一種個體化特異性免疫細胞功能測定方法
2023-10-11 08:25:09
專利名稱：一種個體化特異性免疫細胞功能測定方法
技術領域：
本發明主要涉及生物機體特異性細胞免疫功能測定方法。尤其涉及個體化特異性細胞免疫功能的監測方法學。特別涉及器官移植受者的特異性針對相應供者移植物的細胞免疫功能監測，排斥反應的預測，免疫用藥方案的調整；以及腫瘤患者機體特異性抗腫瘤免疫功能的評估和抗腫瘤治療方案的制定等。此外，應用該方法原理選用不同特異性抗原、疫苗、藥物等可引起抗體免疫功能發生變化物質作為刺激原可建立相應的各種方法。
二、技術背景正常生物機體免疫系統由體液免疫和細胞免疫所組成，二者之間的精確配合和相互調節在維持正常機體生命機能和抗疾病免疫中發揮著極其重要的作用。各種淋巴細胞，尤其是T淋巴細胞在免疫系統中的中心作用近年來受到廣泛地關注。T淋巴細胞作為生物機體抗疾病免疫和排斥免疫的「軸心」概念得到了普遍的認同。
隨著人類對生物機體免疫機制理解的不斷深化，近年來尤其是在特異性免疫識別應答機制方面的研究，取得了重要進展。特異性免疫應答的前提條件是特異性免疫識別，而特異性免疫識別又取決「雙信號」機制的完整性。組成「雙信號」識別的物質基礎是由MHC基因的表達產物MHC分子和特異性多肽複合物組成特異性識別的第一信號；而協同刺激因子(B7家族；B7-1；B7-2等)、細胞粘附因子(CD40等)則組成免疫識別的第二信號。生物體抗疾病免疫或抗移植物排斥免疫的激發、活化、調節以及免疫耐受的產生與上述「雙信號」系統的完整性有著極其密切的關聯。外來抗原(非已抗原)或移植抗原成分進入生物體後，首先通過抗原提呈細胞(Antigen Presenting Cells；APC)的作用，將非已抗原降解為特異性多肽與相應的MHC分子組裝形成MHC-特異性多肽複合物並提呈於細胞表面，然後與膜上的協同刺激因子，細胞粘附因子等共同被特定T淋巴細胞克隆特異性受體(T Cell Receptor；TCR)以及協同刺激因子受體(CD28等)所識別、結合；從而特異性地激活T淋巴細胞及其亞群，誘發生物機體全面的特異性免疫應答。通過MHC-I-多肽複合物誘導激活的CD8陽性T淋巴細胞形成細胞毒性細胞(Cytotexic T Lympholytes；TCL)或稱殺傷性T細胞對感染外來抗原(如病毒等)的細胞或腫瘤細胞或器官移植供者細胞等產生直接的特異性殺傷作用；而MHC-II-多肽複合物誘導、活化的CD4陽性T淋巴細胞或稱輔助性T淋巴細胞(T Helper；TH)可通過分泌各種細胞因子強化或調節CTL的特異性殺傷作用和其他免疫細胞(如巨噬細胞活化)功能；同時可刺激B淋巴細胞增殖，分化成槳細胞分泌特異性抗體啟動體液免疫應答。綜上所述，可獲得以下重要結論1、T細胞尤其是CD4陽性的T淋巴細胞在完整生物機體免疫系統中具有「軸心」作用；2、生物機體的特異性免疫識別是特異性免疫應答的基礎和前提條件；3、「雙信號」識別機制的完備與否決定著特異性免疫應答的性質(即特異性免疫「耐受」或「攻擊」效應)。
人類對生物免疫系統理解、認識的深化，推動了實驗免疫學分析技術的發展；而新的多樣化免疫學技術的出現，又給免疫學基礎理論研究帶來了多角度分析觀測工具，從而進一步促進了免疫學理論的完善和科學性，並作為臨床免疫學的堅實基礎。近年來，各國免疫學工作者建立了多種檢測生物機體免疫學功能的方法和技術。其主要包括各種以測定特異性抗體產生為特徵的體液免疫功能檢測方法和測定各類免疫細胞數目活性、增殖等指標的細胞免疫功能檢測方法。後者可分為以下幾類1.免疫細胞計數通過細胞特異性染色和非特異性染色技術，在顯微鏡下對各類免疫細胞進行分類計數。
2.免疫組化方法通過抗體特異性染色(如免疫酶學或免疫螢光染色技術)觀察各類免疫細胞的組織分布特徵。
3.流式細胞儀方法是近年來迅速發展起來的一種高靈敏度、高效率的細胞分析儀器。其將免疫螢光技術與流式細胞技術、計算機技術相結合；可對免疫細胞進行多色螢光標記分類，高速計數；又可通過測定細胞膜表面標誌的變化，細胞周期變化、細胞分裂增殖對免疫細胞的功能進行測定。
4.3H-TdR摻入細胞增殖方法為一種經典的同位素標記胸腺嘧啶核苷測定DNA含量的方法，作為測定淋巴細胞分化增殖的指標。
5.51Cr-釋放試驗是另一種傳統、經典的同位素測定免疫殺傷細胞活性的高靈敏度方法。
