血清中，針對mAβ1-6肽特異性IgG抗體的ELISA分析。結果表示在第21天(A1d21-A3d21)收集的3隻免疫小鼠的血清，在圖中免疫前血清表示為「Pre imm」；示出了一個免疫前血清的結果。免疫前血清和用偶聯AP205VLP的mAβ1-6免疫的小鼠血清比較，表明在沒有佐劑情況下，抗自身抗原肽mAβ1-6可以獲得強特異性抗體應答。而且，自身肽與AP205VLP偶聯可以破壞對該肽的耐受性，並且引起非常高的特異性免疫應答。因此，AP205 VLP適於在沒有佐劑的情況下產生抗Aβ肽的高抗體效價。
實施例21用QβhAβ1-6免疫減少了超表達「Swedish/London」突變澱粉樣前體蛋白質的轉基因小鼠中的澱粉樣斑塊該實施例證明在發展有阿爾茨海默氏病樣彌散性(剛果紅陰性)澱粉樣斑塊的小鼠模型中，用QβhAβ1-6免疫在新皮層和皮層下大腦區域中引起了斑塊密度的大幅度減少。彌散性澱粉樣斑塊的組織學出現是AD大腦病理學的顯著特徵(Selkoe，1994，Annu.Rev.Neurosci.17489-517)，因此，該實施例證明了用QβhAβ1-6免疫提供了阿爾茨海默氏病治療的有效方法。
為了評估用Qβ-Aβ1-6免疫的治療效果，使用在小鼠Thy-1啟動子控制下超表達「Swedish/London」突變澱粉樣前體蛋白質的轉基因小鼠(APP24；K670N/M671 L；V717I，專利號.WO980-36-4423)。該小鼠株系的特徵在於在18月齡時，在新皮質、海馬、尾狀核及殼核和丘腦中有大量澱粉樣斑塊。在9月齡時可以首先觀察到斑塊。組織學上，APP24小鼠中澱粉樣斑塊主要是彌散型的，即，它們為剛果紅染色陰性的。較少地，也可以發現緊密的澱粉樣斑塊(剛果紅陽性)。
如實施例13中所述，製備偶聯Qβ VLP的人Aβ1-6肽(QβhAβ1-6)。根據下面實驗方法(這些方法對於描述和實現本發明不是必須的)，在0天，用磷酸緩衝鹽溶液(PBS)中的25μg QβhAβ1-6(每隻小鼠給藥2×100μl)(n＝16)，或者做為陰性對照用PBS(每隻小鼠給藥2×100μl)(n＝9)，或者用無偶聯抗原的Qβ病毒樣顆粒(n＝11)，皮下注射9.5月齡APP24轉基因小鼠。隨後，在第15，49，76，106，140，169，200，230，259和291天，給小鼠注射25μg QβhAβ1-6疫苗、Qβ或PBS。在第一次免疫前(0天)1-2天和在第56，90，118，188，214，246和272天，通過尾靜脈從動物取血。在305天也收集血清，在這時也收集大腦用於組織病理學檢查(在該時間點，小鼠年齡19.5個月)。
基本如實施例13中所述，通過ELISA測定對Aβ1-40特異的抗體效價。在圖10中示出了ELISA的結果。圖中所示的是在用QβhAβ1-6免疫的小鼠血清中測定的Aβ1-40或Aβ1-42特異性抗體的效價。該效價表示為OD50％效價。OD50％是信號達到其最大值一半時的抗體稀釋度。從在相同ELISA平板上測定的識別Aβ1-40和Aβ1-42的參照抗體獲得最大值(OD最大值)。所有QβhAβ1-6免疫的小鼠都有1∶8000以上的OD50％效價(免疫前血清效價低於1∶100)，證明了甚至在老齡APP24小鼠中也出現對QβhAβ1-6一致的抗體應答(圖10)。在整個免疫期間，免疫組中，中值OD50％效價是1∶20』000到1∶50』000。
為了定量澱粉樣斑塊，在4℃，在0.1M PBS中的4％甲醛中浸沒來固定大腦。用乙醇脫水後，大腦被包埋在石蠟中，並且用切片機徑向切成4μm厚度的切片。將切片置於超冷凍的載玻片上，並且在37℃乾燥。在PBS中洗切片，並且通過在90℃，0.1M檸檬酸緩衝液中微波加熱3分鐘加強抗原性。在PBS中，用3％山羊血清以1∶1000稀釋NT11抗血清(抗Aβ1-40，Sturchler-Pierrat等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.9413287-13292)，並且在4℃溫育過夜。漂洗後，用在PBS中以1∶200稀釋的生物素醯化抗兔IgG第二抗體(BA1000，Vector Laboratories)溫育切片1小時。漂洗後，用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶技術(ABC-Elite KitPK6100；Vector Laboratories)進一步處理切片。最後，切片與二氨基聯苯胺(DAB)金屬加強的底物(Boehringer，Code 1718096)反應，用蘇木精明礬復染，脫水，在二甲苯中透明和蓋上蓋玻片。每個動物3個不同解剖平面的系統-隨機系列大腦切片用於分析。利用MCID圖像分析儀(ImagingResearch，Brock University，Ontario-Canada，Program Version M5 elite)定量澱粉樣斑塊。通過利用Xillix黑白CCD TV照相機數位化該顯微圖像，並且以256灰度，以640480像素解析度存儲。利用物鏡測微計(LeicaNeoplan Obiective)，以5×放大倍數校準該像素大小。利用用於鄰近物場精確定位的電動機驅動的顯微鏡載物臺，分析每個切片的整個新皮層和嗅核。對於每個物場，用人工輪廓限定解剖面積。對於每個單獨的切片，用免疫陽性澱粉樣斑塊和組織背景之間的人工閾值設定(灰度水平)限定樣品面積。通過人工輪廓排除分離的組織假象。原始數據測定為單獨的計數(澱粉樣沉積物)和成比例的面積值(免疫陽性澱粉樣斑/皮層或嗅核)。
每隻小鼠的數據被標準化為每mm2的沉積物(斑塊)數量，和按整個新皮層的百分數計的總斑塊面積。與PBS或Qβ注射的對照組比較，QβhAβ1-6免疫的小鼠顯示了在皮層和皮層下區域中顯著減少的澱粉樣沉積物(圖11)。在皮層、尾狀核及殼核、海馬和丘腦中，與PBS組比較，沉積物的中值數量和總斑塊面積均高度顯著地減少了80％-98％(p＜0.001，與PBS組比較，Mann-Whitney檢測；圖12)。
在第二項研究中，在0天，用磷酸緩衝鹽溶液(PBS)中的25μgQβhAβ1-6(每隻小鼠給藥2×100μl)(n＝15)，或者做為陰性對照用PBS(每隻小鼠給藥2×100μl)(n＝15)皮下注射13.5月齡APP24轉基因小鼠。隨後，在16，46，76，109，140和170天，給小鼠注射25 μg QβhAβ1-6疫苗或PBS。在第一次免疫(0天)前1-2天，和在31，59，128和154天，通過尾靜脈從動物取血。在184天，也收集血清，在該時間點也收集大腦用於組織病理學檢查(該時間點小鼠的年齡19.5個月)。如上所述測定和表示對Aβ1-40特異的抗體效價，並且再一次發現所有免疫的小鼠對QβhAβ1-6免疫產生應答，具有至少1∶2000以上的OD50％效價(未示出)。整個免疫期間，中值OD50％效價是1∶10』000到1∶50』000。如上所述進行澱粉樣沉積物的定量。與較早(即，在9.5月齡)起始免疫的實驗比較，新皮層中斑塊沉積物數量(-55％)和面積(-32％)的減少不太劇烈，但是仍舊非常明顯(圖13)並且有高度的顯著性(p＞0.001，與PBS比較，Mann-Whitney檢測)。在QβhAβ1-6免疫組中，在皮層下的區域中，斑塊沉積物數量和面積減少了60-90％。與皮層比較，這些區域中更顯著的效果可能與這些區域中更長的斑塊形成時間有關。
