Fmu-epcam-4e4單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區的製作方法

2023-10-11 15:37:34 2

專利名稱：Fmu-epcam-4e4單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫學技術領域，涉及一種單克隆抗體，特別涉及一種抗人EPCAM 的FMU-EPCAM-4E4單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區，包括其胺基酸序列和核苷酸序列。
背景技術：
上皮細胞黏附分子(EPCAM)最初是作為結腸癌的優勢表位被發現，當時認為其作 用是細胞黏附和治療用抗體的可靠結合位點。目前研究認為，EPCAM是糖基化的I型跨膜 糖蛋白，分子量為30到40kD，其結構包括有一個表皮生長因子樣和一個甲狀腺球蛋白樣的 胞膜外區，一段跨膜區和一段26個胺基酸的胞漿區。在正常細胞中EPCAM主要位於上皮細 胞間隙的緊密連接處。 由EPCAM表達的強度和頻率顯示，其基本上高表達於所有人類腺癌、 部分鱗狀細胞癌、視網膜母細胞瘤和肝細胞癌。2007年以前對EPCAM功能方面的研究發現EPCAM在細胞增殖、遷移和信號轉導中 具有重要作用。例如EPCAM在人和齧鼠動物細胞的增強表達，增強了細胞錨定和血清生長 因子非依賴的增殖並且增加了如c-myc和cyclins在內的各種靶基因的表達；在乳腺癌細 胞系，EPCAM信號經RNA幹涉，可造成細胞增殖、遷移和侵襲能力的降低。最近的研究證實=EPCAM可以作為一些實體腫瘤幹細胞的表面標誌物之一，也可 以作為正常幹細胞表面標誌物的組成部分。同時，研究結果還很好地解釋了 EPCAM在腫瘤 細胞高表達的原因，並且發現其與一些腫瘤患者預後較差和生存率較低有關；並進一步解 釋了 EPCAM與腫瘤的關係。此外，小鼠胚胎幹細胞實驗證實，EPCAM在腫瘤幹細胞、正常幹 細胞上的高表達和其自身正反饋的上調，對確保維持這些正常幹細胞及以惡性幹細胞的增 殖非常重要。抗EPCAM抗體用於腫瘤治療的研究一直是抗體治療研究的熱點。早在1979年開 發的鼠源性抗EPCAM抗體17-1A，於1982年就用於對腫瘤的臨床治療。但是鼠源性抗體藥 物在人體使用時，由於其具有免疫原性，會引起人體的免疫反應，從而造成對抗體藥物的清 除或免疫複合物介導的超敏反應。對鼠源性抗體基因改造可以部分解決其免疫原性問題， 如構建嵌合抗體或人源化抗體等。抗體單體分子是由兩條相同的重鏈(H鏈)和兩條相同的輕鏈(L鏈)，通過鏈間二 硫鍵連接而成的四肽鏈結構。H鏈和L鏈包括氨基(N)端和羧基(C)端，靠近N端的可變區 (V區)由高變區/互補決定區(HVR/CDR)和骨架區(FR)組成；靠近C端為恆定區(C區)。 重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)形成的蛋白質摺疊是抗原結合部位，其中的CDR/HVR 是抗體與抗原決定基互補結合的部位，C區引發抗原抗體識別後的反應。抗體根據FR/C區 不同可分為人源、鼠源等，鼠源性抗體在人體內使用時具有免疫原性，易引起人體的免疫反 應，這些免疫反應可引起對鼠源性抗體的清除以及免疫複合物介導的超敏反應。為了克服 鼠源性抗體的缺陷，需要構建高親和力的特異性嵌合抗體、單鏈抗體或人源化抗體。在改造過程中，最為重要的是首先必須獲得具有良好特異性和親和力鼠源性親本 抗體，克隆其輕鏈和重鏈可變區基因，然後將這兩條基因進行改造，構建重組抗體基因。針對這些問題，抗EPCAM治療性抗體的研發不斷取得進展，抗EPCAM的大鼠和小鼠雙特異性抗 體Catumaxomab，單鏈抗體Proxinium，人源化抗體ING-I，人源化融合抗體EMD和完全人源 化抗體Adecatumumab (MT201)等先後進入臨床治療腫瘤的研究。目前在臨床試驗中，通過 改造的抗體Adecatumumab治療乳腺癌取得了良好的效果。因此，篩選出高親和力鼠源性抗 人EPCAM單克隆抗體，從中克隆出輕、重鏈可變區基因，對進一步改善以EPCAM為靶點的藥 物製備和對腫瘤的治療具有非常重要的意義。

發明內容