6.混合淋巴細胞培養(MLC)屬於3H-TdR摻入細胞增殖方法的一種特殊類型。其特點是將一個生物個體(通常為器官移植供者)淋巴細胞滅活使其喪失繁殖能力後作為一種刺激物與另一生物個體(受者)的淋巴細胞共培養3-7天；以3H-TdR摻入技術測定受檢樣品中混合淋巴細胞的DNA合成情況；以此評估受者免疫細胞對供者淋巴細胞的反應性。該方法靈敏度高，但操作過程複雜，需要較長時間出結果和使用放射性同位素等缺點。
7.延遲過敏反應皮膚試驗(Delayed-Type Hypersensitivity；DTH)應用少量特異性抗原皮下注射，誘發機體T細胞依賴性巨噬細胞激活免疫反應和炎性反應。在24-28小時後觀察注射部位的紅疹出現及大小；估測受檢者對相對抗原的特異性細胞免疫功能。該方法具有一定特異性，但結果判定困難，沒有嚴格的量化標準。
8.細胞內ATP測定淋巴細胞受抗原刺激活化後，細胞內ATP水平增加，在體外反應系統中，ATP和蟲螢光素酶在Mg、O2的共同作用下催化蟲螢光素，生成氧化蟲螢光素並釋放波光為562mm的光能；通過對這種光能的測定判定免疫細胞的功能狀態。該方法靈敏度高，但不穩定。受影響因素多，不易標準化。
9.穿刺活檢技術屬於一種侵入性檢測方法，需經穿刺獲得病人的生物組織標本。這種方法常用於判定器官移植後，器官移植受者對移植物的免疫排斥反應。是當前移植後免疫排斥監測的「金標準」。
10.CFSE流式測定細胞分裂增殖該技術需先將受檢免疫細胞進CFSE螢光染色標記，然後在加入刺激物的條件下進行4天細胞培養，繼以免疫螢光抗體標記待測細胞(雙螢光標記)。然後對雙螢光標記細胞進行流式測定分析，根據CFSE染色強度和螢光峰判定相應受檢細胞的分裂增殖情況。
11.MHC分子四聯體特異性反應T細胞檢測方法是新近發展的一種檢測生物體特異性免疫細胞群體的流式細胞分析技術。利用分子重組技術表達帶生物素(Biotin)的MHC分子與抗生物素-PE(Avidin-PE)聯接形成帶有4個MHC分子的「四聯體」，並利用特異性多肽加載在MHC分子上。通過特異性免疫識別機制，相應的MHC-多肽特異性TCR可對MHC分子一多肽進行特異性識別和結合。結合免疫細胞的螢光抗體分類技術，在流式細胞儀上對各類T細胞上的PE螢光進行分析測定，實現對特異性反應T細胞的檢測。該方法中的MHC分子四聯體製備複雜、成本高，難以應用於常規檢測。
上述方法在實際應用中具有各自優缺點，但存在的最大不足是在絕大多數情況下， 以上方法只是對機體非特異性和特異性免疫的混合測量，不能有效的反映生物機體的特異性細胞免疫功能，特別是個體化特異性免疫活性。在器官移植免疫和抗腫瘤免疫中，受者對相應供者器官的特異性排斥免疫功能監測以及腫瘤患者對其腫瘤細胞的特異性抗腫瘤免疫功能監測具有十分重要的臨床應用價值。
相關專利文獻1、Walter，et al.
Mutant MHC Class I MoleculesUS Patent6248，564；20012、Wier；Majorie L.
Methods for measurement of lymphocyte function US Patent5,773,232；1998三、發明內容針對上述現有各種細胞免疫測定方法的主要問題，根據免疫學T細胞特異性識別機制的特點，本發明設計了一種新的個體化特異性的細胞免疫功能測定方法。在器官移植應用中，將器官移植供者的組織細胞成分作為個體特異性抗原或利用MHC(HLA)分子抗原庫，與供者免疫細胞共同溫育以激活相應供者各類免疫細胞，然後對免疫細胞活化的各種標誌進行測定。可反映器官移植受者對移植物的特異性細胞免疫反應功能，從而達到對移植物排斥反應的預測、動態監測，以及為臨床免疫抑制治療提供科學依據。
器官移植中的排斥反應可根據排斥反應出現的時間和免疫學特徵分為超急性、急性、慢性排斥反應。超急性排斥反應主要由受者體內已存在的抗供者HLA分子抗體和補體引起的體液免疫反應和其他炎性反應性細胞及因子所共同參與導致的急性血管內皮細胞損傷、血管堵塞、凝血。
