腫瘤循環DNA技術檢測‑癌症早期易發風險評估數據法的製作方法
2023-10-22 19:58:28 1
本發明屬於臨床輔助檢測應用型專利，尤其涉及血漿中循環DNA的提取及癌症早期患病風險評估檢測方法的建立，具體為一種癌症早期患病風險評估的快速檢測方法。
背景技術：
ctDNA(circulating tumor DNA)，簡稱循環腫瘤DNA，是指腫瘤細胞中的DNA釋放到血液循環系統中的100-300bp的片段。血液中游離小片段DNA早在1947年由Mandel和Metais發現，但由於缺乏靈敏性和特異性的試驗方法，導致相關性研究進展緩慢，直至提取游離小片段DNA的技術出現，並結合螢光定量PCR技術在檢測技術中的應用，將為臨床腫瘤的早期診斷，治療方案的確定，療效觀察，預後評估，轉移風險分析；復發監測等方面提供巨大的臨床參考價值。Sozzi等人發現在Ⅰ期的肺癌患者中循環腫瘤DNA已經存在於血液中以及相關的DNA微衛星也發生改變；Sozzi針對38例已經進行肺癌手術的患者追蹤調查發現，無復發患者有35人，在術後的6個月中血液中的腫瘤循環DNA的含量顯著低於術前的平均水平，但是術後ctDNA明顯成倍增長的3人中，有2人術後2個月死於肝轉移，另一例則在第二年後復發，這說明腫瘤循環DNA與腫瘤病情檢測密切相關。Mulcahy HE等人為患有胰腺癌的患者進行檢測發現血漿中DNA K-ras發生了突變，突變率高達80％以上，其中有4例為胰腺炎的患者在血清中發現K-ras突變，在之後的一年裡被診斷為胰腺癌。說明ctDNA具有腫瘤早期診斷能力，因此也進一步說明，對於正在接受腫瘤治療的患者如果腫瘤循環DNA持續升高，則治療方案應重新擬定，而持續下降的患者則說明仍處於緩解期。ctDNA作為腫瘤的標誌物，在腫瘤診斷、治療、預後檢測方面發揮重要作用。血漿中的ctDNA突變與腫瘤患者的組織特異性相一致性，使良性細胞異常增殖，細胞凋亡增加，進而導致血液中ctDNA也隨之增加，通過對ctDNA更準確的定性和定量，可以更好的應用於臨床。但是目前沒有一種很好的方法去實現癌症早期風險評估。
技術實現要素：
發明目的：本發明提供一種利用腫瘤循環DNA檢測進行癌症早期風險評估的方法，其目的是解決以往所存在的問題。
技術方案：
一種新的循環DNA檢測方法應用於癌症早期患病風險評估，其特徵在於：利用循環DNA的特性，製備多孔徑網狀的納米顆粒對血漿中腫瘤細胞釋放到血漿中的游離小片段DNA進行富集及提取，多孔徑網狀納米顆粒的設計使得富集ctDNA的面積明顯增加，富集效率更高，不同大小的孔徑設計只能針對100～300bp的游離小片段進行富集，這些游離小片段可以順利通過納米顆粒上孔徑，並停留在納米顆粒內部，經過一定轉速的離心使得游離小片段DNA與納米顆粒一起富集到離心管底部。而未經消解的片段較大的游離DNA則不能通過納米顆粒上的孔徑進而排除在外，隨著離心及其他試劑的作用下被剔除掉。
以已知質量的腫瘤組織基因組DNA為模板，進行不同梯度稀釋，利用具有腫瘤特異性的基因及其熱點突變設計分子探針進行QPCR檢測。以基因組DNA的質量為X軸，QPCR檢測得到的CT值為Y軸繪製計算曲線，得到計算公式及標準曲線。
利用得到的計算公式及標準曲線，我們收集了50例健康人群樣本，利用本專利中的血漿中游離小片段DNA提取試劑盒對血漿中ctDNA進行富集提取，以提取的ctDNA為模板並利用具有腫瘤特異性的基因及其熱點突變設計分子探針進行QPCR檢測，得到QPCR檢測的最低CT值及最高CT值，分別帶入到繪製標準曲線時得到的計算公式中，計算得到X值，10x即為QPCR模板上樣量體積中所含的該基因拷貝數，利用新公式(10x×a)/2b計算出每毫升血漿中該基因拷貝數(其中a為ctDNA總體積；b為QPCR上樣模板體積)進而計算出血漿中所含的該基因拷貝數的最高值及最低值。
