癌症的抑制的製作方法

2023-10-22 19:27:52

專利名稱：癌症的抑制的製作方法
癌症的抑制本發明涉及常見癌症，特別是結腸直腸癌、前列腺癌、乳腺癌和肺癌的生長、維持 和進展的抑制。結腸直腸癌在美國男性和女性兩者中都是第三大常見癌症，根據世界衛生組織在 2003年4月關於全球患癌率的報告，每年有超過940000新病例被診斷並且每年全世界報 道近500，000例死亡。結腸癌的總體5年存活率大約為60%，並且在美國每年有近60，000 人死於該疾病。目前採用的療法主要根據結腸或直腸中腫瘤的位置和疾病階段，並且可以包括a) 外科手術，b)化療，c)生物療法或d)放射療法。去除原發腫瘤的外科手術是主要的一線治 療。然而，外科手術的常見不良副作用包括手術出血、腿部血塊以及手術過程中對鄰近器官 的損害。手術選擇包括⑴腸切除，其包括切入腹部以達到受癌影響的結腸或直腸區域。 外科醫生去除癌及其附近的結腸或直腸的部分。然後，將結腸或直腸的兩個健康末端重新 縫合在一起；(ii)肝切除，其包括去除已經從結腸直腸區域擴散至肝的轉移灶以及癌附近 的肝部分。多達一半的肝可以被去除，只要剩餘部分是健康的。破壞肝中癌細胞的兩種其他 方法包括放射波(射頻消蝕)和熱(微波凝固)，和(iii)冷凍手術(還稱為冷凍療法)， 其採用液氮冷凍並破壞已經擴散至肝的結腸直腸癌。其在肝中腫瘤尺寸小時被使用。化療通常用作針對少數患者外科手術的輔助，通常針對腫瘤已經擴散至淋巴結、 化療對其益處已經明確的那些患者。然而，化療副作用包括噁心、嘔吐、食欲不振、脫髮、 口腔潰瘍、手足疹，還包括感染風險、輕傷的出血或青腫、以及貧血相關的疲勞。化療可 以在多種情況下使用(i)首選化療通常在結腸直腸癌晚期並已擴散至身體其他部分時使 用。這種情況下，外科手術不能清除癌，所以此時醫生通常建議化療，化療可以收縮腫瘤結 節、緩解症狀並延長壽命；(ii)輔助化療在癌已經被手術去除之後給予化療時採用。外科 手術可能不會清除所有癌，因此輔助化療治療通常用於殺傷可能被漏掉的任何癌細胞，例 如可能已經轉移或擴散至肝的細胞；和(iii)新輔助化療可以在外科手術之前採用以收縮 腫瘤，以便外科醫生能夠完全去除腫瘤而產生較少併發症。化療通常與放射一起使用以使 放射更有效。生物療法可以被指定用於患有已經擴散的癌症的人。目前療法包括使用(i)生 物應答調節劑，其不直接破壞癌，而是觸發免疫系統反應對抗腫瘤。生物應答調節劑包括細 胞因子，例如幹擾素和白介素。然而，該策略包括通過注射或輸注的大施用劑量的使用，希 望刺激免疫系統的細胞更有效地發揮作用。此外，生物應答調節劑的使用通常伴隨流感樣 症狀，包括發熱、寒戰、噁心和食欲不振。其他不希望的副作用包括注射部位皮疹或腫脹、 治療導致的血壓下降、和疲勞；(ii)集落刺激因子，其刺激產生骨髓細胞，例如紅細胞和白 細胞和血小板。因此，集落刺激因子不直接影響腫瘤，而是在癌症治療過程中幫助支持免疫 系統。但遺憾的是，集落刺激因子的使用伴隨不希望的副作用，例如骨痛、疲勞、發熱和食慾 不振；和(iii)腫瘤疫苗，其促使免疫系統識別癌細胞。所述疫苗通常在癌症發作之後採 用，因此是抑制性而非預防性的。效力差，並且腫瘤疫苗的使用伴隨肌肉疼痛和低熱。
結腸直腸癌治療的主要困難在於20-25%患者在最初診斷時具有臨床可檢測的肝 轉移，並且另外有40-50%患者在初次手術之後三年內發展肝轉移，通常轉移性疾病首先在 肝中發展。除了非黑素瘤皮膚癌之外，乳腺癌是女性中最常見的癌症類型。在2007年，估計 美國女性中有近180，000例侵襲性乳腺癌新病例被診斷。女性發生侵襲性乳腺癌的終生風 險是約1/8(13% )0目前療法包括外科手術、放射療法、化療、激素療法和生物療法。選擇一種療法而 不選擇另一種療法涉及如下考慮腫瘤尺寸和位置，組織學因素(例如淋巴侵襲和組織學 亞型確定)，疾病階段或程度，以及患者年齡和健康狀況。外科手術選擇包括乳房切除術和腫塊切除術(還稱為保乳療法或乳房部分切除 術)，去除或不去除淋巴結。不幸的是，經歷乳房切除術的患者通常遭受下述一種或多種 傷口感染和膿腫、皮瓣壞死、胸壁感覺異常、乳房假體症候群、術後疼痛症候群、血清腫或淋 巴水腫。類似地，腫塊切除術伴隨的併發症包括腋靜脈損傷或血栓形成、血清腫形成、淋巴 水腫、肩運動受損、臂叢損傷和胸壁痛。放射療法伴隨如下併發症乳房軟組織壞死、長期乳房水腫、肋骨骨折、肩活動性 降低、具有感覺異常和臂痛的臂叢病變、淋巴水腫、血管肉瘤、肺癌、冠狀動脈疾病和症狀性 肺炎。然而，目前的化療選擇伴隨不希望的副作用，例如噁心、脫髮、絕經期提前、熱潮 紅、疲勞和暫時降低的血球計數。此外，更嚴重的副作用包括肝毒性、出血性膀胱炎、閉經、 小腦共濟失調、心肌功能不全、外周神經病變、骨髓抑制、神經毒性、禿頂和胸膜滲漏。迄今，激素療法集中於Tamoxifen 的使用和/或芳香酶抑制劑例如Arimidex 、 Aromasir^^^ni^mara 的使用。這些治療分子通過抑制激素特別是雌激素活性而起作用， 並因此抑制可在乳腺癌手術後保留的乳腺癌細胞的生長。但不幸的是，激素療法伴隨不希 望的副作用，例如熱潮紅和陰道乾燥。特別是已經顯示Tamoxifen 治療增加子宮內膜癌風 險、誘導圍絕經期症狀並增加發展白內障的風險。迄今，生物療法集中於Here印tin 的使用。然而，該治療分子的使用伴隨如下不 良作用心臟毒性、發熱、寒戰、噁心、嘔吐，並且特別是在初次輸注之後可發生疼痛。前列腺癌是死於癌症的美國男性中第二大死亡原因，並且是美國男性中診斷的最 常見癌症。在美國，估計10個男性中有一個將在其生命中發展前列腺癌。與其他癌症類型一樣，可用的治療根據多種因素，例如癌症級別和階段，患者年齡 和健康狀況。目前療法包括(i)基於PSA血液測試的觀察等待，PSA血液測試被定期進行 以檢查患者病症還未惡化。該方法被推薦用於影響老年男性的小的、緩慢生長的、非侵略性 癌症，其中所述癌症不影響他們的預期壽命；(ii)前列腺切除術(即，去除前列腺)，但是其 伴隨如下副作用膀胱控制問題、漏尿、陽痿和吻合口狹窄；(iii)放射療法，例如使用高功 率X射線的外部束放射療法(EBRT)，但是該療法伴隨直腸問題、持續出血和直腸潰瘍。可 選地，可以使用直接植入前列腺的放射性粒源植入體(radioactive seed implant)。該療 法還稱為短距離放射療法，並且遞送比通常用外部束所實現的更低的放射劑量(在較長時 段內)。不幸的是，該類型的療法伴隨諸如緩慢且疼痛的排尿和陽痿等併發症；(iv)激素療 法，其被設計為預防雄性激素刺激癌細胞生長。這通常是通過化學抑制雄性激素分泌或通過外科手術方式(睪丸去除)來實現。不幸的是，這些療法伴隨如下副作用乳房增大、性 欲降低、陽痿、熱潮紅、體重增加和肌肉和骨質量減少。