昆蟲抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白及其在植物抗病中的應用的製作方法

2023-10-22 20:20:07 2

專利名稱：：昆蟲抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白及其在植物抗病中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及昆蟲抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白及其在植物抗病中的應用。
背景技術：
：植物在完成其生活史的過程中，隨時面臨著環境病原微生物的威脅。在全球範圍內，由細菌、真菌和病毒引起的植物病害所造成農作物產量的損失每年高達300-500億美元。化學藥劑防治仍是控制農作物病害的一項重要策略，但這一策略給人類健康和環境保護帶來明顯的威脅。傳統育種方法對抗病品種選育做出了最為重要的貢獻，但由於植物本身抗病基因有限和單個抗病基因所介導的抗病性具有高度專化性，抗病譜較窄，只能抗有限的小種，以致病原菌群體發生變化時，就面臨抗性喪失的風險，從而無法滿足農作物病害防治的需要。如何將當今各種生物基因組的豐富資源和高效的基因操作技術，系統地應用於農作物抗性的改良，是當今轉基因工程的一個熱點和焦點問題。更為重要的是，植物基因工程可以在不改變植物已有優異基因型的情況下引入抗病性表型，為獲得新的抗病品種提供了更為強大的手段，成為農業可持續性發展的重要策略之一。植物本身可產生多種抗菌肽，但研究發現植物來源的抗菌肽基因的表達只對病原菌產生中等程度抗性，這是由於經過長期的病原與寄主的相互作用和進化，植物病原菌已經對這些植物抗菌肽產生了耐受性。因此，非植物來源的抗菌肽基因在植物抗病領域的應用越來越受到重視。昆蟲抗菌肽對細菌、真菌、病毒等表現廣譜抗性，抗菌性強、抗菌效果快。據Shai-Matsuzaki-Huanf模型，多數抗菌肽的作用機制都是基於多肽與磷脂相互作用引起細胞膜破裂而導致細胞損傷。由於抗菌肽作用於磷脂類而非酶類，因此，很少有病原對抗菌肽產生抗性。這些特點使得抗菌肽在培育抗性作物方面具有誘人的潛力。目前已發現昆蟲抗菌肽可以抑制許多農業生產中非常重要的植物病原真菌和細菌，如白粉病菌、稻瘟病菌、灰葡萄孢等真菌和丁香假單孢菌、胡蘿蔔軟腐歐氏桿菌、水稻白葉枯病菌等細菌。通過轉基因技術將抗菌肽導入植物中表達，可使作物對植物病原細菌和真菌產生有效抗性。在我國，已有將抗菌肽基因在馬鈴薯、菸草、水稻、辣椒、番茄等植物中成功表達並獲得抗病株系的報導。然而，目前應用於轉基因植物中的昆蟲抗菌肽主要是天蠶素基因，而其他絕大多數抗菌肽在轉基因植物中的抗病功能還沒有測試。Thanatin是目前發現的最小的抗菌肽，僅含有21個胺基酸殘基，它來自於半翅目昆蟲刺肩蝽(Podisusmaculiventris)。Hianatin具有廣譜的抗菌活性，對真菌、G+和G-均表現出抗菌活性(FehlbaumPP,Buletetal.(1994).「Insectimmunity.S印ticinjuryofDrosophilainducesthesynthesisofapotentantifungalpeptidewithsequencehomologytoplantantifungalpeptides."JBiolChem269(52)33159-63.)。其胺基酸序列為GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM，前三個胺基酸對抗菌活性影響不大，而後六個胺基酸(C端疏水區)形成一個環，對抗菌活性影響較大；對不同的菌具有濃度效應。可能作用於細菌的脂多糖，形成沉澱。將T換成S或去除，活性增強(Wu，G.Q.，J.X.Ding,etal.,2009)0沒有溶血性，對人和動物沒有毒性。目前，對於Thanatin在植物病害控制方面研究的較少。擬南芥(Arabidopsisthaliana)屬十字花科，基因組很小，但其2.5萬基因在功能類別上卻和其他開花植物大致相似；擬南芥生命周期很短，從播種到種子收穫僅需要68周；擬南芥個體較小，適合於實驗室內種植；這些特點使得擬南芥成為一種理想的植物遺傳學和分子生物學研究材料。此外，擬南芥在接種條件下可以被多種不同的植物病原細菌、真菌及病毒等侵染，這非常有利於研究植物與病原菌互作。小麥是重要的糧食作物，對其進行基因工程操作以提高其抗病能力將對小麥的抗病育種起到較大的推動作用。
