B型肝炎基因工程疫苗免疫佐劑製備工藝的製作方法

2023-10-22 18:32:57 2

專利名稱：B型肝炎基因工程疫苗免疫佐劑製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬來源於植物的藥物製品領域。
目前臨床上應用的B型肝炎疫苗免疫佐劑為氫氧化鋁膠。它從30年代起始用，現已有50多年歷史了。其優點(1)對老一代疫苗(血源疫苗)其佐劑性效果較肯定;(2)毒性小;(3)生產成本不高。但也存在很多不夠理想之處，半個世紀以來，各國科研工作者，從不同來源，研究了一系列疫苗新佐劑，至今尚未見報導優於氫氧化鋁膠的新的疫苗佐劑，因此延用至今。七十年代起，各種新一代疫苗相繼研製成功，如DNA重組疫苗、合成肽疫苗等，由於新一代疫苗的免疫原性均很低，必須與相關的疫苗佐劑合用，才能使機體產生保護性的有效的免疫應答。因此，新免疫佐劑的開發研究，就成為新一代疫苗研究的熱門課題之一。
氫氧化鋁膠存在的主要問題(1)對各種新一代疫苗的免疫佐劑性差，遠遠不能滿足各種新疫苗迅猛發展的需要;(2)氫氧化鋁膠主要的質量控制指標是濁度與pH值，製備過程中難以標化，往往因批而異影響效果;(3)氫氧化鋁膠與抗原(疫苗)主要是通過物理的離子吸附作用相結合，它往往受抗原的等電點，溶液的pH值及離子強度等因素的影響，使免疫佐劑性波動很大，效果重複性差;(4)機體的細胞免疫反應(CMI)，在機體保護性的免疫應答中，起著十分重要的作用，而氫氧化鋁膠不能誘導機體產生細胞免疫反應;(5)氫氧化鋁膠，不能冷幹與冷凍，對存貯與運輸極為不便。
美國專利US Patent No4，843，067公開了一種只含多糖的免疫藥品(PCI)，雖然也用了ASD多糖，但其主要用來作免疫增強劑，治療人的免疫抑制狀態如老齡等，其分離提取製備方法與我們完全不一樣。日本專利昭53-32107公開了ASD生物學的活性物質，即ASD多糖，只作了一般的免疫學試驗。
本發明的目的是研製出了一種佐劑性效果好、毒性小，優於現用的氫氧化鋁膠的B型肝炎基因工程疫苗(HBsAg)新免疫佐劑。
本發明的主要內容為，從傳統中草藥傘形科植物[Angelica Sinesis(Oliv)Diels]即ASD中分離提取ASDP及ASDE3作為疫苗佐劑，並與疫苗製備成免疫刺激複合物HBsAg-ASDP-ASDE3。
有效組分ASDE3的分離、提取1、傘形科傳統中草藥〔Angelica Sinensis(Oliv)Diels，ASD〕，粉碎機粉碎。
2、加95%乙醇(1-2倍體積)，60℃，抽提3-4次，每次1小時。乙醇提取物合併、濃縮。乙醇提取不溶物，晾乾，備用。
3、乙醇提取物加等體積乙酸乙酯，室溫抽提兩次，抽提物合併、濃縮。
4、乙酸乙酯提取物柱層析(1)柱層析100×3CM，(2)矽膠粒粒度範圍100目，青島海洋化工廠出品，300克，(3)樣品乙酸乙酯提取濃縮物6克，(4)洗脫液，乙酸乙酯-正己烷1∶5～1∶0(V/V)，(5)洗脫液按每份100ml收集，同時用矽膠G，F254，TLC，及三用紫外分析儀，波長2537A及3650A，檢測，Rf為0.5，3650A不顯螢光，(6)將含有效組分ASDE3部分，進行合併，減壓濃縮純化後，即得到單一有效組分ASDE3的樣品，ASDE3為一新化合物。
ASDP分離、提取即製備(1)ASD乙醇抽提之後的乙醇不溶物，稱重。
(2)加1-2倍體積的無鹽水，PH7.0，60℃，抽提2-3次，每次1小時，收集水提物，減壓濃縮。
(3)水提濃縮液，加1/10～1/2體積的氯仿-正丁醇(4∶1～9∶1)，PH7，振搖，5分鐘後，過濾。
(4)上清液，經自來水透析過夜。
(5)透析液再加2-3倍體積無水乙醇，振搖，5分鐘後過濾。
(6)沉澱物分次用乙醇、丙酮、乙醚洗。
(7)洗後，冷凍、乾燥，得ASDP樣品。
上述ASDP樣品，進行了免疫藥理學及化學研究，表明為一多糖類化合物。我們用作為藥物載體。
含有B型肝炎基因工程疫苗的新免疫佐劑ASDP/ASDE的製備HBsAg-ASDP/ASDE3為一新的免疫刺激複合物(ISCOMS)製備方法有二(A)ASDP/ASDE3按60/30mg/Kg配製成PH5-7的水溶液，10磅，20分鐘，高壓消毒後，加入無菌的哺乳動物細胞系表達的重組DNAB肝疫苗，輕輕振蕩，室溫或37℃放1～2小時，冰箱過夜，備用。
(B)先將ASDP處理，即ASDP100mg加入0.015M NaIO450ml室溫pH4～6避光，低溫(4℃)反應2小時，加乙二醇1～2ml，經蒸餾水透析。處理後的ASDP，再按ASDP/ASDE360/30mg/Kg配製後加HBsAg，再加入0.08M NaBH40.2-0.6ml室溫，反應30分鐘，蒸溜水透析過夜，透析液及新的ISCOMS，冰箱保存備用。
ASDP/ASDE3有效劑量範圍2-120/1-60mg/Kg，二者比例為2∶1～1∶2及ASDE有效組分(1-8)合用，作為預防用藥。
ASDE3的免疫佐劑性評價上述純度的樣品，ASDP/ASDE3按60/30mg/Kg劑量與B型肝炎基因工程疫苗合用，免疫動物，6周後分離血清，用固相放射免疫法(RIA)，測定了血清抗體滴度，比對照氫氧化鋁膠一般平均高2-4倍。ASDE有效組分ASDE1-8等合用對免疫佐劑有協同作用。(見表1、3)(圖1、2)同時，ASDP/ASDE3對細胞免疫、吞噬系統、細胞因子的誘生等也有廣泛的免疫調節作用。
ASDP/ASDE3毒理學研究結果表明，毒性很小，注射及用藥部位無明顯刺激性，不引發Ⅰ型變態反應。小鼠皮下給藥LD50＞4000mg/Kg肌肉注射LD50＞1600mg/kg(見表2、4、5、6)。
本發明的優點和積極效果主要優點是對HBsAg免疫佐劑性效果明顯優於現用的氫氧化鋁膠，毒副作用很小，ASDP及ASDE3本身都是免疫調節劑(Immuno modulators)，以HBsAg-ASDP/ASDE3免疫刺激複合物形式提供應用，較分別單獨使用有很大優點。生產成本初步估算不高於氫氧化鋁膠。
(2)B型肝炎基因工程疫苗，目前產量低，成本貴，ASDP/ASDE3完全可代替氫氧化鋁膠。按目前實驗結果，其佐劑性效果比氫氧化鋁膠高出2-4倍，相當於使HBsAg產量體高2-4倍，提高了B型肝炎基因工程疫苗的社會及經濟效益。
(3)根據對ASDP/ASDE3研究結果表明，完全有可能擴大用於其他基因工程疫苗，以及畜牧用的疫苗佐劑，創造更大效益。


