神經肽y激動劑和其不完全激動劑的製作方法

2023-10-11 03:19:49

專利名稱：神經肽y激動劑和其不完全激動劑的製作方法
本申請是1988，8，26提出的，序列號為237，591申請的繼續申請。
本發明涉及新的肽衍生物，它是神經肽Y的激動劑。
豬神經肽Y(PNPY)是有36個胺基酸的肽，它屬於在整個中樞和外周神經系統有廣泛分布的單一家族肽。在中樞和外周神經系統已發現了NPY的受體。在腦中，NPY是飲食的強興奮劑，並可促進促黃體生成激素、生長激素和催乳激素的分泌，產生心血管抑制作用。NPY還具有強的外周血管收縮作用，據報導它可造成短暫的心肌缺血從而引起心腹痛。作為這些受體激動劑的藥物在治療與生殖系統有關的疾病(如青春期早熟，子宮內膜異位，乳腺癌，前列腺癌)中，可增加食慾，降低性行為，降低促甲狀腺生成激素，催乳激素，促黃體生成激素的分泌，故可用作避孕藥，該藥物可在性犯罪中降低性衝動，還可通過刺激釋放來降低生長激素水平，該類藥物可用作外周血管舒張藥和降壓藥。本發明化合物可用於治療飲食疾病如神經性厭食。
具有下式1-4的新的肽衍生物
其中X1是E或D;
X2是S或A;
X3是S或A;
X4是L、I、M、Nle或V;
X5是L、I、M、Nle或V;
X6是Q、P、H或I;
Tc是OR1或NHR′其中R1是氫或(C1-C4)烷基;
Q是-NH-(CH2)n-CO2-;其中n是1-11的整數，
和其藥用鹽是神經肽Y的激動劑。這些肽衍生物可增加熱血動物的血壓，也可用於治療飲食疾病如神經性厭食。
下面是本說明書中使用的胺基酸及氨基和羧基末端基團的常用縮寫Ala(或A)-丙氨酸Val(或V)-纈氨酸Leu(或L)-亮氨酸Ile(或I)-異亮氨酸Pro(或P)-脯氨酸Met(或M)-蛋氨酸Ser(或S)-絲氨酸Thr(或T)-蘇氨酸Cys(或C)-半胱氨酸Cys(或C)-D-半胱氨酸Tyr(或Y)-酪氨酸Asn(或N)-天冬醯胺ASp(或D)-天冬氨酸Lys(或K)-賴氨酸Arg(或R)-精氨酸His(或H)-組氨酸Glu(或E)-各氨酸Nle-正亮氨酸Aoc-8-氨基辛酸＃-NH2
烷基包括直鏈、支鏈和環烷基，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、仲戊基、環戊基、己基、異己基、環己基和環戊甲基。含2至10個碳原子的醯基是指含1或2個羰基的直鏈、支鏈、環狀的飽和和未飽的醯基，如乙醯基、苯甲醯基、琥珀醯基、馬來醯基，和戊二醯基，氨基末端胺基酸的氨基被兩個烷基或醯基取代的那些肽也落在本發明肽的範圍內。
除甘氨酸外，天然胺基酸含於性碳原子。除另有特殊說明，這裡指的光學活性胺基酸是L-構型的。
式1多肽可與任何無毒有機或無機酸形成藥用鹽。適宜成鹽的無機酸有鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸和酸性金屬鹽如正磷酸一氫鈉和硫酸氫鉀。適宜成鹽的有機酸有單、雙和三羧酸，例如，乙酸、葡糖酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、甲酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、馬來酸、羧基馬來酸、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水楊酸、2-苯氧基苯甲酸和磺酸(如甲磺酸，2-羥基乙磺酸。羧基末端胺基酸的鹽包括無毒羧酸與任何適宜的無機或有機鹼形成的鹽。這些鹽包括鹼金屬鹽(如鈉和鉀);鹼土金屬鹽(如鈣和鎂);包括鋁的ⅢA族輕金屬鹽;有機伯、仲、叔胺鹽。例如，三烷基胺，如三乙基胺，普魯卡因、二苄基胺、乙胺(l-ethenamine)，N，N′-二苄乙二胺，二氫樅胺，N-(低級)烷基哌啶和任何其它適宜的胺。