總之，這兩個實驗證明了在超表達「Swedish/London」突變澱粉樣前體蛋白質的轉基因小鼠中，QβhAβ1-6免疫急劇地減少了這些小鼠中澱粉樣沉積物的出現。
圖10超表達「Swedish/London」突變澱粉樣前體蛋白質的轉基因小鼠中血清抗Aβ40/42抗體效價(OD50％)。用QβhAβ1-6免疫9.5和19個月齡之間的小鼠。所示的是個體值(黑點)和框圖，其中框的兩端定義第25個和第75個百分點，並示出中值處的線條和定義第10個和第90個百分點的誤差線(框外值以點表示)。
圖11在徑向大腦切片中澱粉樣斑塊的免疫組織化學染色。圖中所示是用Qβ(A)或QβhAβ1-6(B)疫苗免疫的超表達「Swedish/London」突變澱粉樣前體蛋白質的轉基因小鼠的徑向大腦切片。
圖12在9.5至19月齡免疫後，超表達「Swedish/London」突變澱粉樣前體蛋白質的轉基因小鼠中斑塊沉積的定量。(A)皮層斑塊密度。(B)皮層斑塊面積。(C)尾狀核殼核中斑塊密度。(D)尾狀核殼核中斑塊面積。(E)海馬中斑塊密度。(F)海馬中斑塊面積。(G)丘腦中斑塊密度。(H)丘腦中斑塊面積。斑塊密度表示為斑塊/mm2，斑塊面積表示為β澱粉狀蛋白覆蓋的組織面積的百分比。數據以個體值(黑點)及框圖表示。框兩端定義第25個和第75個百分點，並示出中值處的線條和定義第10個和第90個百分點的誤差線。**p＜0.001(Mann Whitney Rank Sum檢測)。PBS，n＝9，Qβ，n＝11，QβhAβ1-6，n＝16。
實施例22用QβhAβ1-6免疫減少了超表達「Swedish」突變體澱粉樣前體蛋白質的轉基因小鼠中的澱粉樣斑塊該實施例證明了甚至在非常晚的澱粉樣斑塊病理學階段起始免疫，用QβhAβ1-6免疫也提供了阿爾茨海默氏病治療的有效方法。在該實施例中使用的AD小鼠模型中澱粉樣斑塊沉積過程在大約6個月齡就已經開始了(Sturchler-Pierrat等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.9413287-13292)。在這裡所述研究中，在18個月齡開始用QβhAβ1-6免疫，這時在皮層中已經形成了高數量的緊密斑塊。該實施例也證明了在非常年老的動物中，QβhAβ1-6也可以誘導Aβ40/42抗體(在19隻免疫小鼠中沒有未應答者)。
為了評估QβhAβ1-6免疫的治療效果，使用超表達「Swedish」突變澱粉樣前體蛋白質的轉基因小鼠(APP23；K670N/M671L，Sturchler-Pierrat等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.9413287-13292)。在這些小鼠中已充分地表徵了阿爾茨海默氏病樣病理學(Calhoun等，1998，Nature 395755-756；Phinney等，1999，J.Neurosci.198552-8559；Bondolfi等，2002，J.Neurosci.22515-522)。
如實施例13中所述製備偶聯Qβ VLP的人Aβ1-6肽(QβhAβ1-6)。根據下面實驗方法(這些方法對描述和實施本發明不是必須的)，在0天，用磷酸緩衝鹽水中溶解的25μg QβhAβ1-6(每隻小鼠給藥2×100μl)(n＝19)，或者做為陰性對照用磷酸緩衝鹽水(n＝17)，皮下注射18個月齡APP23轉基因小鼠，並且在13，27-34，61-63，90-96和123-130天，用25μg疫苗加強免疫。在第一次免疫(0天)前1-2天和在第41-45天和68天，通過尾靜脈從動物取血。也在152-154天收集血清，在該時間點也收集大腦用於組織病理學檢查(該時間點的小鼠年齡23個月)。
基本如實施例13中所述，通過ELISA測定對Aβ1-40特異的抗體效價，並且如實施例21中所述表示結果。在圖14中示出了ELISA結果。所有QβhAβ1-6免疫的小鼠都有1∶2000以上OD50％效價(免疫前血清效價低於1∶100)，證明了即使在非常年老的小鼠中對Qβ-Aβ1-6仍有一致的抗體應答(圖14)。整個免疫期間，中值OD50％效價是1∶9』000到1∶20』000。
如實施例21中所述進行澱粉樣斑塊的定量。每隻小鼠的數據被標準化為每mm2沉積物(斑塊)的數量和以整個新皮層的％表示的總斑塊面積。QβhAβ1-6免疫的小鼠在皮層中顯示了更少數量的沉積物(圖15，圖16)，這主要由於小體積的斑塊的減少所致。與未免疫組比較，QμhAβ1-6免疫組中中值等斑塊數量減少33％(p＜0.001，與PBS組比較，Mann-Whitney檢測)。因為主要是小體積的斑塊受影響，所以總斑塊面積的減少是中等的，達到10％(p＜0.01，與PBS組比較，Mann-Whitney檢測)。
圖14超表達「Swedish」突變澱粉樣前體蛋白質的轉基因小鼠中血清抗Aβ40/42抗體效價(OD50％)。用QβhAβ1-6免疫18至23月齡的小鼠。所示的是個體值(黑點)和框圖，其中框兩端定義了第25個和75個百分點，並示出中值處的線條和定義第10個和第90個百分點的誤差線(框外以點表示)。
圖15徑向大腦切片中澱粉樣斑塊的免疫組織化學染色。箭頭指向小體積的沉積物。圖中所示的是來源於用PBS(A)或Qβ-Aβ1-6(B)免疫的超表達「Swedish」突變澱粉樣前體蛋白質的轉基因小鼠的徑向大腦切片。
圖16在18至23個月齡免疫後，超表達「Swedish」突變澱粉樣前體蛋白質的轉基因小鼠中斑塊沉積的定量。(A)皮層斑塊密度。(B)皮層斑塊面積。斑塊密度表示為斑塊/mm2，斑塊面積表示為β澱粉狀蛋白覆蓋的組織面積的百分比。數據表示為個體值(黑點)和框圖。框兩端定義了第25個和75個百分點，並示出中值處的線條和定義第10個和第90個百分點的誤差線。**p＜0.001(Mann Whitney Rank Sum檢測)。PBS，n＝17，QβhAβ1-6，n＝19。
為了清楚地理解本發明的目的，現在已經通過示例和實施例的方式完整地以一定的詳細程度描述了本發明，本領域普通技術人員顯而易見可以通過在廣泛等同的條件、製劑和其它參數範圍內修改或改變本發明而實施本發明，而不影響本發明的範圍和其任何具體實施方式
，並且所附權利要求的範圍意欲包括這些修改或改變。
本說明書中提到的所有公開出版物、專利和專利申請指示了本發明所屬領域的技術人員的水平，並且在這裡將它們併入為參考文獻，就如同具體和單獨地指明每篇單獨的公開出版物，專利或專利申請併入為參考文獻一樣。