本發明解決的問題在於提供一種抗人EPCAM的FMU-EPCAM-4E4單克隆抗體的輕鏈 和重鏈可變區，包括其胺基酸和核苷酸序列，為構建高親和力的抗EPCAM嵌合或人源化基 因工程抗體提供支持。本發明是通過以下技術方案來實現FMU-EPCAM-4E4單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區，所述輕鏈可變區的3個互補決 定區(CDR)序列分別為CDRl :Gln-Ser-Leu-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr ；CDR2 =Val-Val-Ser-Lys-Leu-Asp ；CDR3 =Trp-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Pro-Trp-Thr ；所述重鏈可變區的3個互補決定區(OTR)序列分別為CDRl.Gly-Tyr-Ser-Phe-Tyr-Ser-Tyr-Trp ；CDR2 Jle-Tyr-Pro-Gly-Asn-Thr-Asp-Thr ；CDR3 :Ile-Arg-Gly-Gly-Asn-Tyr。所述的單克隆抗體輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO. 1，重鏈可變區的氨基 酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述的編碼單克隆抗體輕鏈可變區的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，編碼重鏈可 變區的基因序列如SEQ ID N0. 4所示。所述的單克隆抗體應用於以人EPCAM為靶點的基因工程抗體或診斷試劑的製備。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果1、本發明提供的FMU-EPCAM-4E4單克隆抗體是一種抗人EPCAM的高親和力單克 隆抗體，經過間接ELISA檢測、流式細胞儀檢測證實該單克隆抗體能夠特異性地結合人 EPCAM ；
2、克隆該單克隆抗體輕鏈、重鏈可變區基因和胺基酸序列，序列分析證實了該抗 體序列的惟一性。3、分析獲得輕鏈、重鏈可變區的⑶R區，在此基礎上為構建高親和力的抗人EPCAM 嵌合或人源化基因工程抗體提供支持。


圖1是抗人EPCAM的FMU-EPCAM-4E4單克隆抗體與C0L0205和SKBr_3細胞系表面 表達的EPCAM結合的流式細胞儀檢測結果圖；圖Ia為與C0L0205細胞繫結合檢測結果圖， 圖Ib為與SKBr-3細胞繫結合檢測結果圖；其中，FITC 異硫氰酸螢光素，橫軸為螢光強度，縱軸為相對細胞計數，Ml表示陽性細胞範圍；圖2是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_4E4單克隆抗體輕鏈可變區基因同源性序列檢測 結果圖；圖3是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_4E4單克隆抗體重鏈可變區基因同源性序列檢測 結果圖；圖4是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_4E4單克隆抗體輕鏈可變區胺基酸同源性序列檢 測結果圖；圖5是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_4E4單克隆抗體重鏈可變區胺基酸同源性序列檢 測結果圖。
具體實施方式

申請人用重組人EPCAM免疫BALB/c小鼠，製備了一組小鼠抗人EPCAM單克隆抗 體，篩選出能穩定分泌高親和力抗人EPCAM的FMU-EPCAM-4E4單克隆抗體雜交瘤細胞株，制 備腹水獲得高親和力抗人EPCAM單克隆抗體。確認該基因序列和相應蛋白序列的惟一性及 其CDR序列；為抗人EPCAM嵌合或人源化基因工程抗體提供支持。下面結合附圖對本發明做詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。本發明具體按以下步驟實施1小鼠抗人EPCAM高親和力抗體的製備1. 1單克隆抗體的製備、純化參照GENBANK NM_002354序列設計引物，並擴增編碼人EPCAM胞膜外區蛋白的基 因；然後將此基因克隆入PGEX-4T-3載體中，構建原核表達載體並轉化宿主細胞；再通過 IPTG誘導，凍融加超聲裂解法獲得重組人EPCAM胞膜外區的可溶蛋白。按單克隆抗體製備方法(細胞和分子免疫學實驗技術第一版，P9-P17)，用重組人 EPCAM胞膜外區蛋白免疫BALB/c小鼠(購自第四軍醫大學實驗動物中心)；初次免疫，使用 福氏完全佐劑，後續免疫使用福氏不完全佐劑，每次間隔3周，均為皮下多點注射，共免疫4 次。末次免疫7-10天後採血測其效價，檢測免疫效果。間隔2-3周後，經靜脈注射抗原再 加強免疫，3天後處死動物取脾進行細胞融合。取對數生長的小鼠骨髓瘤細胞SP2/0計數，同時製備免疫脾細胞懸液。將骨髓瘤 細胞與脾細胞按1 10比例混合進行細胞融合。融合後細胞懸液加入含有飼養細胞(正常 Balb/c小鼠腹腔巨噬細胞)的96孔板，37°C、5% CO2孵箱培養。待克隆出現後，間接ELISA 檢測，挑選陽性克隆。對含有陽性克隆孔的細胞採用有限稀釋法進行克隆化，直至獲得能夠 穩定分泌抗體的雜交瘤細胞系(體外連續培養超過6個月)，並對其分泌的抗體進行常規核 型鑑定和Ig亞類測定，結果為IgG2a亞類。