羊草脅迫相關蛋白基因LcSAP及其應用的製作方法
2023-10-11 12:31:04 4
羊草脅迫相關蛋白基因LcSAP及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了羊草脅迫相關蛋白基因LcSAP及其應用，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。實驗結果表明，在正常情況下，對照酵母和轉基因酵母長勢基本一致。但是，在1.4mol/L?NaCl脅迫下，轉LcSAP基因酵母的長勢明顯好於對照(圖4B)。說明LcSAP基因明顯提高了轉基因酵母的耐鹽能力。
【專利說明】羊草脅迫相關蛋白基因LcSAP及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及的是羊草脅迫相關蛋白基因LcSAP及其應用。
【背景技術】
[0002]羊草(Leymus chinensis (Trin.) Tzvel.)又名鹼草,它是歐亞大陸草原區東部草甸草原及乾旱草原上的重要建群種之一。我國東北部松嫩平原及內蒙古東部為其分布中心，在河北、山西、河南、陝西、寧夏、甘肅、青海、新疆等省(自治區)均有分布。羊草抗寒、抗旱、耐鹽鹼、耐土壤瘠薄，適應範圍廣。羊草在漫長的進化過程中積累了豐富的抗逆基因，形成了一套完善的抗逆機制。
[0003]鋅指蛋白是轉錄因子的一種，與真核生物的生長發育及逆境脅迫的耐受能力都有著重要關係。脅迫相關蛋白(stress associated protein, SAP)是一類含有ANl和A20結構域的鋅指蛋白。SAP包含的兩個鋅指結構ANl和A20都不是植物所特有的。ANl最初在一種動物的類泛素蛋白中發現，在植物中的研究並不多見。在動物中，含A20的鋅指蛋白可控制NF-kB的激活和調節，核因子NF-kB是研究得最為廣泛的轉錄因子之一，具有如下特徵:對外界信號的刺激反應迅速，控制廣泛的基因表達(Vij et al, 2006)。水稻中0SISAP1是第一個被克隆出來的AN1/A20型鋅指蛋白基因，0SISAP1受到冷、鹽、乾旱、重金屬、傷害、脫落酸誘導表達，轉基因菸草證明該基因可以提高植物的對冷害、乾旱和高鹽的抗逆性(Mukhopadhyay et al, 2004)。全基因組分析表明，水稻、擬南芥、番爺中分別有18、14、13個SAP家族成員。水稻和番茄中所有SAP基因家族成員基因都受到一種或多種非生物脅迫誘導表達(Vij et al, 2006; Solanke et al, 2009)。過表達水稻0siSAP8基因提高了轉基因菸草和水稻的抗寒、抗旱和耐鹽能力(Kanneganti et al, 2008)。過表達水稻SAP基因家族的ZFP177基因提高了轉基因菸草耐受低溫和氧化脅迫的能力(Huang et al，2008)。過表達獐毛AlSAP基因提高了轉基因菸草對 乾旱、高鹽、高溫和冰凍的抗性(Ben Saad et al, 2010) 0目前還從苜蓿、甘蔗和毛竹中也克隆得到AN1/A20型鋅指蛋白基因(Gimeno-Gilles etal, 2011;劉金仙等，2009 ;劉志偉等，2010)。上述研究表明SAP基因家族基因是一類與非生物脅迫密切相關的基因。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供羊草脅迫相關蛋白基因LcSAP及其應用。
[0005]本發明的技術方案如下:
[0006]羊草脅迫相關蛋白基因LcSAP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]所述的羊草脅迫相關蛋白基因LcSAP在培育耐鹽脅迫轉基因植物品種中的應用。
[0008]實驗結果表明，在正常情況下，對照酵母和轉基因酵母長勢基本一致。但是，在1.4mol/L NaCl脅迫下，轉LcSAP基因酵母的長勢明顯好於對照(圖4B)。說明LcSAP基因明顯提高了轉基因酵母的耐鹽能力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1為LcSAP的核苷酸序列以及編碼的胺基酸序列；
[0010]圖2LcSAP和其它植物AN1/A20型鋅指蛋白構建的進化樹；A1SAP，獐毛(Aeluropus littoralis), ABK90631 ；MtSAP,苜猜(Medicago truncatula),ABN08135 ；0sSAPl,水稻(Oryza sativa Japonica), BAG97589;PeSAP,毛竹(Phyllostachys edulis), ACLOl 101; PpSAP,小立碗蘚(Physcomitrella patens subsp.patens), XP_001771457;PsSAP,美國西加雲杉(Picea sitchensis), ADE76549;PtSAP,毛果楊(Populus trichocarpa), XP_002297783;S1SAP5,番爺(Solanum Iycopersicum),ACM68442 ；SoSAP,甘鹿(Saccharum officinarum), ACT53874;VvSAP,葡萄(Vitisvinifera), XP_002283057; ZmSAP,玉米(Zeamays)，ΝΡ_001106260。
