產大環糊精4-α-糖基轉移酶的製備方法
2023-10-05 18:33:24 2
專利名稱：：產大環糊精4-α-糖基轉移酶的製備方法
技術領域：
：產大環糊精4-a-糖基轉移酶的製備方法，屬於酶工程
技術領域：
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背景技術：
：大環糊精是區別於常見環糊精，聚合度從9到幾百不等的環狀葡聚糖。由於大環糊精具有高水溶性、低黏度和不回生等特性，可以廣泛地用於食品工業、化學工業、製藥工業中。大環糊精主要是糖基轉移酶產生的。國外對產大環糊精的糖基轉移酶的研究已經進行了幾十年，而國內僅近幾年有人開始進行研究，在生產常見環糊精方面取得了巨大的成就，但是對於產大環糊精酶的研究成果很少。本發明涉及的產大環糊精的4-a-糖基轉移酶是在韓國首爾大學樸教授的幫助下構建的基因工程菌(DH一5a-TA保藏編號CGMCCNo.3093)表達產生的。粗酶酶液顏色淺，無需脫S處理，可通過70'C保溫10min處理對酶進行初步純化，提高目標酶的含量。從基因工程菌中分離得到的酶與環境微生物中提取得到的酶相比，具有更高的耐熱性能，分離純化步驟簡便易行，為實現大規模工業化生產奠定了很好的基礎。
發明內容本發明的目的在於提供一種產大環糊精4-a-糖基轉移酶的製備方法。本發明的技術方案一株產4-a-糖基轉移酶的菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌(&A^7'C^""/0，己保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.3093。一種產大環糊精4-a-糖基轉移酶的製備方法，以大腸埃希氏菌(&c/2en'c/n'"co/OCGMCCNo.3093為出發菌株，經搖瓶發酵製備種子培養基、發酵罐發酵培養、收集菌體，超聲破壁提取粗酶、純化得到純酶4-a-糖基轉移酶，步驟為1)單菌落挑選以接菌環從基因工程菌種CGMCCNo.3093中蘸取少量菌液劃含100嗎/mL氨卞青黴素鈉的LB平板，將平板放置在生化培養箱中37°C恆溫培養12小時；2)種子培養:挑取單菌落接種於50mL含氨卞青黴素鈉100^ig/mL的LB培養基的三角瓶中，將三角瓶固定在恆溫搖床上37°C、200轉/分鐘振蕩培養8h製成種子培養基；3)發酵培養將種子培養基接種至含氨卞青黴素鈉100(xg/mL的3L培養基的發酵罐中，調節溫度37'C、攪拌速度200轉/分鐘、pH為7.5，通氣量為10L/h，接種量為10%，添加10mL/L豆油作為消泡劑，在此條件下發酵培養7h;4)收集菌體、超聲破壁提取粗酶將上述發酵液轉移至250mL離心杯中，4000轉/分鐘條件下離心20分鐘，收集沉澱即為溼菌體；將溼菌體放入事先預冷的pH7.5、0.05mol/L、20mLTris-HCl緩衝溶液中，400W超聲3s、間隔2s、冰浴超聲10分鐘；將經過超聲破壁處理的菌液4"C、10000rpm離心10分鐘，收集上清液，即為粗酶液；5)酶的純化將粗酶液70。C保溫10min，然後於4。C、10000rpm離心10分鐘，收集上清液即為經初步純化的酶液；用5倍柱體積的50mMTris-HClpH7.5、300mMNaCl、20mM咪唑的潤洗緩衝液平衡Ni-NTA親和柱；將經初步純化的酶液全部注入潤洗後的Ni-NTA親和柱；先用50倍柱體積的潤洗緩衝液進行洗脫，除去不被親和柱保留的雜蛋白，然後用2倍柱體積的50mMTris-HClpH7.5、300mMNaCl、250mM咪唑的洗脫緩衝液洗脫，收集洗脫液，內含目標蛋白；將含目標蛋白的洗脫液裝至分子量1000Da的透析袋，透析袋兩端扎口後放入去離子水浴中透析脫鹽，水浴室溫攪拌12h，每隔4h更換一次去離子水，脫鹽完成後將透析袋放於含聚乙二醇2萬的大燒杯中進行濃縮，4h後收集濃縮液即得純酶液。本發明的有益效果從基因工程菌中分離得到的酶與環境微生物中提取得到的酶相比，具有更高的耐熱性能，分離純化步驟簡便易行，為實現大規模工業化生產奠定了很好的基礎。該酶的最適溫度為75°C，最適pH為7.5，經初步純化並冷凍乾燥得到的4-a-糖基轉移酶的活力可達700010000U/g。4-a-糖基轉移酶能夠作用直鏈澱粉產生大環糊精，還能夠對支鏈澱粉進行修飾生成慢消化澱粉，改變澱粉的流變學特性和抗性，從而能夠促進澱粉在更廣範圍內大規模的應用，該酶可廣泛應用於食品、醫藥等行業，具有巨大的潛在商業價值。