未知樣本利用本檢測方法進行檢測後，可根據得到的基因拷貝數所在的區間，對腫瘤易感性的高低進行判定。在排除患者年齡、個人作息習慣及近期炎症反應等幹擾因素，評估該基因拷貝數值是否出現異常。規定檢測範圍為正常，腫瘤易感性較低，建議每6個月進行一次復檢；檢測範圍為偏高值，腫瘤易感性較高，建議每3個月進行一次復檢；檢測範圍為高值，腫瘤易感性明顯高於健康人群，建議每2周進行一次復檢，若復檢結果持續高值則進入腫瘤高發期，應增加醫院影像學檢測的頻率，在腫瘤早期發現並著手治療。
一種腫瘤循環DNA定性和定量形成癌症早期易發風險評估數據法，其特徵在於：包括以下步驟：人體血漿製備及循環DNA提取、循環DNA 提取試劑盒靈敏度檢測、循環DNA檢測方法建立,確定檢測方法、檢測結果計算及確定檢測範圍；
本方法主要利用循環DNA的特性，製備多孔徑網狀的納米顆粒對血漿中腫瘤細胞釋放到血漿中的游離小片段DNA進行富集及提取，以腫瘤組織基因組DNA為模板，進行不同梯度稀釋，利用具有腫瘤特異性的基因及其熱點突變設計分子探針進行QPCR檢測，以基因組DNA的質量為X軸，QPCR檢測得到的CT值為Y軸繪製計算曲線，得到計算公式。
該方法的步驟如下：
(1)確定腫瘤易感基因檢測計算方法及正常參考區間：
(a)、模板製備：
癌症組織基因組DNA樣本，利用Nanodrop可測量DNA濃度或質量的核酸分析儀進行測量，根據DNA濃度不同，將DNA分別稀釋不同梯度，以稀釋後的DNA為模板進行QPCR檢測；檢測結果中以CT值為Y軸，以模板DNA的質量為X軸繪製作圖曲線並得到y＝kx+b型計算公式及R2值；
(b)、引物設計：
在NCBI或其他資料庫及文獻中獲得腫瘤易感基因突變頻率較高的位點，將該基因的基因序列從NCBI中拷貝出來，選取其中一個熱點突變，將原基因序列稍作改變成基因突變後的序列，利用如DNAMAN、Oligo、Primer5等引物設計軟體，進行分子探針設計，分子探針設計原則為：上遊正向引物的最後一位鹼基與突變後位點鹼基一致，或下遊反向引物的反向互補序列的最後一位鹼基與突變後位點鹼基一致；擴增片段大小介於90～120bp之間；
(c)、QPCR檢測：利用任意SYBR Green QPCR檢測試劑盒說明進行操作；
(d)、正常參考區間確定：
收集正常非腫瘤患者50例，分別提取ctDNA，並利用以上方法進行QPCR檢測，檢測結果得到的CT值作為Y值帶入到模板製備獲得的計算公式y＝kx+b中，得出X值，10x即為模板上樣量2ul ctDNA中所含的該基因拷貝數，利用新公式(10x×a)/2b計算出每毫升血漿中該基因拷貝數(其中a為ctDNA總體積；b為QPCR上樣模板體積)。通過50例健康人群的檢測，得到QPCR檢測腫瘤易感基因拷貝數的最高值及最低值，在針對未知樣本進行檢測時，基因拷貝數落在最高值和最低值之間的個體，即為正常水平檢測範圍，對腫瘤的易感性相對較低。
正常參考區間確定之後進行檢測結果說明：
檢測結果共分低、偏高、高三個區間；檢測結果顯示基因拷貝數值低，則對腫瘤易感性低，該類人群每半年進行一次復檢；檢測結果顯示基因拷貝數偏高，則對腫瘤易感性較高，該類人群建議每3個月進行一次復檢；檢測結果顯示基因拷貝數接近或已經高出正常範圍，則屬於腫瘤易感高危人群，該類人群建議每2周進行一次復檢。
