綠藻萃取組合物及其製備方法

2023-10-11 17:35:59

專利名稱：：綠藻萃取組合物及其製備方法
技術領域：
：本發明以綠藻為原料，使用蛋白酶輔助乳酸菌發酵綠藻的方式來產生降血壓的肽(p印tide)與抑制神經傳導物質Y-氨基丁酸(GABA)。同時，並將綠藻發酵水解物模擬腸胃道消化酵素水解，進一步判定肽活性降解的情形，以及其對血管升壓素轉換酶的抑制能力。接著利用膠體層析與高效能液相層析分離(HPLC)純化活性肽，並鑑定其肽序列。
背景技術：
：代謝症候群(metabolicsyndrome)主要包括高血壓或血壓偏高但未達高血壓診斷標準的高血壓；包含血中三酸甘油脂偏高、高密度脂蛋白膽固醇偏低的血脂異常(dyslipidemia);糖尿病或空腹血糖偏高、葡萄糖耐受不良(glucoseintolerance);肥胖(特別指中心肥胖(centralobesity)或稱腹部肥胖)以及高尿酸與凝血因子的不正常等等。有代謝症候群的人，其罹患心血管疾病、腦血管疾病及腎臟疾病的危險遠比沒有代謝症候群的人高，因此代謝症候群的預防與治療，引起臨床醫學及基礎研究極大關注。在心血管疾病(Cardiovasculardisease,CVD)的風險因素中，以高血壓為首要的影響因子。預估有20%成年人面臨到高血壓的問題。當成人的收縮壓上升5mmHg，則會增加16%的心血管疾病風險，而影響高血壓的原因很多，包括腎素系統、內分泌系統、神經因素、心臟、血管及遺傳因子。血管升壓素轉換酶(AngiotensinI-convertingenzyme,ACE;EC3.4.15.1)在影響腎素-血管升壓素系統(Renin-angiotensinsystem,RAS)是關鍵酵素，可以調控血壓，能將不具活性的十肽的血管升壓素I(AngiotensinI)催化成具有強烈血管收縮作用的八肽的血管生壓素II(AngiotensinII)，同時也使具有血管舒張功能的血管舒張素(bradykinin)失去活性，造成血管收縮而引起血壓上升。醫學上利用作為降血壓藥物的ACE抑制劑多半都是短鏈肽的類似物，例如卡託普禾U(captopril)、依那普禾U(enalapril)、阿拉普禾U(alac印ril)與賴諾普禾U(lisinopril)，但是服用後會有乾咳、頭暈、過敏反應等副作用。因此藉由保健食品中原料經酵素水解取得肽類的ACE抑制劑，已掀起風潮。關於利用食品蛋白質水解以產生具有抑制ACE肽的方式已有許多文獻說明，諸如酪蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、發酵牛乳、水產類的蠔油、蜆及藻類等。而利用乳酸菌發酵乳品產生具有抑制神經傳導物質Y-氨基丁酸並進一步應用於降血壓生理效果的文獻包含有Lin等人，2007;Hayakawa等人，2002以及0kada等人，2000。
發明內容本發明具有驚人發現，將破胞綠藻以混和乳酸菌與商用蛋白酶一同發酵水解，隨作用時間拉長其抑制血管升壓素-1轉換酶活性的1(:5。值越小，顯示本混合乳酸菌與商用蛋白酶一同發酵水解的破胞綠藻產物可用於開發具調節血壓生理效果的組合物。本發明提供一種製備有效抑制血管升壓素-I轉換酶活性組合物的方法，該方法包括下列步驟(a)將適量綠藻粉末加入第一溶劑中加熱沸騰後冷卻；(b)加入適量的混合乳酸菌及商用蛋白酶於步驟(a)的溶液中；(c)將步驟(b)溶液置於適當溫度作用一段時間；(d)將步驟(C)溶液加熱後冷卻；(e)將步驟(d)溶液離心取上澄清液；(f)將步驟(f)上澄清液過濾並凍結乾燥。本發明所述方法中，所述步驟(a)的綠藻粉末可為破胞綠藻粉末，還可為未破胞綠藻粉末。