鳶尾苷元的異黃酮類衍生物及其製備方法和以其為有效藥用成分的抗病毒藥物的製作方法
2023-10-05 23:59:09
專利名稱：鳶尾苷元的異黃酮類衍生物及其製備方法和以其為有效藥用成分的抗病毒藥物的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種鳶尾苷元化合物的衍生物，具體講是化學名稱為5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮類的鳶尾苷元化合物的衍生物，以及其製備方法，和以該衍生物為有效藥用成分的抗病毒藥物及相應的製備方法。
背景技術：
因流感病毒等多種病毒感染引起的上呼吸道感染、病毒性肺炎等疾病，一直都是一種常見並可導致死亡的多發性疾病。對這類呼吸道感染性疾病，目前主要多還是採用化學藥物治療。但耐藥菌株和耐藥病毒株的增加速度常超過化學抗生素藥物發展的速度，已成為不容忽視的問題。利用和發揚天然藥物的中藥在這方面的優勢，特別是從天然藥物中提取和分離出的有效藥用成分，和/或在此基礎上進一步開發改造成新的藥用化合物，已日益受到重視。
孫遠碧等人在「射幹與鳶尾化學成分的比較鑑定」(《中藥通報》1984，9(5))；陳芳群在「川射幹中黃酮成分的分離和鑑定」(《中草藥》1990，22(2))；許雲龍等人在「黃射幹的異黃酮類成分」(《雲南植物研究》1999，21(1))；吉文亮等人在「中藥射幹的化學與藥理研究進展」(《國外醫藥·植物藥分冊》2000，15(2))和「射幹中異黃酮提取工藝的研究」(《中藥材》2000，23(8))等許多研究和文獻都報導，如式(I)所示結構的鳶尾苷元化合物，是廣泛存在於具有抗病毒和抗菌、抗炎作用的鳶尾科植物，如鳶尾即川射幹(Iris tectorum Maxim)、射幹(Belamcanda chinensis(L.)DC.)、白射幹(Iris dichotoma pall.)、扁竹根(Iris japonica)、黃射幹(I，Iris tectorrum)等中藥中的多種黃酮類化合物成分中的一種異黃酮化合物。
包括上述文獻在內的許多文獻報導的研究結果表明，中藥鳶尾(Iris tectorum Maxim)所含的異黃酮部分具有顯著的抗病毒、抗炎作用。鳶尾苷(tectoridin)是鳶尾中的主要有效成分(含量約為5％)，文獻報導及藥理研究均證實其有較強的抗病毒、抗炎作用。作為鳶尾苷水解產物的鳶尾苷元，結構如上述式(I)所示，文獻及藥理研究均證實其有更強的抗病毒、抗炎作用。但鳶尾苷及其苷元的水溶性非常差，限制了其臨床運用，因此改善和提高其水溶性，是首先需要解決的一個問題。實驗結果顯示，通過製劑學研究解決其水溶性的效果並不理想，而通過對鳶尾苷、鳶尾苷元進行化學修飾，改變其化學結構，在保持甚至提高其有效藥用作用的前提下，達到增加水溶性，增強療效及擴大其可適用的藥物製劑範圍的目的，就是一條可行的措施。
發明內容
根據上述情況，本發明首先將提供一種在上述式(I)所示結構的鳶尾苷元化合物的基礎上，通過對其進行化學修飾而得到的一系列衍生物，在至少保持了其原有的抗菌、抗病毒、抗炎及解熱鎮痛等藥效作用的前提下，能大大改善和提高其水溶性，為擴大其在製藥及其臨床運用中的適用範圍提供了極大的便利條件。在此基礎上，本發明進一步還將提供以所說的鳶尾苷元化合物的衍生物作為有效藥用成分的抗病毒藥物，特別是以其為有效藥用成分的注射型藥物製劑。
本發明所說的鳶尾苷元化合物的衍生物，化學名稱為5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮類的衍生物，結構如式(II)所示 其中式中的R1為H、NH2或SO3M；R2為OR′；R3為H或-CH2NR″；其中的R′為H、-CH2COONa或-CH2CH2NMe2；NR″為 或-NMe2；M為H、Na、K或N+H(CH2CH2OH)3。
在上述通式(II)所示的化合物中，一個典型的化合物是如式(III)所示的R1為SO3M″的磺酸類化合物，其中M″可以為H、Na、K或-N+H(CH2CH2OH)3。
其中在通式(III)結構的化合物中的典型化合物為磺酸或磺酸鹽類的化合物，即SO3M″中的M″為H、Na或K，結構如式(IV)所示 在通式(III)結構中的另一個典型化合物，是其中的磺酸基R1為-SO3-N+H(CH2CH2OH)3，結構如式(V)所示 本發明所說通式(II)中還包括的一個典型化合物，是其結構中的R1為NH2，R2為OH，R3為H，結構如式(VI)所示 作為本發明上述通式(II)中的再一個典型化合物，是結構中的R1為H，R2為-OCH2COONa，R3為H，結構如式(VII)所示 此外，本發明所說上述通式(II)中的還有的一個典型化合物，是式(II)結構中的R1和R3為H，R2為OCH2CH2NMe2，結構如式(VIII)所示
此外，本發明上述通式(II)中的另一個典型化合物，是式(II)結構中的R1為H，R2為OH，R3為-CH2NR″，其中的NR″為 結構如式(IX)所示 此外，在本發明所說上述通式(II)中的又一個典型化合物，是式(II)結構中的R1為H，R2為OH，R3為-CH2NMe2，結構如式(X)所示 在上述所說的各典型化合物中，其中的式、(VI)、(VIII)、(IX)和(X)所示結構的化合物，還可以分別為其藥學上可以接受的鹽類化合物，如最常用的各相應的鹽酸鹽化合物。
本發明上述式(II)所示結構的化合物中，對於其具體取代基團和/或取代位置的不同，均可以由式(I)結構的異黃酮類鳶尾苷元化合物為原料，根據對製取同類取代化合物的已知製備原則和方法，採用相應的不同方法製備得到。
例如作為本發明進行化學修飾原料使用的前體化合物，即上述式(I)結構的鳶尾苷元異黃酮化合物，除可以採用全合成的方式製備獲得外，更方便易行的方式，是採用目前已有報導的方式，由前述的多種鳶尾科藥用植物中提取並分離後得到。例如，一種可供參考的提取方式是鳶尾原生藥乾燥、粉碎成粗粉過20目篩，置於提取容器內，分別用為藥材重量4倍的70％乙醇加熱回流三次，每次時間1小時，趁熱過濾，合併濾液。減壓回收乙醇後，得比重1.2g/ml(50℃)的棕黃色浸膏狀提取物，收得率為藥材重量的49-51％。上述浸膏中加入95％乙醇攪拌均勻，混懸液沉澱，過濾，濾出物再加入95％乙醇攪拌均勻，重複操作2次，至濾液近無色，得鳶尾苷粗品。加入70％乙醇加熱回流1小時，放置，析出淡黃色沉澱，濾出沉澱，用70％乙醇再重結晶二次，得無色結晶性粉末鳶尾苷，收得率為藥材量的4.5％。
將該鳶尾苷200g置於圓底燒瓶中，加50％乙醇2000ml攪拌均勻後，加入濃鹽酸200ml，搖勻並加熱回流2小時，趁熱過濾後靜置，析出淡黃色細長針晶。過濾，結晶用400ml95％乙醇溶解，傾入800ml沸水中，放冷析出淡黃色細長針晶。過濾後再重結晶一次，60℃減壓乾燥，得式(I)結構異黃酮的鳶尾精品120g，為淡黃色細長針晶，得率為藥材量的3％，含量＞98％。
式(III)結構的衍生物，一般可以採用硫酸對式(I)的異黃酮化合物進行磺化反應，即可得到R1為SO3H取代的產物。優選的方式之一是稱取鳶尾苷元1.0g，加入4.0ml濃硫酸攪拌溶解，室溫下反應1.5～2小時，整個反應過程在無水條件進行，得到式(III)中的M」為H的磺酸衍生物產物。
進一步用如NaCl或KCl等飽和鹽類水溶液進行處理後，即可以得到上述式(IV)的相應磺酸鈉或磺酸鉀化合物。其兩步合成路線如下 製備上述式(V)所示結構的鳶尾苷元化合物的方法，可以採用將式(I)結構的異黃酮類鳶尾苷元化合物為原料與濃硫酸混合，在40-90℃優選為60℃下加熱攪拌反應，冷卻後傾入飽和的氯化鈉、其他鹼金屬的鹽酸鹽、氫溴酸鹽或硝酸鹽等的溶液中，得3′-磺酸鈉中間產物，將其懸浮於乙醇溶液中並加入強酸型陽離子樹脂，室溫攪拌使全部溶解，然後加入三乙醇胺，再減壓蒸去溶劑，得到化合物(V)，合成路線為