發明內容本發明的一個目的是提供一種昆蟲抗菌肽thanatin(S)融合蛋白。本發明所提供的融合蛋白，名稱為ChtSP-Thanatin(S)，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；幻將序列表中序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由1)衍生的蛋白質。本發明的另一個目的是提供所述融合蛋白的編碼基因。本發明所提供的所述融合蛋白的編碼基因(命名為ChtSP-Thanatin(S)),為如下1)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在嚴格條件下與1)的基因雜交且編碼所述融合蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述融合蛋白的基因。上述嚴格條件可為用6XSSC,0.5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然後用2XSSC,0.1%SDS和1XSSC,0.1%SDS各洗膜一次。序列表中的序列1由123個鹼基組成，自5』端第1位_60位為水稻幾丁質酶Cht-I的信號肽的編碼序列，第61位-123位為昆蟲抗菌肽thanatin(S)的編碼序列。含有所述編碼基因的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌也屬於本發明的保護範圍。所述重組表達載體為在pGWBll載體的attR位點插入了所述編碼基因得到的重組表達載體。所述重組表達載體為在pAHC25載體的SmaI和McI酶切位點間插入了所述編碼基因得到的重組表達載體。本發明的又一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。本發明所提供的培育轉基因植物的方法，是將所述編碼基因轉入目的植物中，得到與所述目的植物相比，抗病菌能力提高的轉基因植物。所述編碼基因是通過權所述重組表達載體導入目的植物中的。所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥；所述單子葉植物為小麥。fff^MM^lM^^Y^f^M(Golovinomycescichoracearum)>^(Botrytiscinerea)、丁香假單胞桿菌番爺致病變種(Pseudomonassyrmgaepv.tomato)禾口/或小麥白粉菌(Erysiphegrammis)。將水稻幾丁質酶Cht-I的信號肽連接到thanatin(S)的N端，並對這一融合結構進行密碼子優化，使其有利於在植物中高表達，隨後，將其構建到(Gateway載體系列的pGWBll(C端連FLAG標籤)以及小麥轉化載體pAHC25中。抗病性檢測的結果顯示，ChtSP-Thanatin(S)轉基因植物對白粉病菌(Golovinomycescichoracearum禾口Erysiphegrammis)、灰黴菌(Botrytiscinerea)及丁香假單胞菌(Pseudomonassyrmgae)皆具有明顯的抗性。證明thanatin(S)在控制植物真菌和細菌病害方面效果顯著，具有一定應用前景。本發明採用轉基因技術將序列表中序列1所示的融合基因轉入植物提高植物的抗病性，這是傳統育種技術所無法做到的。本發明利用植物源外的基因來提高植物的抗病性，為植物病害控制提供了一條新途徑，若將其融入到作物育種程序將有廣闊的前景。圖1為ChtSP-Thanatin(S)融合基因在轉基因擬南芥中的表達分析結果；其中，圖1中A為重組載體pGWBll=ChtSP-Thanatin(S)的部分結構示意圖；圖1中B為對轉基因擬南芥植株Tl的15個株系用PCR檢測Thanatin(S)基因整合到基因組上的結果；圖1中C為對轉基因擬南芥植株T2的7個株系用real-timePCR檢測Hianatin(S)基因轉錄水平的結果；圖1中D為選擇轉錄水平較高的3個株系用westernblot技術檢測ChtSP-Thanatin(S)-FLAG的蛋白水平表達結果。圖2為ChtSP-Thanatin(S)轉基因擬南芥對白粉菌抗性的檢測結果；其中，圖2中A為接種後12天轉基因擬南芥lineKline6和line7和野生型Col-O感染白粉菌的表型結果；圖2中B為接種後6天擬南芥葉片上的原始單孢子；圖2中C為擬南芥葉片上單孢所產生的孢子數統計結果。圖3為ChtSP-Thanatin(S)轉基因擬南芥對灰黴菌的抗性檢測結果；其中，圖3中A為轉基因擬南芥lineKline6和line7以及野生型對照Col-O的表型，圖3中B為轉基因擬南芥lineKline6和line7以及野生型對照Col-O的病斑面積的統計分析結果。圖4ChtSP-Thanatin(S)轉基因擬南芥對丁香假單胞桿菌番茄致病變種DC3000的抗性檢測結果；其中，圖4中A為轉基因擬南芥line1、line6和line7以及野生型對照Col-O的葉片接種後2天的表型，圖4中B為轉基因擬南芥lineKline6和line7以及野生型對照Col-O葉片接種後2天化學發光光子數的測定結果。