[0011]圖3LcSAP基因的表達情況；A，LcSAP的組織表達情況:L，葉；R，根。B，LcSAP受脅迫誘導表達情況:Actin基因為內參。
[0012]圖4轉LcSAP基因酵母耐鹽性鑑定；
【具體實施方式】
[0013]以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0014]一、羊草LcSAP基因的克隆及生物信息學分析
[0015]1.1材料處理
[0016]羊草種子在蛭石中萌發，室溫光照16小時，溫度25°C培養。用1/2MS澆灌至三葉期，每隔三天澆一次。用IOOmm0VLNa2CO3脅迫處理24小時後，取羊草葉片至於液氮中冷凍保存。
[0017]L2RNA 提取
[0018]應用TaKaRa公司的RNAiso?Plus試劑盒提取羊草葉片總RNA，根據試劑盒說明書步驟進行。用甲醛變性凝膠電泳鑑定總RNA質量，然後在分光光度計上測定RNA含量。
[0019]1.35』 RACE
[0020]用於5』RACE 的 cDNA 合成採用 Clontech 公司的 SMART?RACEcDNA AmplificationKit試劑盒,具體步驟如下:在0.2ml離心管中加入Iyg RNA, I μ 15』 -Q)S primerA, I μ ISMART IIA oligo，然後加入RNase-free水補足5μ 1，混合離心；72°C水浴2分鐘，再冰浴2分鐘，瞬時離心；加入提前混合好的5 μ I混合物,包括2 μ 15 X First-Strand Buffer, I μ IDDT (20mmol/L), I μ I dNTP Mix (10mmol/L), I μ I M-MLV Reverse Transcriptase ;輕吸混合物使之均勻，瞬時離心；42°C水浴1.5小時；加入Tricine-EDTA BufferlOOy I ;72°C水浴7分鐘，分裝後_20°C冰箱中保存備用。
[0021]根據羊草LcSAP基因EST(CD808976)設計5』 RACE特異性引物GSP(5，-TTTGGCTGAGGCAGACGCT-3，)。以 cDNA 為模板，以 GSP 和 IOXUniversalPrimer A Mix(5，-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3』 )為引物，50 μ IPCR 反應體系:34.5μ IPCR-Grade Water,5 μ 110XAdvantage2PCR Buffer,I μ I dNTP Mix(lOmmol/L),I μ 150XAdvantage2Polymerase Mix,I μ I GSP (10 μ mol/L),5 μ IlOX Universal PrimerA Mix (2 μ mol/L)，2.5 μ I cDNA。PCR 反應條件:94°C 2 分鐘；94°C 30 秒，55°C 40 秒，72°C I分鐘，35個循環；72°C 10分鐘。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，回收目的片段，與PMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌ToplO感受態細胞，選取陽性克隆，由上海生工生物工程有限公司測序。
[0022]1.4RT-PCR克隆羊草LcSAP全長基因
[0023]用於RT-PCR 的 cDNA 合成米用 Promage 公司的 Reverse Transcription System反轉錄試劑盒，具體步驟:將lug RNA於70°C孵育10分鐘，瞬時離心，置於冰上；4μ IMgCl2 (25mmol/L),2 μ I Reverse TranscriptionlOX Buffer,2 μ IdNTP Mixture(1Ommol/L) , 0.5 μ I Ribonuclease inhibitor,15U AMV Reverse Transcriptase, 0.5 μ gOligo (dT) 15Primer,加入去離子水至 20 μ I。
[0024]根據5 』 RACE的測序結果與EST (⑶808976)序列拼接後得到的序列設計引物Fl (5，-CCACCCAAAAGGAAAGGAC-3』 )和 Rl (5，-GAAGTAAACCTGACGGACCAAG-3』)。以 cDNA為模板，以 Fl 和 Rl 為引物，50μ IPCR 反應體系:1μ I cDNA，I μ I Fl (10 μ mol/L)，I μ IRl (10 μ mol/L)，25 μ I Premix Taq?, 22 μ I 去離子水。PCR 反應條件:94°C 2 分鐘；94°C 30秒，55°C 40秒，72°C I分鐘，35個循環；72°C 10分鐘。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，回收目的片段，與PMD18-T載體連接，構建重組載體pMD18-T-LcSAP，轉化大腸桿菌ToplO感受態細胞，選取陽性克隆，由上海生工生物工程有限公司測序。