所述步驟(a)中所述破胞綠藻粉末為3070克。所述步驟(a)中，所述第一溶劑包括至少15重量％的蔗糖。所述步驟(b)中，所述混合乳酸菌為0.55重量％，所述商用蛋白酶為0.55重量％。所述步驟(b)中，所述混合乳酸菌至少包含酪蛋白乳酸桿菌(Xactobacilluscasei)、嗜酸乳酸桿菌(Xactobacillusacidophilus)、嗜熱鏈球菌(Str印tococcusthermophilus)、保力口利亞乳酸桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、龍根菌(Bifidobacteriumlongum)。所述步驟(c)中，所述溫度為3745t:，所述作用時間為040小時。本發明還提供一種有效抑制血管升壓素-I轉換酶活性的組合物，其包含綠藻萃取物。所述綠藻萃取物可為水溶液萃取物。所述綠藻萃取物進一步包含乳酸菌與商用蛋白酶發酵水解產物。所述乳酸菌選自至少包含酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacilluscasei)、嗜酸乳酸桿菌(Xactobacillusacidophilus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、保力口利亞乳酸桿菌(Xactobacillusbulgaricus)、龍根菌(Bifidobacteriumlongum)的菌群。本發明所述的組合物，其還可包含GABA。所述乳酸菌與商用蛋白酶發酵水解產物進一步包含腸胃道酵素水解物。所述腸胃道酵素水解物可包含胃蛋白酶水解物，所述腸胃道酵素水解物可包含胰酵素水解物。本發明所述的組合物，其還可包含抑制血管升壓素轉換酶的活性肽。所述活性肽至少包含Phe-Tyr、Asp-Trp、Ala-Trp、Tyr-Phe、Val-Trp與Ile-Trp。本發明實施例提供破胞綠藻發酵水解物的可溶性蛋白含量、肽含量、游離胺基酸含量、Y_氨基丁酸含量、對ACE抑制活性、對ACE抑制活性的IC5。值的測定。本發明實施例提供模擬腸胃道酵素水解的水解物的製備方式。本發明提供經胃蛋白酶與胰酵素(Pancreatin)水解的水解物，其分子量小於1500Da的主要肽的純化與鑑定方式。圖1為破胞綠藻發酵水解物(發酵40小時)經腸胃道消化酵素水解的肽膠體層圖2為破胞綠藻發酵水解物(發酵40小時)經腸胃道消化酵素水解後的膠體層析劃分物D的逆相高效液相層析圖譜。附圖標記說明l-枯草菌素(1422.0Da);2-penta-L-苯丙氨酸(753.9Da);3-色氨酸(204.2Da)。具體實施例方式以下實施例旨在進一步說明本發明的技術內容，而非用以限制本發明的申請專利範圍。實施例一乳酸菌的培養與凍幹製備菌液由-8(TC取出100微升，加入10毫升的MRS中，以37t:培養6-12小時，測量OD值為0.81.0後，取1毫升加入裝有於1升MRS的錐形瓶中，再次於37t:培養6-12hr，待其OD值為0.81.0，於4°C以7000Xg離心10分鐘，離心後將上層MRS倒掉，加入已殺菌的0.85%NaCl(3-5倍菌體量)，搖晃均勻後，再以7000Xg，10min，4°C的條件離心兩次，接著將NaCl倒掉，加入脫脂鮮奶為基質，鋪盤凍幹。實施例二綠藻萃取物的製備取適量(如30-70克)破胞綠藻粉末加入15克蔗糖並添加450毫升去離子水，以沸水浴加熱30分鐘進行殺菌處理，待冷卻後添加適量(如0.5-5重量％)的混合乳酸菌及商用蛋白酶於42t:的培養箱中作用0至40小時，再以沸水加熱30分鐘，待冷卻後以6，OOOXg離心10分鐘，上澄清液以2號濾紙過濾，最後再經凍結乾燥機進行凍結乾燥製成粉末。