圖5為重組載體ρAHC25=ChtSP-Thanatin(S)-FLAG的部分結構示意圖。圖6轉ChtSP-Thanatin(S)-FLAG融合基因的小麥接種小麥白粉菌(Erysiphegrammis)7天後的抗病表型。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例一、轉基因擬南芥的獲得及其檢測-,ChtSP-Thanatin(S)融合基因在轉基因擬南芥中的表達分析1、遺傳轉化載體的構建採用的農桿菌轉化載體為gateway系列中的pGWBll載體(公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻是=Nakagawa,T.，Kurose,T.，Hino,T.，Tanaka,K.，Kawamukai,M.，Niwa,Y.，Toyooka,K.，Matsuoka,K.，Jinbo,T.andKimura，Τ.(2007)Developmentofseriesofgatewaybinaryvectors,pGWBs,forrealizingefficientconstructionoffusiongenesforplanttransformation.J.Biosci.Bioeng.104，34-41.)，該載體攜帶能夠組成型表達的花椰菜花葉病毒啟動子(CaM35Spromoter)，能夠組成型表達目標基因。轉化所用農桿菌為GV3101菌株(公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻是VanLarebekeN,EnglerG,HolstersΜ,VandenElsackerS,ZaenenI,SchilperoortRA,SchellJ(1974)LargeplasmidinAgrobacteriumtumefaciensessentialforcrowngall-inducingability.Nature252:169-170·)。先>|各寸密碼子在線軟體http//www,icat.de/禾口http//miracle,igib.res,in/dynavac/優化過的ChtSP-Thanatin(基因融合序列委託genescript公司合成，此序列被連接到PUC57載體(購自南京金斯瑞生物科技有限公司，產品目錄號為SD1176)上。以pUC57=ChtSP-Thanatin(S)為模板，用以下引物經過PCR擴增，上遊引物:5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTGCTCTAGAGCCACCATGAGAGCGCTC-3，和下遊引物5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCGGCTGTACACATTCTTTGACATTTTC-3，，擴增產物在華大基因公司進行測序。測序結果表明，獲得的融合基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，編碼具有序列表中序列2所示的胺基酸殘基序列的融合蛋白，序列表中序列2由41個胺基酸殘基組成。序列表中序列1自5』端第1位-60位為水稻幾丁質酶Cht-I的信號肽的編碼序列，第61位-123位為昆蟲抗菌肽thanatin(S)的編碼序列。將該融合基因命名為ChtSP-Thanatin(S)，將其編碼的融合蛋白命名為ChtSP-Thanatin(S)。將測序正確的PCR產物與pD0NR207載體(購自Invitrogen，產品目錄號為I22I3Ol3)以及GatewayBPClonase酶混合物(購自Invitrogen，產品目錄號為11789-021)於25°C共同孵育，得到重組載體pD0NR207:ChtSP_Thanatin(S)。將該重組載體轉化感受態大腸桿菌DHlOB(購自北京百泰克生物技術有限公司，產品目錄號為DP77)，卡納黴素平板篩選獲得陽性克隆，擴繁，提取質粒。再將PD0NR207=ChtSP-Thanatin(S)、pGWB11和GatewayLRClonase酶混合物(購自Invitrogen，產品目錄號為11791-043)於25°C共同孵育，獲得重組表達載體pGWBll=ChtSP-Thanatin(S)0將該重組表達載體轉化大腸桿菌DHlOB(購自北京百泰克生物技術有限公司，產品目錄號為DP77)，潮黴素平板篩選陽性克隆，擴繁，提取質粒並送華大基因公司測序。測序結果表明，在PGWBll載體的attR位點插入了序列表中序列1所示的編碼基因，證明重組質粒構建正確(圖1中A)。將pGWBllChtSP-Thanatin(S)轉化農桿菌GV3101感受態，潮黴素平板篩選並通過菌落PCR反應鑑定(引物同上文所述)陽性克隆，擴繁，用於轉化野生型擬南芥Col-0。