製備上述式(VI)所示結構的鳶尾苷元化合物的方法，可以採用由式(I)結構的異黃酮類鳶尾苷元化合物為原料，在冰浴冷卻下滴加硝酸和濃硫酸混酸的乙醇溶液(即(硝酸+硫酸)/乙醇)，得到3′-硝基中間化合物，然後將其溶於甲醇中，在常壓下以氫催化還原得到3′-氨基取代的化合物(VI)，並且可以進一步與藥物中可以接受的酸反應得到式(VI)結構的相應鹽類化合物，合成路線為 在製備上述式(VII)所示結構的鳶尾苷元化合物時，可以將式(I)結構的異黃酮類鳶尾苷元化合物為原料與氯乙酸乙酯在丁酮和DMF混和溶劑中，加入無水k2CO3和催化量的NaI，攪拌下回流反應後，冷卻至室溫並濾除不溶物，減壓濃縮濾液，殘餘物溶於適量水中，再乙酸乙酯提取和水洗，乾燥後減壓濃縮溶劑，flash柱分離，得4′-酯醚中間產物，用甲醇溶解後，攪拌下滴加NaOH水溶液後進行常溫水解反應完全，再用酸調節至pH3～4，減壓蒸除甲醇得絮狀沉澱並溶於乙酸乙酯，水洗、乾燥，濃縮後與NaHCO3反應製成鈉鹽，得到化合物(VII)，合成路線為 對於上述式(VIII)所示結構的鳶尾苷元化合物的製備，可以採用先將β-二甲氨基乙醇於0℃條件下滴加入二氯亞碸並劇烈攪拌，滴完後於35～50℃攪拌反應，然後用無水乙醇重結晶，得中間產物β-二甲胺基氯乙烷鹽酸鹽A。然後將式(I)結構的異黃酮類鳶尾苷元化合物為原料溶於丁酮、丙酮、DMF、THF或二氧六環等溶劑，加入無水K2CO3或Na2CO3和DMF及催化量的NaI，加熱至回流，可分成五批、每隔半小時加入上述中間產物A，80℃左右回流，薄層板檢測，待卻後過濾，將濾液於旋轉蒸發器上減壓濃縮得粘狀物，適量水稀釋(約10倍重量的水)後，用乙酸乙酯提取，提取液用水洗後乾燥並出去溶劑，得到化合物(VIII)，並且可以進一步與藥物中可以接受的酸反應得到式(III)結構的相應鹽類化合物，合成路線為 製備上述式(IX)所示結構的鳶尾苷元化合物的方法，則可以將式(I)結構的異黃酮類鳶尾苷元化合物原料、含量為37％重量的甲醛溶液、哌啶以及二氧六環、THF、甲醇或乙醇中的一種溶劑混和，回流反應後冷卻，過濾得到化合物(IX)，並且可以進一步與藥物中可以接受的酸反應得到式(III)結構的相應鹽類化合物，合成路線為 試驗結果顯示，上述反應的位置選擇性十分專一，完全得到在A環上反應的產物，與文獻報導和預先設計的位置(C環)不同。這提供了一種選擇性在鳶尾苷元異黃酮A環上衍生化的方法，有利於全面考察結構改造對活性的影響。而其他的反應多是在C環上進行衍生化。在此基礎上，採用類似方法可以得到上述式(X)所示結構的鳶尾苷元化合物。如將式(I)結構的異黃酮類鳶尾苷元化合物原料、含量為37％重量的甲醛溶液、二甲胺的鹽酸鹽以及二氧六環、THF、甲醇或乙醇中的一種溶劑混和，回流反應後待冷，濾集沉澱得到化合物(X)，並且可以進一步與藥物中可以接受的酸反應得到式(III)結構的相應鹽類化合物，合成路線為
以有效用量的上述式(II)所示結構的鳶尾苷元化合物的衍生物作為有效藥用成分，與藥物中可接受的輔助添加成分和按現有的常規製備方式，可以製成為相應的可具有抗病毒作用的藥物。在所說的這些用於抗病毒藥物中，除可以按一般方式得到口服型製劑外，特別是由於上述已成為鹽類形式的各化合物能具有滿意的水溶性，因此尤為適宜製備成為具有抗病毒作用的注射型藥物。例如，將上述各典型化合物按中國藥典2000版二部凡例X頁的溶解度實驗方法進行了溶解性對比實驗稱取研成細粉的供試樣品，置於25℃±2℃一定量的溶劑中，每隔5分鐘強力振搖30分鐘內的溶解情況，並根據藥典對各種溶解性能的定義進行判斷。結果如表1所示。
表1溶解性能對比試驗結果化合物 溶質水(mg/ml)化合物(I)0.1mg/ml化合物(IV) 67mg/ml化合物(V)70mg/ml化合物(VI) 8mg/ml化合物(VII) 15mg/ml化合物(VIII) 10mg/ml化合物(IX) 8mg/ml化合物(X)9mg/ml表1的結果顯示，經本發明化學修飾後的多種結構形式的異黃酮鳶尾苷元化合物衍生物(II)，由於在引入了許多易於成鹽和/或親水性的基團，從而可使該類衍生物的水溶性大為提高，有利於其在製藥和臨床上的應用，也有利於提高其在體內的吸收和生物利用度。
以此為基礎，在製備上述的注射型藥物製劑時，為進一步保證和提高上述式(II)結構鳶尾苷元化合物衍生物在注射液中的溶解穩定性能，製備時還可以在注射液中按允許的用量使用在注射劑藥物中可接受的助溶劑成分。其中，經試驗結果顯示有效且方便的可供參考的優選方式之一，是在所說的注射型製劑中，添加為注射液總量的重量/體積比為2-15％的葡萄糖作為助溶劑，利用葡萄糖中的多羥基與式(II)結構的異黃酮結構締合形成氫鍵，從而大大增加了其在水中的溶解度。
以上述式(IV)結構的鳶尾苷元磺酸鈉為例，其在室溫下的水溶解度僅為20mg/ml(2％)，達不到用藥濃度；加熱至60-100℃後的水溶解度可增至50-60mg/ml(5-6％)，冷卻至室溫後又析出沉澱。但在注射液中加入4％的葡萄糖後，能夠保持在室溫和低溫(0℃-5℃)下放置保持澄清，而且可以用水或糖鹽水任意稀釋，不出混濁。因此其不但可供肌肉注射，還可加入糖和/或鹽水中用於靜脈注射。這就表明了葡萄糖在增加上述式(IV)鳶尾苷元磺酸鈉在水中的溶解度的同時，還能大大提高注射製劑藥物的穩定性。
例如，在製備以上述鳶尾苷元的異黃酮類衍生物(II)為有效藥物成分的注射劑藥物時可作為實施例之一的一種方法，可以採用將鳶尾苷元衍生物(II)5-80重量份和注射用葡萄糖20-150重量份，溶解於700～800重量份的注射用水中，溶解完全後再加入注射用水補足至相當於1000重量份的總體積，G4垂熔玻砂漏鬥過濾後，經常規封裝和滅菌處理，即得到淡黃色澄明液體的注射液，其中的葡萄糖含量2-15％，有效藥物成分(II)的含量為5-80mg/ml。
以下通過具體實施方式
的實例再對本發明的上述內容作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。在不脫離本發明上述技術思想情況下，根據本領域普通技術知識和慣用手段做出的各種替換或變更，均包括在本發明的範圍內。
圖1是式(III)鳶尾苷元磺酸鈉化合物的IR圖譜圖2是式(III)鳶尾苷元磺酸鈉化合物的1HNMR圖譜具體實施方式
實施例1化合物(IV)的製備取式(II)結構的鳶尾苷元120g，加濃H2SO4480ml，攪拌至全溶，放置反應1.5小時，然後緩緩傾入飽和氯化鈉水溶液5000ml中，邊加邊攪，析出大量白色沉澱，過濾。沉澱物加水3000ml並水浴加熱至全部溶解，趁熱過濾、析晶、過濾，得淡黃色片晶。結晶加水1000ml，再水浴加熱至全溶後，趁熱過濾、析晶、過濾。沉澱物於60℃減壓乾燥，得式(IV)結構的鳶尾苷元磺酸鈉精品150g，為淡黃色細長針狀結晶，含量＞98％。
對所得的式(IV)結構鳶尾苷元磺酸鈉產品進行的光譜測試數據如下IR(KBr壓片，cm-1)3465(s)，1654(s)，1622(s)，1575(s)，1494，1465(s)，1436，1367，1340，1278，1165(s)，1095(s)，1070，1031(s)，993，833，815，767，731，667，632，567，543，509，459；1HNMR(D2O為溶劑，TMS內標，δHppm)7.88(s，1H)，7.74(s，1H)，7.25(d，1H)，6.94(d，1H)，6.21(s，1H)，3.70(s，3H)。