實施例三綠藻萃取物的可溶性蛋白含量測定(Peterson,1979)取O.3克破胞綠藻發酵水解液凍結乾燥粉末，以去離子水定量至IO毫升後，經O.2微米濾膜過濾再適當稀釋，取0.1毫升與0.5毫升A試劑以及4毫升B試劑(Bio-RadDCProteinAssayKit,Bio-RadLabortoriesInc.，USA)混合，靜置15分鐘，接著以分光光度計于波長750納米下測定其吸光值，由胎牛血清白蛋白(BovineSerumalbumin)標準物質得到的標準檢量線換算可溶性蛋白的含量，單位為毫克/克。實施例四綠藻萃取物的肽含量測定以鄰苯二醛(o-phthaldialdehyde，0PA)溶液測定樣品中肽含量，分別將25毫升的lOOmM四硼酸鈉、2.5毫升的20%十二烷基磺酸鈉(Sodiumdodecylsulphate,SDS)、1毫升的0PA(40毫克鄰苯二醛溶於1毫升甲醇中)、100微升的13-乙基硫醇(13-merc即toethanol)以去離子水混合於棕色瓶定量至50毫升即為鄰苯二醛溶液。取0.3克破胞綠藻發酵水解液凍結乾燥粉末，以去離子水定量至10毫升後，經0.2微米及5000Da濾膜過濾再適當稀釋，取50微升與2毫升的鄰苯二醛溶液混合震蕩，靜置2分鐘後，以分光光度計于波長340納米下測定其吸光值，由Leu-Gly標準物質得到的標準檢量線換算肽的含量，單位為毫克/克。實施例五綠藻萃取物的游離胺基酸含量測定以Cd-Ninhydrin試劑測定樣品中游離胺基酸含量，先將80毫升的99.5%乙醇與10毫升醋酸混合後，再加入0.8克Ninhydrin與1毫升的CdCl2(用去離子水配製，濃度為51克/毫升)，混合後即為Cd-Ninhydrin試劑。取0.3克綠藻發酵水解液凍結乾燥粉末，以去離子水定量至10毫升後，經0.2微米及5000Da濾膜過濾再適當稀釋，取0.5毫升與1毫升的Cd-Ninhydrin試劑混合震蕩後，於84t:水浴加熱5分鐘後，以分光光度計于波長507納米下測定其吸光值，藉由Leucine標準物質得到的標準檢量線換算游離胺基酸的含量，單位為毫克/克。實施例六綠藻萃取物的Y-氨基丁酸測定以(Moret等人，2005)的方法作修飾，取O.3毫升鄰苯二醛(o-phthaldialdehyde)試劑(100毫克OPA粉末溶於3毫升甲醇)和20微升2-硫醇丙酸(2-Mercaptopropionicacid，MPA)加入4毫升0.1M硼酸鹽溶液(pH10.0)，為OPA衍生劑。取50微升如前述的樣品溶液加入250微升OPA衍生劑震蕩均勻後於室溫反應1分鐘，經0.22微米濾膜過濾後以逆相高效能液相層析(RP-HPLC)分析。RP-HPLC分析條件如下，移動相3.54克KH2P04和5.66克Na2HP04溶於800毫升去離子水中，再以NaOH調整pH值為7.0，最後定量至1升。移動相A:取上述溶液90毫升加入370毫升去離子水；移動相B:HPLC級的乙月青(acetonitrile);移動相C:去離子水。梯度:1-15分鐘保持A:87%，B:13%;15-20分鐘B至15%，(3至85%;20-30分鐘B升至85%，C降至15X。取20微升的溶液注入LunaC18管柱(4.6X250毫米，粒徑尺寸為5微米；phenomenex，U.S.A.)流速為0.8毫升/分鐘，于波長254納米(UV/Visibledetector118，Gillson，France)下測量GABA面積，再以GABA標準品面積做對照計算樣品中GABA含量。