而急性、慢性排斥反應主要由受者針對供者移植物的細胞免疫所介導。通過供者特異性抗原直接或間接提呈機制，受者體內針對供者的T細胞(供者抗原特異性反應T細胞克隆)通過T淋巴細胞受體(T Cell Receptor；TCR)和其它細胞表面受體特異性地識別MHC-供者抗原多肽複合物和結合協同刺激因子，繼而活化增殖，誘發受者抗移植物的特異性排斥反應。由於這種排斥反應具有明顯的個體特異性，且主要以供者細胞表面MHC分子作為識別對象和標誌；因此，以供者細胞及其細胞提取物或包括供者MHC分子的抗原庫作為體外細胞免疫測定的特異性刺激原具有理論上的合理性。這種供者特異性刺激原包含了供者抗原或移植物抗原的全部信息，尤其是供者細胞膜上的MHC分子是引起供者抗原特異性反應T細胞特異性識別機制中的關鍵抗原成分。本發明特別強調在檢測受者特異性抗供者排斥免疫反應的檢測方法中使用供者細胞或細胞提取物或MHC分子抗原庫作為個體化特異性刺激原的重要性。實驗表明對於受者的免疫細胞，供者的亞細胞成分或MHC分子具有與全細胞類同的免疫原刺激特性，二者均可特異性地激活受者機體的供者抗原特異性反應T細胞發生分化增殖效應。在體外實驗中，測定受者免疫細胞(經供者特異性抗原或MHC分子刺激後)的活化標誌，可反映受者免疫細胞對供者移植物的特異性排斥功能，從而達到對排斥反應的預測和動態監測，並為臨床免疫治療用藥提供參考指標。
在特異性細胞免疫功能檢測方法學中，另一突出問題是由於多種因素可直接或間接影響受檢樣品中免疫細胞的反應活性，而導致免疫細胞的非特異性激活從而使結果分析判定困難。本發明特別強調在檢測中設置空白對照和自身對照以排除非特異性活化信號的幹擾。
空白對照設置不加入任何刺激原，其反映受檢免疫細胞在沒有刺激原狀態下的功能狀況，用以排除上述非特異性、個體特異性抗原以外的未知刺激因素的影響。
自身抗原對照使用受檢生物個體的細胞或亞細胞成分作用自身對照抗原刺激物(通常使用外周有核細胞製成)，其製備方法和使用量與供者特異性抗原完全相同。這種自身抗原對照可較好的反映非供者特異性性抗原所導致的影響因素。
個體化特異性抗原管以器官移植供者的細胞或亞細胞成分或包括供者MHC分的MHC分子抗原庫作為刺激原，可反映器官移植受者機體的供者移植物特異性反應細胞免疫功能。
綜合分析上述三者檢測結果及其相互差異、關係可對受檢個體的特異性細胞免疫功能做出客觀合理的評估。
器官移植受者的細胞免疫功能狀態的免疫學分析一、器官移植前器官移植受者在接受移植前，其體內的供者特異性反應T淋巴細胞處在「靜息」狀態或稱非致敏狀態；此時若以MHC型別不完全相符的供者特異性抗原在體外刺激受者免疫細胞可誘發緩慢而強度較弱(相對移植後)的免疫細胞活化，這種情況相當免疫系統與非已抗原的第一次接觸。根據供者與受者的MHC(HLA)相符合程度；受者的細胞免疫反應的強度也存在不同差異。即供者MHC(HLA)與受者MHC(HLA)的符合率越高則受者免疫細胞的活化程度越低，移植後發生排斥反應的發生機率也越低；反之，則排斥反應的發生機率將增加。因此在器官移植前，本發明所述及的方法可作為器官移植供者選擇的科學依據。
二、器官移植後理論上，當器官移植受者接受MHC(HLA)不相符合或部分符合的器官移植後或當移植受者免疫細胞接觸到供者細胞後，其通過特異性免疫識別機制接受非已抗原刺激並發生相應的活化反應，直致排斥反應發生並持續。因此，在器官移植後的任一時間，對受者免疫細胞功能的測定與移植前的非致敏狀態存在實質性差異；即測定對象是已經被供者特異性抗原致敏的免疫細胞，測定結果反映了受者免疫細胞致敏後的細胞免疫功能狀態。這種情況類似於非已抗原成分與免疫細胞第二次或多次接觸時所產生的反應。其具有反應快速、強烈、持續性等特點。因此，在體外對受者特異性細胞免疫功能測定時可相應縮短溫育刺激時間，快速獲得結果。
三、免疫抑制治療的影響由於生物機體免疫反應性遺傳學上的個體差異、供者與受者MHC(HLA)型別符合程度的不同、以及免疫抑制治療的藥物不一樣和用藥劑量的差別等諸多因素影響，會導致對受者免疫細胞功能測定結果分析、評估的複雜性。因此，測定結果是上述各因素的綜合表現形式。本發明強調對器官移植受者的特異性免疫細胞功能進行動態跟蹤測定；特別強調移植前後和免疫用藥前後的動態監測。對受者特異性細胞免疫功能狀態做出具有科學依據的正確判斷。為免疫抑制治療的用藥選擇、劑量調整和個體化治療方案設計提供客觀的參考指標。