生物材料樣品保藏大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號CGMCCNo.3093，保藏日期2009年6月8日。圖l4-a-糖基轉移酶的電泳圖。圖中M表示標準分子量蛋白；Gl表示經過層析後得到目標酶；G2表示經過層析和透析後的目標酶；G3表示經過加熱處理後的粗酶液；G4表示粗酶液。圖2葡萄糖標樣、麥芽糖標樣、麥芽四糖混合物的HPLC圖。圖中5號線是葡萄糖標樣，4號線是麥芽糖標樣，1、2、3號線是麥芽四糖混合物圖3以葡萄糖為底物反應後產物的HPLC圖。圖4以麥芽糖為底物反應後產物的HPLC圖。根據保留時間定性，以麥芽糖為底物反應後生成了麥芽七糖、麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖及葡萄糖圖5麥芽四糖混合物為底物反應後產物的HPLC圖。根據保留時間定性，以麥芽四糖混合物為底物反應後生成了麥芽七糖、麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖及葡萄糖具體實施例方式實施例l、4-a-糖基轉移酶的製備及純化1、酶的製備1)單菌落挑選以接菌環從基因工程菌種中蘸取少量菌液劃含IOO)ig/mL氨卞青黴素鈉的LB平板，將平板放置在生化培養箱中37t恆溫培養12小時；2)種子培養挑取單菌落接種於50mL含氨卞青黴素鈉100pg/mL的LB培養基的三角瓶中，將三角瓶固定在恆溫搖床上37i:、200轉/分鐘振蕩培養8h製成種子培養基；3)發酵培養將種子培養基接種至含氨卞青黴素鈉100pg/mL的3L培養基的發酵罐中，調節溫度37。C、攪拌速度200轉/分鐘、pH為7.5，通氣量為10L/h，接種量為10%，添加10mL/L豆油作為消泡劑，在此條件下發酵培養7h;4)收集菌體、超聲破壁提取粗酶將上述發酵液轉移至250mL離心杯中，4000轉/分鐘條件下離心20分鐘，收集沉澱即為溼菌體；將溼菌體放入事先預冷的pH7.5、0.05mol/L、20mLTris-HCl緩衝溶液中，400W超聲3s、間隔2s、冰浴超聲10分鐘；將經過超聲破壁處理的菌液4'C、10000rpm離心10分鐘，收集上清液，即為粗酶液；2、酶的純化及純度的鑑定(1)酶的純化1)將粗酶液7(TC保溫10min，然後於4。C、10000rpm離心10分鐘，收集上清液即為經初步純化的酶液；2)用5倍柱體積的50mMTris-HClpH7.5、300mMNaCl、20mM咪唑的潤洗緩衝液平衡Ni-NTA親和柱；3)將經初步純化的酶液全部注入潤洗後的Ni-NTA親和柱；4)先用50倍柱體積的潤洗緩衝液進行洗脫，除去不被親和柱保留的雜蛋白，然後用2倍柱體積的50mMTris-HClpH7.5、300mMNaCl、250mM咪唑的洗脫緩衝液洗脫，收集洗脫液，內含目標蛋白；5)將含目標蛋白的洗脫液裝至分子量1000Da的透析袋，透析袋兩端扎口後放入去離子水浴中透析脫鹽，水浴室溫攪拌12h，每隔4h更換一次去離子水，脫鹽完成後將透析袋放於含聚乙二醇2萬的大燒杯中進行濃縮，4h後收集濃縮液即得純酶液。(2)酶純度的鑑定1)凝膠製備用兩塊電泳玻璃板製成垂直板槽(不能漏膠)，垂直放置。將配製好的分離膠溶液倒入，滴加入無離子水，待凝膠聚集後，倒出無離子水，用吸水紙吸乾，倒入濃縮膠，再插入梳子。按表1配製10%分離膠和3%濃縮膠。表l分離膠分離膠濃縮膠濃縮膠10%1%TEMED重蒸餾10%APJt液緩衝液貯液緩衝液SDS(ml)(ml)水(ml)(ml)(ml)(ml)(ml)(ml)10%分離膠6.662.50——0.202.008.540.103%濃縮膠—3.01.250.102.004.600.052)上樣分別取樣品20nL於離心管中，按1/1比例加入樣品緩衝液，沸水浴中加熱35min，取出待用。用微量注射器分別吸取8pL標準蛋白樣品和試驗樣品注入樣品槽。點樣結束後，調節電泳儀電流到10mA(23mA/em),保持電流穩定不變，當溴酚藍遷移到離分離膠底l2cm時，即可停止電泳。3)染色電泳完畢後，取出凝膠板，浸入考馬斯亮藍染色液中，染色30min。4)脫色倒掉染色液，加入脫色液24h後，即可看到清晰的蛋白質條帶。電泳圖如圖l所示。圖中M表示標準分子量蛋白；Gl表示經過層析後得到目標酶；G2表示經過層析和透析後的目標酶；G3表示經過加熱處理後的粗酶液；G4表示粗酶液。