組氨酸在血液淨化親合吸附介質中的應用的製作方法

2023-10-11 14:42:09 2

專利名稱：組氨酸在血液淨化親合吸附介質中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及血液淨化親合吸附介質中，具體地說是組氨酸在血液淨化親合吸附介質中的應用。
背景技術：
蛋白A是從金黃色葡萄球菌的細胞壁中提取的一種單肽鏈蛋白(R.H.Clemmitt et.al.，Biotechnol.Bioeng.，2000，67，206)，它對多種免疫球蛋白，特別是免疫球蛋白G(IgG)的Fc區有較強的結合能力(Pierce Catalog Handbook，T-78，1994-1995)。同時，蛋白A對循環免疫複合物(Circulating immune complexes)也有很強的特異性相互作用(T.M.Phillips，Analytical Techniques inImmunochemistry；New YorkMarcel Dekker，Inc.，1992，p.75)。自身免疫系統疾病如系統性紅斑狼瘡、自免疫溶血性貧血、免疫血小板減少性紫癜和初級抗磷脂症候群(Primary antiphospholipid syndrome)等的發生會導致患者體內抗體和循環免疫複合物的增加。目前固載蛋白A的免疫吸附材料已被用於臨床清除上述疾病患者體內的抗體和循環免疫複合物(T.Burnouf et.al.，J.Chromatogr.B，1998，715，65)，相關的免疫吸附醫療器械已獲得美國FDA的認證，在歐洲也獲得相關管理部門的認證。
血液免疫吸附治療是近年來新興的一種臨床醫療技術，對一些藥物沒有明顯療效的疑難病症如自身免疫系統疾病、腎移植排析、冠狀動脈硬化、黃疸病、重型B肝患者進行免疫吸附體外血液淨化，往往可以獲得很好的效果(H.Hashimoto et.al.，J.Rheum.，1991，18，646)(R.M Hakim et.al.，Am.J.Kidny Dis.，1990，16，429)。免疫吸附治療技術正受到醫學工作者越來越多的重視，血液淨化免疫吸附柱的研製和生產也已成為一個重要的高技術產業。
蛋白A的選擇性好，對免疫球蛋白G的特異性作用強，但蛋白A價格昂貴且易變性失活。因此不僅製備和保存蛋白A免疫吸附柱比較困難而且還會增加患者的治療費用。

發明內容
本發明的目的在於將組氨酸用於血液淨化親合吸附介質中，其所製成的親合吸附介質價格低廉、性能穩定、使用壽命長。
組氨酸在血液淨化親合吸附介質中的應用。
所述血液淨化是指用於清除免疫系統疾病患者血漿中異常增多的免疫球蛋白G；組氨酸最好為L-組氨酸；載體基質和配體L-組氨酸分子之間的反應是基於基質化合物的環氧環基團和配體上氨基、羧基或羥基的取代反應。
在親合載體上共價鍵合組氨酸有兩種方法一種是利用組氨酸的伯氨基與載體上的環氧活性官能團直接反應；其化學合成路線是將組氨酸共價鍵合在親合載體上，具體過程為 在濃度為5mM-500mM的磷酸鉀或磷酸鈉鹽緩衝液中，加入組氨酸溶解後，加入親和載體，調PH值10-14，將反應體系升溫至60℃-80℃，反應時間24h-48h，即製得組氨酸親合吸附介質。
另一種方法是首先在親合載體上連接已二胺間隔臂，然後採用羰基二咪唑法共價鍵合組氨酸；其化學合成路線是採用羰基二咪唑法將組氨酸共價鍵合在親合載體上，具體過程為
1)在親合載體上共價鍵合間隔臂己二胺，鍵合反應條件為在濃度為10mM-500mM的碳酸鉀或碳酸鈉鹽緩衝液中，加入己二胺(親合載體與己二胺摩爾比為1∶2)溶解後，加入親和載體，調PH值10-14，將反應體系升溫至60℃-80℃，反應時間4h-24h，除去未反應的己二胺；2)親合載體間隔臂的己二胺與咪唑基連接，反應條件為用無水二氧六環衝洗連接了己二胺間隔臂的親合載體，然後加入羰基二咪唑，10℃-40℃反應4-12h，反應後用二氧六環和25mM Tris-HCL緩衝液反覆衝洗；3)己二胺與L-組氨酸連接，反應條件為將組氨酸溶於5mM-500mM Tris-HCL緩衝液中，調節其pH值為6.5-8.5，10℃-40℃反應8h-20h，即製得組氨酸親合吸附介質。
所述親合載體為聚丙烯酸縮水甘油酯整體材料和經活化已連接環氧活性官能團的纖維素、瓊脂糖、交聯葡聚糖或矽膠等。
本發明具有如下優點1.性能穩定、使用壽命長。組氨酸是一種簡單的小分子，化學和物理穩定性高且價格低廉。它不僅與蛋白質之間具有很好的生物兼容性而且由於組氨酸分子中同時含有氨基和羧基活性官能團，使其更利於與親合載體相連接。特別是組氨酸對免疫球蛋白G也有較好的特異性吸附，因而它是取代蛋白A用於血液淨化治療免疫系統疾病的理想選擇。
2.價格低廉。與蛋白A免疫吸附柱相比，組氨酸親合吸附介質不僅製備過程簡單、鍵合量高(對人免疫球蛋白G的吸附量高)，而且對人免疫球蛋白G的吸附量也與蛋白A免疫吸附柱相當。通過共價鍵合的方法，將組氨酸鍵合到親合載體上，即可用於免疫系統疾病患者血液中過量免疫球蛋白G的清除。由於組氨酸化學物理穩定性高，製備過程簡單(通過共價鍵合的方法，將L-組氨酸鍵合到親合載體上，即可用於免疫系統疾病患者血液中異常增多的免疫球蛋白G的清除)，因而不僅可以在反應時選擇最優化的反應條件以提高配體的鍵合量，而且與蛋白A免疫吸附柱相比，這種親合吸附介質穩定性更高、使用壽命更長，有可能多次反覆使用，而且價格低廉，因而可以大幅度地降低免疫吸附治療的費用，具有更高的經濟效益和社會效益。
3.應用效果好。模擬配體(L-組氨酸)親合吸附介質是一種可以取代蛋白A免疫吸附柱用於血液淨化的新型親合吸附介質。採用組氨酸親合吸附介質吸附人免疫球蛋白G的標準樣品和血漿樣品中的人免疫球蛋白G，並用基體輔助雷射解吸/離子化飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)檢測組氨酸親合吸附介質對血漿中的人免疫球蛋白G有很好的特異性吸附。