實施例七綠藻萃取物對ACE抑制能力的測定以Wu與Ding(2002)的方法作修飾，利用逆相高效能液相層析法分析。ACE粉末溶於lOOmM硼酸緩衝溶液(含有300mM的氯化鈉，pH8.3，濃度為53mU/毫升)中，5mMHippuryl-Histidyl-Leucine(HHL)粉末亦溶於lOOmM硼酸緩衝溶液中。取75微升ACE溶液及75微升適當濃度樣品(以lOOmM硼酸緩衝溶液稀釋，經0.2微米及5000Da濾膜過濾)混合震蕩後以37t:水浴，反應十分鐘，接著添加75微升的HHL溶液為基質，混合液繼續於37t:水浴，反應30分鐘，最後以250微升的INHC1終止反應。取10微升的溶液注入LunaC18管柱(4.6X250毫米，粒徑尺寸為5iim，phenomenex，U.S.A.)，管柱的衝提液為50%甲醇(含有0.1%三氟醋酸)，流速為0.8毫升/分鐘，于波長228納米(UV/Visibledetector118，Gillson，France)下測量從HHL中分離出的產物馬尿酸(Hippuricacid，HA)的吸光值，由吸光值計算抑制ACE活性的百分比。計算公式如下抑制能力(％)=[(AC-AS)/(AC-AB)]X100%。AC(control)=以緩衝液取代樣品反應後的吸光值。AS(sample)=樣品反應後的吸光值。AB(blank)=以緩衝液取代樣品，反應前先加HC1終止反應後的吸光值。實施例八發酵水解物抑制ACE活性的IC5。值測定取0.3克綠藻發酵水解液凍結乾燥粉末，以去離子水定量至10毫升後，經0.2微米及5000Da濾膜過濾再適當稀釋，作對抑制ACE活性的測定。以樣品濃度的對數值與抑制百分比作圖，求出最適回歸曲線，並依此回歸方程式，求出抑制ACE活性50X所需的樣品濃度，即為ICs。值。實施例九綠藻萃取物的擬腸胃道酵素水解作用取35克綠藻發酵水解液凍結乾燥粉末溶於0.1MKC1-HC1緩衝溶液(pH2.0)，定量至l升，添加胃蛋白酶(E/S=1:25)，在37t:水浴下作用4小時後以2NNaOH將pH值調至7.0，並置於沸水浴中IO分鐘使酵素失活終止反應。取部分做抑制ACE能力的測定，剩餘的反應液再添加胰酵素(E/S=1:25)並在37t:水浴下作用4小時，置於沸水浴中10分鐘終止反應，冷卻至室溫後儲存於-2(TC備用。將經消化酵素水解後的水解液離心(10，000Xg，30分鐘)，取上清液經0.2微米及5000Da濾膜過濾後，作對抑制ACE能力的測定。實施例十綠藻萃取物擬腸胃道消化酵素水解作用產物其小於1500Da的主要肽的純化與鑑定(—)膠過濾層析法取0.3克綠藻發酵水解液凍結乾燥粉末，以去離子水定量至10毫升後，經0.2微米及5000Da濾膜過濾，注射量為2毫升。以C16/900(16X900mm)(AmershamPharmaciaBiotechAB，Sweden)為過濾管柱，內部充填Sephadex⑧G-15(PharmaciaBiotechABU卯sala，Sweden),衝提液為去離子水，流速為0.5毫升/分鐘(MINIPULS3，GilsonMedicalElectronicInc.，France)，以劃分集液器(Fc203，GilsonMedicalElectronicInc.，France)收集流出液(5毫升/管)，再以分光光度計于波長280納米下檢測，由標準品得到的標準檢量線換算肽的分子量。標準品的分子量如下枯草菌素(Bacitracin):1422.0Da，penta-L-苯丙氨酸753.9Da，色氨酸(Tryptophan):204.2Da。