從圖可以看出，目標酶經初步加熱處理，能夠去除部分不耐熱雜蛋白，經親和柱層析後得到的酶純度很高。3、酶的性質該酶的最適溫度為70。C，最適pH7.5，經SDS-PAGE電泳分析，該純酶的分子量約為57000Da。4、酶的轉糖基活性4-a-糖基轉移酶是否具有轉糖基的能力，決定了4-a-糖基轉移酶能否作用直鏈澱粉生成大環糊精。採用HPLC法對底物與底物-酶解產物進行分析，結果如圖2、圖3、圖4、圖5所示。圖2:葡萄糖標樣、麥芽糖標樣、麥芽四糖混合物的HPLC圖。圖中5號線是葡萄糖標樣，4號線是麥芽糖標樣，1、2、3號線是麥芽四糖混合物。表2各保留時間對應的組分編號保留時間(min)樣品17.312麥芽五糖27.844麥芽四糖38.578麥芽三糖49.745麥芽糖511.971葡萄糖圖3:以葡萄糖為底物反應後產物的HPLC圖。根據保留時間定性，以葡萄糖為底物反應產物沒發生變化。表31慰萄糖為底物反應後產物對應的保留時司及峰面積tableseeoriginaldocumentpage7圖4:以麥芽糖為底物反應後產物的HPLC圖。根據保留時間定性，以麥芽糖為底物反應後生成了麥芽七糖、麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖及葡萄糖。表4麥芽糖-為底物反應後各組分對應的保留時司及峰面積tableseeoriginaldocumentpage7圖5:以麥芽四糖混合物為底物反應後產物的HPLC圖。根據保留時間定性，以麥芽四糖混合物為底物反應後生成了麥芽七糖、麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖、麥芽糖及葡萄糖。表5麥芽四糖混合物為底物反應後各組分對應的保留時間及峰面積tableseeoriginaldocumentpage7由圖可以看出，該酶對葡萄糖沒有轉糖基活性，最小作用底物是麥芽糖。4-a-糖基轉移酶能夠作用麥芽糖及麥芽四糖混合物生成麥芽七糖、麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖、麥芽糖及葡萄糖等，這表明該酶具有良好的轉糖基活性。本發明中的酶純化原理該酶具有一定的耐熱性，7CTC加熱處理能夠使一部分不耐熱的蛋白質變性，通過離心即可實現4-d-糖基轉移酶與變性蛋白的分離；此外，4-(i-糖基轉移酶帶有組氨酸標籤，可與填料中N產充分結合，當酶液經過Ni-NTA親和柱時，帶有組氨酸標籤的4-a-糖基轉移酶將被截留，而其他雜蛋白將被洗脫，這樣就可實現4-a-糖基轉移酶與雜蛋白分離，再採用能與N產結合的洗脫液洗脫，即可收集4-a-糖基轉移酶。電泳過程中用到的試劑配方(1)分離膠緩衝液(Tris-HCl緩衝液pH8.9):取lmol/L鹽酸48mL，Tris36.3g，用無離子水溶解後定容至100mL。(2)濃縮膠緩衝液(Tris-HCl緩衝液pH6.7):取lmol/L鹽酸48mL,Tris5.98g，用無離子水溶解後定容至100mL。(3)30%分離膠貯液稱丙烯醯胺(Acr)30g及N，N，-甲叉雙丙烯醯胺(Bis)0.8g，溶於重蒸水中，定容至100mL，過濾後置棕色試劑瓶中，4'C保存。(4)10%濃縮膠貯液稱Acrl0g及Bis0.5g，溶於重蒸水中，最後定容至100mL，過濾後置棕色試劑瓶中，4'C貯存。(5)10MSDS溶液SDS在低溫易析出結晶，使用前微熱，使其完全溶解。(6)1。/oTEMED;(7)10%過硫酸銨(AP):現用現配。(8)電泳緩衝液(Tris-甘氨酸緩衝液pH8.3):稱取Tris6.0g,甘氨酸28.8g，SDSl.Og,用無離子水溶解後定容至1L。(9)樣品緩衝液取SDS100mg,巰基乙醇O.lmL，甘油lmL，溴酚藍2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸緩衝液0.5mL，加重蒸水至10mL。(10)染色液0.25g考馬斯亮藍G-250,加入454mL50。/。甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。(11)脫色液75mL冰乙酸、875mL重蒸水與50mL甲醇混勻。(12)分離膠製備按表l配製20mL10。/。分離膠，混勻後用細長頭滴管將凝膠液加至長、短玻璃板間的縫隙內，約8cm高，用lmL注射器取少許蒸餾水，沿長玻璃板板壁緩慢注入，約3-4mm高，以進行水封。