新的睪丸功能相關蛋白及其用途的製作方法

2023-10-11 13:07:34

專利名稱：新的睪丸功能相關蛋白及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術和醫學領域，具體地說，本發明涉及新的編碼睪丸功能相關蛋白RabJ(一種細胞內吞調控蛋白)的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和製備。具體地說，本發明的多肽是一種新的與睪丸生精和個體發育有關的新型Rab蛋白。
背景技術：
近年來，蛋白轉運逐漸引起了眾多科學家的注意，這涉及到生命的本質，與細胞物質更新、感受外界刺激、細胞內外物質的轉運和信息的交流密切相關。外環境蛋白的攝取、轉移、代謝和細胞自身合成蛋白的分泌、修飾、定位是一個嚴格調控的過程。在分子水平上，目前認為一個Rab基因家族在其中起者非常關鍵的作用。
Rab基因是一個從屬於Ras超家族的具有GTP酶活性的小分子量蛋白。在基因水平上，該家族的一個特點是具有多種異構體，基因序列長短不一，功能也各有不同；在蛋白水平上，該家族的分子都有磷酸/鎂離子結合序列和GTP結合的功能域，有的甚至還有磷酸化的修飾位點；在生化活性上，其典型的特徵是能夠與GTP結合，而且自身又具有緩慢GTP水解活性，脫磷酸後形成GDP-Rab的存在形式，而且隨著GTP-Rab向GDP-Rab的轉換，該蛋白也從膜結合形式轉變為胞漿存在形式；在細胞水平上，該家族蛋白的一個顯著特點是都定位於特定的細胞器或亞細胞膜性結構上，而且負責某一個特定的蛋白轉運步驟；在生物學功能上，目前認為Rab家族在囊泡的形成、定向錨著和融合等蛋白轉運的關鍵步驟中起著主要的調控作用。雖然Rab在調控蛋白轉運的過程中意義重大，但該功能仍需要相關調控蛋白的作用，例如GTP酶活化蛋白(GTPase activating protein，GAP)、GDP解離抑制蛋白(GDP dissociation inhibitor，GDI)、鳥苷酸交換因子(guaninenucleotide exchange factor，GEF)等分子都促進或抑制Rab的生物學行為。目前，該家族的成員已經達到了近40多個(包括其各自的異構體)。
對Rab基因的研究主要集中在基礎生命科學領域，發現了許多Rab分子在特定蛋白轉運過程中的作用。例如Rab1a、Rab1b、Rab2定位於內質網和高爾基體並且介導二者之間的物質轉運；Rab6、Rab8、Rab12與高爾基體相關，介導不同高爾基部位之間的物質轉運。作為細胞與外界環境之間交流的始發事件，與內吞相關的Rab也已經發現。例如，Rab4a定位於早期內吞體，介導早期內吞體的膜成分會到胞膜；Rab9定位於晚期內吞體，介導囊泡向高耳基體的轉運。(Neuron，1993，Vol.11，789-799)。雖然研究集中在基礎醫學領域，然而亦有報導顯示Rab基因在病理或生理情況下的臨床潛在意義。例如人們發現Rab36與小兒神經系統惡性杆狀腫瘤相關(Biochemical and BiophysicalResearch communications，1999，254，594-600)，Rab37表現為肥大細胞特異性分布，提示其與過敏反應、哮喘、炎症之間有聯繫(FEBS Letters，2000，470 61-64)；Rab5a可能與中性粒細胞的顆粒分泌相關，提示其在非特異性抗感染免疫中的潛在意義(Experimental CelResearch，1996，227，367-373)；Rab18在組織胺刺激以後表達上調，提示其在炎症中的作用(FEBS Letters 2000，466，148-154.)。另外研究顯示Rab蛋白在激素(胰島素、生長因子等)、神經肽、神經遞質的合成及分泌中有重要的作用。
睪丸是保證人類生命延續的基因庫的所在地，其功能的正常發揮對於物種的遺傳和延續至關重要。然而睪丸又是一個非常敏感和脆弱的器官，溫度的升高、創傷、化學物質的作用等環境因素對於其功能影響深遠，因此睪丸必須具有強大而且特殊的防護機制來保證自身功能的穩定。在諸多的保護機制中，一種行之有效的方法就是熱休克蛋白(Heatshock protein)的快速合成及其所介導的自身合成(de novo synthesis)、阻止蛋白聚集和變性、促進保護修復相關基因的合成、保護mRNA減慢降解速率等功能發揮保護和促進修復的功能。(Annu.Rev.Genet.1988，22 631-677)在熱休克蛋白家族中引人注目的一對可發生相互作用的分子便是DnaK/Hsp70家族分子和DnaJ/Hsp40家族分子之間所構成的伴侶分子對。DnaJ/Hsp40分子是DnaK/Hsp70的輔助分子，通過J功能域與DnaK/Hsp70的羧基端及中間部分結合，從而發揮其功能。J功能域是所有DnaJ/Hsp40家族分子所共有的，是DnaJ/Hsp40的特徵性功能域。(Trends Biochem.Sci.1994，19 176-181；Curr.Biol.1999，9，R305-308)。
Rab基因調控的異常將引起多個系統的多種疾病，如哮喘、糖尿病、炎症、腫瘤、神經精神異常等多種疾病。因此Rab基因的發現將具有重要的意義，而一個在睪丸組織中優勢表達的可以與熱休克蛋白發生作用的Rab蛋白的發現將更有意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的睪丸功能相關蛋白-RabJ蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。本發明的RabJ蛋白是一種Rab GTP酶和DnaJ/Hsp40同源分子。