實施例2化合物(V)的製備原料300mg(1mmol)與濃硫酸5ml混合，在60℃加熱攪拌3h，冷卻，傾入20ml飽和氯化鈉溶液中。靜置，過濾，所得固體用5％的氯化鈉溶液重結晶，得淡黃色晶體的中間產物283mg，產率70％。
上述中間產物150mg(0.294mmol)懸浮於5ml乙醇中，加入過量的預先處理過的強酸型陽離子樹脂，室溫下攪拌1h，懸浮固體全部溶解。過濾，樹脂用丙酮洗滌。向濾液中加入55mg三乙醇胺，減壓蒸去溶劑，加入二氯甲烷和丙酮處理得粉狀固體的化合物(V)，產率90％。熔點155-159℃。在水中的溶解度大於50mg/ml。
1H NMR(400MHz，D2O)δ7.92(s，1H)，7.78(s，1H)，7.32(d，J＝7.2Hz，1H)，7.00(d，J＝8.0Hz，1H)，6.27(s，1H)，3.96(t，J＝5.2Hz，6H)，3.74(s，3H)，3.47(t，J＝5.2Hz，6H)。
13C NMR(100MHz，D2O)δ182.4，159.0，156.5，155.7，155.0，154.1，135.8，133.2，130.3，124.1，123.2，119.6，106.9，96.9，62.8，57.8，57.5。
IR cm-1(KBr)3356(OH，NH)，3151，1655(C＝O)，1612，144，1291，1168，1090。
ESI MS379.1[M-NH(CH2CH2OH)3]-。
元素分析C22H27NO12S(％)C 49.84，H 5.22，N 2.71；計算值C 49.90，H 5.14，N 2.65。
實施例3化合物(VI)的製備將鳶尾苷元異黃酮(I)(以下均簡稱原料)300mg(1.0mmol)溶於5ml乙醇中，冰浴冷卻下滴加硝酸(68％)210mg和濃硫酸500mg混酸的乙醇溶液(3ml)，然後攪拌24h。過濾即得硝化產物170mg，產率49％。
熔點＞200℃。
ESI MS346.1(M+1)+；344.1(M-1)-。
將上述硝基化合物150mg溶於4ml甲醇中，加入30mg 10％Pd/C，常壓下氫解完全(5h)。過濾，減壓除去甲醇後產物溶於5ml乙酸乙酯中，加入乙酸乙酯的HCl溶液至酸性(pH＝2-3)。過濾得式(VI)結構的鹽酸鹽產物，產率80％。熔點＞250℃。在水中的溶解度大於1mg/ml。
相關的結構檢測數據1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.94(s，1H)，10.78(br.s，1H)，10.58(br.s，1H)，8.34(s，1H)，7.48(s，1H)，7.25(d，J＝8.4Hz，1H)，7.03(d，J＝8.4Hz，1H)，6.55(s，1H)，3.76(s，3H)。
13C NMR(100MHz，DMSO)δ180.5，157.9，154.7，153.4，152.9，150.4，131.7，128.0，123.6，122.0，121.6，121.2，116.0，105.0，94.2，60.2。
IR cm-1(KBr)3421(OH，NH)，3079，1645(C＝O)，1619，1518，1474，1284。
ESI MS316.1(M+1)+；314.1(M-1)-。
元素分析C16H14ClNO6(％)C 54.35，H 4.15，N 4.35；計算值C 54.63，H 4.01，N 3.98。
實施例4化合物(VII)的製備原料300mg(1mmol)、氯乙酸乙酯135mg(1.1mmol)、丁酮8ml、少許5％體積的DMF混和，加入無水K2CO3207.3mg(1.5mmol)和催化量(約5mol％)的NaI，攪拌下回流8h。冷至室溫，濾除不溶物，減壓濃縮濾液，殘餘物溶於適量水中，乙酸乙酯提取，水洗兩次，乾燥，減壓濃縮溶劑，快速柱層析柱分離，得淡黃色固體中間產物，產率39.3％。熔點164～167℃。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ12.85(s，1H)，7.89(s，1H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，6.86(d，J＝8.4Hz，2H)，6.35(s，1H)，5.51(s，1H)，4.81(s，2H)，4.31(q，J＝7.2Hz，2H)，3.98 s，3H)，1.33(t，J＝7.2Hz，3H)。
ESI MS387.2(M+1)+。
上述中間產物125mg(0.32mmol)用甲醇4ml溶解，NaOH 64.8mg(1.6mmol)配成水溶液(1mmol/ml)，攪拌下滴加到上述甲醇溶液，常溫下反應24h，使水解完全，溶液用稀鹽酸調節至pH3～4，減壓蒸除甲醇，生成的白色絮狀沉澱溶於乙酸乙酯，水洗，乾燥，濃縮，與NaHCO3反應製成化合物(VII)的鈉鹽，產率80％。熔點＞250℃。在水中的溶解度大於2mg/ml。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ9.24(s，1H)，10.58(br.s，1H)，8.32(s，1H)，7.24(d，J＝8.4Hz，2H)，6.72(d，J＝8.4Hz，2H)，6.47(s，1H)，4.38(s，2H)，3.78(s，3H)。
13C NMR(50MHz，DMSO)δ180.7，170.3，158.9，158.2，154.2，152.9，152.6，132.2，130.0，122.3，120.7，115.4，105.5，92.2，68.5，60.1。
IR cm-1(KBr)3420(OH)，1655(C＝O)，1614，1422，1290，1176。
ESI MS359.1(M-Na+2)+，357.0(M-Na)-。
元素分析C18H13NaO8(％)C 56.82，H 3.32；計算值C 56.85，H 3.45。
實施例5化合物(VIII)的製備將二氯亞碸14.5ml(0.12mol)置乾燥圓底燒瓶中，冰水浴冷卻下用滴液漏鬥緩慢滴加β-二甲氨基乙醇，劇烈攪拌。滴加完畢得褐色粘狀物，35～50℃攪拌1h，加入50ml無水乙醇重結晶，得β-二甲胺基氯乙烷鹽酸鹽中間產物。適量無水乙醇及乙醚洗滌，密封保存備用。
原料150mg(0.5mmol)溶於15ml丁酮，加入無水K2CO3214mg(1.55mmol)，DMF0.5ml，催化量(約5mol％)的NaI，加熱至回流，分次加入(可分成五批、每隔半小時加入)上述中間產物115.3mg(0.8mmol)，80℃左右回流48h，待冷，濾除不溶物，濾液在旋轉蒸發器上減壓濃縮至幹，得粘狀物。適量(10倍重量)水稀釋後，乙酸乙酯提取，水洗，乾燥，濃縮，得黃色固體產品的化合物(VIII)，產率46.5％。按一般方法製得鹽酸鹽。熔點190℃軟化，235℃分解。在水中的溶解度大於2mg/ml。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.98(s，1H)，10.57(br.s，1H)，9.69(s，1H)，8.49(s，1H)，7.41(d，J＝8.4Hz，2H)，6.94(s，1H)，6.84(d，J＝8.1Hz，2H)，4.54(t，J＝5.2Hz，2H)，3.78(s，3H)，3.58(t，J＝4.8Hz，2H)，2.89(s，6H)。
13C NMR(50MHz，DMSO)δ180.9，157.8，157.2，157.0，154.8，153.0，132.2，130.3，122.4，121.1，115.4，106.5，92.4，64.4，60.5，55.2，43.2。
IR cm-1(KBr)3418(OH，NH)，1656(C＝O)，1614，1515，1460，1272.