序列表110希託斯生物技術股份公司(Cytos Biotechnology AG)諾瓦提斯醫藥股份公司(Novartis Pharma AG)120含有澱粉樣β1-6抗原陣列的疫苗組合物130PA041WO150US 60/396,6391512002-07-19150US 60/470,4321512003-05-1516093170PatentIn version 3.22101211172212PRT213大腸桿菌(Escherichia coli)4001Met Ala Val Val Ser Phe Gly Val Asn Ala Ala Pro Thr Thr Pro Gln1 5 10 15Gly Gln Gly Arg Val Thr Phe Asn Gly Thr Val Val Asp Ala Pro Cys20 25 30Ser Ile Ser Gln Lys Ser Ala Asp Gln Ser Ile Asp Phe Gly Gln Leu35 40 45Ser Lys Ser Phe Leu Ala Asn Asp Gly Gln Ser Lys Pro Met Asn Leu50 55 60Asp Ile Glu Leu Val Asn Cys Asp Ile Thr Ala Phe Lys Asn Gly Asn65 70 75 80Ala Lys Thr Gly Ser Val Lys Leu Ala Phe Thr Gly Pro Thr Val Ser85 90 95Gly His Pro Ser Glu Leu Ala Thr Asn Gly Gly Pro Gly Thr Ala Ile100 105 110Met Ile Gln Ala Ala Gly Lys Asn Val Pro Phe Asp Gly Thr Glu Gly115 120 125
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agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc3060tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc3120agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt3180cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc3240gctcgccgca gccgaacgac gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc3300caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtggtgtca3360tggtcggtga tcgccagggt gccgacgcgc atctcgactg catggtgcac caatgcttct3420ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggccgtgca ggtcgtaaat cactgcataa3480ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac3540ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agttaactag3600tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgcg gaatt 363521028211131212PRT213噬菌體AP20540028Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110
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220
223質粒pAP281-3240030cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga 60gctcgcccgg ggatcctcta gattaaccca acgcgtagga gtcaggccat ggcaaataag 120acaatgcaac cgatcacatc tacagcaaat aaaattgtgt ggtcggatcc aactcgttta 180tcaactacat tttcagcaag tctgttacgc caacgtgtta aagttggtat agccgaactg 240aataatgttt caggtcaata tgtatctgtt tataagcgtc ctgcacctaa accgaaggtc 300agatgcctgt gtcattatgc cgaatgaaaa ccaatccatt cgcacagtga tttcagggtc 360agccgaaaac ttggctacct taaaagcaga atgggaaact cacaaacgta acgttgacac 420actcttcgcg agcggcaacg ccggtttggg tttccttgac cctactgcgg ctatcgtatc 480gtctgatact actgcttaag cttgtattct atagtgtcac ctaaatcgta tgtgtatgat 540acataaggtt atgtattaat ggtagccgcg ttctaacgac aatatgtaca agcctaattg 600tgtagcatct ggcttactga agcagaccct atcatctctc tcgtaaactg ccgtcagagt 660cggttgggtt ggacagacct ctgagtttct ggtaacgccg ttccgcaccc cggaaatggt 720caccgaacca ttcagcaggg tcatcgctag ccagatcctc tacgccggac gcatcgtggc 780ccgcatcacc ggcgccacag gtgcggtgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg 840gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg atcgctggtt tccgcctggg tatggtggca 900ggccccgtgg cccgggggac tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc 960ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa 1020gggagagcgt cgatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 1080caactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg 1140ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgcttc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 1200tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc 1260ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 1320ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggacccc ctattggttt 1380atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 1440tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 1500cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 1560agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1620taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgtttttca atgatgagca cttttaaagt 1680