排除患者年齡、個人作息習慣及近期炎症反應等幹擾因素，評估該基因拷貝數值是否出現異常；規定檢測範圍為正常，腫瘤易感性較低，建議每6個月進行一次復檢；檢測範圍為偏高值，腫瘤易感性較高，建議每3個月進行一次復檢；檢測範圍為高值，腫瘤易感性明顯高與健康人群，建議每半個月進行一次復檢，若復檢結果持續高值則進入腫瘤高發期，應增加醫院影像學檢測的頻率，在腫瘤早期發現並著手治療。
(1)步驟模板製備中：繪製計算曲線並得到計算公式，繪製的計算曲線中應涵蓋正常CT值檢測範圍的最低值及最高值，計算公式中y＝kx+b中的k為負值，即CT值越大，達到閾值時該基因拷貝數越小；b應大於正常CT值檢測範圍的最高值。
(2)步驟引物設計中：以腫瘤組織基因組DNA為模板，進行不同梯度稀釋，利用具有腫瘤特異性的基因及其熱點突變設計分子探針進行QPCR檢測，腫瘤易感基因包含NCBI及其他資料庫中與癌症患病相關的全部基因，腫瘤易感基因熱點突變為NCBI及其他資料庫中針對不同癌症患者進行基因組測序過程中發現的突變頻率較高的基因位點，將原基因序列稍作改變成基因突變後的序列，利用引物設計專用的軟體進行分子探針設計，分子探針設計原則為：上遊正向引物的最後一位鹼基與突變後位點鹼基一致，或下遊反向引物的反向互補序列的最後一位鹼基與突變後位點鹼基一致；擴增片段大小介於90～120bp之間。
(3)步驟中QPCR檢測：循環DNA提取試劑盒靈敏度檢測，本方法試劑盒及QIAGEN試劑盒進行ctDNA提取，得到的ctDNA進行QPCR檢測，將ctDNA稀釋至不同質量，以不同質量的ctDNA為模板，隨意設計任意一個基因引物進行QPCR檢測，本方法試劑盒最低ctDNA檢測質量低於18.8ng，CT值為26.21；QIAGEN試劑盒最低ctDNA檢測質量為39.2ng，CT值為27.01。
利用上述的腫瘤循環DNA定性和定量形成癌症早期易發風險評估數據法在癌症早期易發風險評估中的應用，其特徵在於：癌症組織基因組DNA提取，該提取利用任意組織基因組DNA提取試劑盒提取；製備多孔徑網狀的納米顆粒對血漿中腫瘤細胞釋放到血漿中的游離小片段DNA進行富集及提取，多孔徑網狀納米顆粒主要是對納米顆粒表面進行修飾，在單一納米顆粒上設計多個吸附孔並形成網面結構，在裂解液及蛋白酶K的輔助下，將血漿中的非小片段DNA進行消解，進而保留100-300bp的游離小片段，這些游離小片段可以順利通過納米顆粒上孔徑，並停留在納米顆粒內部，經過一定轉速的離心使得游離小片段DNA與納米顆粒一起富集到離心管底部；而未經消解的片段較大的游離DNA則不能通過納米顆粒上的孔徑進而排除在外，隨著離心及其他試劑的作用下被剔除掉；血漿主要從人體血液中分離得到的血漿；循環DNA為血漿中腫瘤細胞釋放到血液中的100～300bp的游離小片段DNA，然後評估該基因拷貝數值與上述確定的範圍比對確定是否出現異常。
1)向2ml EP管中加入1ml血漿樣本，再加入1ml lysis buffer，30μl蛋白酶K和60μl納米顆粒吸附磁珠。充分顛倒混勻5min。
2)將混勻樣品放入離心機，12000rpm，常溫離心3min，吸棄上清(如向獲取更多的ctDNA，則重複步驟1、2)；
3)向含有沉澱的管中加入1ml wash buffer I，用移液槍反覆吹打，將沉澱充分懸浮均勻。放入離心機，常溫離心，13000rpm，1min。吸棄上清。
4)向含有沉澱的管中加入1ml wash buffer II，用移液槍反覆吹打，將沉澱充分懸浮均勻。
5)放入離心機，常溫離心，13000rpm，1min。吸棄上清。
6)使離心管保持開蓋狀態下，於56℃水浴中加熱3min，以揮發掉未能吸盡的wash buffer II。
7)加入50～70μl EB緩衝液，充分懸浮管底的bead沉澱，蓋緊管蓋，於56℃水浴15min；