在獲得能夠穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株後，按小鼠腹水製備方法製備包含單克 隆抗體的腹水(細胞和分子免疫學實驗技術第一版，P9-P17)。腹水經40%飽和硫酸銨沉 澱後，採用QFF陰離子交換層析法純化。用SDS-PAGE鑑定純化抗體的純度，純化的單克隆 抗體FMU-EPCAM-4E4純度達到95%。1. 2抗人EPCAM單克隆抗體效價測定用間接ELISA方法測定純化前腹水以及純化後單克隆抗體(mAb)的相對親和力。其中包被抗原為重組人EPCAM胞膜外區的可溶蛋白，待測樣品為系列梯度稀釋(IXlO1 IO9的梯度稀釋)的腹水以及純化後mAb，檢測抗體為羊抗鼠-HRP酶標記抗體，底物使用 ABTS。所篩選出的高親和力FMU-EPCAM-4E4mAb，腹水效價為1 X IO"7,純化後效價為0. 6ng/ ml，而一般採用間接ELISA檢測腹水效價達1 X 10_5以上的抗體即可使用。1. 3流式細胞術螢光染色檢測抗人EPCAM單克隆抗體FMU-EPCAM-4E4與細胞表面 EPCAM結合的活性以SED mAb作為陰性抗體對照，流式細胞術檢測FMU-EPCAM_4E4mAb與C0L0205禾口 SKBr-3細胞系表面表達的EPCAM的結合；C0L0205和SKBr_3細胞系用10% FCS-RPMI1640培養基培養至對數生長期，調整 細胞濃度為5 X IO6 1 X 107/ml ；取50 μ 1細胞懸液並加入特異性FMU-EPCAM_4E4mAb腹水 1 μ 1，再加1 μ 1滅活正常兔血清，4°C孵育30min ；同樣方法製備陰性對照組。然後用洗滌液(5% FCS-PBS-4% NaN3)洗滌孵育後的細胞2次，每次加洗滌液2ml， IOOOrpmX5min離心後棄上清；加入100 μ 1工作濃度的羊抗鼠螢光標記抗體，充分振搖， 4°C 孵育 30min ；再用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml，IOOOrpmX 5min離心後棄上清；加0. 5ml的 流式固定液(2 %葡萄糖，1 %甲醛，0. 02 % NaN3的DPBS溶液)，然後進行流式細胞術分析 FMU-EPCAM-4E4mAb與細胞表面EPCAM的結合情況；結果如圖1所示，在C0L0205細胞系與陰性對照相比，結合了 FMU-EPCAM_4E4mAb 而落入Ml陽性細胞範圍的C0L0205細胞達40% ；在SKBr-3細胞系與陰性對照相比，結合了 FMU-EPCAM_4E4mAb而落入Ml陽性細 胞範圍的SKBr-3細胞達29% ；以上流式細胞術螢光染色檢測表明FMU-EPCAM-4E4mAb可以識別並結合C0L0205 和SKBr-3細胞表面表達的天然EPCAM。通過上述2種FMU-EPCAM_4E4mAb結合實驗，在不同水平的鑑定結果表明， FMU-EPCAM-4E4mAb既可以識別重組表達的EPCAM (間接ELISA檢測)，又可以識別細胞表面 天然表達的EPCAM，說明FMU-EPCAM-4E4mAb與相應抗原EPCAM結合具有良好的特異性和親 和力。2抗人EPCAM的FMU-EPCAM-4E4單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區基因的克隆2. 1FMU-EPCAM-4E4雜交瘤細胞的培養按常規方法復甦(細胞培養，第一版，P88)FMU-EPCAM-4E4雜交瘤細胞，用含10% 小牛血清的RPMI 1640培養基於37°C,5% CO2孵箱中培養至對數生長期。2. 2總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成採用TRIZOL Reagent (購自美國GIBCO公司)提取總RNA，具體操作步驟按說明書進行；cDNA第一鏈合成試劑盒購自美國GIBCO公司，在得到總RNA後按產品說明書進行反 轉錄合成cDNA第一鏈。2. 3PCR 法擴增 FMU-EPCAM_4E4mAb 的 VL 禾Π VH 基因PCR擴增試劑購自TakaRa公司，利用VL F (上遊引物)和VL B (下遊引物)以及VH F禾口 VH B兩對引物，以反轉錄合成的cDNA第一鏈為模板進行PCR，擴增FMU-EPCAM_4E4mAb 的 VL 和 FMU-EPCAM-4E4mAb 的 VH 基因；
反應體積50μ 1，反應條件為94°C 5min ；95°C 30s，58°C lmin，72°C lmin，循環 35次；72 °C 7min;引物序列為:VL F:gttagatctc cagcttggtc cc22bp ；VL B:gacattcagc tgacccagtc tcca24bp ；VH F:tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34bp ；VH B:aggtsmarct gcagsagtcw gg22bp ；(IUB 標準兼併鹼基代碼:s :c/g ；m :a/c ；r :a/g ；w :a/t)