2、遺傳轉化和Tl代轉化植株的分析採用花序浸泡法將GV3101攜帶的pGWBll=ChtSP-Thanatin(S)轉化擬南芥生態型6Col-O(購自美國俄亥俄州立大學的生物資源中心(ABRC)，產品目錄號為CS39005)。花序浸泡法具體步驟為將花序在0D600=0.60.8的農桿菌懸液(0.5%蔗糖，0.020.05%SliwetL-77)中浸泡30秒左右，轉化後的植株用黑色塑膠袋避光保溼放置16-24小時，然後在9小時光照/15小時黑暗、溫度為22°C的植物生長間進行培養，直到種子成熟。收穫的種子播種於含潮黴素的平板上，篩選獲得陽性轉化株。同時，用上述方法得到轉空載體pGWB11對照擬南芥植株。設未轉化的擬南芥Col-O為野生型對照擬南芥植株。對獲得的pGWBll=ChtSP-Thanatin(S)轉化獲得的擬南芥Tl代中的15個株系(Linel-15)的基因組DNA進行Thanatin(S)的PCR檢測。PCR檢測所用的引物序列為:5，-ATCTAAAAAACCTGTTC-3『和5，-CATTCTTTGACATTTTCCAG-3，。結果被檢測的pGWBll=ChtSP-Thanatin(S)獨立轉化植株中除了株系5(L5)夕卜，其餘14個株系均能擴增出目的條帶；野生型對照擬南芥Col-O植株未擴增出目的條帶(圖1中B)。為了解Hianatin(S)在轉基因擬南芥中是否轉錄表達，對PGWBllChtSP-Thanatin(S)獨立轉化植株T2中的7株進行了Real-timePCR檢測，所用的引物序列如下5，-ATCTAAAAAACCTGTTC-3『和5，-CATTCTTTGACATTTTCCAG-3，。結果表明目的基因在轉基因植物L1-L8中均能轉錄表達，而在野生型對照擬南芥植株Col-O中不能轉錄表達(圖1中C)。為了進一步研究ChtSP-Thanatin(S)融合蛋白在轉基因擬南芥中的翻譯表達情況，對轉錄水平較高的株系I(Ll)、株系6(L6)和株系7(L7)進行了westernblot檢測，抗體為鼠抗FLAG抗體(購自sigma公司，F1804)。結果顯示，ChtSP-Hianatin(S)融合蛋白在轉基因擬南芥L1、L6和L7中均能翻譯表達，而在野生型對照擬南芥植株Col-O中不能翻譯表達(圖1中D)。二、ChtSP-Thanatin(S)轉基因擬南芥對白粉菌的抗性分析對ChtSP-Thanatin⑶融合蛋白在轉基因擬南芥中翻譯表達較高的株系Kline1))、株系6(line6)和株系7(line7)接種擬南芥白粉菌(Golovinomycescichoracearum)(公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得，記載過該材料的非專禾丨J文獻是YipingWang,MarcΤ.Nishimura,TingZhao，DingzhongTang.2011.ATG2,anautophagy-relatedprotein,negativelyaffectspowderymildewresistanceandmildew-inducedcelldeathinArabidopsis.ThePlantJournal，68，10:74-87)。接禾中方法為用吹風機將白粉菌孢子吹進高1米左右的密閉容器內，靜置1小時以上，孢子可以均勻散落於密閉容器內的擬南芥葉片上。接種後6天取葉片用trypanblue染色(圖2中B,紅色箭頭所指的是原始單孢子)，在顯微鏡下觀察單孢所產生的孢子數，計數並進行統計分析，結果見圖2中C，結果表明ChtSP-Hianatin(S)轉基因擬南芥lineKline6和line7與野生型Col-O相比對白粉菌具有顯著的抗性。接種後12天，拍攝COl-0、lineKline6和line7感染白粉菌的表型照片，見圖2中A，從圖中可見，ChtSP-Thanatin(S)轉基因擬南芥lineUline6和line7較野生型對照Col-O具有明顯的抗性。轉空載體對照植株與野生型對照植株的表型一致。三、ChtSP-Thanatin(S)轉基因擬南芥對灰黴菌的抗性分析對ChtSP-Thanatin⑶融合蛋白在轉基因擬南芥中翻譯表達較高的株系1(Iinel)、株系6(line6)和株系7(line7)接種灰黴菌(Botrytiscinerea)(公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻是=YipingWang，MarcΤ.Nishimura,TingZhao,DingzhongTang.2011.ATG2,anautophagy-relatedprotein,negaivelyaffectspowderymildewresistanceandmildew-inducedcelldeathinArabidopsis.ThePlantJournal,68,(10):74-87)。