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tatggccgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc gctcaaggcg cactcccgtt3480ctggataatg ttttttgcgg cgacatcata acggttctgg caaatattct gaaatgagct3540ggtgacaatt aatcatcgaa ctagttaact agtacgcaag ttcacgtaaa aagggtatcg3600cggaatt 3607210312116212PRT213人工序列220
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223C-端接頭40032Gly Gly Glu Asp Gly Cys1 5210332115212PRT213人工序列220
223接頭40033Gly Gly Lys Gly Gly1 5210342113212PRT213人工序列220
223N-端甘氨酸接頭
220
221REPEAT222(1)..(1)223甘氨酸可以重複0至5次220
221REPEAT222(3)..(3)223甘氨酸可以重複0至12次40034Gly Cys Gly1210352119212PRT213人工序列220
223N端甘氨酸絲氨酸接頭220
221REPEAT222(1)..(1)223甘氨酸可以重複0至5次220
221REPEAT222(3)..(3)223甘氨酸可以重複0至10次220
221REPEAT222(4)..(4)223絲氨酸可以重複0至2次220
221REPEAT222(5)..(9)223這些殘基作為一組可以重複0至3次40035Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5210362113212PRT213人工序列220
223C-端甘氨酸接頭
220
221REPEAT222(1)..(1)223甘氨酸可以重複0至12次220
221REPEAT222(3)..(3)223甘氨酸可以重複0至5次40036Gly Cys Gly12103721110212PRT213人工序列220
223C-端甘氨酸絲氨酸接頭220
221REPEAT222(1)..(1)223甘氨酸可以重複0至10次220
221REPEAT222(2)..(2)223絲氨酸可以重複0至2次220
221REPEAT222(3)..(7)223這些殘基作為一組可以重複0至3次220
221REPEAT222(8)..(8)223甘氨酸可以重複0至8次220
221REPEAT222(10)..(10)223甘氨酸可以重複0至5次40037Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly1 5 1021038
2115212PRT213人工序列220
223甘氨酸絲氨酸接頭220
221REPEAT222(1)..(5)223這些殘基作為一組可以重複任意次40038Gly Gly Gly Gly Ser1 52103921110212PRT213人工序列220
223N-端γ140039Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro1 5 102104021110212PRT213人工序列220
223C-端γ140040Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly1 5 102104121117212PRT213人工序列220
223N-端γ340041Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala1 5 10 15
Pro2104221118212PRT213人工序列220
223C-端γ340042Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly1 5 10 15Cys Gly210432116212PRT213人工序列220
223N-端甘氨酸接頭40043Gly Cys Gly Gly Gly Gly1 5210442116212PRT213人工序列220
223C-端甘氨酸接頭40044Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5210452116212PRT213人工序列220
223C-端甘氨酸-賴氨酸接頭
40045Gly Gly Lys Lys Gly Cys1 5210462116212PRT213人工序列220
223N-端甘氨酸-賴氨酸接頭40046Cys Gly Lys Lys Gly Gly1 5210472114212PRT213人工序列220
223C.端接頭40047Gly Gly Cys Gly12104821137212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物40048ggtaacatcg gtcgagatgg aaaacaaact ctggtcc 372104921137212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物40049ggaccagagt ttgttttcca tctcgaccga tgttacc 37
2105021122212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物40050agctcgcccg gggatcctct ag 222105121140212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物40051cgatgcattt catccttagt tatcaatacg ctgggttcag402105221136212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物40052ggcaaaatta gagactgtta ctttaggtaa gatcgg362105321136212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物40053ccgatcttac ctaaagtaac agtctctaat tttgcc362105421133212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物40054ggccatggca cgactcgaga ctgttacttt agg 33