此外，已經顯示一些激素療法藥物導 致噁心、腹瀉、疲勞和肝損傷；(V)化療-採用與上文結腸直腸癌、乳腺癌或前列腺癌上下文 中描述的相同類型的藥物；和(Vi)冷凍療法，其通過冷凍受影響組織而破壞癌細胞。遺憾 的是，該療法受到限制，因為難以監測冷凍過程的程度，經常導致對膀胱周圍組織的損傷和 長期併發症(例如，對直腸或控制排尿的肌肉的損傷)。肺癌是世界上男性和女性中癌症相關死亡的首要原因。世界範圍內，肺癌依然是 最常見的惡性疾病，估計每年有104萬新病例，這佔被診斷的癌症新病例的12. 8%。肺癌導 致世界上每年921，000例死亡，佔癌症相關死亡的近18%。目前肺癌療法包括單獨或組合的外科手術、放射療法和化療。當採用所述療法時， 醫生考慮肺癌類型(小細胞或非小細胞)，腫瘤尺寸和位置，腫瘤階段(肺之外是否存在 轉移)，和患者的健康狀況。對於非小細胞肺癌(NSCLC)，目前可用的治療包括(i)化療-不幸的是，NSCLC 對化療僅中度敏感。單劑療法應答率大約為15%，較新的藥劑(例如Gemcitabine 、 PaclitaxelT\Docetaxel ,Vinorelbine )具有略高的應答率 Q0_25%)。此外，化療伴隨 如下併發症血細胞數目減少、噁心、嘔吐、腹瀉、口瘡和口腔潰瘍、脫髮和疲勞；(ii)生物 療法-最近的研究努力重點集中於鑑定分子靶標並利用該認識來發展分子靶向療法。雖然 幾種分鐘靶向療法目前被開發並在NSCLC中測試，但這些療法伴隨不希望的副作用，包括 流感樣症狀，例如寒戰、發熱、肌肉疼痛、疲勞、食欲不振、噁心、嘔吐和腹瀉；(iii)放射療 法。該類型療法通常用作外科手術的輔助，或者在因為有限的肺儲備或存在合併症而不能 手術切除時單獨使用。在早期NSCLC中，單獨的放射療法僅伴隨12-16%的5年後存活率。 遺憾的是，併發症是常見的，並且包括噁心、疲勞、皮膚反應、脫髮、持續咳嗽、咽喉乾燥或 疼痛、以及吞咽困難；(iv)聯合化療放療-最近研究已經顯示，當用共存(而非順序)的基 於鉬的化療和放射療法治療時，具有不可切切除的III期疾病的患者中有限的存活。然而， 與上述癌症類型一樣，化療和放療的使用具有許多不希望的副作用；(ν)外科手術-這通常 在腫瘤處於早期和/或腫瘤還未擴散時採用。實例包括楔形切除術，其包括去除三角形的 組織薄片。楔形切除術被用來去除腫瘤及其周圍的小量正常組織。當處理較大量組織時，稱 為分段切除；葉切除術，其包括肺的整個葉(段)的去除；和肺切除術，其包括一個完整肺 的去除。這些治療介入之後遭遇的副作用包括疼痛、感染，還包括肺炎、出血、血塊和其 他感染。此外，手術期間的死亡率肺切除術是6%，葉切除術是3%，而肺段切除術是1 %。對於小細胞肺癌(SCLC)，目前可用的治療包括(i)化療-單劑化療顯示範圍從 17%至50%的應答率。聯合化療具有良好的應答率和存活率，但是主要副作用包括骨髓 抑制、腎毒性、腫瘤溶解症候群(特徵為高尿酸血症、高磷酸鹽血症、低血鈣症、脫水和血 鉀過多症)、脊髓受壓和低血鈉；(ii)放射療法-該療法僅用於減輕症狀，並且患者一定會 復發；(iii)外科手術-大部分SCLC患者非手術治療。例外是具有局限於肺而沒有涉及任 何淋巴結的非常早期疾病的相對小數目的患者(< 5% )。此類患者通常在最初診斷程序 時經歷肺腫瘤切除術。然而，即使對於這些患者，單獨的外科手術被認為不是治癒性的。
具有復髮型SCLC的患者具有極差的預後，大約65-70 %的SCLC患者在展示時具有 彌散的疾病。擴散階段的SCLC目前是不可治癒的，並且具有擴散性疾病的患者的中值存活時間小於1年。即使呈現局部疾病(即，局限期)的患者，其中值存活時間小於2年。SCLC 的5年存活率小於20%。就上述討論的目前可用的全部療法(對於討論的癌症類型的每一個_結腸直腸 癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌)而言，存在另一個問題，即，腫瘤溶解症候群(TLS)。TLS是非 常嚴重且有時威脅生命的癌症療法併發症。其可以被定義為自發的或治療相關的腫瘤壞死 或爆發性細胞凋亡導致的代謝異常集合。TLS患者中觀察到的代謝異常包括血鉀過多症、 高尿酸血症和高磷酸鹽血症與繼發性低血鈣症；並且可以導致急性腎衰竭(ARF)。癌症(尤其是結腸直腸癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌)繼續成為全球範圍內動物保 健的主要問題。因此，本領域存在對解決上述問題的一個或多個的替代和/或改良的癌症 治療劑和療法的需求。本發明通過提供新一類非細胞毒性抗癌劑而解決了所述問題的一個或多個。更具體說，本發明第一方面提供了用於治療癌症的多肽，所述多肽包括a.非細胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶能夠在生長激素分泌細胞中切割細胞外融合器 (exocytic fusion apparatus)的胃白；b.靶向部分(TM)，其能夠與生長激素分泌細胞上的結合位點結合，所述結合位點 能夠經歷胞吞作用以被併入所述生長激素分泌細胞的內體；和c.易位結構域，其能夠從所述內體內、跨內體膜和進入所述生長激素分泌細胞的 胞質溶膠中易位所述蛋白酶。使用中，本發明多肽結合生長激素分泌細胞。此後，易位組分導致蛋白酶組分轉運 入生長激素分泌細胞的胞質溶膠。最後，一旦在內部，蛋白酶抑制生長激素分泌細胞的細胞 外融合過程。因此，通過失活生長激素分泌細胞的細胞外融合器，本發明多肽抑制生長激素 從其釋放/分泌。本發明多肽的『生物活性』組分由非細胞毒性蛋白酶提供。這一獨特的蛋白酶 組通過蛋白酶切割稱為SNARE蛋白的細胞內轉運蛋白(例如，SNAP-25、VAMP或突觸融合 蛋白)而發揮作用-參見Gerald K(2002) "Cell and Molecular Biology (細胞分子生 物學)，，(第四版)John Wiley &Sons, Inc0首字母縮寫SNARE源自術語可溶性NSF附著 受體(Soluble NSFAttachment Receptor)，其中NSF指N-乙基馬來醯亞胺-敏感因子 (N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白是細胞內囊泡形成以及由此通過囊泡 轉運從細胞分泌分子所必不可少的。因此，一旦被遞送至預期靶細胞，則非細胞毒性蛋白酶 能夠抑制靶細胞的細胞分泌。本發明多肽結合的主要靶細胞是分泌生長激素正常的、非病態的、非癌細胞。然 而，這些細胞不同於根據本發明治療的最終的『下遊』癌細胞。本發明提供能夠(並用於)減少/最小化生長激素和/或胰島素樣生長因子 (IGF-I)的全身或血清水平的多肽。