[ooee](二)劃分收集物對ACE抑制活性的測定將經膠體過濾劃分後的波峰及前後各一管，共三管收集為一管，為15毫升/管，經凍結乾燥後，以lOOmM硼酸緩衝溶液將乾燥粉末(含有300mM的氯化鈉，pH=8.3)定量至1毫升，依照前述測定抑制ACE能力與肽含量，並計算劃分收集物對ACE有效抑制百分比(Inhibitoryefficiencyratio,IER)，S卩，抑制(％)/肽濃度(毫克/毫升)，且將具有最高抑制ACE活性的主要波峰收集物供高效能液相層析分離。[ooes](三)高效能液相層析層析條件是以衝提液A:含0.1%三氟醋酸水溶液、衝提液B:含0.1%三氟醋酸的乙腈溶液為移動相，在120分鐘內將衝提液B濃度由0%提高至100%，進行梯度衝提，流速為1.5毫升/分鐘(PumpL-7100,Hitachi,Ltd.，Japan)，樣品注射量為500微升；以C18半製備型(Synergi4iiHydro-RP80A，250XlOmm，Phenomenex，U.S.A.)為層析管柱，同時使用保護管柱(Synergi4iiHydro-RP80A，50XlOmrn，Phenomenex，U.S.A.);檢測器在波長220納米下檢測，並收集具有抑制ACE活性的主要波峰。再將收集波峰以1.5毫升/分鐘的流速，注射量為10微升，注射入疏水性較低的C12分析型管柱(Jupiter4iiProteo90A，250X4.6mm)分析，並配合保護管柱(Jupiter4iiProteo90A，4X3.0mm，Phenomenex,U.S.A.)，流析時間為60分鐘，確定收集物為單一波峰，其餘層析條件與使用C18半製備管柱相同。[OO71](四)胺基酸序列分析收集經高效能液相層析分離的主要波峰，且具較高抑制ACE活性的物質，利用胺基酸序列分析儀(492Agas-phaseautomatedsequence,AppliedBiosystems，Inc.，U.S.A.)以Edman降解法分析，鑑定肽的胺基酸組成序列。[OO73](五)合成肽抑制ACE活性的IC5。值測定取合成的肽粉末，溶於去離子水後，經適當稀釋做對抑制ACE活性的測定。以樣品濃度的對數值與抑制百分比作圖，求出最適回歸曲線，並依此回歸方程式，求出抑制ACE活50%所需的樣品濃度，即為合成肽的ICs。值。各項數據以統計分析系統(StatisticalAnalysisSystem,SAS1988)統計套裝軟體體進行統計的變異數分析(ANOVA)，並以Duncan's多變異法(multiplerangetest)探討各樣品的間的差異性。本發明綠藻萃取物的性質如下所述(—)作用時間對破胞綠藻發酵水解物(添加1%混合乳酸菌)的pH、可溶性蛋白、肽、游離胺基酸與GABA含量的影響如表1所示，O至40小時，破胞綠藻發酵水解物的pH值從6.23下降至3.95;可溶性蛋白含量從66.1增加為415.6毫克/克；肽含量從27.3增加為255.0毫克/克，游離胺基酸含量則從15.4增加為71.9毫克/克。表1作用時間對破胞綠藻發酵水解物的pH、可溶性蛋白、肽與游離胺基酸含量的影響tableseeoriginaldocumentpage81.加入1%混合乳酸菌與1%Prozyme6的破胞綠藻每一值代表3個樣本的平均，同一列的不同上標代表樣本間的顯著差異(p<0.05)另如表2所示，破胞綠藻發酵水解物的GABA含量亦隨作用時間拉長而增加，O至40小時，GABA含量從4.5增加為164.1毫克/100克，明顯增加36倍。