ESI MS372.1(M+1)+。
元素分析C20H22ClNO6(％)C 58.85，H 5.78，N 3.64；計算值C 58.90，H 5.44，N 3.43。
實施例6化合物(IX)的製備原料300mg(1.0mmol)、含量為37％重量的甲醛溶液81mg(1.0mmol)、哌啶(2當量)和二氧六環5ml混和，回流3h。冷卻，過濾得淡黃色固體產物(IX)。在乙醇中加入適量濃鹽酸得相應鹽酸鹽，產率90％。熔點245℃分解。在水中的溶解度小於1mg/ml。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ13.43(s，1H)，11.26(s，1H)，10.03(br.s，1H)，9.74(s，1H)，8.42(s，1H)，7.38(d，J＝8.4Hz，2H)，6.86(d，J＝8.4Hz，2H)，4.30(s，2H)，3.82(s，3H)，3.45-3.38(m，2H)，2.97(m，2H)，1.78-1.63(m，4H)，1.38-1.36(m，1H)，1.07-1.04(m，1H)。
13C NMR(50MHz，DMSO)δ181.0，157.9，157.1，154.3，152.4，131.1，130.2，122.1，120.9，115.4，105.0，95.5，80.5，56.2，52.1，48.2，22.4，21.2，18.8。
IR cm-1(KBr)3197(OH，NH)，2954，1652(C＝O)，1585，1515，1458，1374，1226。
ESI MS398.0(M+1)+；396.2(M-1)-。
元素分析C22H24ClNO6(％)C 60.50，H 5.74，N 3.54；計算值C 60.90，H 5.58，N 3.23。
實施例7化合物(X)的製備原料150mg(0.5mmol)，含量為37％重量的甲醛溶液40.5mg(0.5mmol)，二甲胺的鹽酸鹽61.2mg(0.75mmol)和二氧六環2ml混和，70～80℃回流10h，待冷，濾集不溶物，得到化合物(X)。在酸性(鹽酸pH＝2～3)條件下用乙醇重結晶，得產品的鹽酸鹽，產率38.7％。熔點248℃分解。在水中的溶解度大於2mg/ml。此反應產物的位置選擇性與上述化合物(VII)的相同。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ13.40(s，1H)，11.32(br.s，1H)，10.23(br.s，1H)，9.74(s，1H)，8.40(s，1H)，7.38(d，J＝8.4Hz，2H)，6.85(d，J＝8.4Hz，2H)，4.34(S，1H)，3.81(s，3H)，2.77(s，6H)。
13C NMR(100MHz，DMSO)δ181.0，157.9，156.9，154.3，154.2，152.3，131.1，130.2，122.2，120.9，115.4，105.0，95.9，60.6，48.6，42.3。
IR cm-1(KBr)3145(OH，NH)，1656(C＝O)，1577，1462，1379，1223。
ESI MS357.9(M+1)+；356.2(M-1)-。
元素分析C19H20ClNO6(％)C 57.99，H 5.11，N 3.85；計算值C 57.95，H 5.12，N 3.56。
實施例8各種劑型藥物的製備1.注射液的製備添加為注射液總量的重量/體積比為2～15％的葡萄糖作為助溶劑，利用葡萄糖中的多羥基與異黃酮基締合形成氫鍵，從而大大增加了其在水中的溶解度。
鳶尾苷元磺酸鈉為例，其在室溫下的水溶解度僅為20mg/ml(2％)，達不到用藥濃度；加熱至60-100℃後的水溶解度可增至50-60mg/ml(5-6％)，冷卻至室溫後又析出沉澱。但在注射液中加入2-15％的葡萄糖後，能夠保持在室溫和低溫(0℃-5℃)下放置保持澄清，而且可以用水或糖鹽水任意稀釋，不出混濁。因此其不但可供肌肉注射，還可加入糖和/或鹽水中用於靜脈注射。這就表明了葡萄糖在增加鳶尾苷元磺酸鈉在水中的溶解度的同時，還能大大提高注射製劑藥物的穩定性。
稱取鳶尾苷元磺酸鈉100g，注射用葡萄糖150g，溶解於1500ml注射用水中，待溶解完全後加入注射用水至體積2000ml，用G4垂熔玻砂漏鬥過濾後，濾液以常規方式封裝於安瓿瓶中，並按常規方式作滅菌處理。所得注射液為淡黃色的澄明液體。
稱取式(V)化合物100g，注射用葡萄糖100g，溶解於1500ml注射用水中，待溶解完全後加入注射用水至體積2000ml，用G4垂熔玻砂漏鬥過濾後，濾液以常規方式封裝於安瓿瓶中，並按常規方式作滅菌處理。所得注射液為淡黃色的澄明液體。
稱取鳶尾苷元磺酸鈉100g，注射用葡萄糖80g，溶解於1500ml注射用水中，待溶解完全後加入注射用水至體積2000ml，用G4垂熔玻砂漏鬥過濾後，濾液以常規方式封裝於安瓿瓶中，並按常規方式作滅菌處理。所得注射液為淡黃色的澄明液體，然後置於冷凍乾燥機中進行凍幹15-28小時，即得到黃色疏鬆的凍乾粉針。
2.口服製劑的製備包括片劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、滴丸和微丸、各種溶液劑等。
作為固體口服製劑散劑是各種劑型的基礎，因為我們合成產生的衍生物都是淡黃色到黃色固體，進行烘乾然後粉碎成細粉(指全部能通過五號篩，含有能通過六號篩不少於95％的粉末。)然後過篩、加入適量輔料滑石粉增加其流動性，分裝，即得。
顆粒劑的製備把藥物與輔料粉碎後進行充分的混合，然後加入適當的粘合劑進行制粒，乾燥，整粒，分裝，即可。
膠囊劑的製備膠囊劑分為軟膠囊和硬膠囊，硬膠囊是採用藥物的粉末或者是顆粒進行裝膠囊製得，軟膠囊是把藥液密封於球形或軟質膠囊材料中。採用合適的材料幹明膠∶甘油∶水＝1∶0.4∶混合均勻，調配好作為軟膠囊的囊壁，溶液藥物PH值調到4.5-7.5，也可採用固體藥物粉末需要通過80目篩，然後滴製法或壓製法製備軟膠囊。另外，可以製成腸溶膠囊。
另外，按照常規製劑的程序，選用不同的輔料如乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)、聚丙烯等，作為緩控釋可以製成緩、釋控釋的製劑骨架。如將鳶尾苷元衍生物藥物製成微囊，然後裝入普通空膠囊中，可以成為按照需要進行藥物釋放的產品。
滴丸或微丸滴丸的優點是發揮藥效迅速，生物利用度高，副作用小，液體藥物製成固體滴丸便於服用和運輸，增加藥物穩定性，生產設備簡單，操作容易，重量差異小，成本低無粉塵，根據需要可以製成內服、外用、緩釋、控釋或局部治療等多種類型的滴丸劑。
取藥物基質，如聚乙二醇類、硬脂酸加熱後，將藥液與基質混合均勻，置於滴丸機中保溫，然後滴制到適當的冷凝劑中盛碗，洗除冷凝劑乾燥整理，經過質檢後包裝。
片劑包括普通壓製片、咀嚼片、泡騰片、多層片、緩釋片、控釋片，包衣片(糖衣片、薄膜衣片、腸溶衣片)、分散片、口含片、舌下片等鳶尾苷元衍生物50g，澱粉、糖粉950g，將以上原輔料進行粉碎、過篩、混合均勻，加入適量的粘合劑形成軟材，過篩，成為顆粒，乾燥整粒，加入崩解劑、潤滑劑充分混合，然後壓片，包衣，質檢，包裝。
緩釋片控釋片將鳶尾苷元衍生物50g，加入骨架劑聚乙稀、聚丙烯混合均勻，壓片，按照普通的製劑方法，製成緩釋片1000片。藥物緩緩釋放，在藥物釋放完後，骨架隨著糞便排出體外。
3.外用製劑的製備包括有洗劑、滴眼劑、噴霧劑、眼膏劑、凝膠劑、栓劑、搽劑、軟膏劑、滴鼻劑、滴耳劑、膜劑，透皮貼劑等。
眼膏劑將衍生物作為原料粉碎成極細粉(指全部能通過七號篩，含有能通過八號篩不少於95％的粉末。)加入適量基質，製備成眼用凝膠或者眼藥膏。
外用散劑的原輔料粉碎成最細粉(指全部能通過六號篩，含有能通過七號篩不少於95％的粉末。)一般作為外敷用的散劑可以殺滅病毒，或者預防病毒感染。
滴眼劑將鳶尾苷元衍生物20g進行配液加入PH值調節劑磷酸鹽緩衝液，調節PH值為5.9-8.0之間，加入滲透壓調節劑適量葡萄糖，調節滲透壓相當於0.6-1.5％氯化鈉的滲透壓，加入少量聚乙二醇粘度調節劑，加水980g配液後進行過濾，將濾液滅菌後無菌操作分裝入瓶即可。
噴霧劑、滴鼻劑、滴耳劑與滴眼劑的製備方法相似，只不過對於滲透壓、ph值要求不是很嚴格。