2. 4PCR擴增產物的克隆和篩選PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用小量膠回收試劑盒(購自上海華舜生物工程 有限會司)回收PCR擴增片段，用DNA連接試劑盒(購自TakaRa公司)將該片段按說明書， 利用加A尾插入pMD-TIS載體(購自TakaRa公司)中，連接物轉化E. coli (購自中國普通 微生物菌種保藏中心，CGMCC，北京)，在Amp抗性LB瓊脂培養平皿中37°C培養過夜。挑取LB瓊脂培養平皿中克隆，在Amp抗性LB培養基中37°C搖菌過夜，以1 μ 1菌 液為模板，通過上述針對輕鏈、重鏈可變區設計的引物，用PCR法篩選重組陽性Ε. coli克 隆；將所獲得重組陽性Ε. coli克隆搖菌，菌體送交上海生物工程技術服務有限公司 完成基因序列測定，輕鏈可變區的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，重鏈可變區的基因序列如 SEQ ID NO. 4 所示。3FMU-EPCAM-4E4mAb輕鏈和重鏈可變區的核苷酸序列及同源性分析3. 1確定測序無誤後，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB資料庫中，進行核苷酸序列同源 性分析(Blastn)。FMU-EPCAM-4E4mAb輕鏈可變區基因與編號為GeneID =243420的小鼠Ig輕鏈可變 區基因同源性最高，達281/289(97% )，如圖2所示；FMU-EPCAM-4E4mAb重鏈可變區基因與編號為GeneID =668469的小鼠Ig重鏈可變 區基因同源性最高，為276/296(93% )，如圖3所示。同源性分析表明，編碼FMU-EPCAM-4E4mAb的輕、重鏈可變區的核苷酸序列，儘管 與其它基因序列有一定同源性，但未發現與本發明完全相同的基因序列，表明本發明在基 因序列上具有惟一性。3. 2將可變區基因翻譯成胺基酸序列，進行胺基酸序列分析單克隆抗體輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO. 1，重鏈可變區的胺基酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示。在 non-redundant Genbank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF 蛋白質 資料庫中，進行胺基酸序列同源性分析(Blastp)。分析結果表明，FMU-EPCAM-4E4mAb輕鏈胺基酸序列與編號為ABR32168. 1 GI 149799217的小鼠IgK鏈同源性最高，達104/111 (93% )，如圖4所示；FMU-EPCAM-4E4mAb重鏈胺基酸序列與編號為S55541GI 1363159的小鼠Ig重鏈 蛋白的同源性最高，為101/117(86% )，如圖5所示。同源性分析表明，FMU-EPCAM_4E4mAb輕、重鏈可變區的胺基酸序列，儘管與其它蛋 白胺基酸序列有一定同源性，但未發現與本發明完全相同的胺基酸序列，表明本發明在胺基酸序列上也具有惟一性。3. 3利用IMGT/V-QUEST分析可變區結構，確定⑶R區。將測序所得FMU-EPCAM-4E4mAb輕鏈和重鏈可變區序列，在IMGT/V-QUEST網站 (http://imgt. cines. fr/IMGT_vquest/vquest)進行分析，得出其 CDR 區。輕鏈可變區的3個互補決定區(OTR)序列，如SEQ ID NO. 1劃線部分所示，具體 為CDRl:Gln-Ser-Leu-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr ；CDR2 =Val-Val-Ser-Lys-Leu-Asp ；CDR3 =Trp-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Pro-Trp-Thr ；所述重鏈可變區的3個互補決定區(OTR)序列為CDRl.Gly-Tyr-Ser-Phe-Tyr-Ser-Tyr-Trp ；CDR2 Jle-Tyr-Pro-Gly-Asn-Thr-Asp-Thr ；CDR3 :Ile-Arg-Gly-Gly-Asn-Tyr。4.基因工程抗體設計基於抗人EPCAM單克隆抗體FMU_EPCAM_4E4的表達、純化以及序列分析，設計構建 以下生物製品1)單鏈抗體的構建可將本發明的FMU-EPCAM-4E4mAb輕、重鏈可變區基因通過 linker連接，插入原核或真核表達載體，轉化宿主菌或轉染真核細胞，用於製備可對乳腺 癌、結腸癌和胰腺癌等腫瘤有治療作用的單鏈抗體。 