還提供了用於減少/最小化腫瘤溶解症候群(TLS)的 多肽。本發明多肽特別適合用於治療以下的一種或多種結腸直腸癌、乳腺癌、前列腺癌 和/或肺癌(例如SCLC或NSCLC)；包括它們的轉移、癌前狀態及其症狀。就這方面而言， 『治療』包括減少、預防或消除局部、區域或體循環中的癌細胞及其擴散。因此，在本發明的一個相關方面，提供了用於治療患者癌症的方法，所述方法包括向患者施用治療有效量的本發明多肽。本發明還提供了用於減少患者中生長激素和/或 IGF-I水平(優選全身和/或血清水平)的方法，所述方法包括向患者施用治療有效量的本 發明多肽。作為實例，在一個實施方案中，本發明允許保持生長激素基礎水平在約lOng/ml、 優選小於6ng/ml、更優選小於4或5ng/ml的閾值。在正常人中，每日生長激素水平可以在 睡眠開始後約1小時達到峰值，水平約35ng/ml。就這一點而言，在一個實施方案中，本發明 允許所述峰值被控制在約25ng/ml、優選小於20ng/ml、更優選小於15ng/ml的閾值。還提 供了用於減少/最小化腫瘤溶解症候群(TLS)的方法。不希望受任何理論束縛，本發明人相信升高的生長激素全身水平導致全身IGF-I 的水平變得升高，並且後者導致增加的IGF-IR活化和癌基因活化的伴隨增加，這轉而導致 增加的細胞增殖和腫瘤形成/生長。在本發明多肽施用之後，觀察到生長激素(例如，人GH)從垂體前部的分泌下降。 類似地，觀察到循環IGF-I水平的水平降低。GH/IGF-1水平的所述降低與腫瘤收縮相關。 因此，本發明多肽的使用通過去除主要的對抗作用生物途徑之一而提供了用於癌症治療的 有利環境。施用之後，癌症的區域和遠端擴散被減少或消除。就這方面而言，不希望受任何理 論束縛，本發明人相信，轉移的擴散被本發明多肽所抑制，本發明多肽降低了 IGF-I的循環 濃度。本發明的一個優點在於，癌症治療之後，垂體功能恢復正常。換言之，本發明提供 了對垂體具有最小治療後作用的短效療法。因此，與目前垂體切除療法不同，本發明不需要 為防止最初癌症治療導致的併發症的複雜且令人不悅的治療後(通常是長期的)方案，所 述併發症例如骨質疏鬆、短腸症候群、可導致阿爾茨海默病的記憶喪失、關節炎、背痛、纖 維肌痛和慢性疲勞。本發明多肽的生物活性組分是非細胞毒性蛋白酶。非細胞毒性蛋白酶是不殺傷細 胞的獨立的一類分子；相反，它們通過抑制除了蛋白合成外的細胞過程而發揮作用。非細胞 毒性蛋白酶作為較大毒性分子的部分由多種植物和多種微生物產生，所述微生物例如梭狀 芽抱桿菌(Clostridium sp.)禾口奈瑟菌(Neisseria sp.)。梭菌神經毒素代表主要的一組非細胞毒性毒素分子，並且包括通過二硫鍵連接在 一起的兩條多肽鏈。兩條鏈被稱為重鏈(H-鏈)和輕鏈(L-鏈)，重鏈分子量為大約IOOkDa, 輕鏈分子量為大約50kDa。L鏈具有蛋白酶功能並表現出對參與細胞外過程的囊泡和/或質 膜相關(SNARE)蛋白(例如，小突觸泡蛋白、突觸融合蛋白或SNAP-2Q高底物特異性。這 些底物是神經分泌器的重要組分。 主要來自淋球菌(N. gonorrhoeae)種的奈瑟菌和主要來自肺炎鏈球菌 (S. pneumoniae)種的鏈球菌產生功能上類似的非細胞毒性毒素分子。此類非細胞毒性蛋白 酶的實例是IgA蛋白酶(參見W099/58571，其在此通過引用整體併入)。因此，本發明的非細胞毒性蛋白酶優選是梭菌神經毒素蛋白酶或IgA蛋白酶。現在討論本發明的靶向部分(TM)組分，該組分使本發明多肽結合生長激素分泌 細胞、優選結合垂體細胞和/或結合外垂體細胞(extrapituitarycell)。在一個實施方案 中，TM結合垂體腺的前部區域，例如結合促生長素細胞和/或腺垂體細胞。適合的TM包括生長激素分泌細胞受體的配體，例如細胞因子、生長因子、神經肽、凝集素和抗體-該術語包括單克隆抗體和抗體片段，例如Fab、F(ab) 『 2、Fv、ScFv等。本發明TM結合生長激素分泌細胞例如垂體細胞上的受體。作為實例，TM可以結合 瘦蛋白(OB)受體及其同種型、生長素釋放肽受體、促生長素抑制素(sst)受體(例如sstp Sst2, sst3、SSt4和SSt5及其剪接變體)、胰島素生長因子(IGF)受體(例如IGF-1)、erbB 受體(例如erbBl、erbB2、erbB3和erbB4及其剪接變體)、VIP-胰高血糖素-GRF-促胰液 素超家族受體(包括其剪接變體)例如垂體腺苷酸環化酶活化肽(PACAP)受體(例如PAC、 VPAC1和/或VPAC2)、食慾肽(OX)受體和剪接變體(例如OX1和/或0 )、白介素(IL)受 體(例如IL-l、IL-2、IL-6和IL-10受體)、神經生長因子(NTR)受體(例如TrkA(NTR)和 p75 (NTR))、血管內皮生長因子(VEGF)受體(例如VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)、鈴蟾肽受體 (例如BRS-I、BRS-2或BRS-3)、硬骨魚緊張肽(urotensin)受體、黑色素濃縮激素受體1、 促乳素釋放激素受體、KiSS-I受體、促腎上腺皮質素釋放因子受體1和生長激素釋放激素 (GHRH)受體。在一個實施方案中，本發明TM結合瘦蛋白受體。此類TM的適合實例包括瘦蛋白 肽，例如全長瘦蛋白肽(例如瘦蛋白^57)及其截短物或肽類似物，例如瘦蛋白、瘦蛋白
70-95 禾口瘦蛋白 116-122。在另一個實施方案中，本發明的TM結合生長素釋放肽受體。這方面適合的TM的 實例包括生長素釋放肽，例如全長生長素釋放肽(例如生長素釋放肽117)及其截短物或肽 類似物，例如生長素釋放肽24_117和生長素釋放肽52_117 ； [Trp3,Arg5]-生長素釋放肽(1_5)、 des-Gln-生長素釋放肽、皮質抑素(cortistatin)-8、His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys_NH2、 生長激素釋放肽(例如GHRP-6)或海沙瑞林(hexarelin)。在一個實施方案中，本發明的TM結合促生長素抑制素(SST)受體。作為實例， 適合的TM包括SST肽和皮質抑素(CST)-肽及其肽類似物，例如D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2 (BIM 23052)、D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Va 1 -Phe-D-Na 1-NH2 (BIM 23056)或 c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2(BIM-23^8)。