8)取出離心管於14000rpm離心3min；
9)所得上清即為DNA溶液，用移液槍將其移入新管即可；DNA置於-20℃保存備用。
優點及效果：
本發明提供一種利用腫瘤循環DNA檢測進行癌症早期風險評估的方法，本申請主要提供一種新的血漿中ctDNA的提取及檢測方法，且該檢測方法可應用於癌症早期患病風險評估，通過對腫瘤易感基因在ctDNA中的拷貝數檢測，評估某一種癌症的患病風險，當基因拷貝數明顯且持續高於正常規定範圍時，意味著已經進入腫瘤高發期，應及時去醫院進行影像學檢查，力爭做到在腫瘤發病早期發現並著手治療。該檢測方法可應用於各種腫瘤易感基因及癌症，且檢測原理清晰，操作簡單，用時短，檢測結果準確可靠，是先於影像學檢測的重要癌症患病風險評估手段。
具體優點如下：
1、發明一種新的循環DNA提取試劑盒，縮短ctDNA提取及富集時間，降低成本，為實現產業化奠定基礎。
2、發明一種新的ctDNA檢測方法，利用腫瘤易感基因熱點突變設計分子探針，以癌症組織基因組DNA為模板進行QPCR反應。以CT值為Y軸，DNA質量為X軸繪製計算曲線並得到計算公式。
3、確定正常健康人群腫瘤易感基因在血漿中的拷貝數範圍。
4、利用腫瘤易感基因熱點突變，以ctDNA為模板進行QPCR檢測，計算出腫瘤易感基因在ctDNA中的拷貝數，根據正常參考範圍評估癌症患病風險。
附圖說明：
圖1為：一例肺癌組織基因組DNA中腫瘤易感基因KRAS拷貝數趨勢圖及計算公式；
具體實施方式
一種腫瘤循環DNA定性和定量形成癌症早期易發風險評估數據法，其特徵在於：包括以下步驟：人體血漿製備及循環DNA提取、循環DNA提取試劑盒靈敏度檢測、循環DNA檢測方法建立,確定檢測方法、檢測結果計算及確定檢測範圍；
本方法主要利用循環DNA的特性，製備多孔徑網狀的納米顆粒對血漿中腫瘤細胞釋放到血漿中的游離小片段DNA進行富集及提取，以腫瘤組織基因組DNA為模板，進行不同梯度稀釋，利用具有腫瘤特異性的基因及其熱點突變設計分子探針進行QPCR檢測，以基因組DNA的質量為X軸，QPCR檢測得到的CT值為Y軸繪製計算曲線，得到計算公式。
該方法的步驟如下：
(1)確定腫瘤易感基因檢測計算方法及正常參考區間：
(a)、模板製備：
癌症組織基因組DNA樣本，利用Nanodrop可測量DNA濃度或質量的核酸分析儀進行測量，根據DNA濃度不同，將DNA分別稀釋不同梯度，以稀釋後的DNA為模板進行QPCR檢測；檢測結果中以CT值為Y軸，以模板DNA的質量為X軸繪製作圖曲線並得到y＝kx+b型計算公式及R2值；
(b)、引物設計：
在NCBI或其他資料庫及文獻中獲得腫瘤易感基因突變頻率較高的位點，將該基因的基因序列從NCBI中拷貝出來，選取其中一個熱點突變，將原基因序列稍作改變成基因突變後的序列，利用如DNAMAN、Oligo、Primer5等引物設計軟體，進行分子探針設計，分子探針設計原則為：上遊正向引物的最後一位鹼基與突變後位點鹼基一致，或下遊反向引物的反向互補序列的最後一位鹼基與突變後位點鹼基一致；擴增片段大小介於90～120bp之間；
(c)、QPCR檢測：利用任意SYBR Green QPCR檢測試劑盒說明進行操作；
(d)、正常參考區間確定：
收集正常非腫瘤患者50例，分別提取ctDNA，並利用以上方法進行QPCR檢測，檢測結果得到的CT值作為Y值帶入到模板製備獲得的計算公式y＝kx+b中，得出X值，10x即為模板上樣量2ul ctDNA中所含的該基因拷貝數，利用新公式(10x×a)/2b計算出每毫升血漿中該基因拷貝數(其中a為ctDNA總體積；b為QPCR上樣模板體積)。通過50例健康人群的檢測，得到QPCR檢測腫瘤易感基因拷貝數的最高值及最低值，在針對未知樣本進行檢測時，基因拷貝數落在最高值和最低值之間的個體，即為正常水平檢測範圍，對腫瘤的易感性相對較低。