軟膏劑、搽劑、把鳶尾苷元衍生物40g粉碎成最細粉，採用水溶性基質聚乙二醇600和2000為基質960g(配比為4∶6)加熱混合均勻後，質檢分裝，可以得到有一定稠度的半固體外用製劑。
凝膠劑把鳶尾苷元衍生物40g粉碎，溶解在水中，把水溶性基質卡波普製成水凝膠基質，然後與藥物混合加水到1000ml，質檢分裝，可以得到透明或半透明的凝膠劑。
栓劑把鳶尾苷元衍生物40g粉碎成最細粉，採用水溶性基質聚乙二醇600和18000為基質960g(配比為4∶6)加熱混合均勻後，倒入塗有液體石蠟的模具中，冷卻成型，質檢包裝，可以得到符合規定的融變時限的固體外用製劑。
塗膜劑把鳶尾苷元的衍生物和高分子成膜材料聚乙稀縮甲乙醛(按照4∶96)共同溶解在乙醇裡製成了可以塗布成膜的外用製劑。
透皮貼劑首先把鳶尾苷元衍生物60g粉碎成細粉加水成為溶液，再把水溶性聚合物PVA、PVP加水混合均勻後，與藥物水溶液混合形成凝膠藥庫，質檢分劑量，同時把壓敏膠丙烯酸塗布在背襯材料聚丙烯上可以得到粘膠層，分割成大於藥庫面積，然後與凝膠藥庫複合，再在表面加上一層防粘材料聚乙稀高聚物，包裝形成透皮貼劑。
實施例9鳶尾苷元磺酸鈉的急性毒性實驗和抗病毒藥效實驗以上述得到的式(IV)鳶尾苷元磺酸鈉注射液(50mg/ml)為實驗樣品，進行了下述各項實驗一.急性毒性試驗以體重18～20g雌雄各半的小鼠為試驗動物，分別以肌肉注射、經脈注射和腹腔注射方式給藥。肌肉注射(im)給藥為以0.2ml/10g(500mg/kg)分別注射於雙側後腿肌肉處；靜脈注射(iv)為分組均以尾靜脈給藥，各組劑量分別是841.5mg/kg、781.25mg/kg、725.25mg/kg、673.25mg/kg、625.0mg/kg和580.2mg/kg；腹腔注射(ip)給藥劑量為0.4mg/10g(即相當於1000mg/kg)。分別觀察各組實驗動物給藥後的毒性反應情況及死亡情況，每天1次，至14天。發現死亡動物立即解剖觀察。用半數效量概率單位法(加權直線回歸法)測定半數致死劑量。實驗結果1.肌肉注射給藥的試驗動物精神狀態、被毛、飲食飲水、生長發育等各項反應均未見異常，注射後的14天內，20隻小鼠無1隻死亡，故一次肌肉注射給藥的小鼠最大耐受量為500mg/kg，半數致死量應在500mg/kg以上。2.經脈注射給藥試驗動物LD50＝725.81mg/kg，95％可信限為669.92mg/kg～785.53mg/kg；中試產品用序貫法測定的LD50＝868.2mg/kg，LD50的95％可信限為798.2～944.4mg/kg。3.腹腔注射試驗動物的14天內無1隻死亡，一次腹腔注射給藥的小鼠最大耐受量為1000mg/kg。
三種給藥途徑的急性毒性試驗結果表明，作為試驗樣品的上述抗病毒注射液的毒性較低，im和ip給藥均測不出LD50，最大耐受量分別為500mg/kg和1000mg/kg；iv的LD50為725.81mg/kg和868.2mg/kg。
二、體外抗病毒實驗試驗藥物為本發明的上述注射液樣品；對照藥物為注射用穿琥寧(40mg/ml)(批號000501，成都製藥三廠生產)；空白對照為Hanks液(四川省人民醫院檢驗科病毒實驗室提供)。
實驗用的細胞株為Hep-2、HL16C細胞(均由汕頭華茵生物工程應用研究所細胞工程研究室提供)。病毒株為腺病毒ADV3型，ADV7型，呼吸道合胞病毒(RSV)，流感病毒(Flu·V)甲1、甲3型，及柯薩奇B組病毒(CoxBV)混全株(分別由首都兒科研究所、中國預防醫科院病毒研究所和四川省衛生防疫站提供)，試驗前分別測TCID50。
實驗方法1.細胞毒性試驗取試驗樣品注射液、注射用穿琥寧，用Hanks液分別從10mg/ml作倍比稀釋，二種稀釋後的藥液即為10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml。取以上二種藥物4種不同濃度藥液分別接種Hep-2、Z-HL16C細胞，同步設細胞對照加足2％小牛血清Eagles維持液，置37℃溫箱，逐日觀察以上細胞毒性反應。細胞毒性試驗結果如表2所示。
表2細胞毒性試驗結果藥物濃度(mg/ml) 病毒對照藥物 病毒1052.51.25 對照細胞Hep-2- -- - - -試驗樣品Z-HL16C - -- - - -Hep-2- -- - - -穿琥寧Z-HL16C - -- - - -空白對照 Hep-2- -- - - -(Hanks液)Z-HL16C - -- - - -(注「-」表示細胞無任何毒性反應)表2的結果顯示，各劑量組(10～1.25mg/ml)的試驗樣品藥液和對照藥穿琥寧，以及空白對照(Hanks液)，對Hep-2和Z-HL16C細胞均無任何毒性反應。
2.抗病毒試驗取100TCID50ADV3、ADV7、Flu·V甲1、甲3型、CoxBV及RSV病毒分別接種Hep-2和Z-HL16C細胞(Flu·V、甲1、甲3型接種Z-HL16C細胞)，等吸附30分鐘後，洗去病毒液分別加入試驗樣品和穿琥寧無毒界限藥液，(即10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml)同時設病毒對照、細胞對照、空白對照(Hanks液)同步與以上藥物同時進行。細胞維持液為2％小牛血清Eagles液，置37℃培養箱內，每天觀察Hep-2、Z-HL16C細胞病變，記錄各細胞管病變情況。抗RSV試驗，接種病毒和無毒界線藥物後，平放37℃培養箱24小時後，移放35℃旋轉培養器(12轉/分)、逐日觀察細胞病變。細胞管出現PH下降，應立即進行換液。試驗中凡病毒對照出現2+～3+病變，細胞對照管，形態正常，生長良好，可終止該試驗。試驗結果如表3所示。
表3的結果顯示，本發明試驗樣品注射液10mg/ml藥液對ADV3、ADV7、CoxBV、Flu·V甲1及RSV的致細胞病變具有抑制作用，對Flu·V甲3有部分抑制作用。5mg/ml藥液對Flu·V甲1、RSV的致細胞病變具有抑制作用，對ADV3、CoxBV有部分抑制作用。2.5mg/ml藥液對Flu·V甲1有抑制作用。穿琥寧10mg/ml藥液對ADV3.7、CoxBV、Flu·V甲1及RSV的致細胞病變具有抑制作用。其它濃度藥液及空白對照各管均不能抑細胞病變。
表3抗病毒試驗報告藥物濃度(mg/ml) 病毒對照藥物 病毒105 2.51.25對照細胞AdV3- 1+2+ 3+ 3+ -AdV7- 2+3+ 3+ 3+ -CoxBV - 1+2+ 3+ 3+ -試驗樣品Flu·V甲1- - - 2+ 3+ -Flu·V甲31+2+2+ 3+ 3+ -RSV- - 2+ 3+ 3+ -AdV3- 2+2+ 3+ 3+ -AdV7- 2+2+ 3+ 3+ -CoxBV - 2+2+ 3+ 3+ -穿琥寧Flu·V甲1- 2+2+ 3+ 3+ -Flu·V甲32+2+2+ 3+ 3+ -RSV- 2+3+ 3+ 3+ -AdV33+3+3+ 3+ 3+ -AdV73+3+3+ 3+ 3+ -空白對照 CoxBV 3+3+3+ 3+ 3+ -(Hanks液)Flu·V甲13+3+3+ 3+ 3+ -Flu·V甲33+3+3+ 3+ 3+ -RSV3+3+3+ 3+ 3+ -(注「-」表示細胞無病變。1+--3+表示細胞病變程度。)上述的實驗結果表明，在感染100TCID50病毒的情況下，本發明試驗樣品注射液10mg/ml濃度下對腺病毒3型、腺病毒7型、柯薩奇B組病毒、流感病毒甲1、甲3型及呼吸道合胞病毒均有不同程度的抑制作用，對流感病毒甲1及呼吸道合胞病毒抑制作用效果較好。對照藥物穿琥寧10mg/ml的藥液對腺病毒病毒3型、腺病毒7型、柯薩奇B組病毒、流感病毒甲1、甲3型及呼吸道合胞病毒均有抑制作用。實驗結果已提示，本發明的試驗樣品注射液對流感病毒甲1型及呼吸道合胞病毒的抑制作用均可優於目前已有使用的注射用穿琥寧藥物。
實施例10抗病毒藥效實驗以上述的各例典型鳶尾苷元衍生物作為試驗藥物樣品，進行了下述各項藥效實驗。
一、抗病毒實驗各試驗藥物為本發明的衍生物製成的注射液樣品，和口服膠囊、顆粒、片劑、溶液劑及滴眼劑、搽劑、乳膏、洗劑、滴眼劑等外用劑；對照藥物為注射用穿琥寧(40mg/ml)(成都製藥三廠生產)；病毒唑空白對照為Hanks液(四川省人民醫院檢驗科病毒實驗室提供)。