2105521119212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物40055gatttaggtg acactatag 192105621137212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物40056gatggacgtc aaactctggt cctcaatccg cgtgggg 372105721137212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物40057ccccacgcgg attgaggacc agagtttgac gtccatc 372105821131212DNA213人工序列220
223EcoRIHBcAg(s)引物40058ccggaattca tggacattga cccttataaa g 312105921151212DNA213人工序列220
223Lys-HBcAg(as)引物40059cctagagcca cctttgccac catcttctaa attagtaccc acccaggtag c 51
2106021148212DNA213人工序列220
223Lys-HBcAg(s)引物40060gaagatggtg gcaaaggtgg ctctagggac ctagtagtca gttatgtc 482106121138212DNA213人工序列220
223HBcAg(1-149)Hind(as)引物40061cgcgtcccaa gcttctaaac aacagtagtc tccggaag 382106221137212DNA213人工序列220
22348as引物40062gtgcagtatg gtgaggtgag gaatgctcag gagactc 372106321137212DNA213人工序列220
22348s引物40063gagtctcctg agcattcctc acctcaccat actgcac 372106421133212DNA213人工序列220
223107as引物40064
cttccaaaag tgagggaaga aatgtgaaac cac 332106521147212DNA213人工序列220
223HBcAg149hind-as40065cgcgtcccaa gcttctaaac aacagtagtc tccggaagcg ttgatag472106621133212DNA213人工序列220
223107s引物40066gtggtttcac atttcttccc tcacttttgg aag 332106721138212DNA213人工序列220
223HBcAgwtHindIIII引物40067cgcgtcccaa gcttctaaca ttgagattcc cgagattg 382106821110212PRT213人工序列220
223表位CeH340068Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly1 5 102106921151212DNA213人工序列220
223CeH3fwd引物220
221CDS222(1)..(51)40069gtt aac ttg acc tgg tct cgt gct tct ggt gca tcc agg gat cta gta48Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Ala Ser Arg Asp Leu Val1 5 10 15gtc51Val2107021117212PRT213人工序列220
223CeH3fwd引物40070ValAsn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Ala Ser Arg Asp Leu Val1 5 10 15Val2107121151212DNA213人工序列220
223CeH3rev引物40071accagaagca cgagaccagg tcaagttaac atcttccaaa ttattaccca c 51210722117212PRT213人工序列220
223CeH3rev引物肽40072Asp Glu Leu Asn Asn Gly Val1 5
2107321131212DNA213人工序列220
223HBcAg-wt EcoRI fwd引物40073ccggaattca tggacattga cccttataaa g 312107421138212DNA213人工序列220
223HBcAg-wt Hind III rev引物40074cgcgtcccaa gcttctaaca ttgagattcc cgagattg 38210752116212PRT213人(Homo sapiens)40075Asp Ala Glu Phe Arg His1 5210762116212PRT213小鼠(Mus musculus)40076Asp Ala Glu Phe Gly His1 5210772119212PRT213人工序列220
223Aβ1-6 GGC40077Asp Ala Glu Phe Arg His Gly Gly Cys
1 5210782119212PRT213人工序列220
223小鼠Aβ1-6 GGC40078Asp Ala Glu Phe Gly His Gly Gly Cys1 52107921128212DNA213人工序列220
223引物p1.4 440079aaccatggca aataagccaa tgcaaccg 282108021130212DNA213人工序列220
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223引物p1.4 840083cagacttgct gaaaatgtag ttgataaacg agttggatca ctc43210842116212PRT213人40084Asp Ala Glu Phe Arg His1 5210852116212PRT213兔(Oryctolagus cuniculus)40085Asp Ala Glu Phe Arg His1 5210862116212PRT213光滑爪蟾(Xenopus laevis)40086Asp Ser Glu Tyr Arg His1 5210872116212PRT213大鼠(Rattus norvegicus)40087Asp Ala Glu Phe Gly His