圖1為不含間隔臂和含有己二胺間隔臂的L-組氨酸親合吸附介質對人血清白蛋白(HSA)非特異性吸附圖；(a)不含間隔臂；(b)含有己二胺間隔臂的L-組氨酸親合吸附介質；圖2為L-組氨酸親合吸附介質對人免疫球蛋白G標準樣品的特異性吸附圖；(a)流動相為磷酸鹽緩衝液；(b)流動相為Tris-HCL緩衝液；圖3為L-組氨酸親合吸附介質對人免疫球蛋白G的特異性吸附圖；色譜峰1.雜蛋白；2.人免疫球蛋白G。
具體實施例方式
親合載體可以為聚丙烯酸縮水甘油酯整體材料和經活化已連接環氧活性官能團的纖維素、瓊脂糖、交聯葡聚糖或矽膠等；本發明在親合載體上共價鍵合組氨酸反應前應在載體上連接環氧活性官能團(聚丙烯酸縮水甘油酯整體材料本身已具有環氧活性官能團，不需此步反應)，其具體過程為載體基質上連接環氧活性官能團的反應是基於基質化合物的羥基和3-氯-1，2-環氧丙烷的活化反應。
載體基質和配體L-組氨酸分子之間的反應是基於基質化合物的環氧環基團和配體上氨基、羧基或羥基的取代反應。
一.利用組氨酸的伯氨基與載體上的環氧活性官能團直接反應將L-組氨酸共價鍵合在親合載體上，具體過程為在濃度為5mM-500mM的磷酸鉀或磷酸鈉緩衝液中，加入過量的(載體基質和配體L-組氨酸分子之間的反應是基於基質化合物的環氧環基團和配體上氨基、羧基或羥基的取代反應)L-組氨酸溶解後，加入親和載體，用鹼(氫氧化鈉)調節PH值10-14，將反應體系升溫至60℃-80℃，反應時間24h-48h，即製得組氨酸親合吸附介質。
實施例1-5，按上述反應條件操作，其不同之處在於(參見下表1)
表1.

二.親合吸附介質的化學合成路線是採用羰基二咪唑法將L-組氨酸共價鍵合在親合載體上，具體過程為

1)在親合載體上共價鍵合間隔臂己二胺，鍵合反應條件為在濃度為10mM-500mM的碳酸鉀或碳酸鈉鹽緩衝液中，加入己二胺(親合載體與己二胺摩爾比為1∶2)溶解後，加入親和載體，用鹼(氫氧化鈉)調節PH值10-14，將反應體系升溫至60℃-80℃，反應時間4h-24h，反應完成後用一定體積的有機溶劑(例如乙醇或乙腈)和水衝洗除去未反應的己二胺。
2)親合載體間隔臂的己二胺與咪唑基連接，反應條件為用無水1，4-二氧六環衝洗連接了己二胺間隔臂的親合載體，然後加入過量的羰基二咪唑，10℃-40℃反應4-12h，反應後用二氧六環和25mM Tris-HCL緩衝液反覆衝洗；3)己二胺與L-組氨酸連接，反應條件為將L-組氨酸溶於5mM-500mM Tris-HCL緩衝液中，調節其pH值為6.5-8.5，10℃-40℃反應8h-20h，即製得組氨酸親合吸附介質。
無水二氧六環獲取取一定體積的二氧六環於圓底燒瓶內，加入適量新鮮的納絲及批示劑二苯甲酮，加熱回流，直至溶液呈明顯深藍色。迅速取下冷凝管，換成蒸餾裝置，蒸出的二氧六環立即使用。
實施例6-10，按上述反應條件操作，其不同之處在於(參見下表2)表2.