化合物中的一些基團是優選的。申請人認為X1是穀氨酸的式1的肽衍生物較好。申請人還認為X2和X3分別為絲氨酸(S)和丙氨酸(A)，X4和X5分別為亮氨酸(L)和異亮氨酸(I)，Tc為NH2，Q為Aoc的式1的肽衍生物較好。式1-4的最好肽衍生物分別為下面的式5-8肽衍生物。
本發明蛋白質可通過本領域技術人員熟知的方法製備。這些方法包括固相序列法，它是採用已建立的自動法，如使用自動肽合成儀。
用於固相製備多肽的樹脂載體可是本領域常用的任何適宜樹脂，優選已與0.5至3%二乙烯基苯交聯的聚苯乙烯，該聚苯乙烯被轉變為對甲基二苯甲基胺或二苯甲基胺(用於製備C-末端醯胺)或被氯甲基化或羥甲基化，從而使其能與開始加入的α-氨基保護的胺基酸(用於製備C-末端烷基醯胺和酯)形成酯。
羥甲基化的樹脂實例見Bodanszky，等，Chem.Ind.(London)38，1597-98(1966)。氯甲基化的樹脂可從加利福尼亞，Richmond，BioRad實驗室買到，其製備見Stewart等，「固相肽合成」(FreemanCo.，舊金山1969)，第1章，1-6頁。保護的氨基可通過Gisin方法，HelvChemActa，56，1476(1973)，結合到樹脂上，許多結合有保護的胺基酸的樹脂是可買到的。例如，製備羧基末端是Thr的本發明多肽，所使用的結合有叔丁氧羰基(Boe)保護的Thr的苄基化、羥甲基化的苯乙醯胺甲基樹脂(PAM)是可買到的。
下面是α-氨基保護的胺基酸偶聯到樹脂載體上，保護基用任何適宜的方法脫掉，如用溶於二氯甲烷的三氟乙酸，只使用三氟乙酸或溶在二噁烷中的HCl。脫保護在0℃至室溫進行。對於除去特殊α-氨基保護基可使用其它常規斷開劑。除去α-氨基保護基後，可將其它氨基保護的胺基酸按所需順序逐步偶聯。多胺基酸可預先與樹脂承載的胺基酸序列偶聯，然後再通過溶液方法偶聯。
被引入多肽的每個胺基酸的α-氨基保護基可是本領域已知的任何保護基。使用的α-氨基保護基種類有(1)醯類保護基，如甲醯基，三氟乙醯基，鄰苯二甲醯基，甲苯磺醯基，苯磺醯基，硝基-苯亞磺醯基，三苯甲亞磺醯基，鄰硝基苯氧乙醯基和α-氯丁醯基;(2)芳香尿烷類保護基，如苄氧羰基和取代的苄氧羰基，如對-氯苄氧羰基，對-硝基苄氧羰基，對-溴苄氧羰基，對-甲氧苄氧羰基，1-(對-二苯基)-1-甲基乙氧羰基，α，α-二甲基-3，5-二甲氧苄氧羰基，二苯甲氧羰基和9-芴基甲氧羰基(Fmoc);(3)脂肪尿烷類保護基，如叔丁氧羰基(Boe)，二異丙基甲氧羰基，異丙氧羰基，乙氧羰基和烯丙氧羰基;(4)環烷基尿烷類保護基，如環戊氧羰基，金剛烷氧羰基和環己氧羰基;(5)硫代尿烷類保護基，如苯硫代羰基;(6)烷基類保護基，如三苯甲基和苄基;和(7)三烷基矽烷基，如三甲基矽烷。優選的α-氨基保護基是叔丁氧羰基或Fmoc。