1 5210882116212PRT213豚鼠(Cavia porcellus)40088Asp Ala Glu Phe Arg His1 52108921115212PRT213小鼠(Mus musculus)40089Val His Glu Pro His Glu Phe Arg His Val Ala Leu Asn Pro Val1 5 10 15210902116212PRT213小鼠(Mus musculus)40090Tyr Tyr Glu Phe Arg His1 52109121142212PRT213人(Homo sapiens)40091Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 4021092211770212PRT213人(Homo sapiens)
40092Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg1 5 10 15Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro20 25 30Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln35 40 45Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp50 55 60Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu65 70 75 80Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn85 90 95Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val100 105 110Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu115 120 125Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys130 135 140Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu145 150 155 160Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile165 170 175Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu180 185 190Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val195 200 205Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys210 215 220
Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu225 230 235 240Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu245 250 255Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile260 265 270Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg275 280 285Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile290 295 300Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe305 310 315 320Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr325 330 335Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr340 345 350Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala355 360 365Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp370 375 380Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala385 390 395 400Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala405 410 415Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile420 425 430Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn435 440 445Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met450 455 460
Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu465 470 475 480Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys485 490 495Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe500 505 510Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser515 520 525Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser530 535 540Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp545 550 555 560Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val565 570 575Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala580 585 590Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro595 600 605Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe610 615 620Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val625 630 635 640Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser645 650 655Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp660 665 670Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu675 680 685Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly690695 700
Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu705 710 715 720Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val725 730 735Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met740 745 750Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met755 760 765Gln Asn7702109321182212PRT213人(Homo sapiens)40093Gly Ser Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys1 5 10 15Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln20 25 30Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile35 40 45Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Ile Ile50 55 60Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Asn His His Gly Val65 70 75 80Val Glu
權利要求
1.一種組合物，其包含(a)具有至少一個第一附著位點的核心顆粒；和(b)至少一個具有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽，並且其中所述第二附著位點選自(i)非天然存在於所述抗原或抗原決定簇上的附著位點；和(ii)所述抗原或抗原決定簇上天然存在的附著位點，其中所述第二附著位點能與所述第一附著位點締合；並且其中所述Aβ1-6肽和所述核心顆粒通過所述締合相互作用以形成有序和重複的抗原陣列。
2.如權利要求1所述的組合物，其中所述核心顆粒選自(i)病毒；(ii)病毒樣顆粒；(iii)噬菌體；(iv)RNA噬菌體的病毒樣顆粒；(v)細菌菌毛；(vi)病毒衣殼顆粒；和(vii)(i)，(ii)，(iii)，(iv)，(v)或(vi)的重組形式。
3.如權利要求1或2所述的組合物，其中所述核心顆粒包含，優選地是病毒樣顆粒，其中優選地所述病毒樣顆粒是重組病毒樣顆粒。
4.如權利要求2或3所述的組合物，其中所述病毒樣顆粒包含選自如下的重組蛋白質或其片段(a)重組B型肝炎病毒蛋白質；(b)重組麻疹病毒蛋白質；(c)重組新培斯病毒蛋白質；(d)重組輪狀病毒蛋白質；(e)重組口蹄疫病毒蛋白質；(f)重組逆轉錄病毒蛋白質；(g)重組諾沃克病毒蛋白質；(h)重組甲病毒蛋白質；(i)重組人乳頭瘤病毒蛋白質；(j)重組多瘤病毒蛋白質；(k)重組噬菌體蛋白質；(l)重組RNA噬菌體蛋白質；(m)重組Ty蛋白質；(n)重組Qβ噬菌體蛋白質；(o)重組GA噬菌體蛋白質；(p)重組fr噬菌體蛋白質；(q)重組AP205噬菌體蛋白質；和(r)來源於(a)到(q)的任何重組蛋白質的片段。
5.如權利要求2或3所述的組合物，其中所述病毒樣顆粒是B型肝炎病毒核心抗原。
6.如權利要求2或3所述的組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體蛋白質或其片段，或者可替代地由重組RNA噬菌體蛋白質或其片段組成。
7.如權利要求6所述的組合物，其中所述RNA噬菌體選自(a)噬菌體Qβ；(b)噬菌體R17；(c)噬菌體fr；(d)噬菌體GA；(e)噬菌體SP；(f)噬菌體MS2；(g)噬菌體M11；(h)噬菌體MX1；(i)噬菌體NL95；(j)噬菌體f2；(k)噬菌體PP7；和(l)噬菌體AP205。
8.如權利要求2或3所述的組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體Qβ蛋白質或其片段，或者可替代地由重組RNA噬菌體Qβ蛋白質或其片段組成。
9.如權利要求2或3所述的組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體fr蛋白質或其片段，或者可替代地由重組RNA噬菌體fr蛋白質或其片段組成。
10.如權利要求2或3所述的組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體AP205蛋白質或其片段，或者可替代地由重組RNA噬菌體AP205蛋白質或其片段組成。
11.如權利要求3至10任一所述的組合物，其中所述重組蛋白質包含RNA噬菌體外殼蛋白，或者可替代地基本由，或者可替代地由RNA噬菌體外殼蛋白組成。
12.如權利要求11所述的組合物，其中所述RNA噬菌體外殼蛋白具有選自下面的胺基酸序列(a)SEQ ID NO4；(b)SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的混合物；(c)SEQ ID NO6；(d)SEQ ID NO7；(e)SEQ ID NO8；(f)SEQ ID NO9；(g)SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的混合物；(h)SEQ ID NO11；(i)SEQ ID NO12；(k)SEQ ID NO13；(l)SEQ ID NO14；(m)SEQ ID NO15；(n)SEQ ID NO16；和(o)SEQ ID NO28。
13.如權利要求3至10任一所述的組合物，其中所述重組蛋白質包含RNA噬菌體的突變外殼蛋白，或者可替代地基本由，或者可替代地由RNA噬菌體的突變外殼蛋白組成。
14.如權利要求13所述的組合物，其中所述RNA噬菌體選自(a)噬菌體Qβ；(b)噬菌體R17；(c)噬菌體fr；(d)噬菌體GA；(e)噬菌體SP；(f)噬菌體MS2；(g)噬菌體M11；(h)噬菌體MX1；(i)噬菌體NL95；(j)噬菌體f2；(k)噬菌體PP7；和(l)噬菌體AP205。
15.如權利要求13或14所述的組合物，其中通過置換方式移除至少一個賴氨酸殘基已修飾了所述RNA噬菌體的所述突變外殼蛋白。
16.如權利要求13或14所述的組合物，其中通過置換方式添加至少一個賴氨酸殘基已修飾了所述RNA噬菌體的所述突變外殼蛋白。
17.如權利要求13或14所述的組合物，其中通過缺失至少一個賴氨酸殘基已修飾了所述RNA噬菌體的所述突變外殼蛋白。