特異性抗腫瘤免疫功能測定根據上述相同原理和方法學基礎，以腫瘤患者自身腫瘤細胞或亞細胞成分；或任何其它與患者腫瘤細胞具有共同抗原成分的其它腫瘤細胞(如同類腫瘤細胞等)；或同類腫瘤抗原庫作為特異性腫瘤抗原刺激物，與腫瘤患者自身免疫細胞在體外進行溫育刺激，然後對相應各類T淋巴細胞或其它免疫細胞的激活標誌物或增殖功能進行測定，可反映腫瘤患者的抗腫瘤特異性細胞免疫功能狀態，為抗腫瘤免疫治療和病情預後及轉歸提供科學依據。
在免疫藥物的篩選、評估和臨床治療效果的監測領域；利用本發明所述及的方法，在檢測中增設藥物加特異性刺激物加受檢樣品免疫細胞測定管；或/和直接以免疫藥物為刺激物(或抑制物或調節物)與免疫細胞共同溫育，可獲得免疫藥物對相應個體細胞免疫功能的效應程度等有關資料。
在免疫疫苗研究領域，直接將疫苗作為特異性刺激物，或/和其它特異性抗原刺激物共同作為刺激原，在疫苗接種前後對相應生物個體進行特異性細胞免疫功能進行動態監測，可用於對疫苗作用及效價的評估。
本發明所述及受檢樣品的免疫細胞定義為所有直接或間接參與生物機體免疫反應的任何細胞，尤其是指T淋巴細胞及其亞群、B淋巴細胞、NK細胞以及APC細胞等。根據實際需要，在檢測前可採用適當方法(如免疫磁珠分選、免疫親和技術分選、免疫共沉澱分選，梯度密度分離等)對上述各類免疫細胞及其亞群分離免疫，然後分別進行功能測定；或先以特異性抗原刺激混合免疫細胞群體，然後用上述方法分選細胞，對某一特定細胞群體進行功能測定，如T淋巴細胞(CD3+)；CTL(CD8+)，TH(CD4+)，NK細胞(CD16+，或/和CD56+)，B淋巴細胞(CD19+或CD20+)等。
體外生物檢測方法的金標準是採取最為接近生物體生理內環境的反應系統，其能最為客觀地反映檢測結果的真實性。這在體外測定生物體免疫功能狀態的方法中尤其重要。生物機體的免疫功能狀態是各種免疫細胞相互聯繫(Communication)、作用(Interaction)、接觸(Contaction)、調節(Regulation)的綜合體現。因此，在體外檢測某細胞群體免疫功能時，應儘可能保證其它直接或間接影響該群體某種特定免疫功能的細胞共存於同一測定體系中，以避免檢測結果的片面性和不客觀性。例如，在檢測某生物體T淋巴細胞功能時，應保留相應的抗原提呈細胞存在於同一檢測系統之中，從而保證T淋巴特異性識別系統的完整性；另外，在測定NK細胞或B細胞免疫功能的反應體系中應包含T淋巴細胞。因此，本發明著重強調使用原始樣品作為測定對象。原始樣品定義為直接來自生物體經最少處理或不經任何處理的含免疫細胞的體液樣品，其主要包括全外周血、全骨髓、去除紅細胞的有核細胞混合群體、腹腔液、胸腔液或經離心後獲取的腹腔液、胸腔液、腦脊液所含的混合細胞組分。
四、發明小結本發明提出了一種以特異性抗原作為刺激物測定生物機體細胞免疫功能的方法。這種新方法學設計具有顯著的個體化特異性。其主要特徵如下1、使用具有個體化特異性抗原作為誘導活化特定生物個體特異性免疫細胞的刺激物在器官移植受者細胞免疫功能測定中，以相應的器官供者細胞或亞細胞成分作為特異性刺激原，對受者體內供者移植物抗原特異反應性免疫細胞的功能進行測定。用於對移植前器官移植供者的選擇，在移植後可對針對移植物排斥反應的預測；動態監測受者特異性細胞免疫功能，可為免疫抑制治療提供用藥參考。
將腫瘤患者自腫瘤細胞或其亞細胞成分作為特異性抗原刺激物，可對患者體內潛在的抗腫瘤特異性免疫功能進行測定，為腫瘤治療提供客觀的科學依據。2、使用多價通用性、特異性抗原庫作為誘導活化任一生物個體特異性免疫細胞的刺激物1)利用混合MHC分子或HLA分子作為多價、通用性、特異性抗原器官移植供者、受者之間的MHC或HLA的符合程度是導致移植物排斥反應發生的決定性因素。在移植排斥免疫應答中，受者T淋巴細胞主要通過對自身或供者MHC分子和供者MHC(HLA)多肽複合物的特異性識別機制活化產生抗移植物免疫應答(Indirect or Direct Recognition；間接或直接識別)。因此，製備包括全部或部分MHC分子或HLA分子的混合體系作為多價、通用性、特異性抗原可對所有或部分生物群體進行特異性細胞免疫功能測定。
利用包含所有生物MHC(HLA)I類分子的MHC-I類分子庫(MHC-IMolecules Bank)作為刺激原，可對任一生物個體CTL(CD8+)的功能進行測定。
利用包含所有生物的MHC(HLA)II類分子的MHC-II類分子庫(MHC-II moleculesBank)。可對任一生物個體CD4+T淋巴細胞的功能進行測定。