在本發明的第一方面，提供新穎的分離出的RabJ多肽，它包含具有SEQ ID NO2或4胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2或4胺基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述RabJ多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2或4所示胺基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中25-843位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1787位的序列；(c)具有SEQ ID NO3中1-822位的序列；(d)具有SEQ ID NO3中1-1091位的序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了製備具有RabJ蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達RabJ蛋白的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有RabJ蛋白活性的多肽。
在本發明的第五方面，提供了與上述的RabJ多肽特異性結合的抗體。還提供了可用於檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續的15-1000個或更多個核苷酸。
在本發明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗RabJ多肽活性的化合物，以及抑制RabJ多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或製備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是RabJ多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在RabJ蛋白的方法，它包括將樣品與RabJ蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在RabJ蛋白。
在本發明的第八方面，提供了一種檢測與RabJ多肽異常表達相關的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發明的第九方面，提供了本發明多肽和編碼序列的用途。例如本發明多肽可被用於篩選促進RabJ多肽活性的激動劑，或者篩選抑制RabJ多肽活性的拮抗劑、或者被用於肽指紋圖譜鑑定。本發明的RabJ蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用於PCR擴增反應，或者作為探針用於雜交反應，或者用於製造基因晶片或微陣列。
在本發明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明的RabJ多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可治療睪丸炎症、腫瘤、創傷，男性不育和發育異常等生殖系統疾病和其他多種疾病。
本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所界定的本圖1是本發明的人RabJ的cDNA序列，其中非編碼序列用小寫字母表示，編碼序列用大寫字母表示。
圖2是本發明的人和小鼠RabJ蛋白的全長胺基酸序列。
圖3是本發明的人RabJ蛋白與Rab蛋白和DnaJ/Hsp40蛋白的胺基酸序列同源性比較圖。上方序列是人RabJ，下方序列是Rab家族的蛋白或DnaJ/Hsp40蛋白。相同的胺基酸在兩個序列之間用黑體標出，相似的胺基酸用灰體標出。
圖4是本發明的hRabJ生化特性分析。
圖5是本發明的兔源多抗的特異性鑑定和RabJ蛋白表達譜分析；圖6是本發明的RabJ在任何小鼠睪丸組織中分布的免疫組化分析；圖7是本發明的RabJ在細胞內的定位研究，pnm表示後核膜(post nucleamembrane)。
圖8是本發明所發現的RabJ與Hsc70家族分子的相互作用。
具體實施例方式
本發明經過廣泛而深入的研究，克隆了一個新的Rab基因-RabJ的核苷酸、蛋白序列以及其結構特徵的分析利用原核表達載體表達純化了蛋白並研究了其基本的生化性質；經過製備兔源多克隆抗體，用Northern印跡、Western印跡、細胞內蛋白螢光標記和免疫組化等技術證明RabJ是優勢表達在睪丸組織的新型Rab蛋白；利用綠色螢光蛋白融合載體以及穩定表達RabJ的293細胞株研究了其胞內定位；利用免疫共沉澱技術說明了RabJ與Hsc70分子間的相互作用。
在本發明中，術語「RabJ蛋白」、「RabJ多肽」或「睪丸功能相關蛋白RabJ」可互換使用，都指具有睪丸功能相關蛋白RabJ胺基酸序列(SEQ ID NO2或4)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的睪丸功能相關蛋白RabJ。在本發明中hRabJ指人源的RabJ分子，而mRabJ指小鼠源的hRabJ的同源物。研究提示，RabJ可能參與睪丸的熱防護和其他對機體不利因素的防護；可能可以用於生殖功能異常和睪丸疾病，如腫瘤、創傷、發育異常等的診斷和治療；而且可能對於某些蛋白轉運異常疾病的診斷和治療也極有意義。
如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，「分離的RabJ蛋白或多肽」是指RabJ多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化RabJ蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。RabJ多肽的純度能用胺基酸序列分析。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括RabJ多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然RabJ多肽相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