其他實例包括 SST 肽SST-14和SST-觀；以及肽和肽類似物，例如奧曲肽、蘭樂肽、BIM23027、伐普肽、司格列肽 和S0M230。這些TM是用於結合SST受體、特別是sst^sst^sst^ss、和sst5受體的優選 TM。在一個實施方案中，本發明的TM結合胰島素樣生長因子(IGF)受體。適合的實例 包括例如IGF-I肽和IGF-2肽。在一個實施方案中，本發明的TM結合VIP-胰高血糖素-GRF-促胰液素超家族受 體，例如結合PAC (例如PAC1)或結合VPAC (例如VPAC-I或VPAC-2)受體。此類TM的適合 實例包括垂體腺苷酸環化酶活化肽(PACAP)、血管活性腸肽(VIP)及其截短物和肽類似物。在一個實施方案中，TM是VIP肽，包括VIP-I和VIP-2肽，例如VIP (1-28)或其截 短物或肽類似物。這些TM顯示與VPAC-I的選擇性結合。可選地，可以採用顯示與VPAC2 選擇性結合的TM，例如mR0M(參見Yu等，Peptides 27 (6) pl359_66 (2006)，其在此通過引 用併入)。在另一個實施方案中，TM可以是PACAP肽，例如PACAP(1-38)或PACAP(1_27)或 其截短物或肽類似物。這些TM是結合PACHf^nPAC-I)受體的優選TM。在另一個實施方案中，本發明的TM結合食慾肽受體(例如(^或 ^受體)。適 合的TM的實例包括全長食慾肽-A肽及其截短物或肽類似物，和食慾肽-B肽及其截短物或肽類似物。在一個實施方案中，本發明的TM結合白介素受體。適合的TM的實例包括IL_1 肽(例如IL-I α、IL-β、IL-18肽)及其截短物或肽類似物、IL-2肽(例如IL_2、IL-3、 IL-12、IL-23肽)及其截短物或肽類似物、和IL-17肽(例如11-17A、IL-17C肽)及其截 短物或肽類似物。在另一個實施方案中，本發明的TM結合NGF受體。適合的TM的實例包括全長NGF 及其截短物或肽類似物。在一個實施方案中，本發明的TM結合血管活性表皮生長因子(VEGF)受體。適合 的TM的實例包括VEGF肽(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E及相關的剪接 變體)及其截短物或肽類似物，和胎盤生長因子(PIGF)及其截短物或肽類似物。在另一個實施方案中，本發明的TM結合ErbB受體。作為實例，TM選自EGF 肽、轉化生長因子-α (TGF-α)肽、EGF和TGF-α嵌合體、雙調蛋白肽、β細胞調節素 (betacellulin)肽、印igen肽、表皮調節素(印iregulin)肽、肝素結合EGF (HB-EGF)肽、神 經調節蛋白(NRG)肽，例如NRGl α ,NRGl β、NRG2 α、NRG2 β、NRG3、NRG4和神經調節蛋白剪 接變體、tomoregulin 1和2肽、神經蛋白聚糖-C肽、lin-3肽、vein肽、gurken肽、spitz 肽或keren肽；及其截短物和肽類似物。存在4類ErbB受體(稱為ErbB 1、erbB2、erbB3 和erbB4)，其還被稱為HER受體。存在這些受體的許多變體，其產生自全長受體的可變剪接 和/或切割(例如EGFR vl翻譯起始在aa543 ；EGFR vll缺失aa521_603 ；EGFR vIII缺失 aa 6-273 ；EGFRvIII/Δ 12-13缺失aa 6-273和409-520 ；EGFR vIV缺失aa 959-1030 ；EGFR vV 截短在殘基 958 ；EGFR TDM/2-7 串聯重複 6-273 ；EGFRTDM/18-25 串聯重複 664-1030 ； EGFR-TDM/18-26串聯重複664-1014)。此外，存在四種ErbB4受體同種型，稱為erbB4JM_a、 erbB4JM-b、erbB4CYT_l 和 erbB4 CYT-1。優選的TM結合ErbB受體(例如ErbBl、ErbB2、ErbB3、ErbB4)及其剪接變體，特別 是ErbBl受體。ErbB TM還可以包括含有EGF基序的蛋白，在六半胱氨酸EGF-模塊中的第四 個半胱氨酸與第五個半胱氨酸之間具有剪接位點，其中所述模塊緊鄰潛在配體的跨膜區。 例如，感光細胞間(interphotoreceptor)基質蛋白聚糖_2 (IMP-2)、跨膜肽酶(MEP) 1 α、 ΜΕΡΙ β、粘蛋白(MUC) 3、MUC4、MUC12和MUC17，以及具有T結支架的蛋白，例如馬鈴薯羧肽 酶抑制劑，和ErbB受體的抗體，例如西妥昔單抗、ABX-EGF,曲妥單抗或EMD72000。其他實 例包括不同ErbB配體的交換結構域(環序列和/或連接胺基酸)產生的嵌合體，例如其中 B-環序列已經被昆蟲(果蠅)ErbB配體中存在的B-環序列替代的哺乳動物erbB受體配 體、其中EGF的C-環序列已經被TGF α (44-50)的C-環序列替代的ErbB配體、其中一個或 多個結構域已經被TGF α中相應序列替代而產生EGF/TGFa嵌合體(例如E3T、T3E、E4T、 T4E、T3E4T、T6E和E3T4E)的EGF配體，和其中N-末端TGF α序列(WSHFND)或神經調節蛋 白序列(SHLVK)已經用於替代第一個半胱氨酸殘基C末端的N-末端EGF序列(NSDSE)的 EGF嵌合體、TlE和Biregulin。而其他嵌合體包括其中結構域已經被另一個蛋白的EGF樣 結構域代替的EGF，所述另一蛋白例如血液凝固蛋白、神經發育蛋白或細胞粘附蛋白(例如 Notch 3、Delta 1、EMR1、F4/80、EMR3 和 EMR4 受體)。在進一步實施方案中，本發明的TM結合黑色素濃縮激素受體1。在這方面適合的 TM的實例包括黑色素濃縮激素(MCH)肽，例如全長MCH及其截短物和類似物。