在本技術領域範圍內選擇適宜的偶聯劑。具體適宜的偶聯劑(其中所加的胺基酸是Gln，Asn或Arg)是N，N′-二異丙基碳化二亞胺和1-羥基-苯並三唑。用這些偶聯劑是為了防止形成腈和內醯胺。其它偶聯劑有(1)碳化二亞胺(如N，N′-二環己基碳化二亞胺和N-乙基-N′-(Y-二甲基氨基丙基碳化二亞胺);(2)氨基氰(如N，N′-二苄基氨基氰);(3)烯酮亞胺;(4)異噁唑鎓鹽(isoxazolim salts)(如N-乙基-5-苯基-異噁唑鎓-3′-磺酸鹽);(5)含芳香雜環醯胺的單環氮，其特徵為環上含1至4個氮，如咪唑醯胺，吡唑醯胺和1，2，4-三唑醯胺。使用的特殊雜環醯胺有N，N′-羰基二咪唑和N，N′-羰基-二-1，2，4-三唑;(6)烷氧化的乙炔(如乙氧乙炔);(7)可與胺基酸的羧基部分形成混合酸酐的試劑(如氯甲酸乙酯和氯甲酸異丁酯)或與被偶聯的胺基酸形成對稱酸酐(如Boc-Ala)2-O)的試劑;(8)含氮雜環化合物，其中環上氮含羥基(如N-羥基苯並三唑，N-羥基琥珀醯胺和1-羥基苯並三唑)。其它用於肽偶聯的活性劑見Kapoor，J.Pharm.Sci.，59，PP.1-27(1970)。申請人認為對除Arg，Asn和Gln以外的所有胺基酸用對稱酸酐作偶聯劑較好。
每份保護的胺基酸或胺基酸序列被引入到約超四倍量的固相反應物中，偶聯是在二甲基甲醯胺∶二氯甲烷(1∶1)或僅在二甲基甲醯胺或優選僅在二氯甲烷中進行，如果偶聯進行不完全，應在固相反應物中進行下一個胺基酸的偶聯之前，在除去α-氨基保護基前，繼續進行前一個偶聯反應。在每階段合成中偶聯反應進行的情況可通過水合茚三酮反應(見E.Kaise等，Analyt.Biochem.34，595(1970))監測。
在得到所需胺基酸序列後，從樹脂中脫去肽。這可通過水解進行，如用甲硫酸，甲苯酚或硫代甲苯酚的氫氟酸溶液處理結合多肽的樹脂。
在固相肽合成領域中已知許多胺基酸在鏈製備期間需要保護。適宜保護基的使用和選擇在本領域技術人員的能力範圍內並取決於要保護的胺基酸和肽上存在的其它保護的胺基酸。側鏈保護基的選擇標準在於該保護基必須在斷裂α-氨基的保護基時不脫去。例如，賴氨酸的適宜側鏈保護基是苄氧羰基和取代的苄氧羰基(如2-氯苄氧羰基，對-硝基苄氧羰基，3，4-二氯苄氧羰基)，取代基選自滷素(如氯，溴，氟)和硝基;甲苯磺醯基;叔戊氧羰基;叔丁氧羰基和二異丙甲氧羰基。蘇氨酸和絲氨酸的醇羥基可由下列基團保護乙醯基，苯甲醯基，叔丁基，三苯甲基，苄基，2，6-二氯苄基和苄氧羰基。天冬氨酸和各氨酸的羧基可用苄基或環己基保護。優選保護基是苄基。
保護基可通過本領域熟知的方法脫去。典型的保護基脫去是在肽鏈合成完成後進行的，但保護基也可在任何其它適宜期間脫去。
式1肽衍生物作為神經肽Y激動劑的能力是採用Lunberg等，Eur.J.Pcol.145，21-9(1988)所述方法，通過這些肽與碘化的神經肽Y竟爭受體的能力說明的。125I-Bolton-Hunter-神經肽Y結合是在豬脾粗膜中進行的。來自冷凍脾的膜按前述製備並用於速激肽結合研究(Buck等，1984)。等分的膜(大約15mg組織)於室溫，在含肽類似物，130mM NaCl，2.7mM KCl，2mMMgCl2，1.8mM CaCl2，20mMHEPES，4mg/ml BSA，40μg/ml桿菌肽，4μg/ml亮肽素和4μg/ml抑糜蛋白酶素的緩衝液(7.4)中培養2小時，BHNPY濃度為0.1nM，非專一性結合由含1μMPNPY得以證明。樣品快速濾過預先在0.5%組蛋白浸泡過夜的華特曼GF/C濾器(類型Ⅱ-AS;Sigma)，然後用冰冷卻的普通HEPES-鹽緩衝液(PH7.4)洗滌兩次。受試肽的IC50取竟爭曲線的6至10點計算，利用該方法測得實例1和2的肽衍生物IC50＜50nM。