同理，利用上述MHC(HLA)I類和II類分子的混合體系(MHC(HLA)I/II類分子庫)，可對生物體總T淋巴細胞功能進行測定。
上述三種MHC分子庫在與某一特定生物個體免疫細胞群體進行溫育或共培養時，存在於反應系統中的APC細胞可將MHC分子提呈給相應的特定T淋巴細胞群體(CTL，TH1，TH2等)，誘導其活化。如果受檢免疫細胞是第一次接觸這些非已MHC(HLA)分子；在設定時間內它們的活化程度、反應強度則相對低而弱；若檢測系統中的受檢免疫細胞曾經被MHC(HLA)分子庫中的部分I類或II類分子(器官移植物具有的MHC分子)所致敏(第二次或多次接觸)，則那些被致敏的免疫細胞會在短時間內迅速活化，其活化的程度和反應較為強烈。這在器官移植排斥反應中尤其顯著。在臨床器官移植實踐中，移植手術完成後，移植受者免疫細胞被相應的非已MHC(HLA)分子所致敏而處在高敏感狀態。在體外反應系統中，免疫細胞再次遭遇MHC(HLA)分子庫中與移植供者相同的MHC(HLA)分子而迅速發生活化反應並被測量。因此，根據移植前後，移植受者免疫細胞對包括在MHC(HLA)分子庫中與移植供者相同的MHC(HLA)分子的反應性，可判斷受者免疫細胞的特異性抗移植物排斥反應的有無和強度。
2)多種同類腫瘤細胞或腫瘤共同抗原庫作為多價、通用性抗原如前所述，利用腫瘤患者自身的腫瘤細胞或亞細胞成分可製備個體化特異性刺激原，可用於對相應個體的特異性抗腫瘤細胞免疫功能進行測定。但在臨床實踐中，有許多腫瘤患者由於種種原因而不能獲得其自身的腫瘤細胞而不能進行個體化特異性腫瘤抗原製備，給測定帶來一定困難。因此，針對這種情況，本發明強調使用多種同類腫瘤細胞製備多價腫瘤抗原(腫瘤抗原庫)；或使用腫瘤共同抗原作為免疫細胞的刺激物對相應患者的抗腫瘤細胞免疫功能進行測定。
本發明首次在機體特異性細胞免疫功能測定方法學中引入MHC(HLA)分子庫和腫瘤抗原庫作為免疫刺激原的概念。其主要意義在於製備多價廣譜具有通用性的抗原刺激物，用於任一特定生物個體的特異性細胞免疫功能測定。對於整個生物群體而言，上述MHC(HLA)分子庫或腫瘤抗原庫具有廣譜通用性特點；而對於某一特定生物個體又具有其特異性。這是因為，在對某一特定生物個體的特異性細胞免疫功能測定中，其已經處在致敏狀態的免疫細胞(這些細胞曾接受相應移植物或腫瘤抗原的刺激)，通過特異性識別機制對MHC(HLA)分子庫或腫瘤抗原庫中的某些特異性抗原分子(器官移植供者MHC分子或腫瘤共同抗原成分)進行識別，從而賦予這種檢測方法以個體特異性。3、分類測定各種免疫細胞群體的功能狀態
利用各種分離技術，如特異性抗體磁顆粒分離技術，雙色或多色螢光標記流式細胞技術等。可在特異性抗原刺激前或刺激後對各類免疫細胞及其亞群進行純化或分類測定。如總T淋巴細胞、CTL(CD8+)，TH(CD4+)NK細胞(CD16+，CD56+)、B淋巴細胞(CD19+或CD20+)、APC細胞(CD80+/CD83+/CD86+/HLA-DR+)功能的選擇性測定等。4、免疫細胞活化信號測量的多樣性各種免疫細胞接受上述特異性抗原刺激後，活化的免疫細胞可發生下列主要細胞生物學變化酶學改變(如蛋白酪氨酸激酶；PTKs；Ras-MAP激酶；ZAP-70激酶等)，離子濃度改變(Ca++濃度)、膜受體改變(IL-2受體等)、特異性配體表達(CD40配體；CD40L)，細胞內ATP濃度增加；NK-KB，NFAT， AP-1，Fas激活表達、各種CD分子表達(CD69，CD25，CD71，CD95，CD40等)，MHC分子表達(MHC-I類分子，MHC-II類分子)，各種細胞因子表達(IL-2，IL-4，IL-12，INFr等)，DNA合成增加(3H-TdR摻入增加)、細胞增殖及數目增加(CFSE染色流式測定)，CTL細胞毒性殺傷功能增強(51Cr-釋放試驗，MTT試驗等)。通過對上述任何一種細胞生物學變化的測量，可建立多種抗原特異性細胞免疫功能的測定方法。5、合理的空白對照、自身抗原對照設置和動態監測方案在對樣品免疫細胞功能進行檢測時，本發明除提出設置不加任何刺激物的空白對照樣品外，著重強調設置自身抗原對照樣品。自身抗原對照主要是利用自身細胞或亞細胞成分(通常為外周血有核細胞或溶解物等)製備而成；但亦可採用無關細胞系(受檢免疫細胞不對此發生活化反應或允許範圍內的微弱反應)的細胞、亞細胞成分。這種自身抗原對照和空白對照可完好地反映非特異性抗原所產生背景信號(Background Signals)，另一方面也有助於對受檢樣品中免疫細胞的非特異性功能狀態進行分析；而比較空白對照、自身抗原對照、特異性抗原刺激樣品三者測量結果，分析三者結果之間的數量關係；對測量結果或受檢生物個體的特異性細胞免疫功能狀態可作出符合客觀實際的解釋和科學判斷。