在另一個實施方案中，本發明的TM結合促乳素釋放激素受體。在這方面適合的TM 的實例包括促乳素釋放肽及其截短物和類似物。在進一步實施方案中，本發明的TM結合KiSS-I受體。在這方面適合的TM的實例 包括Kissp印tin-10、Kisspeptin-54肽及其截短物和類似物。在另一個實施方案中，本發明的TM結合促腎上腺皮質素釋放因子受體1。在這方 面適合的TM的實例包括促腎上腺皮質素-釋放激素、尿皮質素(urocortin) 1和尿皮質素 2，包括其截短物和類似物。在另一個實施方案中，本發明的TM結合生長激素釋放激素(GHRH)受 體。GHRH還被稱為生長激素釋放因子(GRF或GHRF)或somatocrinin。本發明的 適合的TM實例包括全長GHRH(1-44)肽及其截短物或肽類似物，例如GHRH(1_29)； GHRH(l-37) ；hGHRH(l-40)-OH ； [MeTyrl, Alal5,22, Nle27]-hGHRH(1-29)-NH2 ； [MeTyrl, Ala8，9，15,22,28, Nle 27]-hGHRH(1-29)-NH2 ；cyclo (25-29)[MeTyrl, Alal5, DAsp25, Nle27, 0rn29+++]-hGHRH(1-29)-NH2 ； (D-Tyr1)-GHRH(1-29)-NH2 ； (D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2 ； (D_Asp3)-GHRH(1-29)-NH2(D_Ala4)-GHRH(1-29) -NH2 ； (D-Thr7)-GHRH(1-29)-NH2 ； (D_Asn8)-GHRH(1_29)-NH2 ； (D-Ser9)-GHRH(1-29) -NH2 ； (D-TyrlO)-GHRH(1-29)-NH2 ；(Phe4)-GHRH(1-29)-NH2 ； (pCl_Phe6)-GHRH(1-29)-NH2 ； (N-Ac-Tyrl)-GHRH(1-29)-NH2 ； (N-Ac-Tyrl, D_Ala2)-GHRH(1-29)-NH2 ； (N-Ac-D-Tyrl， D-Ala2)-GHRH(1-29)-NH2 ； (N-Ac-D-Tyrl, D-Ala 2，D_Asp3)-GHRH(1-29)-NH2 ； (D_Ala2， NLeu27) -GHRH (1-29) -NH2 ； (Hi s 1，D_Ala2，NLeu27) -GHRH (1-29) -NH2 ； (N-Ac-Hi s 1，D_Ala2， N-Leu27)-GHRH(1-29)-NH2 ； (Hisi,D-Ala 2，D-Ala 4，Nleu27)-GHRH(1-29)-NH2 ； (D_Ala2， D-Asp3, D-Asn8, NLeu27)-GHRH(1-29)-NH2 ； (D_Asp3，D_Asn8，NLeu27)-GHRH(1-29)-NH2 ； [Hisl, NLeu27]-hGHRH(1-29)-NH2 ； [NLeu27]-hGHRH(1-29)-NH2 ；H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile -Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-L eu_NH2 ；H-Tyr-Ala-Asp-Ala-IIe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2 ；H-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-IIe-P he-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-As p-Ile-Met-Ser-Arg-NH2 ；H-Tyr-Ala-Asp-Ala-IIe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-IIe-L eu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IIe-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Gl u-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu~NH2 ；H-Tyr-Ala-Asp-Ala-IIe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-I Ie-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-N H2 ；H is-Val-Asp-Ala-IIe-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-A Ia-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg ；禾口 His-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-A sn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala.在進一步實施方案中，TM結合鈴蟾肽受體(例如BRS-1、BRS_2或BRS-3)。用於本 發明的結合鈴蟾肽受體的TM包括鈴蟾肽-最初從蛙皮膚分離的14胺基酸肽(pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2)；和哺乳動物中兩個已知的同系物，即神經調節肽B和促胃液素釋放肽(GRP)，例如豬GRP-Ala-Pro-Val-Ser-Val-Gly-Gl y-Gly-Thr-Val-Leu-Ala-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-HiS-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu -Mel-NH2,和人 GRP-Val-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Thr-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2。額外的 TM包括相應的鈴蟾肽、 神經調節肽B和GRP截短物及其肽類似物。在另一個實施方案中，本發明的TM結合硬骨魚緊張肽受體。在這方面適 合的TM包括硬骨魚緊張肽及其截短物和肽類似物，例如環狀神經肽硬骨魚緊張 肽-II (U-II)。U-II的C末端環區域在不同物種中是強烈保守的，並且包括六個氨基 酸殘基(-Cys Ple-Trp-Lys-Tyr-Cys-)，其結構類似於促生長素抑制素-14的中央區域 (-Phe-Trp-Lys-Thr-)。適用於本發明的硬骨魚緊張肽包括U-II前體肽，例如前原-硬骨 魚緊張肽-II (包括其兩個人1 和139同種型)，及其截短物和類似物，例如十一殘基成熟 肽形式。根據本發明的第二個方面，提供了物質組合物，即，包括以下的多肽a.非細胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶能夠在生長激素分泌細胞中切割細胞外融合器 的蛋白；b.靶向部分(TM)，其能夠與生長激素分泌細胞上的結合位點結合，所述結合位點 能夠經歷胞吞作用以被併入所述生長激素分泌細胞的內體；和d.