應用例L-組氨酸親合吸附介質對人血清白蛋白的非特異性吸附由於己二胺本身具有一定的疏水性，另外己二胺分子中的氨基與樣品間也存在著一定的非特異性的離子交換作用，因而含有己二胺間隔臂的L-組氨酸親合吸附介質的非特異性吸附也較大。圖1分別是不含間隔臂和含有己二胺間隔臂的L-組氨酸親合吸附介質對人血清白蛋白(HSA)非特異性吸附的色譜圖。可以看出，含有己二胺間隔臂的L-組氨酸親合吸附介質HSA有一定的非特異性吸附，而不含間隔臂的L-組氨酸親合吸附介質BSA的非特異性吸附很低，基本沒有檢測出來。圖2為L-組氨酸親合吸附介質對人免疫球蛋白G標準樣品的特異性吸附；(a)流動相為磷酸鹽緩衝液；(b)流動相為Tris-HCL緩衝液；圖3為L-組氨酸親合吸附介質對人免疫球蛋白G的特異性吸附，其中峰1.蛋白；2.免疫球蛋白G。
比較例蛋白A免疫吸附柱與L-組氨酸親合吸附介質的比較蛋白A免疫吸附介質的製備過程採用反應路線如下


表3 L-組氨酸親合吸附介質與蛋白A免疫吸附柱性能的比較

權利要求
1.組氨酸在血液淨化親合吸附介質中的應用。
2.按照權利要求1所述組氨酸在血液淨化親合吸附介質中的應用，其特徵在於所述血液淨化是指用於清除免疫系統疾病患者血漿中異常增多的免疫球蛋白G。
3.按照權利要求1所述組氨酸在血液淨化親合吸附介質中的應用，其特徵在於所述組氨酸為L-組氨酸。
4.按照權利要求1所述組氨酸在血液淨化親合吸附介質中的應用，其特徵在於所述親合吸附介質的化學合成路線是將組氨酸共價鍵合在親合載體上，具體過程為 在濃度為5mM-500mM的磷酸鉀或磷酸鈉緩衝液中，加入組氨酸溶解後，加入親和載體，調PH值10-14，將反應體系升溫至60℃-80℃，反應時間24h-48h，即製得組氨酸親合吸附介質。
5.按照權利要求1所述組氨酸在血液淨化親合吸附介質中的應用，其特徵在於所述親合吸附介質的化學合成路線是採用羰基二咪唑法將組氨酸共價鍵合在親合載體上，具體過程為 1)在親合載體上共價鍵合間隔臂己二胺，鍵合反應條件為在濃度為10mM-500mM的碳酸鉀或碳酸鈉鹽緩衝液中，加入己二胺溶解後，加入親和載體，調PH值10-14，將反應體系升溫至60℃-80℃，反應時間4h-24h，除去未反應的己二胺；2)親合載體間隔臂的己二胺與咪唑基連接，反應條件為用無水二氧六環衝洗連接了己二胺間隔臂的親合載體，然後加入羰基二咪唑，10℃-40℃反應4-12h，反應後用二氧六環和25mM Tris-HCL緩衝液反覆衝洗；3)己二胺與組氨酸連接，反應條件為將組氨酸溶於5mM-500mMTris-HCL緩衝液中，調節其pH值為6.5-8.5，10℃-40℃反應8h-20h，即製得組氨酸親合吸附介質。
6.按照權利要求4或5所述組氨酸在血液淨化親合吸附介質中的應用，其特徵在於所述親合載體為纖維素、瓊脂糖、交聯葡聚糖或矽膠。
全文摘要
本發明涉及血液淨化親合吸附介質，具體地說是組氨酸在血液淨化親合吸附介質中的應用。L－組氨酸親合吸附介質是一種可以取代蛋白A免疫吸附柱用於血液淨化的新型親合吸附介質；通過共價鍵合的方法，將L－組氨酸鍵合到親合載體上，即可用於免疫系統疾病患者血液中異常增多的免疫球蛋白G的清除；由於組氨酸化學物理穩定性高，因而這種親合吸附介質不僅製備過程簡單，對人免疫球蛋白G的吸附量高，而且價格低廉、性能穩定、可多次反覆使用，具有良好的社會和經濟效益。
文檔編號A61M1/38GK1666784SQ20041002137
公開日2005年9月14日 申請日期2004年3月12日 優先權日2004年3月12日
發明者鄒漢法, 羅權舟, 孔亮, 厲欣 申請人:中國科學院大連化學物理研究所