舉例一、個體化特異性抗原製備(一)全細胞抗原刺激物製備1.抽取器官移植供者和受者外周靜脈血各5-10ml，分別置於兩支抗凝管中；2.在上述管中加入適量RBC裂解液、裂解RBC，離心去除RBC裂解碎片；3.收集有核細胞成分並進行細胞計數，使上述兩管細胞具有相同的細胞濃度；4.使用放射性照射或裂黴素處理有核細胞，使其喪失分裂活性。製備成個體化特異性全細胞抗原刺激物，用於受者免疫細胞功能測定；5.由相應器官移植受者製備的細胞抗原將作為檢測方法中的自身抗原對照刺激物；由相應器官移植供者製備的細胞抗原將作為檢測方法中的個體化特異性刺激物(二)亞細胞抗原刺激物製備1.同方法(一)中步驟1-3；2.使用反覆凍融法裂解有核細胞成分；即在0℃以下凍結細胞，然後在常溫或37℃融解，反覆1-5次；或使用超聲破碎法或勻漿方法，裂解上述細胞，製備亞細胞抗原；3.由上述製備獲得的亞細胞抗原將分別作為自身對照和個體化特異性刺激物用於分析測定；4.上述亞細胞抗原成分可置低溫(＜20℃)保存，供動態監測分析多次使用。(三)MHC(HLA)分子純化製備1.同方法(一)中步驟1-3；2.用含有去垢劑的適當緩衝液溶解有核細胞，經離心等方法去除細胞核成分，保留含有MHC(HLA)分子的細胞膜和細胞漿可溶性組份。
3.使用抗MHC(HLA)I類或/和II類分子抗體的親和層析柱，分離純化相應的MHC(HLA)I類或/和II類分子組分。
4.利用SDS-PAGE技術鑑定上述純化成分的分子量；利用抗MHC(HLA)分子抗體Western Blot技術(免疫印跡技術)對純化物進行特異性純度鑑定；5.測定上述純化物的蛋白濃度，置低混保存備用或直接用於檢測。(四)血小板MHC(HLA)I類分子製備1.同方法(一)中步驟1；2.常規離心分離獲得相應的血漿組分。
3.進一步製取血小板。血小板可作為MHC(HLA)I類分子抗原刺激物直接用於檢測免疫細胞功能或進一步純化獲得血小板提取物或MHC(HLA)I類分子。
4.利用勻漿或超聲破碎技術或血小板溶解液裂解血小板，去除不含MHC(HLA)分子的有形成分。保留含MHC(HLA)I類分子組分直接用於檢測。
5.利用MHC(HLA)I類分子抗體的新和層析柱，對步驟4獲得的血小板溶解物進行MHC(HLA)I類分子純化；
6.同方法(三)中的步驟4-5。
(五)MHC分子庫製備1.利用多個(100±個體)已知MHC(HLA)型別生物體的外周血有核細胞、或/和血小板，或表達MHC分子的細胞系、或轉基因細胞系(表達特定已知的MHC(HLA)分子型別)作為MHC(HLA)分子庫製備來源，以滿足統計學上對各類MHC(HLA)型別的要求(理論上覆蓋100％的生物群體)。
2.根據方法3、方法4所提供的方法對MHC(HLA)I類、II類分子進行純化、鑑定；可分別獲得MHC(HLA)I類分子庫(覆蓋目前已知的全部I類分子型別)；MHC(HLA)II類分子庫(覆蓋目前已知的全部MHC(HLA)II類分子型別)；全MHC(HLA)分子庫(包括全部MHC(HLA)I類II類分子型別)。
3.上述三種MHC(HLA)分子庫可根據測定需要分別加以選用。如利用MHC(HLA)I類分子庫檢測CD8+的CTL細胞功能；利用MHC(HLA)II類分子檢測CD4的TH的細胞功能等。