[0025]1.5生物信息學分析
[0026]通過ORFfinder 程序(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析LcSAP基因開放閱讀框。LcSAP基因全長889bp，包括211bp的5』非編碼區和192bp的3』非編碼區，開放閱讀框為486bp，編碼161個胺基酸殘基(圖1)。
[0027]利用NCBI 的 CDD (Conserved Domain Database)資料庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析LcSAP的保守結構域，結果表明在LcSAP的N末端具有四個保守的半光氨酸殘基，這種結構與抑制細胞凋亡的鋅指蛋白A20類似；在蛋白的C端具有ANl類型的典型鋅指結構域:Cx2-4Cx9-12Cx2Cx4Cx2Hx5HxC(x代表任意的胺基酸)，其中保守的半胱氨酸和組氨酸殘基可以參與形成鋅指結構。
[0028]利用Mega4.1將羊草LcSAP與其他物種的SAP基因的胺基酸序列進行聚類分析，構建LcSAP的進化樹。從進化樹可以看出，羊草LcSAP與獐毛AlSAP同源性最高，同源性為57.1% ;與苜蓿、水稻、毛竹、小立碗蘚、美國西加雲杉、毛果楊、番茄、甘蔗、葡萄、玉米序列同源性為 40.8%-45.1%(圖 2)。
[0029]二、半定量RT-PCR分析羊草LcSAP基因的組織表達模式
[0030]將羊草培養至三葉期，取羊草葉和根至於液氮中冷凍保存。應用TaKaRa公司的RNAiso?Plus試劑盒提取羊草葉和根總RNA。應用Promage公司的Reverse TranscriptionSystem反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。根據羊草Actin基因序列(AB181991)設計引物 F2 (5，-GGACCTTGCTGGTCGTGACC-3』)和 R2 (5，-CCTCAGGGCACCTGAACCTTT-3 』)。以羊草葉和根cDNA為模板，以Fl和Rl (或F2和R2)為引物，50 μ I PCR反應體系:1 μ I cDNA, I μ IFl (或 F2) (10ymol/L)，ly I Rl (或 R2) (10 μ mol/L)，25 μ I Premix Taq?，22 μ I 去離子水。PCR反應條件:94°C 2分鐘；94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分鐘，30個循環；72°C 10分鐘。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。[0031]半定量RT-PCR結果表明羊草LcSAP基因在羊草的葉和根中均有表達，在葉中表達量相對較高(圖3A)。
[0032]三、半定量RT-PCR分析羊草LcSAP基因的脅迫誘導表達模式
[0033]將羊草培養至三葉期，用400mmol/L NaCl，IOOmmoI/LNa2CO3 和 20%PEG6000 處理三葉期羊草，脅迫處理後O小時、6小時、12小時、24小時後，提取羊草葉片RNA。應用Promage公司的Reverse Transcription System反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。以羊草cDNA為模板，以Fl和Rl(或F2和R2)為引物，50μ I PCR反應體系:1μ1 cDNA，I μ I Fl(或F2)(10 μ mol/L), I μ I Rl (或 R2) (10 μ mol/L)，25 μ I PremixTaq?, 22 μ I 去離子水。PCR 反應條件:94°C 2分鐘；94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分鐘，30個循環；72°C 10分鐘。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。
[0034]半定量RT-PCR結果表明LcSAP受到 400mM NaClUOOmM Na2CO3>20%PEG6000 的脅迫誘導表達，但是表達形式有所不同。在NaCl脅迫下LcSAP mRNA表達量逐漸升高；在Na2CO3脅迫下LcSAP mRNA表達量先升高再降低，在脅迫後6小時的表達量最高；在PEG6000脅迫下LcSAP mRNA表達量先降低再升高，在脅迫後12小時的表達量最低，在24小時的表達量最高。說明LcSAP受到中性鹽、鹼性鹽和乾旱的脅迫誘導表達(圖3B)。
[0035]四、轉基因酵母驗證LcSAP基因功能
[0036]4.lpYES2/CT-LcSAP 載體構建