在本發明中，術語「RabJ多肽」指具有RabJ多肽活性的SEQ ID NO.2或4序列的多肽。該術語還包括具有與RabJ多肽相同功能的、SEQ ID NO.2或4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括RabJ多肽的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人RabJ DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗RabJ多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含RabJ多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了RabJ多肽的可溶性片段。通常，該片段具有RabJ多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
發明還提供RabJ多肽或多肽的類似物。這些類似物與天然RabJ多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，「RabJ多肽保守性變異多肽」指與SEQ ID NO2或4的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。
表1

本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。對於人RabJ而言，編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本文所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。對於小鼠RabJ而言，編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO3所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體；而「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO4的蛋白質，但與SEQ ID NO3所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼RabJ的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語「編碼多肽的多核苷酸」可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2或4所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼RabJ蛋白的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的人RabJ核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優選用於獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用於PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，並可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或RabJ蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的RabJ多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼RabJ多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，人RabJ多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限於在細菌中表達的基於T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源於杆狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含人RabJ編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在複製起始點晚期一側的100到270個鹼基對的SV40增強子、在複製起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的RabJ多肽或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限於)直接做為藥物治療RabJ蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用於篩選促進或對抗RabJ蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組RabJ多肽篩選多肽庫可用於尋找有治療價值的能抑制或刺激RabJ多肽功能的多肽分子。