約30min後，凝膠與水封層間出現折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多餘水分。(13)濃縮膠的製備按表1配製10mL3%濃縮膠，混勻後用細長頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約0.5cm處，輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內，避免帶入氣泡。約30min後凝膠聚合，再放置20-30min。待凝膠凝固，小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多餘的水分，將pH8.3Tris-甘氨酸緩衝液倒入上、下貯槽中，應沒過短板約0.5cm以上，即可準備加樣。HPLC分離條件糖柱，柱溫85'C，流動相為超純水，流速0.4mL/min。權利要求1、一株產4-α-糖基轉移酶的菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.3093。2、一種產大環糊精4-a-糖基轉移酶的製備方法，其特徵在於，以大腸埃希氏菌(Esc/^Wc/7/flco//)CGMCCNo.3093為出發菌株，經搖瓶發酵製備種子培養基、發酵罐發酵培養、收集菌體、超聲破壁提取粗酶、純化得到純酶4-a-糖基轉移酶，步驟為1)單菌落挑選以接菌環從基因工程菌種CGMCCNo.3093中蘸取少量菌液劃含100嗎/mL氨卞青黴素鈉的LB平板，將平板放置在生化培養箱中37°C恆溫培養12小時；2)種子培養挑取單菌落接種於50mL含氨卞青黴素鈉100pg/mL的LB培養基的三角瓶中，將三角瓶固定在恆溫搖床上37°C、200轉/分鐘振蕩培養8h製成種子培養基；3)發酵培養將種子培養基接種至含氨卞青黴素鈉100pg/mL的3L培養基的發酵罐中，調節溫度37°C、攪拌速度200轉/分鐘、pH為7.5，通氣量為10L/h，接種量為10%，添加10mL/L豆油作為消泡劑，在此條件下發酵培養7h;4)收集菌體、超聲破壁提取粗酶將上述發酵液轉移至250mL離心杯中，4000轉/分鐘條件下離心20分鐘，收集沉澱即為溼菌體；將溼菌體放入事先預冷的pH7.5、0.05mol/L、20mLTris-HCl緩衝溶液中，400W超聲3s、間隔2s、冰浴超聲10分鐘；將經過超聲破壁處理的菌液4。C、10000rpm離心10分鐘，收集上清液，即為粗酶液；5)酶的純化將粗酶液70。C保溫10min，然後於4。C、10000rpm離心10分鐘，收集上清液即為經初步純化的酶液；用5倍柱體積的50mMTris-HClpH7.5、300mMNaCl、20mM咪唑的潤洗緩衝液平衡Ni-NTA親和柱；將經初步純化的酶液全部注入潤洗後的Ni-NTA親和柱；先用50倍柱體積的潤洗緩衝液進行洗脫，除去不被親和柱保留的雜蛋白，然後用2倍柱體積的50mMTris-HClpH7.5、300mMNaCl、250mM咪唑的洗脫緩衝液洗脫，收集洗脫液，內含目標蛋白；將含目標蛋白的洗脫液裝至分子量1000Da的透析袋，透析袋兩端扎口後放入去離子水浴中透析脫鹽，水浴室溫攪拌12h，每隔4h更換一次去離子水，脫鹽完成後將透析袋放於含聚乙二醇2萬的大燒杯中進行濃縮，4h後收集濃縮液即得純酶液。全文摘要產大環糊精4-α-糖基轉移酶的製備方法，屬於酶工程
技術領域：
。本發明以大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)CGMCCNo.3093為出發菌株，經搖瓶發酵製備種子培養基、發酵罐發酵培養、收集菌體、超聲破壁提取粗酶、純化得到純酶4-α-糖基轉移酶。該酶的最適溫度為75℃，最適pH為7.5，該酶具有耐高溫、酶活高等特點，經初步純化並冷凍乾燥得到的4-α-糖基轉移酶的活力可達7000～10000U/g。4-α-糖基轉移酶能夠作用直鏈澱粉產生大環糊精，還能夠對支鏈澱粉進行修飾生成慢消化澱粉，因此該酶可廣泛應用於食品、醫藥等行業，具有巨大的潛在商業價值。文檔編號C12N1/21GK101633900SQ20091003255公開日2010年1月27日申請日期2009年7月2日優先權日2009年7月2日發明者徐學明,晉雪霞,旭曹,王金鵬,謝正軍,金徵宇,陳寒青申請人:江南大學