易位結構域，其能夠從所述內體內易位、跨內體膜和進入所述生長激素分泌細 胞的胞質溶膠中易位所述蛋白酶。本發明第一方面的所有特徵等同應用於上述第二方面。在本發明第一方面和/或第二方面的優選實施方案中，TM具有人肽胺基酸序列。 因此，優選的TM是例如人GHRH肽、人CST肽或人SST肽。多肽製備本發明多肽包括3個主要組分『生物活性』(即，非細胞毒性蛋白酶)；TM ；和易位 結構域。與製備此類融合蛋白相關的通用技術通常被稱為再靶向毒素技術。作為示例，我 們參考W094/21300；W096/33273 ；W098/07864 ；W000/10598 ；W001/21213 ；W006/059093 ； W000/62814 ；W000/04926 ；W093/15766 ；W000/61192 ；和 W099/58571。所有這些出版物在此 通過引用併入。更具體說，本發明TM組分可以與本發明的蛋白酶組分或易位組分融合。所述融合 優選通過共價鍵，例如直接共價鍵或通過間隔分子/接頭分子。蛋白酶組分和易位組分優 選通過共價鍵連接在一起，所述共價鍵例如直接共價鍵或通過間隔分子/接頭分子。適合 的間隔分子/接頭分子是本領域公知的，並且通常包括基於胺基酸的序列，長度為5至40、 優選10至30個胺基酸殘基。使用中，多肽具有雙鏈構象，其中蛋白酶組分和易位組分優選通過二硫鍵連接在一起。本發明多肽可通過技術人員公知的常規化學軛合技術來製備。作為實例，參考 Hermanson, GT. (1996)，Bioconjugate techniques (生物輒合技術)，Academic Press，禾口 Wong，S. S. (1991)，Chemistry of protein conjugationand cross_linking(蛋白輒合禾口 交聯的化學)，CRC Press, Nagy等，PNAS 95第1794-99頁(1998)。使合成TM與本發明多肽連接的更詳細方法提供於例如EP0257742。上述軛合出版物在此通過引用併入。可選地，所述多肽可通過單個多肽融合蛋白的重組製備來製備(參見例如 W098/07864)。該技術基於天然梭菌神經毒素(即，全毒素)被製備的體內細菌機制，並得 到具有下述『簡化』結構排列的融合蛋白NH2-[蛋白酶組分]-[易位組分]-[TM] -COOH根據W098/07864，TM被置於融合蛋白C末端。然後融合蛋白通過蛋白酶處理而被 活化，所述蛋白酶切割蛋白酶組分和易位組分之間的位點。由此產生雙鏈蛋白，包括作為與 另一單多肽鏈共價連接(通過二硫鍵)的單多肽鏈的蛋白酶組分，所述另一單多肽鏈含有 易位組分和TM。可選地，根據W006/059093，融合蛋白的TM組分位於線性融合蛋白序列中間，在蛋 白酶切割位點和易位組分之間。這確保TM與易位結構域連接(即，如天然梭菌全毒素所發 生的)，但是在這種情況下，兩個組分的順序與天然全毒素相反。蛋白酶切割位點的隨後切 割暴露TM的N末端部分並提供雙鏈多肽融合蛋白。上述蛋白酶切割序列可以通過常規方式以DNA水平被引入(和/或去除任何固 有的切割序列)，例如通過定點誘變。可以人工或在計算機軟體(例如DNASTAR，Inc.的 MapDraw程序)輔助下進行篩選以確認切割序列的存在。雖然可以採用任何蛋白酶切割位 點(即，梭菌的或非梭菌的)，但下述是優選的腸激酶(DDDDK I )Xa 因子(IEGR J, /IDGR J,)TEV (菸草刻蝕病毒)(ENLYFQ I G)凝血酶(LVPR 丨 GS)PreScission(LEVLFQ J, GP)。其他蛋白酶切割位點包括被非細胞毒性蛋白酶，例如被梭菌神經毒素切割的識別 序列。這些包括被非細胞毒性蛋白酶例如梭菌神經毒素切割的SNARE(例如SNAP-25、突觸 融合蛋白、VAMP)蛋白識別序列。具體實例提供於US2007/0166332，其在此通過引用整體並 入。術語蛋白酶切割位點還包括內蛋白，其是自切割序列。自剪接反應是可控的，例如 通過改變存在的還原劑的濃度。上述『活化』切割位點可以被用作『破壞性』切割位點(下 文討論)，將要併入本發明多肽的切割位點。在優選實施方案中，本發明融合蛋白可以包括一個或多個位於N末端和/或C末 端的純化標籤。雖然可以採用任何純化標籤，但下述是優選的His-標籤(例如6 X組氨酸)，優選作為C-末端和/或N-末端標籤MBP-標籤(麥芽糖結合蛋白)，優選作為N-末端標籤GST-標籤(穀胱甘肽-S-轉移酶)，優選作為N-末端標籤Hi S-MBP-標籤，優選作為N-末端標籤GST-MBP-標籤，優選作為N-末端標籤硫氧還蛋白-標籤，優選作為N-末端標籤CBD-標籤(殼多糖結合結構域)，優選作為N-末端標籤。融合蛋白中可以包括一個或多個肽間隔分子/接頭分子。例如，肽間隔物可以在純化標籤與融合蛋白分子其餘部分之間使用。因此，本發明第三方面提供了編碼上述多肽(即，本發明第二方面)的核酸(例如 DNA)序列。所述核酸可以包括在載體形式中，例如質粒中，其可以任選包括複製起點、核酸整 合位點、啟動子、終止子和核糖體結合位點的一個或多個。本發明還包括用於在宿主細胞特別是大腸桿菌中或通過杆狀病毒表達系統表達 所述核酸序列(即，本發明第三方面)的方法。本發明還包括用於活化本發明多肽的方法，所述方法包括使所述多肽與蛋白酶接 觸，所述蛋白酶在位於非細胞毒性蛋白酶組分和易位組分之間的識別位點(切割位點)切 割所述多肽，從而使所述多肽轉化為雙鏈多肽，其中非細胞毒性蛋白酶組分和易位組分通 過二硫鍵連接在一起。在優選實施方案中，識別位點對於天然存在的梭菌神經毒素和/或 天然存在的IgA蛋白酶不是天然的。本發明多肽可被進一步修飾以減少或預防與分散至非靶向區域相關的不想要的 副作用。根據該實施方案，所述多肽包括破壞性切割位點。所述破壞性切割位點不同於『活 化』位點(即，雙鏈形成)，並且可被第二蛋白酶切割並且不可被非細胞毒性蛋白酶切割。而 且，當通過第二蛋白酶在破壞性切割位點如此切割時，所述多肽效價降低(例如對預期靶 細胞的結合能力降低，易位活性降低和/或非細胞毒性蛋白酶活性降低)。為了完整性，本 發明的任何『破壞性』切割位點可以單獨用作本發明多肽的『活化』位點。因此，根據該實施方案，本發明提供了可在位點外(off-site)位置被可控制地失 活和/或破壞的多肽。在優選實施方案中，所述破壞性切割位點被第二蛋白酶(即，破壞性蛋白酶)識別 並切割，所述第二蛋白酶選自循環蛋白酶(例如，胞外蛋白酶，例如血清蛋白酶或凝血級聯 的蛋白酶)、組織相關蛋白酶(例如，基質金屬蛋白酶(MMP)，例如肌肉的MMP)和細胞內蛋 白酶(優選靶細胞不存在的蛋白酶)。因此，在使用中，如果本發明多肽分散遠離其預期靶細胞和/或被非靶細胞攝取， 則所述多肽將通過破壞性切割位點的切割(通過第二蛋白酶)而被失活。