另一方面，本發明還包括對人RabJ DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於人RabJ基因產物或片段。較佳地，指那些能與人RabJ基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制RabJ多肽的分子，也包括那些並不影響RabJ多肽功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人RabJ基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的人RabJ基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達RabJ多肽或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷RabJ多肽功能的抗體以及不影響RabJ多肽功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人RabJ基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與人RabJ基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗RabJ多肽的抗體可用於免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的RabJ多肽。此外，與RabJ多肽結合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內可跟蹤其位置和分布。這种放射性標記的抗體可作為一種非創傷性診斷方法用於腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉移。
本發明中的抗體可用於治療或預防與RabJ多肽相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷RabJ多肽的產生或活性。
抗體也可用於設計成針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如RabJ多肽高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆鹼等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合於抗體上，這種雜交抗體可用於殺滅RabJ多肽陽性的細胞。
多克隆抗體的生產可用RabJ多肽或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。
利用本發明蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與RabJ蛋白發生相互作用的物質，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
本發明的多肽可直接用於疾病治療，例如，用於炎症、腫瘤、神經系統，呼吸系統，內分泌系統和心血管疾病等多種疾病的治療。在使用本發明RabJ蛋白時，還可同時使用其他治療劑。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明RabJ多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的RabJ蛋白或其拮抗劑、激動劑施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約1微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
RabJ多肽的多聚核苷酸也可用於多種治療目的。基因治療技術可用於治療由於RabJ蛋白的無表達或異常/無活性的RabJ蛋白的表達所致的細胞內吞、分泌或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的RabJ蛋白，以抑制內源性的RabJ蛋白活性。來源於病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用於將RabJ基因轉移至細胞內。構建攜帶RabJ基因的重組病毒載體的方法可見於已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組人RabJ基因可包裝到脂質體中，然後再轉移至細胞內。
抑制人RabJ mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發明的範圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交後進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸醯胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下遊。為了增加核酸分子的穩定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
能與RabJ多肽結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的胺基酸結合於固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對RabJ多肽分子進行標記。
本發明還涉及定量和定位檢測RabJ多肽水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的RabJ多肽水平，可以用作解釋RabJ多肽在各種疾病中的重要性和用於診斷RabJ蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在RabJ蛋白的方法是利用RabJ蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與RabJ蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在RabJ蛋白。