正常參考區間確定之後進行檢測結果說明：
檢測結果共分低、偏高、高三個區間；檢測結果顯示基因拷貝數值低，則對腫瘤易感性低，該類人群每半年進行一次復檢；檢測結果顯示基因拷貝數偏高，則對腫瘤易感性較高，該類人群建議每3個月進行一次復檢；檢測結果顯示基因拷貝數接近或已經高出正常範圍，則屬於腫瘤易感高危人群，該類人群建議每2周進行一次復檢。
排除患者年齡、個人作息習慣及近期炎症反應等幹擾因素，評估該基因拷貝數值是否出現異常；規定檢測範圍為正常，腫瘤易感性較低，建議每6個月進行一次復檢；檢測範圍為偏高值，腫瘤易感性較高，建議每3個月進行一次復檢；檢測範圍為高值，腫瘤易感性明顯高與健康人群，建議每半個月進行一次復檢，若復檢結果持續高值則進入腫瘤高發期，應增加醫院影像學檢測的頻率，在腫瘤早期發現並著手治療。
(1)步驟模板製備中：繪製計算曲線並得到計算公式，繪製的計算曲線中應涵蓋正常CT值檢測範圍的最低值及最高值，計算公式中y＝kx+b中的k為負值，即CT值越大，達到閾值時該基因拷貝數越小；b應大於正常CT值檢測範圍的最高值。
(2)步驟引物設計中：以腫瘤組織基因組DNA為模板，進行不同梯度稀釋，利用具有腫瘤特異性的基因及其熱點突變設計分子探針進行QPCR檢測，腫瘤易感基因包含NCBI及其他資料庫中與癌症患病相關的全部基因，腫瘤易感基因熱點突變為NCBI及其他資料庫中針對不同癌症患者進行基因組測序過程中發現的突變頻率較高的基因位點，將原基因序列稍作改變成基因突變後的序列，利用引物設計專用的軟體進行分子探針設計，分子探針設計原則為：上遊正向引物的最後一位鹼基與突變後位點鹼基一致，或下遊反向引物的反向互補序列的最後一位鹼基與突變後位點鹼基一致；擴增片段大小介於90～120bp之間。
(3)步驟中QPCR檢測：循環DNA提取試劑盒靈敏度檢測，本方法試劑盒及QIAGEN試劑盒進行ctDNA提取，得到的ctDNA進行QPCR檢測，將ctDNA稀釋至不同質量，以不同質量的ctDNA為模板，隨意設計任意一個基因引物進行QPCR檢測，本方法試劑盒最低ctDNA檢測質量低於18.8ng，CT值為26.21；QIAGEN試劑盒最低ctDNA檢測質量為39.2ng，CT值為27.01。
利用上述的腫瘤循環DNA定性和定量形成癌症早期易發風險評估數據法在癌症早期易發風險評估中的應用，其特徵在於：癌症組織基因組DNA提取，該提取利用任意組織基因組DNA提取試劑盒提取；製備多孔徑網狀的納米顆粒對血漿中腫瘤細胞釋放到血漿中的游離小片段DNA進行富集及提取，多孔徑網狀納米顆粒主要是對納米顆粒表面進行修飾，在單一納米顆粒上設計多個吸附孔並形成網面結構，在裂解液及蛋白酶K的輔助下，將血漿中的非小片段DNA進行消解，進而保留100-300bp的游離小片段，這些游離小片段可以順利通過納米顆粒上孔徑，並停留在納米顆粒內部，經過一定轉速的離心使得游離小片段DNA與納米顆粒一起富集到離心管底部；而未經消解的片段較大的游離DNA則不能通過納米顆粒上的孔徑進而排除在外，隨著離心及其他試劑的作用下被剔除掉；血漿主要從人體血液中分離得到的血漿；循環DNA為血漿中腫瘤細胞釋放到血液中的100～300bp的游離小片段DNA，然後評估該基因拷貝數值與上述確定的範圍比對確定是否出現異常。
血漿中的游離小片段DNA進行富集及提取，該方法步驟如下：
1)向2ml EP管中加入1ml血漿樣本，再加入1ml lysis buffer，30μl蛋白酶K和60μl納米顆粒吸附磁珠。充分顛倒混勻5min。