實驗用的細胞株為Hep-2、Z-HL16C細胞(均由第四軍醫大學細胞工程研究室提供)。病毒株為腺病毒ADV3型，ADV7型，呼吸道合胞病毒(RSV)，流感病毒(Flu·V)甲1、甲3型，及柯薩奇B組病毒(CoxBV)混全株(分別由中國預防醫科院病毒研究所和四川省衛生防疫站提供)，試驗前分別測TCID50。
實驗方法
1.細胞毒性試驗將試驗樣品注射劑、口服膠囊、顆粒、片劑、丸劑，滴眼液、眼膏劑等外用製劑進行溶解，配製成需要的濃度，注射用穿琥寧，用Hanks液分別從10mg/ml作倍比稀釋，稀釋後的藥液即為10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml。取以上二種藥物4種不同濃度藥液分別接種Hep-2、Z-HL16C細胞，同步設細胞對照加足2％小牛血清Eagles維持液，置37℃溫箱，逐日觀察以上細胞毒性反應。細胞毒性試驗結果如表4所示。
表4細胞毒性試驗結果藥物濃度(mg/ml)對照藥物 細胞852.51.25 細胞Hep-2--- - -化合物(□)Z-HL16C --- - -Hep-2--- - -化合物(VI)Z-HL16C --- - -Hep-2--- - -化合物(VII)Z-HL16C --- - -Hep-2--- - -化合物(VIII)Z-HL16C --- - -Hep-2--- - -化合物(IX)Z-HL16C --- - -Hep-2--- - -化合物(X)Z-HL16C --- - -空白對照 Hep-2--- - -(Hanks液)Z-HL16C --- - -(注「-」表示細胞無任何毒性反應)表4的結果顯示，各劑量組(8～1.25mg/ml)的試驗樣品藥液和對照藥穿琥寧，以及空白對照(Hanks液)，對Hep-2和Z-HL16C細胞均無任何毒性反應。
2.抗病毒試驗取100TCID50ADV3、ADV7、Flu·V甲1、甲3型、CoxBV及RSV病毒分別接種Hep-2和Z-HL16C細胞(Flu·V、甲1、甲3型接種Z-HL16C細胞)，等吸附30分鐘後，洗去病毒液分別加入試驗樣品和穿琥寧無毒界限藥液，(即8mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml)同時設病毒對照、細胞對照、空白對照(Hanks液)同步與以上藥物同時進行。細胞維持液為2％小牛血清Eagles液，置37℃培養箱內，每天觀察Hep-2、Z-HL16C細胞病變，記錄各細胞管病變情況。抗RSV試驗，接種病毒和無毒界線藥物後，平放37℃培養箱24小時後，移放35℃旋轉培養器(12轉/分)、逐日觀察細胞病變。細胞管出現PH下降，應立即進行換液。試驗中凡病毒對照出現2+～3+病變，細胞對照管，形態正常，生長良好，可終止該試驗。試驗結果如表5所示。
表5的結果顯示，本發明試驗樣品注射液10mg/ml藥液對ADV3、ADV7、CoxBV、Flu·V甲1及RSV的致細胞病變具有抑制作用，對Flu·V甲3有部分抑制作用。5mg/ml藥液對Flu·V甲1、RSV的致細胞病變具有抑制作用，對ADV3、CoxBV有部分抑制作用。2.5mg/ml藥液對Flu·V甲1有抑制作用。穿琥寧8mg/ml藥液對ADV3.7、CoxBV、Flu·V甲1及RSV的致細胞病變具有抑制作用。其它濃度藥液及空白對照各管均不能抑細胞病變。
表5抗病毒試驗報告藥物濃度(mg/ml) 病毒對照藥物病毒8 5 2.5 1.25對照細胞AdV3- 1+ 1+ 2+ 3+ -AdV7- 1+ 2+ 2+ 3+ -CoxBV - 1+ 1+ 3+ 3+ -化合物 Flu·V甲1- - -2+ 3+ -(□)Flu·V甲3- 1+ 2+ 3+ 3+ -RSV - - 2+ 3+ 3+ -HSV-1 - - -1+ 3+ -VZV - 1+ 1+ 1+ 3+ -AdV3- 1+ 2+ 3+ 3+ -AdV7- 2+ 2+ 3+ 3+ -CoxBV - 2+ 2+ 2+ 3+ -化合物 Flu·V甲1- - -2+ 3+ -(VI)Flu·V甲31+ 2+ 2+ 3+ 3+ -RSV - - 2+ 3+ 3+ -HSV-1 - 1+ 2+ 3+ 3+ -VZV - 2+ 2+ 3+ 3+ -AdV3- 1+ 1+ 2+ 3+ -AdV7- 2+ 3+ 3+ 3+ -CoxBV - 1+ 2+ 3+ 3+ -化合物Flu·V甲1- - -2+ 3+ -(VII)Flu·V甲31+ 2+ 2+ 3+ 3+ -RSV - - 2+ 3+ 3+ -HSV-1 - 1+ 1+ 1+ 3+ -VZV - 1+ 1+ 2+ 3+ -AdV3- 1+ 2+ 3+ 3+ -AdV7- 2+ 3+ 3+ 3+ -CoxBV - 1+ 2+ 3+ 3+ -化合物 Flu·V甲1- - -2+ 3+ -(VIII) Flu·V甲31+ 2+ 2+ 3+ 3+ -RSV - - 2+ 3+ 3+ -HSV-1 - 1+ 1+ 2+ 3+ -VZV - - 2+ 2+ 3+ -AdV3- 1+ 3+ 3+ 3+ -AdV7- 2+ 3+ 2+ 3+ -CoxBV - 1+ 2+ 3+ 3+ -Flu·V甲1- - -2+ 3+ -化合物Flu·V甲31+ 2+ 2+ 3+ 3+ -(IX)RSV - - 2+ 2+ 3+ -HSV-1 - - 2+ 2+ 3+ -VZV 1+ 2+ 2+ 3+ 3+ -化合物 AdV3- 1+ 2+ 3+ 3+ -(X) AdV7- 2+ 3+ 3+ 3+ -
CoxBV - 1+ 3+ 3+ 3+ -Flu·V甲1- - -2+ 3+ -Flu·V甲31+ 2+ 2+ 3+ 3+ -RSV - - 2+ 3+ 3+ -HSV-1 - 1+ 2+ 3+ 3+ -VZV - - 1+ 2+ 3+ -AdV3- 1+ 2+ 3+ 3+ -AdV7- 2+ 3+ 3+ 3+ -CoxBV - 2+ 2+ 3+ 3+ -利巴韋 Flu·V甲1- 1+ 1+ 3+ 3+ -林 Flu·V甲31+ 3+ 3+ 3+ 3+ -RSV - - 2+ 3+ 3+ -HSV-1 - 1+ 2+ 3+ 3+ -VZV - 1+ 2+ 3+ 3+ -AdV3- 2+ 2+ 3+ 3+ -AdV7- 2+ 2+ 3+ 3+ -CoxBV - 2+ 2+ 3+ 3+ -Flu·V甲1- 2+ 2+ 3+ 3+ -穿琥寧Flu·V甲32+ 2+ 2+ 3+ 3+ -RSV - 2+ 3+ 3+ 3+ -HSV-1 1+ 2+ 3+ 3+ 3+ -VZV 1+ 2+ 3+ 3+ 3+ -AdV33+ 3+ 3+ 3+ 3+ -AdV73+ 3+ 3+ 3+ 3+ -空白對 CoxBV 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ -照 Flu·V甲13+ 3+ 3+ 3+ 3+ -(Hanks Flu·V甲33+ 3+ 3+ 3+ 3+ -液) RSV 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ -HSV-1 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ -VZV 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ -(注「-」表示細胞無病變。1+～3+表示細胞病變程度。)上述的實驗結果表明，在感染100TCID50病毒的情況下，本發明試驗樣品注射液10mg/ml濃度下對腺病毒3型(ADV3)、腺病毒7型(ADV7)、柯薩奇B組病毒(CoxBV)、流感病毒甲1、(Flu·V甲1)甲3型(Flu·V甲3型)及呼吸道合胞病毒(RSV)均有不同程度的抑制作用，對流感病毒甲1及呼吸道合胞病毒抑制作用效果較好。對照藥物穿琥寧10mg/ml的藥液對腺病毒病毒3型、腺病毒7型、柯薩奇B組病毒、流感病毒甲1、甲3型及呼吸道合胞病毒均有抑制作用。實驗結果已提示，本發明的試驗樣品對流感病毒甲1型及呼吸道合胞病毒的抑制作用均可優於目前已有使用的注射用穿琥寧和利巴韋林。
3.抗SARS病毒試驗採用北京SARS流行期間病人肺組織分離的病毒BJ01株和Vero-E6細胞，研究鳶尾苷元衍生物對Vero-E6細胞的毒性和對Vero-E6細胞內冠狀病毒的抑制作用。