RabJ蛋白的多聚核苷酸可用於RabJ蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，RabJ蛋白的多聚核苷酸可用於檢測RabJ蛋白的表達與否或在疾病狀態下RabJ蛋白的異常表達。如RabJ DNA序列可用於對活檢標本的雜交以判斷RabJ蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用RabJ蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測RabJ蛋白的轉錄產物。
檢測RabJ基因的突變也可用於診斷RabJ蛋白相關的疾病。RabJ蛋白突變的形式包括與正常野生型RabJ DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發明的序列對染色體鑑定也是有價值的。簡而言之，根據本發明RabJ蛋白的cDNA製備PCR引物(優選15-35bp)，可以將序列定位於染色體上。然後，將這些引物用於PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應於引物的人基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數據相關聯。這些數據可見於例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯機獲得)。然後可通過連鎖分析，確定基因與業已定位到染色體區域上的疾病之間的關係。
在本發明的實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽。本發明的多核苷酸是從人樹突狀細胞cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1和圖1A所示，它包含的多核苷酸序列全長為1787個鹼基，其開放讀框位於25-843位，編碼全長為273個胺基酸的RabJ多肽(SEQ ID NO2和圖2)。該RabJ蛋白氨基端屬於蛋白轉運調控蛋白Rab家族分子，與Rab4和Rab5胺基酸序列高度同源，一致性可高達40％，相似性則可達60％；該蛋白的羧基端與DnaJ/Hsp40家族分子Hsj、CSP、Msj等分子同源(圖3)。RabJ蛋白也包含三個GTP結合基序，三個磷酸/Mg2+結合基序和一個保守的J功能域。
Northern印跡分析表明在組織中優勢表達於睪丸組織，在卵巢、腦、骨骼肌、心臟等僅有微弱表達，而在其他組織無表達。已進行的研究提示，RabJ可能為調控蛋白轉運的蛋白，介導蛋白的跨核轉運及內吞；也可能通過與Hsc70(heat shock cognate 70)的相互作用調控Hsc70介導的多種功能；或者作為Rab所要轉運蛋白和Hsc70分子間的橋梁，介導Hsc70的跨核轉運及其與Hsc70分子間的相互作用。因此，RabJ蛋白或其相關的拮抗劑、激動劑等可為診斷和治療睪丸炎症和腫瘤，男性不育和發育障礙及其他蛋白轉運相關疾病提供幫助，並可能直接為睪丸炎症、腫瘤、創傷及男性不育及發育障礙提供新的治療途徑，在男性避孕中可能具有巨大的應用前景。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1人和小鼠RabJ cDNA的克隆用Trizol(Gibco公司)提取人樹突狀細胞總RNA。然後，從總RNA中分離poly(A)mRNA。將poly(A)mRNA經逆轉錄形成cDNA後，用SuperScriptII克隆試劑盒(購自Gibco)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點上，轉化DH5α細菌形成cDNA質粒文庫。用雙脫氧法測定隨機挑選克隆的5′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列資料庫進行比較，結果發現有一個cDNA克隆的DNA序列為新的全長cDNA。通過合成一系列引物對新克隆所含的DNA序列進行雙向測定。計算機分析表明，克隆所含的全長cDNA是一個新的cDNA序列(如SEQ ID NO1所示)，編碼一個新的蛋白質(如SEQID NO2所示)。此蛋白質被命名為人睪丸功能相關蛋白hRabJ(human Rab protein with Jdomain)，其編碼基因命名為人睪丸功能相關基因hRabJ。序列SEQ ID NO1A全長為1787bp，包括24的5′端非編碼區和316bp的3′端非編碼區，編碼含273個胺基酸的多肽。理論上計算未糖基化的成熟分子的分子量約為30.7kD。BLAST分析表明其與已知基因不同，氨基端與人Rab4和Rab5胺基酸序列高度同源，一致性達45％，相似性達60％(圖3A)，屬於蛋白轉運調控蛋白Rab家族分子；另外在該蛋白的羧基端與DnaJ/Hsp40蛋白的J功能域同源(圖3B)。此外，在RabJ蛋白中也包含三個GTP結合基序，三個磷酸/Mg2+結合基序，這也進一步提示它可能參與蛋白轉運的調控。
接著，以小鼠睪丸cDNA為模板，根據hRabJ兩端序列設計引物，克隆並測序了小鼠的RabJ同源物mRabJ。該基因全長1091bp(SEQ ID NO3和圖1B)，編碼274個胺基酸的蛋白質(SEQ ID NO4)，與hRabJ在蛋白水平有95％的同源性。也含有三個GTP結合基序，三個磷酸/Mg2+結合基序和一個約70個殘基組成的保守性J功能域(圖2)。