2)人-鼠抗EPCAM嵌合抗體的構建可將本發明的FMU-EPCAM_4E4mAb輕、重鏈可 變區基因插入通用型嵌合抗體表達載體中，獲得含嵌合基因的載體轉染真核細胞，用於制 備可望對乳腺癌、結腸癌和胰腺癌等腫瘤有治療作用的嵌合抗體。3)人源化抗體的構建可將本發明的FMU-EPCAM_4E4mAb輕、重鏈可變區基因 的CDR區移植到人源抗體可變區的骨架區(FR)中，形成互補決定區(CDR)移植抗體 (CDR-grafted antibody)，也禾爾重構(reshapingantibody) ^iKMVcijiW (humanized antibody)。利用CDR移植技術改造抗體，可以獲得既保持鼠源性親本mAb特異性，又更加接近 人抗體的新型抗體，用於製備可對乳腺癌、結腸癌和胰腺癌等腫瘤有治療作用的人源化抗 體。4)可根據本發明的基因序列及其編碼的胺基酸序列，製備針對人EPCAM功能表位的其它生物製品。5)可利用本發明的抗人EPCAM的FMU-EPCAM-4E4特異性單抗作為區分上皮和 非上皮來源組織的工具，以確診一些易於混淆的疾病。通過採用本發明的抗人EPCAM的 FMU-EPCAM-4E4特異性單抗染色，觀察組織中EPCAM的表達強度，可能作為一些上皮來源腫 瘤預後及分化程度的判斷標誌。6)可應用本發明的高親和力FMU-EPCAM-4E4mAb製備測定體液中EPCAM胞膜外區 蛋白的ELISA試劑盒，可望在腫瘤發生、發展及預後的臨床診斷中具有廣泛的應用價值。胺基酸及核苷酸序列表中國人民解放軍第四軍醫大學
FMU-EPCAM-4E4單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區41
111PRT人工合成1Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Val Thr lie Gly Gln Pro Ala Ser1510 1520Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp2530 3540Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu lie Tyr Val Val Ser Lys Leu Asp4550 5560Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie6570 7580Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro8590 95100Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie1051102113PRT人工合成2Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met15 10 1520Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Tyr Ser Tyr Trp Met His Trp Leu Lys Gln Arg2530 3540Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie Gly Gly lie Tyr Pro Gly Asn Thr Asp Thr Ser Tyr4550 5560Asn Pro Lys Phe Lys Asp Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Thr Tyr6570 7580Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asp Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys lie Arg Gly Gly8590 95100Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser1051103333DNA