2)將混勻樣品放入離心機，12000rpm，常溫離心3min，吸棄上清(如向獲取更多的ctDNA，則重複步驟1、2)；
3)向含有沉澱的管中加入1ml wash buffer I，用移液槍反覆吹打，將沉澱充分懸浮均勻。放入離心機，常溫離心，13000rpm，1 min。吸棄上清。
4)向含有沉澱的管中加入1ml wash buffer II，用移液槍反覆吹打，將沉澱充分懸浮均勻。
5)放入離心機，常溫離心，13000rpm，1min。吸棄上清。
6)使離心管保持開蓋狀態下，於56℃水浴中加熱3min，以揮發掉未能吸盡的wash buffer II。
7)加入50～70μl EB緩衝液，充分懸浮管底的bead沉澱，蓋緊管蓋，於56℃水浴15min；
8)取出離心管於14000rpm離心3min；
9)所得上清即為DNA溶液，用移液槍將其移入新管即可；
DNA置於-20℃保存備用。
以下具體實施方式將以腫瘤易感基因KRAS為例對本發明予以進一步的說明，但並不因此而限制本發明：
一、標準曲線及計算公式獲得：
(一)一例非擴散性小細胞肺癌組織樣本基因組DNA提取
(以生工Ezup柱式動物組織基因組DNA抽提試劑盒為例)
1)取約25mg腫瘤組織用液氮研磨成粉末加到1.5ml離心管中，加入180μl Buffer ACL，再加入20μl Proteinase K溶液，震蕩混勻。56℃水浴1h至細胞完全裂解。
2)加入200μl Buffer CL，充分顛倒混勻。
3)加入200μl的無水乙醇，充分顛倒混勻。
4)將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2min，再10,000rpm室溫離心1min，倒掉收集管中廢液。
5)將吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μl CW1Solution，10,000rpm離心30s，倒掉收集管廢液。
6)將吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μl CW2Solution，10,000rpm離心30s，倒掉收集管廢液。
7)將吸附柱重新放回收集管中，於12,000rpm室溫離心2min，離去殘留的CW2Solution。將吸附柱打開蓋子於室溫放置數分鐘，以徹底晾乾吸附材料中殘留的CW2Solution，CW2Solution的殘留會影響基因組DNA的產量和後續的實驗。
8)取出吸附柱，放入一個新的1.5ml離心管中，加入50-200μl CE Buffer靜置3min，12,000rpm室溫離心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即進行下一步實驗或-20℃保存。
(二)癌症組織基因組DNA濃度檢測(任意可定量DNA的方式均可)(以Nano100超微量核酸分析儀為例)
取樣本基因組DNA 2ul加入到測量孔，開始測量，可直接讀取DNA濃度。
(三)腫瘤易感基因KRAS熱點突變引物設計
以腫瘤易感基因KRAS為例，KRAS基因c.35G>A，Gly12Asp基因突變位點在已報導的文獻中與多種癌症的發病相關，在NCBI中找到該基因序列，附表2中為KRAS基因的原基因序列，附表3為該基因突變後的基因序列。將該基因突變後的序列拷貝到引物設計軟體中，原則為該引物的設計5』至3』端引物序列最後一位與突變後的位點鹼基一致(或反向互補序列中最後一位鹼基與突變後的鹼基一致)。擴增產物片段在80-120bp之間最佳，如附表4所示。
(四)計算公式的獲得