由於本發明肽衍生物可作為神經肽Y的激動劑，則這些化合物具有價值的藥理活性，如升壓、血管收縮，動脈收縮，結腸松馳和胃排空減小。本發明NPY激動劑的顯著醫療用途是治療飲食疾病，如神經性厭食。
本發明肽衍生物的劑量要求能激動神經肽Y，並產生升壓和血管收縮及其它作用，劑量取決於患者，治療的嚴格條件和所選擇的肽衍生物，劑量範圍為0.2mg至250mg/患者體重kg/每天。對於具體患者可很快確定適宜劑量。優選每日給藥1至4次，每次含活性化合物5mg至100mg。
這裡使用的術語「患者」指哺乳動物如靈長類動物，其包括人、羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠和小鼠。
雖然一些肽衍生物可通過腸胃道口服，但申請人認為非口服給藥較好，例如，皮下、靜脈、肌肉內或腹膜內;貯存注射(depotinzection);植入物;或將含本發明衍生物製成噴霧劑，以噴霧或乾粉形式通過鼻、喉、支氣管的黏膜吸收給藥。
用於非腸道給藥的化合物可製成注射用的溶液或懸浮液。該注射液包括本發明化合物，生理用稀釋劑，藥用載體，指無菌液體，如水和油，另外還可加或不加表面活劑性和其它藥用添加劑。這些製劑中使用的油是指石油，動物油，植物油和合成的天然油，例花生油，豆油及礦物油。通常水，鹽水，葡萄糖水溶液和有關的糖溶液，乙醇和脂肪族二元醇類如乙二醇和聚乙二醇是優選的液體載體，尤其是用於製備注射液。
本發明化合物可以貯存注射或植入物製劑形式服用，該製劑是以使活性成份持續釋放的方式配製的。該活性成份可壓入小丸或小圓柱體內並以貯存注射液或移入體形式移入皮下或肌肉內。植入物可用惰性材料，如生物降解聚合物或人工矽酮，如Dow-Corning公司製造的矽化橡膠和矽酮橡膠。
下面是說明本發明的實施例，但本發明並不限制於這些實施例。
實施例1

的製備通過固相方法，採用Applied Biosystems Model430-A肽合成儀，以0.5mmol等級，在對-甲基二苯甲基胺樹脂(0.4mmol/g;肽Intl)上合成標題肽衍生物。所有上式中胺基酸都可雙偶聯成Nα-叔-Boc-保護的胺基酸的對稱酸酐，但不包括可由DCC/HOBT法雙偶聯的Arg、Asn、Gln。側鏈保護如下Arg(Tos)，Asp(Chx)，Cys(pMBzl)，Glu(Bzl)，His(Tos)，Ser(Bzl)，Tyr(2-BrZ)，Thr(Bzl)，Lys(2-Clz)。從樹脂載體上脫下肽(0.25mmol，理論值)，然後於-5℃，含5%苯甲醚的HF溶液中脫保護40分鐘。真空脫HF後，用30%乙酸和水從樹脂中萃取肽。溶液從樹脂中濾出，然後凍幹，保留的肽通過製備型高壓液相色譜，在DynamaxC-18柱(41.4×250mm;Rainin)上，用溶在0.1%三氟乙酸的乙腈作洗脫劑來純化。肽的純度和特性由分析型高壓液相色譜分析(Vydal218TP54柱，4.60×250mm，2.0ml/分鐘，Tc-1.9分鐘，線性梯度，含在1%TFA中的15-40%乙腈，時間25分多鐘)，胺基酸分析(AAA)(含8%苯酚的6NHCl;106℃，20-40小時)，快原子轟擊質譜(FAB-MS)(M-ScanLtd.)。
AAAaB-1.96;T-1.03;S-1.62;P-1.88;A-1.96;I-2.84;L-2.14;Y-4.04;H-1.09;R-4.06.
a6NHCl，24Hr，106℃.
FAB-MS(M+H)+3311.2±1mu.