圖1為新免疫佐劑ASDP/ASDE3與氫氧化鋁膠，分別與B型肝炎基因工程疫苗合用，小鼠血清不同濃度稀釋，抗HBsAg抗體滴度的比較圖，橫座標為稀釋度，縱座標為cpm均值(×103)，曲線1HBsAg-ASDP-ASDE3，曲線2已知抗HBsAg抗體陽性血清，曲線3 HBsAg-Al(OH)3，曲線4已知抗HBsAg抗體陰性血清。
圖2為ASDP/ASDE3免疫佐劑性劑量反應曲線圖。橫座標為ASDP/ASDE3濃度mg/kg，縱坐標A，為cpm均值(×103)結果見曲線5，(對照Al(OH)3為2.5×103)。縱座標B，為血清陽轉率(%)，結果見曲線6，(Al(OH)3為67%)。縱座標C，為樣品cpm值與已知陽性血清cpm值比值(S/N)，結果見曲線7(AL(OH)3為28)。
圖3為ASDP及ASDE的分離，提取及製備流程圖本發明的最佳實施例1、ASDE3分離、提取、製備a、ASD1000克加95%乙醇1000ml，60℃振蕩，提取三次。
b、乙醇提取物，減壓濃縮成200ml。
c、加等體積乙酸乙酯提取2次，抽提物濃縮去除有機溶媒。
d、矽膠柱層析，樣品與矽膠比為1∶50(W/W)。
e、先後用乙酸乙酯-正己烷1∶5，1∶3，1∶1，1∶0，洗脫，收集洗脫液，檢測後合併、濃縮。
f、經純化後得ASDE33克。
2、ASDP分離、提取、製備a、ASD乙醇提取後之乙醇不溶物800克，b、加PH7之蒸餾水800ml，c、60℃振蕩提取1小時，共三次，d、水提物收集，濃縮成1/5體積，e、加氯仿-正丁醇5∶1(水提物體積的1/5)振蕩過濾，取水層。
f、水層減壓濃縮成原體積的1/5，自來水透析、過夜。
g、透析液加三倍無水乙醇，醇析，過濾，取沉澱。
h、沉澱先後用乙醇、丙酮、乙醚洗滌各一次。
i、沉澱冷凍乾燥後，得ASDP30克。
3、免疫刺激複合物的製備(即疫苗HBsAg加佐劑ASDP/ASDE3)ASDP/ASDE3按120/60mg/Kg製備成PH6的溶液(用生理鹽水配製)，先用0.5N NaOH少量溶解，再用生理鹽水調到所需濃度，再用0.5NHcl調PH至PH6，10磅，20分鐘高壓消毒備用。
將B型肝炎表面抗原(HBsAg)分別稀釋成2.5微克/毫升，1.25微克/毫升，0.625微克/毫升與上述ASDP/ASDE3溶液等體積配比，室溫，輕振搖約2小時，後置冰箱備用。
表1.新免疫佐劑ASDP/ASDE3的免疫佐劑性

