一種多肽食鹽替代物及其製備方法
2023-10-11 03:09:54 1
專利名稱：一種多肽食鹽替代物及其製備方法
技術領域：
本發明屬於食品領域，涉及一種多肽食鹽替代物及其製備方法，具體涉及大豆蛋白的酶解、目標多肽的分離純化和測序技術及目標多肽的鹹度評定。
背景技術：
「民以食為天，食以味知先」。鹹味是一種基礎的食品風味。食鹽是最基礎的鹹味劑，也是唯一具有重要生理功能的的味製劑，它可調節細胞與血液之間的滲透平衡和正常的水鹽代謝。然而過多的食鹽攝入會嚴重影響人類的健康，引起一系列的疾病。據研究表明，長期高鈉飲食容易產生鈉的滯留，而鈉的滯留會導致腎臟病及心血管疾病。隨著生活水平的提高，人們越來越注意飲食的健康，因而開發一種新型的鹹味劑迫在眉睫。本發明採用大豆蛋白作為原料，製得具有鹹味的多肽，能夠部分替代食鹽從而減少鈉離子的攝入，使人們的飲食更加安全健康，具有廣闊的市場前景。
發明內容
本發明的目的在於提供一種多肽食鹽替代物。本發明的另一目的在於提供一種多肽食鹽替代物的製備方法。本發明製備的多肽食鹽替代物既能擁有食鹽的鹹味，同時又能降低鈉離子的攝入，避免了由於高鈉飲食引起的一系列的疾病，因而更符合現代人的健康飲食觀念。本發明的目的可以通過以下技術方案實現一種多肽食鹽替代物，其在於由包括下述步驟的方法製成(1)製備酶解液將大豆蛋白製成水溶液、並水浴反應後；加入Alcalase酶酶解並滅活，調節PH值後，再加入胃蛋白酶酶解並滅活，離心留上清；(2)分離純化目標多肽將步驟(1)製備的大豆蛋白酶解液加入到G-25葡聚糖層析柱中進行脫鹽及初步分離，收集具有鹹味的組分；然後將目標溶液濃縮並進行G-15葡聚糖凝膠層析，再次收集具有鹹味的組分；將經G-15葡聚糖層析收集的鹹味多肽混合物放入冷凍乾燥機中冷凍乾燥，得到凍乾粉；將凍乾粉使用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化，得到純淨的鹹味多肽。上述的多肽食鹽替代物，其在於所述的多肽食鹽替代物胺基酸序列為Gly-Lys。上述的多肽食鹽替代物，其在於步驟(1)中製成的大豆蛋白水溶液的濃度為8 15g/L，水浴條件為80 85°C反應15 20min ；Alcalase酶酶解反應條件為42 47°C反應100 120min ；胃蛋白酶酶解反應條件為46 50°C反應100 120min ；兩次酶解反應後滅活條件為95 100°C滅活15 20min ；Alcalase酶酶解反應後將反應溶液的pH值調成 1. 0。上述的多肽食鹽替代物，其在於步驟⑴製備酶解液的過程中，大豆蛋白與 Alcalase酶的質量體積比(g/ml)為1 0. 05 0. 07，大豆蛋白與胃蛋白酶的質量比為 1 0. 03 0. 05。
上述的多肽食鹽替代物，其在於步驟O)中進行G-25葡聚糖層析和G-15葡聚糖層析時的洗脫速度為lml/min，用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化時的B液為乙 If+0.01% TFA(v/v/% )，洗脫梯度為30%~ 60% B，洗脫時間:60min。上述的多肽食鹽替代物的製備方法，其在於包括以下步驟(1)製備酶解液稱取大豆蛋白溶於水中製成8 15g/L的溶液，將溶液在80 85°C水浴條件下反應15 20min，冷卻後加入Alcalase酶於42 47°C反應100 120min， 95 100°C滅活15 20min ；調至pH為1. 