實施例2製備

用固相法，採用Applied Biosystem Model430A肽合成儀，以0.5mmol級別，在對-甲基二苯甲基胺樹脂(0.4mmol/g，肽Intl)上合成標題肽衍生物，式中所有胺基酸可雙偶聯成Nα-t-Boc-保護的胺基酸的對稱酸酐，但不包括可被DCC/HOBT法雙偶聯的Arg、Asn、Gln。側鏈胺基酸保護如下Arg(Tos)，Asp(Chx)，Cys(pMBzl)，Glu(Bzl)，His(Tos)，Ser(Bzl)，Tyr(2-Brz)，Thr(Bzl)，Lys(2-Clz)。從樹脂載體上斷開肽(0.25mmol，理論值)，然後於-5℃，含5%苯甲醚的HF液體中脫保護40分鐘。真空除去HF後，用30%乙酸和水萃取樹脂中肽。將萃取液稀釋到1升，用氫氧化銨將PH調至8至9，然後加入氰鐵酸鉀直到溶液變黃(約25ml)。攪拌30分鐘後，用冰醋酸將PH降至＜5，該溶液與25ml澄清的AC3×4A樹脂(BioRad)攪拌2小時。從樹脂中濾出溶液，然後凍幹。保留的肽通過製備型HPLC，在DynamaxC-18柱上(41.4×250mm;Rainin)，用含在0.1%三氟乙酸中的乙腈作洗脫劑進行純化。肽的純度和特性用分析型HPLC(Vgdac218TP54柱，4.6C×250mm，2.0ml/分鐘，Tc-1.9分鐘，線性梯度為溶在0.1%TFA的15-40%乙腈，需時＞25分鐘)來分析。胺基酸分析(AAA)(含8%苯酚的6NHCl;106℃;20-40小時)，快原子轟擊質譜(FAB-MS)(M-SeanLtd)。
AAAaB-1.89;T-0.99;S-1.68;Z-1.13;P-0.93;A-1.03;L-1.09;I-2.07;Y-3.88;H-0.94;R-3.06.
a6N HCl，24 Hr，106℃.
FAB-MS2888.0±1mu.
實施例3

的製備用實施例2的步驟製備標題化合物。
AAAaB-2.03;T-1.05;S-1.83;Z-1.10;P-1.98;A-2.04;L-2.07;I-1.93;Y-3.91;K-1.02;H-0.98;R-3.87.
a6N HCl，24 Hr，106℃.
FAB-MS3327±1mu.
實施例4

的製備用實施例2的步驟製備標題化合物。
AAAaB-1.00;S-1.00;T-1.01;Z-1.03;L-0.99;I-1.86;Y-2.06;H-0.97;R-2.97;K-1.10.
a6N HCl，24 Hr，106℃.
FAB-MS2193±mu.
用相似方法製備實施例5-12化合物。
實施例

實施例5-12化合物具有下面特徵


權利要求
1.下式的肽衍生物或其藥用鹽
其中X1是E或D；X2是S或A；X3是S或A；X4是L、I、M、Nle或V；X5是L、I、M、Nle或V；X6是Q、P、H或I；TC是OR′或NHR′；其中R′是氫或(C1-C4)烷基；Q是-NH-(CH2)n-CO2-；其中n是1-11的整數。
2.權利要求1的肽衍生物，其中X2是A。
3.權利要求1的肽衍生物，其中X3是S。
4.權利要求1的肽衍生物，其中X4是I。
5.權利要求1的肽衍生物，其中X5是I。
6.權利要求1的肽衍生物，其中X6是Q。
7.權利要求1的肽衍生物，其中Q是Aoc。
8.權利要求1的肽衍生物，該肽衍生物如下
9.活化神經肽Y受體的方法，其特徵為將受體與權利要求1-8中一肽衍生物相接觸。
10.用其治療低血壓患者方法，其特徵為將有效量的權利要求1-8的一肽衍生物給患者服用。
11.用其治療厭食疾病的方法，其包括將有效量的權利要求1-8的一肽衍生物給患者服用。
全文摘要
NPY激動劑是天然NPY的衍生物。採用常規競爭結合和生化分析及在各種情況下這些衍生物的使用確定了激動機制，其中也介紹了所指的神經肽Y。
文檔編號A61P9/02GK1042155SQ8910652
公開日1990年5月16日 申請日期1989年8月25日 優先權日1988年8月26日
發明者克爾斯蒂南思基·約翰·裡納德 申請人:默裡多藥物公司