[0037]根據LcSAP 基因序列設計引物 F3 (5，-AATTAAGCTTATGGCGCAAGAGAGTTGGA-3，)和R3 (5，-GACTGAATTCTCAGAATCTGGTGACCTTATCAG-3』 )。以 pMD18-T_LcSAP 為模板，以 F3 和R3 為引物，50 μ I PCR 反應體系:1 μ I cDNA, I μ I Fl (10 μ mol/L)，I μ I Rl (10 μ mol/L)，25 μ I Premix Taq?, 22 μ I 去離子水。PCR 反應條件:94°C 2 分鐘；94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C I分鐘，30個循環；72°C 10分鐘。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，回收目的片段。提取pYES2/CT質粒。將LcSAP基因PCR產物和pYES2/CT質粒分別用Hind III和EcoR I限制性內切酶進行雙酶切。酶切反應體系如下:1μ I Hind ΙΙΙ，1μ1 EcoR I,2μ 110ΧΜBuffer,5y I PCR產物(或pYES2/CT質粒)，11 μ I去離子水。37°C I小時，電泳用後回收目的基因和線性化載體。將回收的目的基因和線性化載體在T4DNA連接酶的作用下16°C連接I小時。連接產物轉化大腸桿菌ToplO感受態細胞，挑取單克隆菌落提取質粒，Hind III和EcoR I雙酶切鑑定，陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序。鑑定為陽性的重組載體命名為 pYES2/CT-LcSAP。
[0038]4.2轉化釀酒酵母菌株INVScl
[0039]釀酒酵母轉化採用LiAc方法，具體步驟:挑取釀酒酵母菌株INVScl單克隆放入10ml Yro液體培養基中，30°C培養過夜；菌液稀釋成50ml 0D600=0.4，在培養3小時；1500g離心收集細胞，用40ml I X TE重懸沉澱；1500g離心收集細胞，用2mllXLiAc/0.5 X TE重懸沉澱；室溫放置10分鐘；混合I μ g pYES2/CT-LcSA`P質粒(或pYES2/CT質粒)，100 μ g變性的矽精DNA，100 μ I酵母菌懸液和700μ llXLiAc/40%PEG3350/lXTE，充分混合，3(rC培養30分鐘；加入88 μ 1DMS0混均，42°C熱激7分鐘，離心10秒鐘去除上清；用ImllXTE重懸沉澱，再次離心收集細胞；用100 μ 11 X TE重選沉澱，塗布在含有Amp抗性的YH)平板上，篩選轉化子。
[0040]4.3Northern 雜交[0041 ] 提取含有pYES2/CT和pYES2/CT_LcSAP的釀酒酵母RNA，步驟如下:用Iml預冷AE緩衝液(50mmol/L乙酸鈉，pH5.2 ；IOmmoI/LEDTA, pH8.2)重懸離收集的酵母細胞，16000g,4°C，離心10秒鐘；棄上清，重複以上步驟；用400 μ I預冷的AE緩衝溶液重懸酵母細胞，加Λ 40 μ 110%SDS充分混均，再加入440 μ I預先用AE緩衝液平衡的苯酚溶液(ρΗ5.2)充分混均；用液氮快速冷凍細胞5分鐘，轉移細胞至65°C水浴5分鐘；重複用AE，10%SDS和苯酚溶液混均，再用液氮快速冷凍細胞5分鐘，16000g，室溫離心7分鐘；轉移上清至另一個新的1.5mlEP管裡，加入600μ1酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)震蕩;16000g，4°C，離心5分鐘，轉移上清至另一個新的1.5mlEP管裡；加入50 μ 13mol/L乙酸鈉(pH5.2)和Iml預冷的無水乙醇，_20°C放置20分鐘;16000g，4°C，離心15分鐘，棄上清，加入Iml預冷的80%乙醇；16000g,4°C,離心15分鐘,棄上清,乾燥沉澱,用100 μ I RNase-free水溶解沉澱。
[0042]Northern 雜交米用 Roche 公司的 DIG-High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit I試劑盒。探針製備步驟如下:LcSAP基因全長PCR產物作為探針，取16 μ I探針沸水浴10分鐘變性，立即放入冰水混合物中，加入4μ I DIG-High Prime到變性後的模版中，混勻後離心，37°C孵育20小時。
[0043]Northern雜交步驟如下:RNA樣品在1.2%甲醛變性膠中50V下電泳3小時，將RNA轉移到Hybong-N+尼龍膜上，用2X SSC溶液洗膜5分鐘。50°C預雜交30分鐘。探針於100°C煮沸10分鐘，迅速放於冰中。含有探針的雜交液50°C雜交過夜。洗液I室溫洗2X 10分鐘。洗液 II68°C洗 2X 15 分鐘。Washing buffer 室溫洗膜 5 分鐘。40ml Blocking buffer室溫洗膜 30 分鐘。20ml Antibody Solution 室溫洗膜 30 分。50ml Washing buffer 室溫洗膜2X 15分鐘。20ml Detecting buffer室溫洗膜5分鐘。加入IOml顯色液(IOmlDetecting buffer 和 200 μ I NBT/BCIP)，黑暗放置 I 小時。
[0044]通過Northern雜交表明LcSAP基因在轉基因釀酒酵母中得到了表達(圖4A)。