在綠藻中同時添加混合乳酸菌與蛋白酶進行發酵水解，可溶性蛋白、肽、游離胺基酸以及GABA各含量皆隨發酵水解時間的拉長而增加，表示作用時間與發酵水解程度成正比關係。表2作用時間對破胞綠藻發酵水解物1的Y_氨基丁酸含量與抑制ACE的IC50的影響tableseeoriginaldocumentpage91.加入1%混合乳酸菌與1%Prozyme6的破胞綠藻2.GABA=Y_氨基丁酸3.未定每一值代表3個樣本的平均，同一列的不同上標代表樣本間的顯著差異(p<0.05)(二)破胞綠藻發酵水解物的Y-氨基丁酸抑制ACE的IC5。能力不同作用時間對破胞綠藻發酵水解物抑制ACE活性的IC5。值的影響，其結果如表2所示。破胞綠藻發酵水解物隨著作用時間10至40小時的增加，其抑制ACE活性的IC5。值從0.120下降為0.089毫克肽/毫升，顯示在乳酸菌發酵階段，會增加更多具有抑制ACE活性的肽。(三)模擬腸胃道消化酵素的水解作用破胞綠藻發酵水解物中的肽在體外試驗中均顯示具有抑制ACE能力的活性。而經由腸胃道酵素作用，可能會將肽再水解而改變其生理活性。因此將綠藻發酵水解物模擬腸胃道酵素作用，以模擬人體消化後對抑制ACE活性的影響，其結果如表3所示。表3腸胃道消化酵素對破胞綠藻發酵水解物的肽含量與其ACE11(^。2值的影響tableseeoriginaldocumentpage9l.ACE=血管升壓素轉換酶2.IC50=抑制50%ACE活性所需的抑制劑濃度3.破胞綠藻水解物發酵40小時4.在37。C水解4小時5.經胃蛋白酶水解4小時，接著以胰酵素於37t:水解4小時每一值代表3個樣本的平均，同一列的不同上標代表樣本間的顯著差異(p<0.05)實驗組為經混合乳酸菌及作用40小時的破胞綠藻發酵水解物進一步以胃蛋白酶與胰酵素水解，以模擬腸胃道酵素作用，肽含量由6.5減少為6.2毫克/毫升。經混合乳酸菌及商用蛋白酶作用40小時的破胞綠藻發酵水解物其對ACE抑制的IQ。值為0.089毫克肽/毫升。在模擬腸胃道酵素作用後，對ACE抑制的IC5。值增加為0.109毫克肽/毫升，表示經腸胃道酵素作用後，會將具有抑制ACE活性的肽再水解，使其活性降低，因此減少對ACE抑制IC5。值的表現能力。(四)體外模擬腸胃道消化酵素水解的破胞綠藻發酵水解物中分子量小於1500Da的主要肽的純化與鑑定1.膠體層析經混合乳酸菌及商用蛋白酶作用40小時的破胞綠藻發酵水解物進一步以胃蛋白酶與胰酵素水解的樣品經由S印hadexG-15膠過濾層析分離的結果如圖l所示。實線為胃蛋白酶與胰蛋白酶作用前的圖譜，虛線為胃蛋白酶與胰蛋白酶作用後的圖譜。破胞綠藻發酵水解物經由模擬腸胃道酵素消化作用後，其膠體層析圖譜有右移現象，顯示腸胃道酵素會將肽再作用成更小的分子。如圖1所示，經混合乳酸菌及商用蛋白酶作用40小時的破胞綠藻發酵水解物進一步以胃蛋白酶與胰蛋白酶水解的樣品經由S印hadexG-15膠過濾層析分離可得四個劃分(AD)。表4顯示四劃分的預估分子量，劃分A:1000900Da、劃分B:765700Da、劃分C:570510Da、劃分D:320290Da。利用此種層析方法，可使破胞綠藻發酵水解物的肽依分子量大小來分離。其中劃分C為經由胃蛋白酶與胰蛋白酶水解後所產生，而劃分B的吸光值也提高。分別收集四個劃分並測其肽含量與抑制ACE的百分比，進而將兩者相除即為單位濃度肽的有效抑制百分比IER(Inhibitoryefficiencyratio)，藉由IER作為初步篩選最具抑制能力的劃分，而IER越高表示其抑制ACE能力越強。表4破胞綠藻發酵水解物經腸胃道消化酵素水解後的膠體層析劃分物的ACE1有效抑制百分比(IER2)與ICs。