實施例2用RT-PCR方法複製人和小鼠RabJ的編碼序列用Trizol(Gibco公司)提取處於對數生長期HeLa細胞總RNA，取6mg細胞總RNA與0.5μgOligo-dT12-18混合，進行反轉錄。反轉錄體系為20μl，反應結束後加80μlddH2O進行稀釋。PCR擴增所用的引物如下有義引物 5′CGGGATCCAATGGAGGCCAACATGCCGA 3′(SEQ ID NO5)，反義引物5′GCGGTACCGACTACTTGATGTTTTTCAG 3′(SEQ ID NO6)。PCR反應體積為50μl，其中含反轉錄模板10μl、0.4mM引物、0.2mM dNTP和1U ExTaq DNA聚合酶(TakaraInc.)，擴增參數為94℃30秒、60℃30秒、72℃45秒，25個循環後PCR產物行2％瓊脂糖凝膠電泳初步確認。DNA序列分析結果表明該PCR產物的編碼DNA序列與SEQID NO1所示的編碼區序列完全相同。
用相同的RT-PCR方法獲得mRabJ編碼序列，其中所用引物相同，只是模板採用小鼠睪丸cDNA而已。
實施例3人RabJ重組表達在該實施例中，以實施例2中的人PCR擴增產物為模板，用序列如下的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人RabJ DNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′端寡核苷酸引物序列為5′CGGGATCCGAGGCCAACATGCCGAAGCG(SEQ ID NO7)該引物含有BamH I限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之後是由起始密碼子開始的部分編碼序列；3′端引物序列為5′CGGGATCCTCACTTGATGTTTTTCAGGAGGG(SEQ ID NO8)該引物含有BamH I限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和人RabJ的DNA序列。
將獲得的PCR產物純化後經BamH I酶切再與質粒pUC18按常規方法重組並轉化至感受態大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆鑑定後純化並測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。將正確序列的人RabJ cDNA BamH I酶切片段克隆至表達載體pGEX-2T(Pharmacia公司)，形成形成載體pGEX-2T-RabJ，然後轉化入DH5α。陽性克隆用PstI酶切鑑定插入方向，酶切產物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。經測序證實，已插入了完整的RabJ編碼序列。
挑表達RabJ的陽性DH5α克隆接種於100ml 2×YTA培養基中，37℃300rpm振蕩培養12-15hr，1∶10稀釋於預熱的2×YTA培養基繼續振蕩培養1.5hr，加100mM IPTG至0.1mM後30℃誘導2-6hr，5,000g 4℃離心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重懸，超聲(B.BraunLabsonic U)破碎後再加入20％Triton X-100至1％輕搖30min，然後12,000g 4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾後，過1ml 50％穀胱甘肽Sepharose 4B層析柱，1×PBS充分洗滌後，加入500ul穀胱甘肽洗脫緩衝液(10mM穀胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH8.0)室溫靜置30分鐘後收集洗脫液，重複洗脫2-3次，得到RabJ多肽。
用Edams水解法進行N-端胺基酸序列分析，結果N-端10個胺基酸與SEQ ID NO2所示的N-端10個胺基酸殘基完全相同。
實施例4 GST-hRabJ的生化性質分析按照如下方法進行GTP結合實驗和阻斷實驗用10μg GST-hRabJ融合蛋白，10μg GST或10μg BSA作SDS-PAGE後，將蛋白印跡到硝酸纖維素膜上，然後將膜在含5％BSA、100mM NaCl、0.5mM MgCl2、50mM Tris.HCl(pH7.5)、20μ Ciα-32P-GTP的溶液中(Buffer A)於4℃孵育過夜，然後用該緩衝液充分洗滌後，做放射自顯影。另外，10μg GST-hRabJ融合蛋白或10μg GST或10μg BSA分別與25nM α-32P-GTP溶於以下緩衝系統(Buffer B)；50mM Tris-HCl，2mM EDTA，1mM DTT，5mM MgCl2，pH8.0。總體積為50μl。於30℃作用不同的時間，在各個時間點，取5μl溶於45μl冰冷的上述液體(不含α-32P-GTP)中，快速用G 50 microspin-colomn除去未結合的游離α-32P-GTP，然後溶於950μl預冷的Tris緩衝系統中，用於放射活性測定。從其中取3μl點樣於硝酸纖維素膜上，作放射自顯影。在緩衝液中加入100μM的GTP、GDP、GTPγS、ATP，然後於30℃結合1小時，G 50 microspin-colomn除去游離α-32P-GTP後，加入950μl冰冷的緩衝液中以中止結合併用於放射活性測定。然後取3μl點樣於硝酸纖維素膜上，做放射自顯影(圖4)。
GTP酶活性分析按下述方法進行25μg GST-hRabJ融合蛋白與25nMγ-32P-GTP溶於50μl以下緩衝系統(Buffer C)；50mM Tris.HCl，2mM EDTA，1mM DTT，5mMMgCl2，pH8.0。在30℃作用30min後，用G 50 microspin-colomn迅速去除游離γ-32P-GTP。取5μl溶於995μl冰冷的緩衝液中。然後將MgCl2濃度提高到10mM，繼續在30℃孵育，在不同的時間點取出5μl，加入995μl冰冷的緩衝液以中止酶活性，濾過0.2μm的硝酸纖維素濾膜，然後用1ml冰冷緩衝液洗四次，然後用1ml 2M甲酸核苷酸解離，並且用於放射活性測定。(圖4)結果表明，hRabJ具有GTP酶活性。