〈213〉人工合成3gatgttgtgctgacccagtc tccagtcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60atgtcttgcaagtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120ttgttgcagaggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atgttgtgtc taaattggac 180cctggagtccctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240agcagagtggaggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300tggacgttcggtggagggac caagctggag ate3334339DNA〈213〉人工合成4gaggtccagctgcaggagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60tcctgcagggcttctggcta cagctttacc agctactgga tgcactggct aaaacagagg 120cctggacagggtctagaatg gattggtggt atttatcctg gaaatactga tacaagctac 180aacccgaagttcaaggacaa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactacctac 240atggagctcagcagcctgac agatgaggac tctgcggtct attactgtat aagagggggt 300aactactggggccaagggac cacggtcacc gtctcctca339
權利要求
FMU-EPCAM-4E4單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區，其特徵在於，所述輕鏈可變區的3個互補決定區(CDR)序列為CDR1Gln-Ser-Leu-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr；CDR2Val-Val-Ser-Lys-Leu-Asp；CDR3Trp-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Pro-Trp-Thr；所述重鏈可變區的3個互補決定區(CDR)序列為CDR1Gly-Tyr-Ser-Phe-Tyr-Ser-Tyr-Trp；CDR2Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Thr-Asp-Thr；CDR3Ile-Arg-Gly-Gly-Asn-Tyr。
2.如權利要求1所述的FMU-EPCAM-4E4單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區，其特徵在於， 所述的單克隆抗體輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ IDN0. 1所示，重鏈可變區的胺基酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示。
3.如權利要求1所述的FMU-EPCAM-4E4單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區，其特徵在於， 編碼單克隆抗體輕鏈可變區的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，編碼重鏈可變區的基因序列 如 SEQ ID NO. 4 所示。
4.權利要求1或3所述的FMU-EPCAM-4E4單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區應用於以人 EPCAM為靶點的基因工程抗體或診斷試劑的製備。
全文摘要
本發明公開了FMU-EPCAM-4E4單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區，FMU-EPCAM-4E4單克隆抗體輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID No.1，重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID No.2所示。本發明通過重組人EPCAM免疫BALB/c小鼠，製備了一組小鼠抗人EPCAM單克隆抗體，篩選出能穩定分泌高親和力抗人EPCAM單克隆抗體的雜交瘤細胞株，製備腹水獲得高親和力的抗人EPCAM單克隆抗體。確認該基因序列和相應蛋白序列的惟一性及其CDR序列；為抗人EPCAM嵌合或人源化基因工程抗體提供支持。
文檔編號C12N15/13GK101817882SQ20101001366
公開日2010年9月1日 申請日期2010年1月22日 優先權日2010年1月22日
發明者孫元傑, 宋朝君, 張葵, 朱參勝, 楊琨, 謝鑫, 金伯泉 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學