4.除上述MHC(HLA)分子庫外，對於其它MHC型別；如少數MHC(Minor MHC)分子庫也可利用上述提供的原理、方法進行製備，用於測定生物體的某些其它免疫功能。二、腫瘤特異性抗原製備(一)自身腫瘤特異性抗原製備1.由外科手術中切除的患者自身腫瘤組織剪成碎塊或活檢腫瘤組織，用酶學消化，梯度密度離心等技術製成單個腫瘤細胞懸液；2.經滅活處理的血液腫瘤細胞可直接用作特異性抗原刺激物；3.同時製備腫瘤患者外周血滅活的有核細胞作為自身抗原對照；4.上述細胞可使用前述的凍融法，去垢劑裂解法、勻漿、超聲裂解法將腫瘤細胞製成亞細胞成分作為檢測方法中的特異性刺激物；(二)多價腫瘤抗原庫製備1.根據現有各種腫瘤組織學來源、分類方法；可利用來自多個個體的同類腫瘤或多個同類腫瘤細胞系作為多價腫瘤抗原製備的來源。如腺癌類、鱗癌類、各類白血病細胞、黑色素細胞瘤細胞等；2.利用上述方法(一)中所提供的方法，可製備成不同種類腫瘤的抗原庫，通過腫瘤共同抗原識別機制，利用相應各類腫瘤抗原庫對某一特定腫瘤患者的特異性抗腫瘤免疫功能進行測定。三、個體化特異性細胞免疫功能檢測方法學由於本發明屬於一種個體化特異性細胞免疫功能檢測的方法學技術平臺；根據發明中提出的方法學原理、技術路線可衍生出多種相應的檢測方法，所必需強調的是這些方法不可能在本發明中一一列舉。因此，僅列一種方法學技術平臺描述「個體化特異性細胞免疫學功能檢測方法學」，詳見附圖
一。
權利要求
1.一種用於監測器官移植受者、腫瘤患者免疫細胞功能的個體化特異性方法。其主要包括以下內容1)製備個體化特異性抗原和自身對照抗原；2)製備MHC(HLA)分子庫；製備腫瘤抗原庫；3)以上述抗原刺激活化受檢樣品中的免疫細胞；4)以適當分離和/或分類方法對特異性免疫細胞的各種活化指標進行測量。
2.權利要求1中的個體化特異性抗原解釋為器官移植供者的任何組織或細胞及其相應提取物和腫瘤患者自身腫瘤的腫瘤細胞及其相應提取物。
3.權利要求2中的細胞或腫瘤細胞解釋為經過各種體外處理或不經過任何處理所獲得的供者任何生物細胞；或腫瘤患者自身的腫瘤細胞；包括具有或不具有生物活性增殖功能的細胞。
4.權利要求1中的個體化特異性抗原進一步解釋為經過物理、化學、生物化學、生物學、酶學等方法對上述組織、細胞處理後所獲得的複合組分或單一組分。
5.權利要求1中的個體化特異性抗原可來源於某特定生物個體或一個以上生物個體的組織細胞及其細胞成分。
6.權利要求1中的MHC(HLA)分子庫解釋為包括目前全部或部分已知的MHC(HLA)分子的混合分子庫；如MHC(HLA)I類分子庫；MHC(HLA)II類分子庫；MHC(HLA)I類和II類分子的混合分子庫。
7.權利要求6中的MHC(HLA)分子庫進一步解釋為通過各種方法、技術，以各種生物細胞、生物材料作為來源所製備獲得。如親和層析技術，層析技術DNA重組技術、DNA轉染技術、細胞生物學方法以及其它各種理化方法等。
8.權利要求1中的MHC(HLA)腫瘤抗原庫解釋為包括某一類腫瘤(如腺癌類、黑色素細胞瘤類等)共同抗原的腫瘤抗原，或包括所有腫瘤共同抗原的腫瘤抗原庫。上述腫瘤抗原庫可由一種或一種以上的同類腫瘤或/和不同類腫瘤，或由來自同一腫瘤組織細胞或不同腫瘤組織細胞的一個或多個生物個體，或細胞系製備而成。包括化學合成、生物合成；但必需包含一種或一種以上可被受檢生物個體免疫細胞所能特異性識別並發生相應生物學反應的腫瘤抗原成分。
9.權利要求10中的MHC(HLA)腫瘤抗原庫進一步解釋為全細胞腫瘤抗原庫，亞細胞腫瘤抗原庫或腫瘤抗原單一或多種純化組分所組成的腫瘤抗原庫。
10.權利要求9中的MHC(HLA)進一步解釋為通過任何物理、生化、化學合成方法、生物學方法、常層析方法、免疫親和層析方法、離心、梯度密度離心、沉澱等各種方法製備而成。
11.權利要求10中的抗原刺激解釋為以權利要求1-10中的個體化特異性抗原或MHC(HLA)分子庫，或腫瘤抗原庫中的抗原與相應受試樣品中的免疫細胞在體外共同溫育或培養30分鐘以上，完成對免疫細胞的刺激活化過程。
12.權利要求1中的受檢樣品解釋為接受相應器官移植供者的受者或任一移植受者和腫瘤特異性抗原製備來源腫瘤患者或任一腫瘤患者的外周全血、骨髓、各種生物體液如關節液、胸腔液、腹腔液、髓脊液等；但其至少包含一種與免疫功能有關的活性細胞成分。
13.權利要求1中的免疫細胞解釋為直接或間接參入免疫學生物反應的任何細胞個體或群體；如各類淋巴細胞及其亞群(T、B淋巴細胞；輔助性T淋巴細胞(TH0；TH1；TH2)、記憶性T、B淋巴細胞、抑制性T淋巴細胞等)；NK細胞；各種抗原提呈細胞(如樹突狀細胞、巨噬細胞、B淋巴細胞；間質細胞、纖維母細胞、纖維細胞)、血小板、紅細胞、各種骨髓細胞、各種幹細胞；各種免疫細胞前體細胞等。