值tableseeoriginaldocumentpage10l.ACE=血管升壓素轉換酶2.^1=有效抑制百分比=%抑制/肽濃度(毫克/毫升)3.IC50=抑制50%ACE活性所需的抑制劑濃度4.-:未定破胞綠藻發酵水解物經由模擬腸胃道消化後，其不同分子量劃分物皆有抑制ACE活性的能力，以劃分D(M.W.=320290Da)的IER值最高，為3396%/毫克/毫升，IC5。為0.006毫克/毫升。因此將選擇具有較高IER值的劃分D做分離並純化鑑定其活性肽的序列。2.高效能液相層析法將上述劃分D以高效能液相層析法(C18管柱)進行純化與分離，共可得十一個尖峰(D1D11)物質，如圖2所示。分別收集尖峰物質並測其肽含量與抑制ACE有效百分比且計算其IER值，其結果如表5所示。其中以尖峰DIO與Dll的IER值分別為4917.9與5744.6%/毫克/毫升，皆高於破胞綠藻發酵水解物40小時的劃分D的IER值(3396.2%/毫克/毫升)，此結果證明可利用高效能液相層析法所分離的尖峰物質具有達到純化有效肽的目的。表5破胞綠藻發酵水解物(發酵40小時)經腸胃道消化酵素水解後膠體層析的劃分物D進一步以HPLC純化所得劃分Dl至Dll的ACE有效抑制百分比尖峰抑制肽濃度IER1(%)(毫克/毫升)(%/毫克/毫升)Dl0.90.01180D213.30.023579D36.70細834D49.70.016607D55.00.013381D629.20.0122433D728.80.0132217D866.80.0232卯5D918.50.0161157D1083.60.0174918Dll74.70.01357451.IER=有效抑制百分比=%抑制//肽濃度(毫克/毫;升)3.肽序列的鑑定分別收集以膠過濾層析分離的劃分D的破胞綠藻發酵水解物經由高效能液相層析法(C18管柱)進行分離的尖峰D6、D7、D8、D9、D10與Dll的肽產物(IER大於1000%/毫克/毫升)，再以高效能液相層析(C12管柱)分析。分離結果中，尖峰Dll的滯留時間最長(尖峰D6:40.14分鐘、尖峰D7:40.89分鐘、尖峰D8:41.16分鐘、尖峰D9:43.18分鐘、尖峰DIO:44.06分鐘、尖峰D11:47.10分鐘)，且各尖峰的肽經C12管柱分離皆為單一波峰，確定為單一物質之後，再經Edman降解法鑑定其胺基酸組成序列。尖峰D6、D7、D8、D9、D10與Dll的序列分別為Phe—Tyr(FY，IC50=18.05iiM)、Asp-Trp(DW，IC50=31.81iiM)、Ala-Trp(AW，IC50=9.19iiM)、Tyr-Phe(YF，IC50=45.76iiM)、Val-Trp(VW，IC50=2.27iiM)與Ile-Trp(IW，IC50=1.33iiM)，其結果如表6所示。此六個肽中D7、D8、D10與Dll其氮端或碳端皆有色胺酸(tryptophan)，推測水解物經腸胃道消化酵素作用，因胃中的消化酵素，胃蛋白酶，會特別作用在氮端或碳端為芳香11族胺基酸(如Phe、Trp與Tyr)或Leu的肽鍵，而腸中胰酶的消化酵素胰凝乳蛋白酶則對tryptophan具專一性水解。D7、D8、D10與Dll其氮端或碳端皆有tryptophan的現象與陳，2007年的研究，將海鱺魚皮水解物(PX5組及經腸胃道消化酵素水解後)的樣品經HPLC純化，並以Edmandegradation法鑑定其胺基酸組成序列，得到四個肽序列Trp-Ala-Ala、Ala-Trp-Trp、Ile-Trp-Trp與Trp-Leu，而該四肽序列皆含有tryptophan的現象類似。