3.1試驗材料(1)受試藥將上述各鳶尾苷元衍生物配製成注射液即迪康抗病毒注射液(50mg/2ml)，由四川迪康科技藥業股份有限公司提供，批號20030301。
(2)陽性對照藥物利巴韋林(病毒唑)注射液，0.1g/ml，山東新華製藥股份有限公司生產，批准文號H19993063，生產批號02100020。臨床用途用於呼吸道胞病毒引起的病毒性肺炎與支氣管炎。臨床成人日用量為一次0.5g，一日2次。
(3)細胞Vero-E6細胞，本室細胞庫保存。用含10胎牛血清的DMEM培養液，在37℃5％CO2培養箱培養，2-3天，傳代一次。
(4)病毒株冠狀病毒，2003年2月SARS病流行期間，從北京病人肺組織中分離，命名為BJ01株。
(5)試劑DMEM培養基和胎牛血清，GibcolBRL公司產品，批號分別為31600-026和16000-36。
(6)儀器96孔細胞培養板，Coming公司。生物倒置顯微鏡XDS-1B型，重慶光學儀器廠。
3.2方法和結果(1)藥品的配製方法受試藥鳶尾苷元衍生物，為淡黃色液體，4℃冰箱保存。陽性對照藥配製成10mg/ml母液。使用時用細胞生長液配製成所需濃度。
鳶尾苷元衍生物對細胞的毒性試驗每毫升30-40萬個Vero-E6細胞接種96孔細胞培養板，每孔0.1ml，置37℃5％CO2培養箱培養18小時，加入不同濃度的測試藥，每個濃度4孔，每孔0.4ml，同時設無藥物細胞對照組，培養4-5天，以觀察細胞病變(CPE)為指標，第五天在倒置顯微鏡下觀察CPE，完全病變為4；75％為3；50％為2；25％為1；無病變為0。試驗重複二次。按照REED-MUENCHy方法計算半數有毒濃度(TD50)和最大無毒濃度(TD0)，結果見表6。
表6鳶尾苷元衍生物注射液對Vero-E6細胞的毒性藥物 藥物濃度 病變孔數/細胞孔數稀釋度mg/ml鳶尾苷元衍生物細胞對照組1∶2 43/4 0/41∶4 22/4 0/41∶8 10/4 0/41∶16 0.5 0/4 0/41∶32 0.25 0/4 0/4由表6計算可知，迪康抗病毒注射液對Vero-E6細胞最大無毒濃度(TD0)為1mg/ml，半數中毒濃度(TD50)為2.34mg/ml。說明鳶尾苷元衍生物對Vero-E6細胞的毒性比較小，安全性較好。
4.鳶尾苷元衍生物對冠狀病毒的抑制試驗(細胞病變法)將Vero-E6細胞接種到96孔培養板，37℃培養到單層，棄掉生長液。將冠狀病毒BJ01株第4代病毒液用DMEM維持液稀釋為100個TCID50/0.1ml，每孔0.1ml接種Vero-E6細胞，吸附2小時，棄掉病毒液。設立正常細胞對照組、病毒對照組和陽性藥物對照組。置於37℃，5％CO2培養箱中培養，每天觀察細胞病變，觀察5天，記錄CPE，試驗重複兩次，結果基本一致。按REED-MUENCH方法計算半數有效濃度(IC50)，治療指數(TI)，結果見表7。
表7鳶尾苷元衍生物對冠狀病毒的抑制作用藥物藥物濃度 病變孔數/細胞孔數稀釋度 mg/ml 鳶尾苷元病毒對照陽性對照正常細胞對衍生物 藥 照1∶11 0/4 4/4 0/4 0/41∶20.51/4 4/4 1/41∶40.25 1/4 4/4 2/41∶80.125 1/4 4/4 2/41∶16 0.0625 2/4 4/4 3/41∶32 0.031254/4 4/4 4/4由表7計算可知，鳶尾苷元衍生物濃度0.0976mg/ml對冠狀病毒具有抑制作用。
四、結論如下表8鳶尾苷元衍生物對Vero-E6細胞的毒性和對冠狀病毒抑制作用總結表藥物名稱 TD50IC50(mg/ml) (mg/ml)化合物IV 4.340.0976化合物V4.520.0968化合物VI 3.850.1200化合物VII 4.200.1015化合物VIII 3.450.1120化合物IX 2.890.1251化合物X3.950.1187上述的試驗結果表明(1)本發明的鳶尾苷元衍生物對Vero-E6細胞的毒性鳶尾苷元衍生物加入Vero-E6細胞培養5天，以細胞病變為指標，半數中毒濃度(TD50)為2.34mg/ml，最大無毒濃度(TD0)為1mg/ml。
(2)鳶尾苷元衍生物在Vero-E6細胞內對冠狀病毒具有抑制作用鳶尾苷元衍生物注射液加入Vero-E6細胞培養5天，半數有效濃度(IC50)為0.0976mg/ml，鳶尾苷元衍生物注射液對冠狀病毒的最小治療指數為23.98。
5.對禽流感H5N1和H9N2亞型病毒的殺滅效果試驗以上述各實施例的鳶尾苷元衍生物作為試驗藥物，進行了下述體外殺滅禽流感病毒(AIV)的試驗。
(1)材料與方法1.1受試藥各實施例的鳶尾苷元衍生物溶液(淡黃色液體，每毫升含30mg生藥)。
1.2禽流感病毒毒株為A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)、A/Chicken/Shandong/6/96(H9N2)，由依託於中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所的農業部動物流感重點開放實驗室保存。
1.3雞胚10日齡SPF雞胚，由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供。
1.4預備試驗1.4.1病毒EID50的測定將禽流感H5、H9亞型病毒10倍系列稀釋，接種10日齡SPF雞胚，每個稀釋度5枚雞胚(0.1ml/胚)，測定病毒的半數感染劑量(EID50)。
1.4.2受試藥母液的調製上述的各鳶尾苷元衍生物為母液，每毫升含30mg生藥。
1.4.3受試藥對雞胚的最大無毒劑量將每毫升30mg、15mg、7.5mg、3.75mg、1.875mg、0.9375mg、0.46875mg、0.234375mg、0.1171875mg生藥的受試藥溶液分別接種10日齡SPF雞胚，第個稀釋度接種5枚雞胚(0.1ml/胚)。將接種的雞胚置37℃溫箱中培養96小時。24小時死亡的雞胚去掉，記錄雞胚死亡情況。
1.5受試藥對病毒的殺滅率試驗採用Klein-Defors懸浮方法進行受試藥對強、弱兩種禽流感病毒的殺滅試驗，以滅菌生理鹽水對受試藥進行10倍系列稀釋，接種並檢測感染雞胚情況。
1.5.1病毒懸液的製備分別將禽流感H5、H9亞型病毒製成107.63EID50/0.1ml、108.17EID50/0.1ml病毒懸液。
1.5.2受試藥的配製以上述的各鳶尾苷元衍生物為原料，做殺滅試驗時用滅菌生理鹽水稀成所需的濃度。
1.5.3 Klein-Defors懸浮殺滅試驗分別取107.63EID50禽流感H5亞型病毒懸液、108.17EID50H9亞型病毒懸液與濃度為每毫升含30mg、15mg、7.5mg、3.75mg、3.0mg、1.875mg、1.5mg、0.75mg、0.375mg生藥的鳶尾苷元衍生物按1∶9混合，在20±1℃條件下作用5分鐘後，再用滅菌生理鹽水做10倍遞進稀釋。對照組用滅菌生理鹽水代替消毒液，同法處理；稀釋液接種10日齡SPF雞胚，每個稀釋度接種5枚雞胚(0.1ml/胚)。將接種的雞胚置37℃溫箱中培養，記錄雞胚死亡情況。24小時以內死亡的雞胚去掉，24小時以後的死胚及時取出，至96小時全部取出，逐個取尿囊液做血凝(HA)試驗，血凝試驗陽性者判為雞胚感染。
按照雞胚感染的結果，按下列方程式計算試驗組和對照組雞胚感染的陽性率、樣本含EID50與殺滅率。
陽性率＝血凝陽性雞胚數/接種雞胚數；樣本含EID50量的對數＝L-d(S-0.5)(L為最低稀釋倍數的對數；d為稀釋度間對數的差；S為各稀釋列陽性率之和。)病毒殺滅率＝(對照樣本含EID50量-試驗樣本含EID50量/對照樣本含EID50量×100％)(2)試驗結果2.1受試藥對雞胚的最大無毒劑量用滅菌生理鹽水稀釋的每毫升含30mg、15mg、7.5mg、3.75mg、1.875mg、0.9375mg、0.46875mg、0.234375mg、0.1171875mg生藥的鳶尾苷元衍生物注射雞胚，試驗結果顯示不同濃度藥物接種雞胚後不引起雞胚死亡，表明受試藥原液及原液的各種稀釋度藥物對雞胚無眼觀毒害作用。結果如表9所示。
表9受試藥對雞胚的最大無毒劑量