接種方法為取葉片平鋪於0.8%瓊脂平板上，將濃度為5X105SpOreS/ml的灰黴菌孢子懸浮液10μL滴至葉片中央。22°C保溼3天後觀察表型，拍照並測量病斑直徑和進行統計分析。結果見圖3，圖3中A為轉基因擬南芥lineKline6和line7以及野生型對照Col-O的葉片病斑表型，圖3中B為轉基因擬南芥line1、line6和line7以及野生型對照Col-O的病斑直徑的統計分析結果。結果表明Thanatin(S)轉基因擬南芥的三個株系line1、line6和line7較野生型對照Col-O對灰黴菌具有顯著的抗性。轉空載體對照植株與野生型對照植株的表型一致。四、ChtSP-Thanatin(S)轉基因擬南芥對丁香假單胞桿菌番茄致病變種的抗性分析所用菌株為帶有化學發光報告基因的丁香假單胞桿菌番茄致病變種菌株DC3000(luxCDABE-taggedPseudomonassyrmgaepv.tomatoDC3000)(公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻是JimFan,CaseyCrooks,ChrisLamb.2008.High—throughputquantitativeluminescenceassayofthegrowthinplantaofPseudomonassyrmgaechromosomalIytaggedwithPhotorhabdusluminescensluxCDABE.ThePlantJournal,53,(2):393-399,January2008)。用Iml無針頭注射器將濃度為0D600=0.002的菌懸液注射接種Thanatin(轉基因擬南芥株系和野生型的葉片，2天後取葉片，拍照並測定菌量。菌量的測定方法如下用打孔器取3枚面積為0.6cm2的葉片置於1.5ml離心管，加入200ulIOmMMgCl2溶液，將葉片研磨成均勻的懸液，直接放入FB12luminometer(BertholdDetectionSystems,http//www.berthold~ds.com/)測定光子數。結果如圖4所示，圖4中A為轉基因擬南芥line1、line6和line7以及野生型對照Col-O的葉片接種後2天的表型，圖4中B為轉基因擬南芥line1、line6和line7以及野生型對照Col-O葉片接種後2天化學發光光子數的測定(請說明圖4中B縱坐標所示的螢光量的計算公式)，結果顯示，ChtSP-Thanatin(S)轉基因擬南芥的三個株系line1、line6和line7比野生型對照Col-O對丁香假單胞桿菌番茄致病變種具有明顯的抗性。轉空載體對照植株與野生型對照植株的表型一致。實施例2、Thanatin(S)轉基因小麥的獲得及其對小麥白粉菌的抗性分析一、遺傳轉化載體的構建轉化小麥採用的載體為pAHC25(公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻是ChristensenAH,QuailPH.1996.Ubiquitinepromoter-basedvectorsforhighlevelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch5:213-218.)。首先採用限制性內切酶SmaI和Mcl雙酶切，將pAHC25中的GUS序列去除，回收載體大片段；以pGWBll=ChtSP-Thanatin(S)為模板，PCR擴增為ChtSP-Thanatin(-FLAG融合基因序列，擴增產物也用SmaI和SacI雙酶切，PCR擴增所用引物為5，-TATCCCCCGGGAACAAGTTTG-3，和5』-TACGAGCTCCTAAGCCTTGTC-3』。然後將酶切後的PCR產物與回收的載體大片段用T4連接酶連結，即獲得含有目的基因的重組轉化載體PAHC25=ChtSP-Thanatin(S)-FLAG。將該重組載體轉化大腸桿菌DHlOB(購自北京百泰克生物技術有限公司，產品目錄號為DP77)，氨苄平板篩選陽性克隆，擴繁，提取質粒並送華大基因公司測序。測序結果表明，在PAHC25載體的SmaI和McI酶切位點間插入了序列正確的序列表中序列1所示的編碼基因(圖5中A)。將載體pAHC25ChtSP-Thanatin(S)-FLAG用基因槍法轉化小麥品種科農199(KN199)(國審麥2006017，良種繁育階段)(公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻是李俊明，張相岐，張愛民，王志國，安調過，紀軍，王靜，2007，高產廣適小麥新品種一科農199.