另，尖峰D6Dll碳端的胺基酸出現規則較符合Cheung等人於1980年所提出的論點，即肽的碳端為芳香族胺基酸或氮端為具分支鏈的胺基酸，抑制ACE能力較強。表6破胞綠藻發酵水解物(發酵40小時)經腸胃道消化酵素水解後膠體層析劃分物D進一步以HPLC純化所得劃分D6至Dll的肽序列與其IC5。值tableseeoriginaldocumentpage12權利要求一種製備有效抑制血管升壓素-I轉換酶活性組合物的方法，該方法包括下列步驟(a)將適量綠藻粉末加入第一溶劑中加熱沸騰後冷卻；(b)加入適量的混合乳酸菌及商用蛋白酶於步驟(a)的溶液中；(c)將步驟(b)溶液置於適當溫度作用一段時間；(d)將步驟(c)溶液加熱後冷卻；(e)將步驟(d)溶液離心取上澄清液；(f)將步驟(f)上澄清液過濾並凍結乾燥。2.如權利要求l所述的方法，其特徵在於所述步驟(a)的綠藻粉末為破胞綠藻粉末。3.如權利要求l所述的方法，其特徵在於所述步驟(a)的綠藻粉末為未破胞綠藻粉末。4.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述步驟(a)中所述破胞綠藻粉末為3070克。5.如權利要求l所述的方法，其特徵在於所述步驟(a)中，所述第一溶劑包括至少15重量％的蔗糖。6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟(b)中，所述混合乳酸菌為0.55重量％，所述商用蛋白酶為0.55重量％。7.如權利要求l所述的方法，其特徵在於所述步驟(b)中，所述混合乳酸菌至少包含酪蛋白乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳酸桿菌、龍根菌。8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟(c)中，所述溫度為3745t:，所述作用時間為040小時。9.一種有效抑制血管升壓素-I轉換酶活性的組合物，其特徵在於其包含綠藻萃取物。10.如權利要求9所述的組合物，其特徵在於所述綠藻萃取物為水溶液萃取物。11.如權利要求9所述的組合物，其特徵在於所述綠藻萃取物進一步包含乳酸菌與商用蛋白酶發酵水解產物。12.如權利要求11所述的組合物，其特徵在於所述乳酸菌選自至少包含酪蛋白乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳酸桿菌、龍根菌的菌群。13.如權利要求11所述的組合物，其特徵在於其包含GABA。14.如權利要求11所述的組合物，其特徵在於所述乳酸菌與商用蛋白酶發酵水解產物進一步包含腸胃道酵素水解物。15.如權利要求14所述的組合物，其特徵在於所述腸胃道酵素水解物包含胃蛋白酶水解物。16.如權利要求14所述的組合物，其特徵在於所述腸胃道酵素水解物包含胰酵素水解物。17.如權利要求14所述的組合物，其特徵在於其包含抑制血管升壓素轉換酶的活性肽。18.如權利要求17所述的組合物，其特徵在於所述活性肽至少包含Phe-Tyr、Asp-Trp、Ala-Trp、Tyr-Phe、Val-Trp與Ile-Trp。全文摘要本發明揭露一種綠藻萃取物及其製造方法，該綠藻萃取物含有活性肽與抑制神經傳導物質，可有效抑制血管升壓素-I轉換酶的活性，其可進一步用於開發具調節血壓生理效果的組合物。文檔編號A61K36/05GK101744845SQ20081017934公開日2010年6月23日申請日期2008年11月28日優先權日2008年11月28日發明者葉錦熙,蕭秀玟,蔡震壽申請人:臺灣綠藻工業股份有限公司