1.模板稀釋：根據步驟(二)中得到的DNA濃度，共取2ul，計算2ul DNA的質量。將2ul DNA樣本分別稀釋10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍及1000倍，並根據稀釋的倍數及初始DNA質量計算出稀釋後的DNA質量。
2.QPCR反應體系：
(以TAKARA公司SYBR Premix Ex Taq為例)
3.QPCR反應程序：
4.繪製計算曲線並得到計算公式
以CT值為Y軸、DNA質量為X軸在excel中繪製作圖曲線並得到計算公式，圖1即為KRAS基因檢測作圖曲線及計算公式。得到計算公式：y＝-0.3002+36.775。
二、腫瘤易感基因KRAS在血漿中拷貝數正常範圍參考區間確定
收集50例健康人群血液樣本，利用本發明中提及的血漿中循環DNA提取試劑盒進行提取ctDNA，以ctDNA為模板，腫瘤易感基因KRAS熱點突變設計的分子探針進行QPCR檢測，將得到的CT值帶入到圖1中的計算公式中，得到X值，10x即為模板上樣量2ul ctDNA中所含的該基因拷貝數，利用新公式(10x×a)/2b計算出每毫升血漿中該基因拷貝數(其中a為ctDNA總體積；b為QPCR上樣模板體積)。通過50例健康人群的檢測，得到QPCR檢測CT值的最高值35.8及最低值28.9，分別帶入到公式中計算出基因拷貝數，確定正常水平檢測範圍:104～1027copies/ml。
三、利用本檢測方法對未知樣本腫瘤易感性進行評估
規定檢測範圍低於1020copies/ml為正常，腫瘤易感性較低，建議每6個月進行一次復檢；檢測範圍介於1020～1027copies/ml之間為偏高值，腫瘤易感性較高，建議每3個月進行一次復檢；檢測範圍高於1027copies/ml則為高值，腫瘤易感性明顯高於健康人群，建議每2周進行一次復檢，若復檢結果持續高值則說明已經進入腫瘤高發期，應增加醫院影像學檢測的頻率，在腫瘤早期發現並著手治療。
結果
我們經過不斷試驗研究發現，該循環DNA檢測方法可應用於APC，C-KIT，KRAS等所有腫瘤易感基因。本方法經多次重複實驗，可以確定其結果準確可靠，特異性、重複性良好。本領域技術人員利用上述揭示的技術內容做出些許簡單修改、等同變化或修飾，均落在本發明的保護範圍內。
結果與分析
1.血漿中ctDNA提取試劑盒靈敏度檢測
利用本發明中提及的血漿中循環DNA提取試劑盒及QIAGEN公司同類產品得到的ctDNA，利用QPCR進行檢測，各項結果均顯示，本發明中的試劑盒優於QIAGEN，檢測靈敏度約為QIAGEN的2倍左右。本發明中的試劑盒在納米顆粒微球設計上具有一定的優越性，多孔徑網狀納米顆粒大大增加了對ctDNA的富集效率，使得最終ctDNA質量更純，濃度更高，該特徵是本發明優於其他產品的原因之一。
2.計算曲線及其計算公式的獲得
利用腫瘤易感基因之一的KRAS基因熱點突變設計分子探針，以肺癌組織基因組DNA為模板進行QPCR檢測。癌症組織中具有腫瘤特異性的易感基因的突變信息更為全面，且突變頻率較血液多。因此，選用癌症組織基因組DNA為模板是為了在DNA濃度很低的情況下，仍然能檢測到易感基因的拷貝數。當基因組DNA稀釋至100倍時，QPCR的CT值為35.93，繼續稀釋至200倍、500倍後，CT值差異不大，說明檔DNA稀釋至100倍時，已經達到檢測上線。此時將CT值作為Y軸，基因組DNA質量為X軸繪製曲線並得到計算公式：y＝-0.3002+36.775。利用本計算公式進行計算，CT值與腫瘤易感基因拷貝數之間成反比，即CT值越大，基因拷貝數越小，腫瘤易感性越弱，患病風險越低。