0後，加入胃蛋白酶於46 50°C反應100 120min，95 100°C滅活15 20min，離心保留上清液；其中大豆蛋白與Alcalase酶的質量體積比(g/ml)為1 0.05 0.07，大豆蛋白與胃蛋白酶的質量比為1 0. 03 0. 05 ；(2)分離純化目標多肽將步驟(1)製備的大豆蛋白酶解液加入到G-25葡聚糖層析柱中進行脫鹽及初步分離，收集具有鹹味的組分；然後將目標溶液濃縮並進行G-15葡聚糖凝膠層析，再次收集具有鹹味的組分；將經G-15葡聚糖層析收集的鹹味多肽混合物放入冷凍乾燥機中冷凍乾燥，得到凍乾粉；將凍乾粉使用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化，得到鹹味多肽。上述的多肽食鹽替代物的製備方法，其在於所述的步驟O)中步驟O)中進行 G-25葡聚糖層析和G-15葡聚糖層析時的洗脫速度為lml/min，用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化時的B液為乙腈+0.01% TFA(ν/ν/%)，洗脫梯度為30^-60% B，洗脫時間:60min。本發明通過單因素實驗及正交實驗確定大豆蛋白酶解的最適溫度、pH、時間、最適酶添加量等條件。根據感官評定結果，通過多次試驗確定葡聚糖凝膠層析流速等條件，反相高效液相色譜的最適進樣量及B液的最適濃度梯度等條件，最終分離純化得到鹹味多肽。多肽食鹽替代物的製備方法包括1.酶解液的製備稱取大豆蛋白溶於蒸餾水中製成8 15g/L的大豆蛋白溶液， 加熱使蛋白質的高級結構被破壞，解螺旋從而利於酶對其進行切割。接著加入Alcalase酶及胃蛋白酶，使其在最適的條件下對大豆蛋白進行定向切割。最後高速離心保留上清液去除雜質，得到多肽混合液。2.鹹味多肽的分離純化及測序首先將得到的多肽混合液經G-25葡聚糖凝膠層析，進行脫鹽並去除一部分分子量大的多肽，然後經感官評定選出具有鹹味或近似鹹味的組分。這些組分再經G-15葡聚糖凝膠層析，得到分子量相近的多肽段。接著使用反相高效液相色譜儀對其進行分離純化，再經感官評定得出具有鹹味的多肽。最後採用蛋白質測序儀對分離得到的鹹味多肽進行測序，得到其序列。即製得具有鹹味的多肽。3.鹹味多肽的感官鑑定採用「與對照的差異檢驗」法將呈梯度濃度的鹹味多肽溶液與特定濃度的NaCl溶液進行比較，從而得到鹹味多肽的鹹度。本發明的有益效果本發明以大豆蛋白為原料，通過葡聚糖凝膠層析以及反相高效液相色譜的分離， 製得了純淨的鹹味多肽，重複性高，結果精確可靠。本發明是我國首次對鹹味肽進行研究。開發出的鹹味肽在保證鹹味的同時能降低鈉離子的攝入，避免了由於高鈉離子攝入而引起的一系列疾病，從而更加保健，深受廣大消費者歡迎，具有很好的經濟價值及市場前景。
本發明是首次研究對肉品加工既有調味作用又有改變其物化性質且對人的營養有益的食鹽替代物。本發明是首次對天然資源進行酶解，並從中分離出鹹味肽，更加安全可靠。
圖1為鹹味肽高效液相色譜圖。
具體實施例方式實施例11.酶解液的製備1)稱取Ig大豆蛋白溶於IOOml水中，在80 85°C條件下加熱15 20min。2)冷卻，加入Alcalase酶(諾維信)0. 06ml，在42 47 °C條件下反應100 120mino3)於95 100°C條件下加熱15 20min，滅活。4)冷卻，調節溶液的pH至1.0，加入胃蛋白酶0. 04g，於46 50°C下反應100 120mino5)於95 100°C條件下加熱15 20min，滅活。6)使用高速離心機，在SOOOrpm條件下離心15 20min。保留上清液去除沉澱。