14.權利要求1中的細胞分離分類方法解釋為可將混合細胞群體中某特定細胞群體(如T淋巴細胞、B淋巴細胞、CD4陽性細胞，CD8陽性細胞、中性粒細胞、NK細胞、血小板等)加以純化、分類的任何物理、生化、免疫學、生物學等方法。
15.權利要求1中的細胞分離分類方法進一步解釋為離心、密度梯度離心、自然沉降、非特異性吸附、固相吸附、免疫磁珠吸附、聚苯乙烯微珠免疫吸附、聚苯乙烯微孔板吸附，以及使用單或多標記技術(如單或多色螢光標記)在相應儀器(如流式細胞儀、螢光顯微鏡等)上可對各種免疫細胞進行分類鑑別的任何方法。
16.權利要求1中的活化指標解釋為免疫細胞經過刺激激活、活化後產生的任何直接、間接的生物學改變和生物學產物，並可被體外直接或間接測量手段所檢測的各種信號。
17.權利要求1中的活化指標進一步解釋為細胞形態變化、細胞數目變化、細胞酶學變化、細胞內離子濃度變化、細胞內外受體變化、細胞膜通透性變化、細胞吞噬功能變化、細胞活化標誌蛋白表達(如CD分子CD69，CD25，CD71，CD95，MHC-I分子，MHC-II分子等)；細胞內能量變化(如ATP、AMP濃度變化等)、細胞分泌各種生物因子變化(IL-2，IL-12，TNF；INFr；IL-4等)、細胞核變化(細胞核數目、DNA含量變化等)；細胞功能變化(殺傷功能、吞噬功能、粘附功能等)、細胞蛋白質濃度變化等。
18.權利要求1中的檢測方法解釋為能夠對權利要求17中活化指標進行相應測量的任何檢測方法，其主要包括但不限於下列方法ELISA，細胞ELISA(Cellular ELISA)；ELISPOT；發光檢測方法(生物發光、化學發光、時間延遲發光等)；螢光檢測方法(螢光測定儀、螢光顯微鏡計數、流式細胞儀檢測方法等)；同位素檢測(如51Cr釋放、3H-TdR摻入等)、細胞塗片染色檢測、細胞免疫組織化學檢測、細胞色素(MTT)檢測等。
19.權利要求1中的特異性抗原可來源權利要求2、3中所述的細胞及細胞提取物；也可來源於其他一個或一個以上生物個體的細胞；但至少必需含有一種能夠活化受檢樣品中特異性免疫細胞的成分，並可用於評價受檢個體的特異性免疫反應細胞的功能狀態(如受者對供者組織器官、細胞的特異性免疫反應細胞功能；腫瘤患者抗腫瘤特異性免疫反應細胞功能)。
20.權利要求1中的特異性抗原必須至少包括一種或一種以上與相應移植物共有的抗原成分或至少一種與腫瘤患者自身腫瘤細胞的共有抗原成分；並能特異性地刺激、活化移植物受者或腫瘤患者的抗移植物特異性免疫或腫瘤特異性免疫細胞。
21.本發明特別強調在特異性細胞免疫功能測定分析中設置自身抗原的對照刺激物，其具體方法為以與製備相應個體化、特異性抗原相同的方法製備受檢個體的細胞或細胞提取作為自身陰性對照，在完全相同的實驗條件下，分別對同一樣品中免疫細胞進行溫育、刺激、活化直至獲得最終結果。並結合特異性抗原刺激管(孔)和自身抗原對照管(孔)；無抗原刺激管(孔)的結果進行綜合分析和評價。
22.權利要求1中的個性化、特異性抗原和MHC(HLA)分子庫；腫瘤抗原庫和自身對照抗原可一次性製備、儲存用於不同時間採集的同一生物個體樣品的多次檢測；也可在不同時間多次適時製備而成。
全文摘要
根據細胞免疫學中T淋巴細特異性識別、激活、效應機制原理，結合器官移植免疫學、腫瘤免疫學的特點，本發明建立了一種具有個體化特異性免疫細胞功能檢測方法。該方法以器官移植供者的特異性抗原成分(全細胞Ag，細胞提取物Ag，純化的細胞Ag，HLA分子)；或MHC(HLA)分子庫；或腫瘤患者自身的腫瘤細胞Ag成分或含自身腫瘤抗原的腫瘤抗原庫作為個體化特異性刺激物與相應的器官受者或腫瘤患者的免疫細胞溫育培養；繼而通過對器官受者或腫瘤患者免疫細胞及其亞群進行分離或分類並同時對相應免疫細胞的活化指標進行測量，藉以評估器官移植供者特異性抗原反應性免疫細胞、腫瘤患者特異性抗原反應性免疫細胞的功能狀態。上述測定方法學具有顯著的個體化、特異性特徵；並同時具有廣譜通用性；可廣泛應用於器官移植中特異性免疫排斥反應的預測、動態監測以及腫瘤患者特異性抗腫瘤免疫功能的評價；作為免疫治療性用藥方案的重要參考指標。
文檔編號G01N33/566GK1444043SQ0215854
公開日2003年9月24日 申請日期2002年12月25日 優先權日2002年12月25日
發明者陳格, 劉向軍 申請人:帕弗瑞生物技術(北京)有限公司