＊小鼠 BALB/C 雄性 三周齡，8-10克樣品用50%小牛血清1∶5稀釋表2.ASDP/ASDE的急性毒性(LD50)小鼠(mg/kg) 大鼠(mg/kg)免疫佐劑 S.C. I.M. I.V. S.C.
ASDE2＞4000 ＞800 ＞800ASDP/ASDE2＞2000 ＞200 100ASDE3＞4000 ＞1600 ＞640ASDP/ASDE3＞2000 ＞800 200




權利要求
1.一種B型肝炎基因工程疫苗免疫佐劑的製備工藝，其特徵在於從傳統中草藥傘形科植物[AngelicaSinesis(Oliv)Diels]即ASD中分離提取ASDP及ASDE2，為疫苗佐劑並製備成免疫刺激複合物HBsAg-ASDP-ASDE2，作為預防用藥。
2.按權利要求1所述的製備工藝，其特徵在於ASD中佐劑有效組分ASDE3的分離、提取a、傘形科傳統中草藥(Angelica Sinensis(Oliv) Diels，ASD)，用粉碎機粉碎。b、加95%乙醇(1-2倍體積)，60℃，抽提3-4次，每次1小時。乙醇提取物合併、濃縮。乙醇提取不溶物，晾乾，備用。c、乙醇提取物加等體積乙酸乙酯，室溫抽提兩次，抽提物合併、濃縮。d、乙酸乙酯提取物柱層析(1)柱層析100×3CM，(2)矽膠粒度範圍100目，青島海洋化工廠出品，300克，(3)樣品乙酸乙酯提取濃縮物6克，(4)洗脫液，乙酸乙酯-正己烷1∶5～1∶0(V/V)，(5)洗脫液按每份100ml收集，同時用矽膠G，F254，TLC，及三用紫外分析儀，波長2537A及3650A，檢測，Rf為0.5，3650A不顯螢光，(6)將含有效組分ASDE2部分，進行合併，減壓濃縮純化後，即得到單一有效組分ASDE3的樣品。
3.按權利要求1所述的製備工藝，其特徵在於ASD中佐劑有效組份ASDP的分離、提取及製備a、ASD乙醇抽提之後的乙醇不溶物，稱重。b、加1-2倍體積的無鹽水PH7.0，60℃，抽提2-3次，每次1小時，收集水提物，減壓濃縮。c、水提濃縮液，加1/10～1/2體積的氯仿-正丁醇(4∶1～9∶1)，PH7，振搖，5分鐘後，過濾。d、上清液，經自來水透析過夜。e、透析液再加2-3倍體積無水乙醇，振搖，5分鐘後過濾。f、沉澱物分次用乙醇、丙酮、乙醚洗。g、洗後，冷凍、乾燥，得ASDP樣品。
4.按權利要求1所述的製備工藝，其特徵在於，免疫刺激複合物包括疫苗加佐劑的製備ASDP/ASDE3按60/30mg/Kg配製成PH5-7的水溶液，10磅，20分鐘，高壓消毒後，加入無菌的哺乳動物細胞系表達的重組DNAB肝疫苗，輕輕振蕩，室溫或37℃放1～2小時，冰箱過夜，備用。
5.按權利要求1所述的製備工藝，其特徵在於免疫刺激複合物的製備先將ASDP處理，即ASDP100mg加入0.015M NaIO450ml室溫pH4～6避光，低溫(4℃)反應2小時，加乙二醇1～2ml，經蒸餾水透析。處理後的ASDP，再按ASDP/ASDE360/30mg/Kg配製後加HBsAg，再加入0.08M NaBH40.2-0.6ml室溫，反應30分鐘，蒸溜水透析過夜，透析液及新的ISCOMS，冰箱保存備用。
6.按權利要求1所述的製備工藝，其特徵在於ASDP/ASDE3有效劑量範圍2-120/1-60mg/Kg，二者比例為2∶1～1∶2及ASDE有效組分(1-8)合用。
全文摘要
本發明屬來源於植物材料的藥物製品領域。從傳統中草藥，傘形科植物Angelica Sinensis(Oliv)Diels，ASD中分離，提取並製備了佐劑有效組份ASDP及ASDE，再與哺乳動物細胞系表達的DNA重組B肝抗原結合，研製成免疫刺激複合物，完全可代替HBsAg-A(OH)
文檔編號A61K31/715GK1053747SQ9110157
公開日1991年8月14日 申請日期1991年3月18日 優先權日1991年3月18日
發明者柳鍾勳, 許津, 左增豔, 劉海群, 林赴田, 於鋒, 宋坤改 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所