利用本檢測方法及計算公式，對健康人群進行KRAS基因拷貝數檢測，在50例樣本中，CT值最高者達到35.8，處於基因拷貝數最低值，帶入到計算公式中，得出拷貝數約為104copies/ml；CT值最低值為28.9，處於正常範圍內基因拷貝數最高值，帶入到公式中，得出拷貝數約為1027copies/ml。以此確定在對KRAS基因拷貝數進行檢測時，正常參考區間為104～1027copies/ml。規定檢測範圍低於1020copies/ml為正常，腫瘤易感性較低，建議每6個月進行一次復檢；檢測範圍介於1020～1027copies/ml 之間為偏高值，腫瘤易感性較高，建議每3個月進行一次復檢；檢測範圍高於1027copies/ml則為高值，腫瘤易感性明顯高於健康人群，建議每2周進行一次復檢，若復檢結果持續高值則說明已經進入腫瘤高發期，應增加醫院影像學檢測的頻率，在腫瘤早期發現並著手治療。
表1為本發明ctDNA提取試劑盒與QIAGEN試劑盒靈敏度對比結果(美加為發明)；
表2為KRAS基因原基因序列
ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAGGAGTACAGTGCAATGAGGGACCAGTACATGAGGACTGGGGAGGGCTTTCTTTGTGTATTTGCCATAAATAATACTAAATCATTTGAAGATATTCACCATTATAGAGAACAAATTAAAAGAGTTAAGGACTCTGAAGATGTACCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAATGTGAT TTGCCTTCTAGAACAGTAGACACAAAACAGGCTCAGGACTTAGCAAGAAGTTATGGAATTCCTTTTATTGAAACATCAGCAAAGACAAGACAGGGTGTTGATGATGCCTTCTATACATTAGTTCGAGAAATTCGAAAACATAAAGAAAAGATGAGCAAAGATGGTAAAAAGAAGAAAAAGAAGTCAAAGACAAAGTGTGTAATTATGTAA
表3為KRAS基因35位點鹼基G突變為A後的基因序列
ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAGGAGTACAGTGCAATGAGGGACCAGTACATGAGGACTGGGGAGGGCTTTCTTTGTGTATTTGCCATAAATAATACTAAATCATTTGAAGATATTCACCATTATAGAGAACAAATTAAAAGAGTTAAGGACTCTGAAGATGTACCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAATGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGACACAAAACAGGCTCAGGACTTAGCAAGAAGTTATGGAATTCCTTTTATTGAAACATCAGCAAAGACAAGACAGGGTGTTGATGATGCCTTCTATACATTAGTTCGAGAAATTCGAAAACATAAAGAAAAGATGAGCAAAGATGGTAAAAAGAAGAAAAAGAAGTCAAAGACAAAGTGTGTAATTATGTAA
表4為根據突變後KRAS基因序列設計的引物序列
Forward primer：CCTTGGGTTTCAAGTTATATG
Reverse primer：CCCTGACATACTCCCAAGGA