2.鹹味多肽的分離純化及測序1)吸取2ml多肽混合液加到G-25葡聚糖層析柱中，以lml/min的流速進行脫鹽及初步分離，收集分離得到的組分。2)選取15 20名感官評定員對收集的組分進行感官評定，選出其中具有鹹味的組分。3)重複G-25葡聚糖層析數次，收集足夠量含有鹹味多肽的組分。4)將收集的目標溶液進行旋轉蒸發，濃縮從而提高鹹味多肽的濃度。5)吸取2ml的濃縮液加到G-15葡聚糖層析柱中，以lml/min的流速進行進一步地分離，收集分離得到的組分。6)選取15 20名感官評定員對收集的組分進行感官評定，選出其中具有鹹味的組分。7)重複G-15葡聚糖凝膠層析數次，收集足夠量的目的肽混合物。8)將經G-15葡聚糖層析收集的鹹味多肽混合物放入冷凍乾燥乾燥機中，進行冷凍乾燥，得到凍乾粉。9)將凍乾粉使用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化，通過多次的分離純化，得到高純度的鹹味多肽。樣品加樣量為25ul、B液洗脫梯度為30% 60%8、洗脫時間:60min。B 液為乙腈 +0. 01% TFA (v/v/% )。10)使用蛋白質測序儀對鹹味多肽進行測序，得到其胺基酸序列為Gly-Lys。
3.多肽鹹度的鑑定採用「與對照的差異檢驗法」對多肽鹹度進行鑑定，具體方法如下1)按質量百分含量計，配製濃度為0.6%的食鹽溶液作為對照，濃度分別為
50.4%,0.6%,0.8%,1.0%,1.2%的鹹味肽溶液作為樣品。同時配製相同濃度的食鹽溶液
作為盲樣。2)將樣品及盲樣進行隨機數字編碼，將樣品與對照以小組的形式呈遞。每組中包括一個樣品和一個對照，其中對照溶液標誌出來。3)選取30 50名評價員對其進行評定，一次評定5個樣品，評價6次。評定待測樣品與對照之間的差異度，並打分。每個分值對應相對的差異程度。4)將最終的結果進行方差分析，得到與濃度為0. 6%的食鹽溶液鹹度相當的樣品溶液濃度，從而得到鹹味多肽的鹹度。評定結果如下樣品類別溶液評定說明1.你將成對分別評定5個樣品，每一對的第一個評定是對照，記錄樣品編號；2.評定樣品的鹹度，並用如下尺度表示樣品與對照間的差異程度，將你認為最能表達與對照樣差異程度的尺度值填入評定結果。-3——比對照鹹味極淡-2——比對照鹹味很淡-1——比對照鹹味較淡0——鹹度與對照並無差異1——比對照較鹹2——比對照很鹹3——比對照極鹹表1採用「與對照的差異檢驗法」對多肽鹹度進行鑑定的鑑定結果
權利要求
1.一種多肽食鹽替代物，其特徵在於由包括下述步驟的方法製成(1)製備酶解液將大豆蛋白製成水溶液、並水浴反應後；加入Alcalase酶酶解並滅活，調節PH值後，再加入胃蛋白酶酶解並滅活，離心留上清；(2)分離純化目標多肽將步驟(1)製備的大豆蛋白酶解液加入到G-25葡聚糖層析柱中進行脫鹽及初步分離，收集具有鹹味的組分；然後將目標溶液濃縮並進行G-15葡聚糖凝膠層析，再次收集具有鹹味的組分；將經G-15葡聚糖層析收集的鹹味多肽混合物放入冷凍乾燥機中冷凍乾燥，得到凍乾粉；將凍乾粉使用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化， 得到純淨的鹹味多肽。
2.根據權利要求1所述的多肽食鹽替代物，其特徵在於所述的多肽食鹽替代物胺基酸序列為Gly-Lys。