麥類作物學報，27(:368)，最終獲得14個轉基因株系，PCR方法檢測證明有8個株係為陽性(圖5中B)，所用的引物序列為5，-ATCTAAAAAACCTGTTC-3『和5，-CATTCTTTGACATTTTCCAG-3，。同時，用上述方法得到轉空載體pAHC25對照小麥植株。設未轉化的小麥科農199為野生型對照小麥植株。二、ChtSP-Thanatin(S)轉基因小麥TO對小麥白粉菌的抗性分析將TO代的5個株系(L5、L8、L10、LlUL13)的轉基因小麥苗和對照KN199採用離體葉段法接種小麥白粉菌(Erysiphegrammis)(公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻是萬平，令利軍，周文娟，張文俊，凌宏清，朱立煌，張相岐。2004.小麥鋅指蛋白基因的克隆、序列與表達分析。遺傳學報，Vol31，(9)895-900)。首先製備含50mg/L苯並咪唑的0.5%瓊脂平板切除中部3cm寬的部分，剪取km左右的待接種葉片，兩端插入瓊脂切面，將白粉菌孢子均勻抖落至葉片上，於17°C、85%相對溼度、20001χ光照強度培養，7天後，觀察抗病表型並拍照。有5個株系(L5、L8、L10、L11、L13)的葉片，對小麥白粉菌的抗性顯著高於對照KN199，結果如圖6所示。轉空載體對照植株與對照KN199植株的表型一致。權利要求1.一種融合蛋白，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由1)衍生的蛋白質。2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特徵在於所述編碼基因為如下1)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在嚴格條件下與1)的基因雜交且編碼權利要求1所述融合蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權利要求1所述融合蛋白的基因。4.含有權利要求2或3所述編碼基因的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌。5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於所述重組表達載體為在pGWBll載體的attR位點插入了權利要求2或3所述編碼基因得到的重組表達載體。6.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於所述重組表達載體為在PAHC25載體的SmaI和Mcl酶切位點間插入了權利要求2或3所述編碼基因得到的重組表達載體。7.一種培育轉基因植物的方法，是將權利要求2或3所述的編碼基因轉入目的植物中，得到與所述目的植物相比，抗病菌能力提高的轉基因植物。8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於權利要求2或3所述的編碼基因是通過權利要求4-6中任一所述的重組表達載體導入目的植物中的。9.根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥；所述單子葉植物為小麥。10.根據權利要求7-9中任一所述的方法，其特徵在於所述病菌為擬南芥白粉菌(Golovinomycescichoracearum)、灰黴菌(Botrytiscinerea)、丁香假單胞桿菌番前致病變禾中(Pseudomonassyrmgaepv.tomato)禾口/或小麥白粉菌(Erysiphegraminis)。全文摘要本發明公開了昆蟲抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白及其在植物抗病中的應用。本發明所提供的昆蟲抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由1)衍生的蛋白質。抗病性檢測的結果顯示，ChtSP-Thanatin(S)轉基因植物對白粉病菌(Golovinomycescichoracearum和Erysiphegraminis)、灰黴菌(Botrytiscinerea)及丁香假單胞桿菌番茄致病變種(Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000)皆具有明顯的抗性。證明Thanatin(S)在控制植物真菌和細菌病害方面效果顯著，具有一定應用前景。文檔編號C12N15/62GK102372781SQ201110344260公開日2012年3月14日申請日期2011年11月3日優先權日2011年11月3日發明者吳廷全,唐定中,姚愛玉,張永清,鄒聲浩,陳偉達,陳永芳申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所