18.如權利要求13或14所述的組合物，其中通過插入方式添加至少一個賴氨酸殘基已修飾了所述RNA噬菌體的所述突變外殼蛋白。
19.如前述任一權利要求所述的組合物，其中所述第二附著位點能通過至少一個共價鍵締合所述第一附著位點。
20.如前述任一權利要求所述的組合物，其中所述第二附著位點能通過至少一個非肽鍵締合所述第一附著位點。
21.如前述任一權利要求所述的組合物，其中所述Aβ1-6肽與所述核心顆粒融合。
22.如前述任一權利要求所述的組合物，其中所述Aβ1-6肽選自(a)具有SEQ ID NO75的胺基酸序列的人Aβ1-6肽；(b)具有SEQ ID NO76的胺基酸序列的小鼠Aβ1-6肽；(c)具有SEQ ID NO84的胺基酸序列的靈長類Aβ1-6肽；(d)具有SEQ ID NO85的胺基酸序列的兔Aβ1-6肽；(e)具有SEQ ID NO86的胺基酸序列的光滑爪蟾Aβ1-6肽；(f)具有SEQ ID NO87的胺基酸序列的大鼠Aβ1-6肽；和(g)具有SEQ ID NO88的胺基酸序列的豚鼠Aβ1-6肽。
23.如前述任一權利要求所述的組合物，其中所述Aβ1-6肽具有SEQ IDNO75的胺基酸序列。
24.如前述任一權利要求所述的組合物，其還包含胺基酸接頭，其中所述胺基酸接頭包含所述第二附著位點，或者可替代地由所述第二附著位點組成。
25.如前述任一權利要求所述的組合物，其中所述第二附著位點或具有所述第二附著位點的所述胺基酸接頭與所述Aβ1-6肽在其C末端結合。
26.如前述任一權利要求所述的組合物，其中所述第二附著位點或具有所述第二附著位點的所述胺基酸接頭選自(a)GGC；(b)GGC-CONH2；(c)GC；(d)GC-CONH2；(e)C；和(f)C-CONH2。
27.如前述任一權利要求所述的組合物，其中具有所述至少一個第二附著位點的所述Aβ1-6肽是NH2-DAEFRHGGC-CONH2(SEQ ID NO77)。
28.如權利要求27所述的組合物，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體Qβ外殼蛋白的病毒樣顆粒。
29.一種藥物組合物，其包含(a)如權利要求1所述的組合物；和(b)可接受的藥物學載體。
30.如權利要求29所述的藥物組合物，其還包含佐劑。
31.如權利要求29或30所述的藥物組合物，其中所述疫苗組合物無佐劑。
32.一種疫苗組合物，其包含前述任一權利要求所述的組合物。
33.如權利要求32所述的疫苗組合物，其還包含佐劑。
34.如權利要求32或33所述的疫苗組合物，其中所述疫苗組合物無佐劑。
35.如權利要求32至34任一所述的疫苗組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體蛋白質或其片段。
36.如權利要求32至35任一所述的疫苗組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體Qβ蛋白質或其片段。
37.如權利要求32至35任一所述的疫苗組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體fr蛋白質或其片段。
38.如權利要求32至35任一所述的疫苗組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體AP205蛋白質或其片段。
39.如權利要求32至38任一所述的疫苗組合物，其中所述Aβ1-6肽選自(a)具有SEQ ID NO75的胺基酸序列的人Aβ1-6肽；(b)具有SEQ ID NO76的胺基酸序列的小鼠Aβ1-6肽；(c)具有SEQ ID NO84的胺基酸序列的靈長類Aβ1-6肽；(d)具有SEQ ID NO85的胺基酸序列的兔Aβ1-6肽；(e)具有SEQ ID NO86的胺基酸序列的光滑爪蟾Aβ1-6肽；(f)具有SEQ ID NO87的胺基酸序列的大鼠Aβ1-6肽；和(g)具有SEQ ID NO88的胺基酸序列的豚鼠Aβ1-6肽。
40.如權利要求32至39任一所述的疫苗組合物，其還包含胺基酸接頭，其中所述胺基酸接頭包含所述第二附著位點，或者可替代地由所述第二附著位點組成。
41.如權利要求40所述的疫苗組合物，其中具有所述第二附著位點的所述胺基酸接頭與所述Aβ1-6肽在其C末端結合。
42.如權利要求40或41所述的疫苗組合物，其中具有所述第二附著位點的所述胺基酸接頭選自(a)GGC；(b)GGC-CONH2；(c)GC；(d)GC-CONH2；(e)C；和(f)C-CONH2。
43.如權利要求32至42任一所述的疫苗組合物，其中具有所述至少一個第二附著位點的所述抗原或抗原決定簇是NH2-DAEFRHGGC-CONH2(SEQ ID NO77)。
44.如權利要求43所述的疫苗組合物，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體Qβ外殼蛋白的病毒樣顆粒。
45.一種製備前述任一權利要求所述的組合物的方法，該方法包括(a)提供具有至少一個第一附著位點的核心顆粒；(b)提供至少一個具有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽；並且其中所述第二附著位點選自(i)非天然存在於所述抗原或抗原決定簇上的附著位點；和(ii)所述抗原或抗原決定簇上天然存在的附著位點；且其中所述第二附著位點能締合所述第一附著位點；和(c)混合所述核心顆粒和所述至少一個抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇和所述核心顆粒通過所述締合相互作用以形成有序和重複的抗原陣列。
46.一種免疫的方法，包括向動物或人類施用前述任一權利要求所述的組合物。
47.如權利要求46所述的免疫方法，其中所述抗原或抗原決定簇是自身抗原。
48.如權利要求46或47所述的免疫方法，其中所述動物是人類。
49.如權利要求46至48任一所述的免疫方法，其中所述抗原或抗原決定簇是人Aβ1-6肽。
50.權利要求1至44任一所述的組合物，其用作藥物。
51.權利要求1至44任一所述的組合物在製備用於治療阿爾茨海默氏病和相關疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及分子生物學、病毒學、免疫學和醫學領域。本發明提供了包含有序和重複的抗原或抗原決定簇陣列的組合物，特別是Aβ1－6肽－VLP組合物。更具體地，本發明提供了包含病毒樣顆粒和與其結合的至少一個Aβ1－6肽的組合物。本發明也提供了用於產生此綴合物或有序重複陣列的方法。本發明組合物可以用於生產治療阿爾茨海默氏病的疫苗，和用作預防或治癒阿爾茨海默氏病及有效地誘導免疫應答，特別是抗體應答的藥物。而且，在所述上下文中，本發明組合物特別可以用於有效地誘導自身特異性免疫應答。
文檔編號A61P25/28GK1674934SQ03819734
公開日2005年9月28日 申請日期2003年7月18日 優先權日2002年7月19日
發明者M·F·巴赫曼, A·蒂索, R·奧特曼, R·隆得, M·施陶芬比爾, P·弗賴 申請人:希託斯生物技術股份公司, 諾瓦提斯醫藥股份公司