3.根據權利要求1所述的多肽食鹽替代物，其特徵在於步驟(1)中製成的大豆蛋白水溶液的濃度為8 15g/L，水浴條件為80 85°C反應15 20min ；Alcalase酶酶解反應條件為42 47°C反應100 120min ；胃蛋白酶酶解反應條件為46 50°C反應100 120min ；兩次酶解反應後滅活條件為95 100°C滅活15 20min ；Alcalase酶酶解反應後將反應溶液的PH值調成1. 0。
4.根據權利要求1所述的多肽食鹽替代物，其特徵在於步驟(1)製備酶解液的過程中， 大豆蛋白與Alcalase酶的質量體積比(g/ml)為1 0. 05 0. 07，大豆蛋白與胃蛋白酶的質量比為1 0. 03 0. 05。
5.根據權利要求1所述的多肽食鹽替代物，其特徵在於步驟( 中進行G-25葡聚糖層析和G-15葡聚糖層析時的洗脫速度為lml/min，用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化時的B液為乙腈+0.01% TFA(v/v/% )，洗脫梯度為30% 60% B，洗脫時間60min。
6.權利要求1或2所述的多肽食鹽替代物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1)製備酶解液稱取大豆蛋白溶於水中製成8 15g/L的溶液，將溶液在80 85°C水浴條件下反應15 20min，冷卻後加入Alcalase酶於42 47°C反應100 120min，95 100°C滅活15 20min ；調至pH為1. 0後，加入胃蛋白酶於46 50°C反應100 120min， 95 100°C滅活15 20min，離心保留上清液；其中大豆蛋白與Alcalase酶的質量體積比 (g/ml)為1 0.05 0.07，大豆蛋白與胃蛋白酶的質量比為1 0. 03 0. 05 ；(2)分離純化目標多肽將步驟(1)製備的大豆蛋白酶解液加入到G-25葡聚糖層析柱中進行脫鹽及初步分離，收集具有鹹味的組分；然後將目標溶液濃縮並進行G-15葡聚糖凝膠層析，再次收集具有鹹味的組分；將經G-15葡聚糖層析收集的鹹味多肽混合物放入冷凍乾燥機中冷凍乾燥，得到凍乾粉；將凍乾粉使用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化， 得到鹹味多肽。
7.根據權利要求6所述的多肽食鹽替代物的製備方法，其特徵在於所述的步驟O)中步驟O)中進行G-25葡聚糖層析和G-15葡聚糖層析時的洗脫速度為lml/min，用反相高效液相色譜儀進行進一步分離純化時的B液為乙腈+0.01% TFA(V/V/% )，洗脫梯度為 30% 60% B，洗脫時間60min。
全文摘要
本發明屬於食品領域，具體公開了一種多肽食鹽替代物及其製備方法，通過大豆蛋白的酶解、目標多肽的分離純化及測序，最終製得具有鹹味的多肽，製備工藝包括用Alcalase酶及胃蛋白酶對大豆蛋白進行定向切割得到多肽混合液；使用葡聚糖凝膠層析柱、反相高效液相色譜儀對目的多肽進行分離純化；目標多肽的鹹味評定。本發明採用天然的大豆蛋白作為原料，製得鹹味多肽，能夠部分代替食鹽減少鈉離子的攝入，避免了由於長期高鈉飲食引起的一系列的疾病，因而會受到廣大消費者的歡迎，具有很大的經濟效益和廣闊的市場前景。
文檔編號A23L1/237GK102224921SQ20111012119
公開日2011年10月26日 申請日期2011年5月11日 優先權日2011年5月11日
發明者張雅瑋, 彭增起, 郭秀雲 申請人:南京農業大學