實施例5RabJ的Northern印跡分析按如下常規方法進行Northern印跡待檢濾膜置於10ml經68℃預熱的雜交液，在雜交爐(Bellco)中於68℃預雜交30分鐘；將標記好的cDNA探針於95～100℃變性2～5分鐘，置冰上迅速冷卻後加入雜交液(cDNA探針終濃度為2～10ng/ml或1～2×106cpm/ml)，充分混勻，於68℃雜交2小時。雜交結束後，濾膜用2×SSC、0.05％SDS室溫淋洗數次，繼振蕩衝洗30～40分鐘，其間更換洗液數次。隨後用0.1×SSC、0.1％SDS於50℃振蕩衝洗20～40分鐘。最後濾膜用塑料保鮮膜包裹，於-70℃曝光X線膠片24～48小時。
Northern印跡雜交結果顯示hRabJ和mRabJ均優勢表達於睪丸組織。在人腦和卵巢中和小鼠的心臟、腦、骨骼肌組織中有微弱表達。然而在細胞系中RabJ的表達廣泛，為弱表達(圖未示出)。
實施例6抗人RabJ抗體的產生將實施例3中獲得的重組蛋白人RabJ用來免疫動物以產生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離後備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，並用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天後，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉澱人RabJ基因翻譯產物的能力加以評估。結果發現，抗體可特異性地與本發明蛋白發生結合。而且利用Protein A親和層析，純化所得多抗用於蛋白水平的檢測。
實施例7RabJ蛋白的組織和細胞分布。
利用實施例6中所得抗體進行常規Western印跡分析人和小鼠的多種組織和細胞系中RabJ的表達。首先充分裂解組織或細胞，行SDS-PAGE電泳，然後轉膜，先後用RabJ多抗和HRP-標記的抗兔二抗結合，最後用化學發光底物顯色。(圖5)結果表明，hRabJ存在睪丸組織和一些細胞中。
實施例8RabJ在睪丸組織中的免疫組織化學檢測把新鮮的人和小鼠的睪丸標本動存於液氮中，切片前一天凍於-80℃。採用冷凍切片。切片和染色過程主要遵照DAKO的說明書進行。簡單的程序如下首先待切片乾燥後，用丙酮於室溫固定10min，在空氣中使其完全自然乾燥脫水；接著用過氧化物酶阻斷劑室溫作用5min，消除內原性過氧化物酶對結果的幹擾；然後用試劑盒內的一抗稀釋液稀釋一抗，並在4℃與切片共同作用過夜。PBS充分洗滌後滴上二抗溶液，室溫作用30min。洗滌後，滴上底物-蘇木精孵育5min，然後洗去；將切片用血紅素復染，清水洗後於37mM的氨水中浸數下，並在清水中繼續漂洗5min。然後封片觀察。(圖6)如圖6所示，圖6A(10×)，6B(10×)，6C(100×)和6D(100×)為使用正常兔IgG的陰性對照，圖6E(10×)，6F(10×)，6G(20×)、6H(20×)、6I(100×)和6J(100×)是用hRabJ多克隆抗體染色。圖6A、C、E、G和I為人樣品，圖6B、D、F、H、J為小鼠樣品。結果表明，RabJ在睪丸中優勢表達。
實施例9RabJ的亞細胞定位用hRabJ-pcDNA3.1載體瞬時轉染293細胞，48h後轉入100ml培養瓶。利用pcDNA3.1載體中的新黴素篩選位點，在900μg/ml濃度G418存在下持續篩選4-5周。然後Western檢測hRabJ的表達，並能夠穩定傳代。
hRabJ的分步裂解和蛋白定量收集培養的hRabJ-293細胞，在含1mM PMSF的PBS中洗兩次後，重懸於10mMTris.HCl，pH7.4，0.25M蔗糖，1mM MgCl2，5mM CaCl2，1mMPMSSF，1mM Na3VO4中。放冰上30min，然後在冰上用球型細胞勻漿器上下勻漿10次，800g離心15min，收集沉澱(胞核部分)。上清繼續以100,000g 4℃離心1h。然後，將上清收集(胞漿可溶性部分)，用同樣的緩衝液，把沉澱(胞漿模性成份)洗兩遍，用適當體積的緩衝液重懸。蛋白定量用Bradford法。
免疫螢光標記轉染前24小時將2HeLa細胞鋪板與6孔板中，每孔中放入一多聚賴氨酸處理的蓋玻片。在GFP、hRabJ-cGFP、nGFP-hRabJ和hRabJ-pcDNA3.1載體瞬時轉染後48h，將玻片取出，PBS中洗一遍後，用4％多聚甲醛室溫固定10min。然後用PBS充分漂洗。加入50mM NH4Cl(溶於PBS，pH7.6)淬滅15min後，用PBS-BSA-Saponin溶液(pH7.6的PBS，2mg/ml BSA，0.05％Saponin)洗兩遍，每次5min。將一抗稀釋於PBS-BSA-Saponin溶液中，然後滴加於蓋玻片上，4℃結合8h。用PBS-BSA-Saponin溶液洗三次後，加入稀釋於PBS-BSA-Saponin溶液中的Oregan green 488標記的抗兔二抗，37℃結合1h。用PBS-BSA-Saponin溶液洗三次後，用90％的甘油封片，共聚焦顯微鏡觀察。(圖7A和7B)圖7A表明，亞細胞組份定位表明hRabJ在細胞核和細胞質都存在。圖7B中，A、B、C和D所是用GFP、hRabJ-GFP、GFP-hRabJ和hRabJ-pcDNA3.1載體瞬時轉染的HeLa細胞，E是用hRabJ抗體檢測的hRabJ-293細胞，F是用mRabJ-pcDNA3.1載體轉染的NIH3T3細胞。結果表明，hRabJ存在於核膜和細胞器上。