在一個實施方案中，所述破壞性切割位點被位點外細胞類型中存在的第二蛋白酶 識別並切割。在該實施方案中，位點外細胞和靶細胞優選為不同的細胞類型。可選地(或 附加地)，破壞性切割位點被位點外位置(例如靶細胞的遠端)存在的第二蛋白酶識別並切 割。因此，當破壞性切割在細胞外發生時，靶細胞和位點外細胞可以是相同或不同的細胞類 型。就這一點而言，靶細胞和位點外細胞可以各自具有與本發明相同多肽結合的受體。本發明破壞性切割位點在所述多肽處於位點外位置中或位點外位置處時提供所 述多肽的失活/破壞。就這方面而言，在破壞性切割位點處的切割使多肽效價最小化(當 與缺少相同的破壞性切割位點或具有相同的破壞性位點但是為未切割形式的相同多肽相 比較)。作為實例，減小的效價包括降低的結合(與哺乳動物細胞受體)和/或減少的易 位(向胞質溶膠方向跨哺乳動物細胞的內體膜)和/或減少的SNARE蛋白切割。當選擇本發明上下文中的破壞性切割位點時，優選地，所述破壞性切割位點不是 可以單獨用於作為其生產過程的一部分的本發明多肽的翻譯後修飾的任何蛋白酶的底物。 就這方面而言，本發明非細胞毒性蛋白酶通常採用蛋白酶活化事件(通過單獨的『活化』蛋白酶切割位點，其在結構上不同於本發明的破壞性切割位點)。活化切割位點的目的是切割 非細胞毒性蛋白酶與本發明多肽的易位組分或結合組分之間的肽鍵，從而提供其中所述兩 個組分通過二硫鍵連接在一起的『活化』雙鏈多肽。因此，為了幫助確保本發明多肽的破壞性切割位點不負面影響『活化』切割位點和 隨後的二硫鍵形成，前者優選被引入本發明多肽中距離『活化』切割位點至少20、至少30、 至少40、至少50和更優選至少60、至少70、至少80個(連續的)胺基酸殘基的位置。破壞性切割位點和活化切割位點相對於多肽的天然組分而言優選是外源的(即， 改造/人工的)。換言之，所述切割位點優選不是多肽相應天然組分所固有的。作為實例， 基於BoNT/A L-鏈或H-鏈(分別地)的蛋白酶或易位組分可以根據本發明被改造而包括 切割位點。但是，所述切割位點不會存在於相應的BoNT天然L-鏈或H-鏈。類似地，當多 肽的靶向部分組分被改造為包括蛋白酶切割位點時，所述切割位點不會存在於相應靶向部 分的相應天然序列中。在本發明的優選實施方案中，破壞性切割位點和『活化』切割位點不被同一蛋白酶 切割。在一個實施方案中，兩個切割位點彼此不同，因為各自識別序列內的耐受胺基酸的至 少一個、更優選至少兩個、特別優選至少三個和最優選至少四個是不同的。作為實例，在梭菌L-鏈和Hn組分之間含有)(a因子『活化』位點的多肽嵌合體的情 況下，優選在非)(a因子位點的位點採用破壞性切割位點，其被插入L-鏈和/或Hn和/或TM 組分中的其他地方。這種情況下，多肽可以被修飾以在L-鏈和Hn組分之間容納可選的『活 化』位點(例如，腸激酶切割位點)，這種情況下，單獨的敘因子切割位點可以作為破壞性 切割位點在其他地方被併入所述多肽。可選地，L-鏈和&組分之間存在的fe因子『活化』 位點可以被保留，並且諸如凝血酶切割位點的可選切割位點作為破壞性切割位點被併入。當在本發明任何組分的一級序列中鑑定用於加入切割位點的適合位點時，優選選 擇與將要插入的建議切割位點密切匹配的一級序列。通過這樣做，最小的結構變化被引入 多肽。作為實例，切割位點通常包括至少3個連續的胺基酸殘基。因此，在優選的實施方案 中，選擇已經具有(在正確的位置)為引入新切割位點所需要的胺基酸殘基的至少一個、優 選至少兩個的切割位點。作為實例，在一個實施方案中，胱天蛋白酶3切割位點(DMQD)可 以被引入。就這方面而言，優選的插入位置被鑑定，其已經包括選自例如DXXX、XMXX、XXQX、 xxxD、DMxx> DxQx> DxxD> xMQx、xMxD、xxQD、DMQx> xMQD、DxQD 禾口 DMxD 的一級序列。類似地，優選將切割位點引入表面暴露的區域。在表面暴露區域內，存在的環區域 是優選的。在本發明優選實施方案中，破壞性切割位點被引入在下述位置的一個或多個，其 基於BoNT/A的一級胺基酸序列。雖然插入位置是參考BoNT/A被鑑定的(為了方便)，但是 可選蛋白酶結構域和/或易位結構域的一級胺基酸序列可以容易地與所述BoNT/A位置對 齊。對於蛋白酶組分，優選下述位置的一個或多個27-31、56-63、73-75,78-81、 99-105、120-124、137-144、161-165、169-173、187-194、202-214、237-241、243-250、 300-304、323-335、375-382、391-400和413-423。以上編號優選始於本發明蛋白酶組分的
N-末端。在優選實施方案中，破壞性切割位點位於距離蛋白酶組分N-末端大於8個胺基酸殘基、優選大於10個胺基酸殘基、更優選大於25個胺基酸殘基、特別優選大於50個胺基酸 殘基的位置。類似地，在優選實施方案中，破壞性切割位點位於距離蛋白酶組分C-末端大 於20個胺基酸殘基、優選大於30個胺基酸殘基、更優選大於40個胺基酸殘基、特別優選大 於50個胺基酸殘基的位置。對於易位組分，優選下述位置的一個或多個474-479、483-495、507-543、 557-567、576-580、618-631、643-650、669-677、751-767、823-834、845-859。上述編號優選 明確本發明易位結構域組分的N-末端449起始位置和易位結構域組分C-末端871終止位置。在優選實施方案中，破壞性切割位點位於從易位組分N-末端大於10個胺基酸殘 基、優選大於25個胺基酸殘基、更優選大於40個胺基酸殘基、特別優選大於50個胺基酸殘 基的位置。類似地，在優選實施方案中，破壞性切割位點位於從易位組分C-末端大於10個 胺基酸殘基、優選大於25個胺基酸殘基、更優選大於40個胺基酸殘基、特別優選大於50個 胺基酸殘基的位置。在優選實施方案中，破壞性切割位點位於從TM組分N-末端大於10個胺基酸殘 基、優選大於25個胺基酸殘基、更優選大於40個胺基酸殘基、特別優選大於50個胺基酸殘 基的位置。類似地，在優選實施方案中，破壞性切割位點位於從TM組分C-末端大於10個 胺基酸殘基、優選大於25個胺基酸殘基、更優選大於40個胺基酸殘基、特別優選大於50個 胺基酸殘基的位置。本發明多肽可以包括一個或多個(例如兩個、三個、四個、五個或更多個)破壞性 蛋白酶切割位點。當包括超過一個破壞性切割位點時，每個切割位點可以相同或不同。就 這一點而言，超過一個破壞性切割位點的使用提供了提高的位點外失活。類似地，兩個或多 個不同的破壞性切割位點的使用提供了額外的設計靈活性。破壞性切割位點可以被加入下述多肽組分的任何一個中非細胞毒性蛋白酶組 分；易位組分；靶向部分；或間隔肽(如果存在)。就這一點而言，破壞性切割位點被選擇以 確保對多肽效價的不利影響最小(例如，通過對靶向/結合區和/或易位結構域、和/或對 非細胞毒性蛋白酶結構域的影響最小)，同時確保多肽遠離其靶位點/靶細胞時不穩定。優選的破壞性切割位點(加上相應的第二蛋白酶)列於下表中。所列切割位點純 粹是示例說明性的並且不是要限制本發明。0123