注分子為死亡胚數，分母為接胚數2.2受試藥對禽流感病毒的殺滅作用用滅菌生理鹽水稀釋的每毫升30mg、15mg、7.5mg、3.75mg、3.0mg、1.875mg、1.5mg、0.75mg、0.375mg的鳶尾苷元衍生物與107.63EID50禽流感H5亞型病毒液作用5分鐘，分別測定殺滅病毒率，各稀釋濃度的鳶尾苷元衍生物與108.17EID50禽流感H9亞型病毒作用5分鐘，分別測定殺滅病毒率。結果見表10。
表10不同濃度的鳶尾苷元衍生物對禽流感H5N1、H9N2亞型病毒的殺滅作用
上述試驗結果顯示採用Klein-Defors懸浮殺滅與感染試驗方法，研究鳶尾苷元衍生物在不同濃度下，分別與禽流感H5N1和H9N2(9∶1)在體外直接接觸作用5分鐘，以此來檢測體外該受試藥對禽流感病毒的殺滅效果。結果表明，鳶尾苷元衍生物每毫升含3.0mg生藥的濃度時與禽流感病毒作用5分鐘，有一定的殺病毒作用；每毫升含3.75-30mg生藥的濃度範圍內與禽流感病毒作用5分鐘，對病毒的殺滅率可達到95％以上，有良好的殺病毒作用。
安全性試驗顯示，母液系列稀釋接種雞胚，不引起雞胚死亡，表明受試藥母液及原液的各種稀釋度藥物以對雞胚無眼觀毒害作用。
這些試驗結果均清楚顯示，經本發明化學修飾後所得到的式(II)結構形式的鳶尾苷元化合物衍生物，在保持了與其前體原料，即原始提取得到的鳶尾苷元化合物相當的抗病毒、抗炎作用的前提下，能極大地提高了其水溶性及化學穩定性，且製備方法簡便，成本低廉，安全可靠，無需特殊設備，也無「三廢」汙染。由於中藥的成分複雜，質量穩定性難以控制，因此本發明提供的鳶尾苷元的異黃酮化合物衍生物，對於擴大其在製藥及臨床上的使用範圍，特別是在能將其製備成具有抗病毒、抗炎作用的注射液方面，具有重要的積極意義和良好的發展前景。
權利要求
1.化學名稱為5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮類的鳶尾苷元化合物的衍生物，結構如式(II)所示 其中式中的R1為H、NH2或SO3M；R2為OR′；R3為H或-CH2NR″；其中R′為H、-CH2COONa或-CH2CH2NMe2；NR″為 或-NMe2；M為H、Na、K或N+H(CH2CH2OH)3。
2.如權利要求1所述的鳶尾苷元化合物的衍生物，其特徵是所說的式(II)結構中的R1為SO3M″，其中M″可以為H、Na、K或-N+H(CH2CH2OH)3，結構如式(III)所示
3.如權利要求2所述的鳶尾苷元化合物的衍生物，其特徵是所說的式(III)結構中的M″為Na，結構如式(IV)所示
4.如權利要求2所述的鳶尾苷元化合物的衍生物，其特徵是所說的式(III)結構中的R1為-SO3-N+H(CH2CH2OH)3，結構如式(V)所示
5.如權利要求1所述的鳶尾苷元化合物的衍生物，其特徵是所說的式(II)結構中的R1為NH2，R2為OH，R3為H，結構如式(VI)所示
6.如權利要求1所述的鳶尾苷元化合物的衍生物，其特徵是所說的式(II)結構中的R1為H，R2為-OCH2COONa，R3為H，結構如式(VII)所示
7.如權利要求1所述的鳶尾苷元化合物的衍生物，其特徵是所說的式(II)結構中的R1和R3為H，R2為OCH2CH2NMe2，結構如式(VIII)所示
8.如權利要求1所述的鳶尾苷元化合物的衍生物，其特徵是所說式(II)結構中的R1為H，R2為OH，R3為-CH2NR″，其中NR″為 結構如式(IX)所示
9.如權利要求1所述的鳶尾苷元化合物的衍生物，其特徵是所說式(II)結構中的R1為H，R2為OH，R3為-CH2NMe2，結構如式(X)所示
10.如權利要求5、7、8或9所述的鳶尾苷元化合物的衍生物，其特徵是所說結構的化合物為其藥學上可以接受的鹽類化合物。
11.如權利要求10所述的鳶尾苷元化合物的衍生物，其特徵是所說的鹽類化合物為鹽酸鹽。
12.製備上述通式(III)中的R1為磺酸或磺酸鹽類的鳶尾苷元化合物的方法，其特徵是以式(I)的異黃酮類鳶尾苷元化合物為原料，與硫酸經磺化反應得到式(III)中的M」為H的磺酸衍生物產物，進一步用如NaCl或KCl等飽和鹽類水溶液進行處理後，即可以得到上述式(IV)的相應磺酸鈉或磺酸鉀化合物，合成路線為
13.製備上述式(V)所示結構的鳶尾苷元化合物的方法，其特徵是以式(I)結構的異黃酮類鳶尾苷元化合物為原料與濃硫酸混合，在40-90℃加熱攪拌反應，冷卻後傾入飽和的氯化鈉或其他鹼金屬的鹽酸鹽、氫溴酸鹽或硝酸鹽溶液中，得3′-磺酸鈉中間產物，將其懸浮於乙醇溶液中並加入強酸型陽離子樹脂室溫攪拌使全部溶解，然後加入三乙醇胺，再減壓蒸去溶劑，得到化合物(V)，合成路線為
14.製備上述式(VI)所示結構的鳶尾苷元化合物的方法，其特徵是以式(I)結構的異黃酮類鳶尾苷元化合物為原料，在冰浴冷卻下滴加硝酸和濃硫酸混酸的乙醇溶液，得到3′-硝基中間化合物，然後將其溶於甲醇中，在常壓下以氫催化還原得到3′-氨基取代的化合物(VI)，並且可以進一步與藥物中可以接受的酸反應得到式(VI)結構的相應鹽類化合物，合成路線為
15.製備上述式(VII)所示結構的鳶尾苷元化合物的方法，其特徵是將式(I)結構的異黃酮類鳶尾苷元化合物為原料與氯乙酸乙酯在丁酮和DMF混和溶劑中，加入無水k2CO3和催化量的NaI，攪拌下回流反應後，冷卻至室溫並濾除不溶物，減壓濃縮濾液，殘餘物溶於適量水中，再乙酸乙酯提取和水洗，乾燥後減壓濃縮溶劑，flash柱分離，得4′-酯醚中間產物，用甲醇溶解後，攪拌下滴加NaOH水溶液後進行常溫水解反應完全，再用酸調節至pH3～4，減壓蒸除甲醇得絮狀沉澱並溶於乙酸乙酯，水洗、乾燥，濃縮後與NaHCO3反應製成鈉鹽，得到化合物(VII)，合成路線為
16.製備上述式(VIII)所示結構的鳶尾苷元化合物的方法，其特徵是先將β-二甲氨基乙醇於0℃條件下滴加入二氯亞碸並劇烈攪拌，滴完後於35～50℃攪拌反應，然後用無水乙醇重結晶，得中間產物β-二甲胺基氯乙烷鹽酸鹽A，將式(I)結構的異黃酮類鳶尾苷元化合物為原料溶於丁酮、丙酮、DMF、THF或二氧六環中，加入無水K2CO3或Na2CO3以及DMF及催化量的NaI，加熱至回流，分次加入上述中間產物A，80℃左右回流，待卻後過濾，將濾液濃縮得粘狀物，適量水稀釋後，用乙酸乙酯提取，提取液用水洗後乾燥並出去溶劑，得到化合物(VIII)，並且可以進一步與藥學上可以接受的酸反應得到式(VIII)結構的相應鹽類化合物，合成路線為
17.製備上述式(IX)所示結構的鳶尾苷元化合物的方法，其特徵是將式(I)結構的異黃酮類鳶尾苷元化合物原料、重量百分比為37％的甲醛溶液、哌啶以及二氧六環、THF、甲醇或乙醇中的一種混和，回流反應後冷卻，過濾得到化合物(IX)，並且可以進一步與藥學上可以接受的酸反應得到式(IX)結構的相應鹽類化合物，合成路線為
18.製備上述式(X)所示結構的鳶尾苷元化合物的方法，其特徵是將式(I)結構的異黃酮類鳶尾苷元化合物原料、重量百分比為37％的甲醛溶液、二甲胺的鹽酸鹽以及二氧六環、THF、甲醇或乙醇中的一種混和，回流反應後待冷，濾集沉澱得到化合物(X)，並且可以進一步與藥物中可以接受的酸反應得到式(X)結構的相應鹽類化合物，合成路線為
19.用於抗病毒的藥物，其特徵是以有效用量的式(II)所示結構的鳶尾苷元化合物的衍生物為有效藥用成分，與藥物中可接受的輔助添加成分共同組成。
20.如權利要求19所述的用於抗病毒的藥物，其特徵是所說的藥物為注射型製劑。
21.製備以鳶尾苷元化合物衍生物(II)為有效藥物成分的注射劑藥物的方法，其特徵是將鳶尾苷元衍生物(II)5-80重量份和注射用葡萄糖20-150重量份，溶解於700～800重量份的注射用水中，溶解完全後再加入注射用水補足至相當於1000重量份的總體積，G4垂熔玻砂漏鬥過濾後，經常規封裝和滅菌處理，得到淡黃色澄明液體的注射液，使其中的葡萄糖含量2-15％，有效藥物成分的含量為5-80mg/ml。
全文摘要
本發明涉及如式(II)所示結構的異黃酮類的鳶尾苷元化合物衍生物，其製備方法及以其為有效藥用成分的抗病毒藥物。該化合物的結構如圖式中R
文檔編號C07D311/00GK1594308SQ20041004448
公開日2005年3月16日 申請日期2004年5月14日 優先權日2003年5月15日
發明者徐學明, 袁崇軍, 王笳, 齊尚斌, 銀海, 曾雁鳴, 馮麗霞, 李建 申請人:成都迪康藥物研究所, 四川迪康科技藥業股份有限公司