實施例10RabJ與Hsc70間的相互作用在100mm的培養皿中，用hRabJ-pcDNA3.1載體瞬時轉染HeLa細胞和293細胞48h後或直接用hRabJ-293細胞在100mm培養皿至長滿後，收集細胞。用PBS洗一遍，重懸於1.5ml 50mMTris.HCI，pH8.0，2mM EDTA，1mM DTT，1mMPMSF，1mM Na3VO4的溶液中，冰上孵育30min後，用小超聲探頭冰上破碎細胞，直至液體澄清。然後13,000g離心15min，收集上清，棄去沉澱。用BCA蛋白定量試劑盒對上清進行定量。取含250μg總蛋白的上清，加入抗hRabJ的抗體(100μg/ml)，4℃振蕩結合6h。然後加入平衡的蛋白A珠子，再振蕩結合8h。然後用冰冷的裂解緩衝液洗三次，吸去上清，加入50μl2×SDS上樣緩衝液，然後用Hsc70和Hsp40抗體分別作Western印跡檢測。(圖8)結果表明，RabJ與Hsc70有相互作用(結合)，並且參與Hsc70的跨膜轉運。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110第二軍醫大學免疫學研究所120新的睪丸功能相關蛋白及其用途1300144711608170PatentIn version 3.021012111787212DNA213Homo sapiens220221CDS222(25)..(843)4001caagcttatg catgcggccg ctga atg gag gcc aac atg ccg aag cgg aag51Met Glu Ala Asn Met Pro Lys Arg Lys1 5gag ccc ggc agg tct ctc cgc atc aaa gtc atc tcc atg ggc aac gcc 99Glu Pro Gly Arg Ser Leu Arg Ile Lys Val Ile Ser Met Gly Asn Ala10 15 20 25gaa gtg ggg aaa agc tgt att ata aag cga tac tgt gag aaa aga ttc 147Glu Val Gly Lys Ser Cys Ile Ile Lys Arg Tyr Cys Glu Lys Arg Phe30 35 40gtg tct aaa tac ctg gca aca att gga att gac tat gga gtc aca aag 195Val Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ile Gly Ile Asp Tyr Gly Val Thr Lys45 50 55gta cac gtc aga gac aga gaa atc aaa gtt aac atc ttt gat atg gct 243Val His Val Arg Asp Arg Glu Ile Lys Val Asn Ile Phe Asp Met Ala60 65 70gga cat ccc ttc ttc tat gag gtt cga aat gag ttt tac aag gac aca 291Gly His Pro Phe Phe Tyr Glu Val Arg Asn Glu Phe Tyr Lys Asp Thr75 80 85cag ggt gtg ata ctg gtc tat gat gtt ggg cag aaa gac tcc ttt gac 339Gln Gly 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權利要求
1.一種分離的RabJ多肽，其特徵在於，它包含具有SEQ ID NO2或4胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQ ID NO2或4胺基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2或4所示胺基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中25-843位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1787位的序列；(c)具有SEQ ID NO3中1-822位的序列；(d)具有SEQ ID NO3中1-1091位的序列。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求6所述的載體。
8.一種具有RabJ蛋白活性的多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a)在適合表達RabJ蛋白的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有RabJ蛋白活性的多肽。
9.一種能與權利要求1所述的RabJ蛋白特異性結合的抗體。
10.一種藥物組合物，其特徵在於，它含有安全有效量的權利要求1所述的多肽以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明公開了一種人和小鼠的新型睪丸功能相關蛋白RabJ(Rab protein with J domain)。本發明還提供編碼此蛋白分子的多核苷酸和經重組技術產生這種蛋白分子的方法。還公開了編碼這種新型睪丸功能相關蛋白RabJ的多核苷酸的用途以及hRabJ的基本生化性質。本發明還涉及該分子在細胞內的定位以及其在睪丸生精過程中的作用。
文檔編號C07H21/00GK1408724SQ0112682
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月21日 優先權日2001年9月21日
發明者陳濤湧, 章衛平, 萬濤, 曹雪濤 申請人:第二軍醫大學免疫學研究所