[0045]4.4轉LcSAP基因酵母的誘導培養及耐鹽性實驗
[0046]轉LcSAP基因酵母誘導培養具體步驟如下:挑取對照酵母(轉PYES2/CT空載體的酵母)和轉基因酵母(轉pYES2/CT-LcSAP重組載體的酵母)單菌落，接種與SC-U液體培養基中(加入終濃度為2%的葡萄糖)中，30°C振蕩培養24小時；調整5ml的培養液0D600為0.3 ；6000rpm離心I分鐘；用Iml誘導培養基(SC-U含有2%半乳糖和2%面子糖)重懸菌體，接種於50ml的誘導培養基中30°C振蕩培養24小時。
[0047]轉LcSAP基因酵母耐鹽性實驗具體步驟如下:從對照酵母和轉基因酵母中各取?μ 1，按照10'10_2、10_3倍數進行稀釋；從各稀釋的酵母液中去5μ I在Yro培養基和含有
1.4mol/LNaCl的YPD培養基上點板；30°C培養72小時，拍照記錄。
[0048]結果表明，在正常情況下，對照酵母和轉基因酵母長勢基本一致。但是，在1.4mol/LNaCl脅迫下，轉LcSAP基因酵母的長勢明顯好於對照(圖4B)。說明LcSAP基因明顯提高了轉基因酵母的耐鹽能力。
[0049]應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬於本發明所附權利要求的保護範圍。
[0050]序列表
[0051]SEQUENCELISTING
[0052] 申請人:西北農林科技大學[0053]羊草脅迫相關蛋白基因LcSAP及其應用
[0054]〈130〉
[0055]〈160〉10
[0056] PatentInversion3.5
[0057]〈210〉I
[0058]〈211〉889
[0059]〈212〉DNA
[0060]〈213〉LcSAP的核苷酸序列
[0061] I
[0062]
ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtggtatcaacgc agagtacgcg gggggacgcc60
acccaaaagg aaaggacaca ggcataaaagaacgccaaca aaataacaag aacagaattc120
tatxccccgg aagaacaggc ggaagagaggagccgatccc cgtgccgtxt cctccgtgt.t180`tccgatcgac ccaccggcta tccggctagaaatggcgcaa gagagttgga aagaggcaga 240
ggagactggt atccacgcac ccgaggctccgat.aatgtgc a.tcaacaact gtggcttctt300
cggcaaccgg atgacagaga acatgtgctcaaagtgttac cgagacactg tcaaggccaa360
gaggat.ggcc actctagt.cg agaacaaaact.gcggctgct gttgcat.cgt cacccacacc420
gttggtggca gagatcaagg atgaagcgtctgcctcagcc aaagaaggga agcaagtagc480
cgaagaagat gcgccgaagc cacccagcaaccgctgcctg tcgtgccgga agaaggtcgg540
gctgacaggg ttcaagtgcc gctgcggagacaccttctgc tcaacgcacc gctacgccga 600
tgcgcacaat tgcaagtt.cg acta.caagcaggccggcagg gagcagatxg cccagcagaa660
ccccgtcgtc aaggctgaca aggtcaccagattctgatga tggattggtg gttctgcagg720
agtcctccag ctcgtttatt tcctcatgatgatgatgctt cttggtccgt caggtttact780
tcagaattgt gtgtctacca tcctcctggaatgtactttg ccgatgaacc cgccttcgac840
aaacaccacc atccgatgcc cgtccaacgaccatcaacgg gccat.tgca889
[0063]〈210〉2
[0064]〈211〉161
[0065]〈212〉PRT
[0066]〈213〉LcSAP編碼的胺基酸序列
[0067]2
[0068]
【權利要求】
1.羊草脅迫相關蛋白基因LcSAP，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
2.根據權利要求1所述的羊草脅迫相關蛋白基因LcSAP在培育耐鹽脅迫轉基因植物品 種中的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK103757029SQ201410016123
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月14日 優先權日:2014年1月14日
【發明者】麻鵬達, 劉晶瑩, 郭夢雪, 楊睎喆, 李瑩瑩, 王愛芹 申請人:西北農林科技大學