權利要求
1.一種多肽，所述多肽應用於抑制癌症，所述多肽包括a.非細胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶能夠在生長激素分泌細胞中切割細胞外融合器的蛋白；b.靶向部分(TM)，其與生長激素分泌細胞上的結合位點結合，所述結合位點能夠經歷 胞吞作用以被併入所述生長激素分泌細胞的內體；和c.易位結構域，其從所述內體內、跨內體膜和進入所述生長激素分泌細胞的胞質溶膠 中易位所述蛋白酶。
2.根據權利要求1應用的多肽，其中所述生長激素分泌細胞是垂體細胞。
3.根據權利要求1或權利要求2應用的多肽，其中所述TM結合選自由以下組成的組的 受體生長激素釋放激素(GHRH)受體、瘦蛋白(OB)受體、生長素釋放肽受體、促生長素抑制 素(sst)受體、胰島素生長因子(IGF)受體、ErbB受體、VIP-胰高血糖素-GRF-促胰液素超 家族受體、食慾肽(OX)受體、白介素(IL)受體、神經生長因子(NTR)受體、血管內皮生長因 子(VEGF)受體、鈴蟾肽受體、硬骨魚緊張肽受體、黑色素濃縮激素受體1、促乳素釋放激素 受體、KiSS-I受體或促腎上腺皮質素釋放因子受體1。
4.根據任一前述權利要求應用的多肽，其中所述TM選自由以下組成的組生長激素釋 放激素(GHRH)肽、瘦蛋白肽、生長素釋放肽、促生長素抑制素(SST)肽、皮質抑素肽、胰島素 樣生長因子(IGF)肽、轉化生長因子(TGF)肽、VIP-胰高血糖素-GRF-促胰液素超家族肽、 PACAP肽、血管活性腸肽(VIP)、食慾肽、白介素肽、神經生長因子(NGF)肽、血管內皮生長 因子(VEGF)肽、甲狀腺激素肽、雌激素肽、ErbB肽、表皮生長因子(EGF)肽、EGF和TGF-α 嵌合肽、雙調蛋白肽、β細胞調節素肽、印igen肽、表皮調節素肽、肝素結合EGF(HB-EGF) 肽、鈴蟾肽、硬骨魚緊張肽、黑色素濃縮激素(MCH)肽、促乳素釋放肽、Kissp印tin-ΙΟ肽、 Kisspeptin-54肽、促腎上腺皮質素釋放激素肽、尿皮質素1肽或尿皮質素2肽。
5.根據任一前述權利要求應用的多肽，其中所述非細胞毒性蛋白酶包括梭菌神經毒素 內肽酶。
6.根據權利要求1-4任一項應用的多肽，其中所述非細胞毒性蛋白酶包括IgA蛋白酶。
7.根據任一前述權利要求應用的多肽，其中所述易位結構域包括梭菌神經毒素易位結 構域。
8.一種多肽，包括a.非細胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶能夠在生長激素分泌細胞中切割細胞外融合器的蛋白；b.靶向部分(TM)，其與生長激素分泌細胞上的結合位點結合，所述結合位點能夠經歷 胞吞作用以被併入所述生長激素分泌細胞的內體；和c.易位結構域，其從所述內體內、跨內體膜和進入所述生長激素分泌細胞的胞質溶膠 中易位所述蛋白酶。
9.根據權利要求8所述的多肽，其中所述生長激素分泌細胞是垂體細胞。
10.根據權利要求8或權利要求9所述的多肽，其中所述TM結合選自由以下組成的組 的受體生長激素釋放激素(GHRH)受體、瘦蛋白(OB)受體、生長素釋放肽受體、促生長素抑 制素(sst)受體、胰島素生長因子(IGF)受體、ErbB受體、VIP-胰高血糖素-GRF-促胰液素 超家族受體、食慾肽(OX)受體、白介素(IL)受體、神經生長因子(NTR)受體、血管內皮生長因子(VEGF)受體、鈴蟾肽受體、硬骨魚緊張肽受體、黑色素濃縮激素受體1、促乳素釋放激 素受體、KiSS-I受體或促腎上腺皮質素釋放因子受體1。
11.根據權利要求8-10任一項所述的多肽，其中所述TM選自由以下組成的組生長激 素釋放激素(GHRH)肽、瘦蛋白肽、生長素釋放肽、促生長素抑制素(SST)肽、皮質抑素肽、胰 島素樣生長因子(IGF)肽、轉化生長因子(TGF)肽、VIP-胰高血糖素-GRF-促胰液素超家族 肽、PACAP肽、血管活性腸肽(VIP)、食慾肽、白介素肽、神經生長因子(NGF)肽、血管內皮生 長因子(VEGF)肽、甲狀腺激素肽、雌激素肽、ErbB肽、表皮生長因子(EGF)肽、EGF和TGF-α 嵌合肽、雙調蛋白肽、β細胞調節素肽、印igen肽、表皮調節素肽、肝素結合EGF(HB-EGF) 肽、鈴蟾肽、硬骨魚緊張肽、黑色素濃縮激素(MCH)肽、促乳素釋放肽、Kissp印tin-ΙΟ肽、 Kisspeptin-54肽、促腎上腺皮質素釋放激素肽、尿皮質素1肽或尿皮質素2肽。
12.根據權利要求8-11任一項所述的多肽，其中所述非細胞毒性蛋白酶包括梭菌神經 毒素內肽酶。
13.根據權利要求8-11任一項所述的多肽，其中所述非細胞毒性蛋白酶包括IgA蛋白酶。
14.根據權利要求8-13任一項所述的多肽，其中所述易位結構域包括梭菌神經毒素易 位結構域。
15.根據權利要求8所述的多肽，其中所述多肽包括與SEQID N0:8、9、10、ll、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87 的任一個具有至少 90-92%、或至少 95-97%、或至少98-99%序列同一性的胺基酸序列。
16.一種核酸序列，所述核酸序列編碼根據權利要求8-15任一項的多肽。
17.一種核酸，所述核酸編碼根據權利要求8的多肽，其中所述核酸包括與SEQ ID NO 7和32的任一個具有至少90-94%、或至少95-97%、或至少98-99%序列同一性的核酸序 列。
18.—種抑制患者癌症的方法，包括向患者施用有效量的根據權利要求8-15任一項的 多肽或根據權利要求16或17的核酸。
19.根據權利要求1-7任一項的應用或者根據權利要求18的方法，用於抑制選自由以 下組成的組的一種或多種癌症前列腺癌、肺癌、乳腺癌或結腸直腸癌。
全文摘要
本發明涉及用於抑制或治療癌症的方法，特別涉及用於抑制或治療結腸直腸癌、乳腺癌、前列腺癌和/或肺癌的一種或多種的方法。該療法採用靶向於生長激素分泌細胞例如靶向於垂體細胞的非細胞毒性蛋白酶。當如此被遞送時，所述蛋白酶被內化並抑制生長激素從所述細胞的分泌/傳輸。本發明還涉及用於所述方法的多肽和核酸。
文檔編號A61K38/00GK102083451SQ200980122092
公開日2011年6月1日 申請日期2009年6月11日 優先權日2008年6月12日
發明者K·福斯特, P·馬科斯, 弗雷德裡克·馬代克, 菲爾·萊卡納 申請人:賽恩泰新公司