用作拮抗劑的抗促甲狀腺激素受體的人單克隆抗體的製作方法

2023-10-23 10:41:32

專利名稱：：用作拮抗劑的抗促甲狀腺激素受體的人單克隆抗體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及與促曱W^L素(TSH)受體(TSHR)^的脅，並且M而言，但非氺他l^涉;SJt樣的抗體，即這種^t可與TSHR結^f且可通過TSH-刺激性^#^TSHR-刺^bht^阻斷TS皿的激活。
背景技術：
：促曱狀腺激素(Thyrotropin)或促甲狀腺激素(thyroidsti咖latinghormone)(TSH)是一種通過TS服調節曱狀腺功能的垂體激素(Szkudlinski匿，FremontV，RoninC，WeintraubBD2002Thyroid—stimulatinghormoneandTSHRstructure—functionrelationships.PhysiologicalReviews82:473-502)。TSHR是一種G蛋白>(!^1受體，由3個結構^^試富含亮氨酸的結構域(LRD)、切割結構域(CD)和跨膜結構域(TMD)(NunezMiguelR，SandersJ，JeffreysJ，D印raetereH，EvansMRichardsT，BlundellH，ReesSmithB,FurmaniakJ2004Analysisofthethyrotropinreceptor—thyrotropininteractionbycomparativemodelling.Thyroid14:991—1011)。TSH結合到TS服上引發受體信號傳導，其皿甲^^:素甲^^素(T4)和^甲^^氨酸(T3)的形成與釋改。有一種反^^制涉及循環中T4和T3的水平，這種機制控制雄下垂^#^TSH(和下丘腦分泌的促曱^^素#^1素)，TSH又控制曱^W:活和血清中曱^^L素的水平。本領域的很多資^H兌明，某些自身免疫性甲狀腺病(AITD)的患者具有與TS皿反應的自身抗體(ReesSmithB，McLachlanSN^FurmaniakJ1988Autoantibodiestothethyrotropinreceptor.EndocrineReviews9:106-121)。在大多數情況下，這些自身^#^TSHR結^f模仿TSH的作用，從而刺激曱狀腺產生高水平的T4和T3。這些自身抗^^稱為曱:)W'J激性自身抗MTSHR自身M(TRAb)，具有刺激性活'賦TSH激動劑活性。上文提及的曱現曱狀腺活動itJL或曱狀腺毒症(血清中曱狀^素過量)的患者中;l^效應的。這種病症被稱為格雷^JJf病(Graves'disease)。人們認為，在一些患者中，具有刺激活性的TRAb在BI^組織中與TSHR相互作用，並且導致了格雷A^f病的眼部徵狀。作為強大的曱;^刺激因子的人單克隆M(hMAbTS服l)i^詳細記載於專利申請W02004/050708A2中。與在一些患AITD的患者中不同，自身抗體可結合TSHR、阻止TSH結合於所述受體，^^殳有刺激TSHR的能力。這些類型的自身:^^皮稱為具有阻斷活性或TSH拮抗活性的TRAb，並JL^其血清中有阻斷性TRAb的患者可能會出現曱狀腺活性不足的症狀(曱狀腺功能減退症)(ReesSmithB，McLachlanSM，FurmaniakJ1988Autoantibodiestothethyrotropinreceptor.EndocrineReviews9:106-12D。具體地，如^/j^在於'I^女性的血清中，具有阻斷活性的TRAb可穿過胎盤並且可以阻斷胎兒的甲批腺TSHR,引起新生兒甲狀腺功能減退^^嚴重的發育後果。再者，具有阻斷活性的TRAb可出現於受感染母親的母乳中，這可育化嬰兒中進一步導致臨床的曱^^功能減退症。迄今為止，還尚^H得具有TSH拮抗劑活性的抗TSHR的人單克隆自身抗體。因此，針對這種類型的自身M怎樣和TS服相互作用的詳^^9f究，以及針對它們和TSHR的相互A^4J^促性^:素是一種在^it程中產生的具有溫和曱W^^^的激素。對具有刺激活性或阻斷活性的TRAb的'I^t的^^iE^下述研究中;^toJ"重治療。在專利申請W02004/050708A2中描述的發明提供了關於具有強WJ激活性的人單克隆自身抗體的'M及其與TSHR的相互作用的詳情。再者，專利申請W02006/016121A公開了一種包括至少一個點突變的突變的TSHR製品，它可用於在來自待篩查的患者的體液樣品中，對患者血清刺激性TSHR自身抗體、患者血清阻斷性TSHR自身脅和TSH進行差異篩查和鑑定。專利申請WO2004/050708A2還描述了具有TSHR阻斷活性的小鼠單克隆抗體(9D33)。9D33以高親和力(2x10"L/mol)與TSHR結合，並JU1—種TSH、hMAbTSHR1(M22)和具有刺激活性或阻斷活性的患者血清TRAb的有效拮抗劑(專利申請W02004/050708A2和SandersJ，AllenF，JeffreysJ，BoltonJ，RichardsT，DepraetereH，NakatakeN，EvansMKiddieA，PremawardhanaLD，ChirgadzeDY，MiguelRN，BlundellTL，FurmaniakJ，ReesSmithB2005Characteristicsofamonoclonalantibodytothethyrotropinreceptorthatactsasapowerfulthyroid-stimulatingautoantibodyantagonist.Thyroid15:672-682)。雖然小鼠單克隆M9D33至少可顯示具有阻斷活性的患者血清TRAb的一些特徵，但它^1一種通過以TS服免疫實M物產生的小鼠抗體，並因此不能真正^(J(^體內對TSHR自身免C^答過程中產生的TS服的自身抗體。作為一種小鼠單克隆跳，為了應用於>^體內，需絲9D33人源化。考慮到AJH匕過程中涉及的^^複雜,來看，這可能是不利的。本發明起因於抗TSHR的人單克隆自身M(5C9)的產生和'J^，該:fe^在患者血清中是一種TSH和刺激性TRAb的有效拮抗劑。已^c具有甲^J!^功能減退症和高水平TSHR自身私昧的患者的外周淋巴細胞分離到了5C9。通過以下方式將該淋巴細l&7lc生化以愛潑斯坦巴爾病毒(EBV)感染並將陽性克隆與小鼠/人細胞系融合，以形成穩定的克隆。從克隆培養物的上清液純化IgG，評估5C9IgG結合於TSHR並影響TS服活性的能力。^^地，研究了5C9抑制TSH與TSHR結合的能力，及抑制TSH的環AMP刺激活性的能力。再者，還評估了5C9抑制刺激性或阻斷性的患者血清TRAb與TS服的結合的能力，及抑制它們的生物活性的能力。另夕卜，研究了5C9^TSHRM、TSH和相關4^^的測定中的用途。對5C9的重鏈(HC)和雜(LC)的可變區(V區)基因進fr測序，並指定互補決定區(CDR)。
發明內容才艮據本發明的第一方面，提供了一種分離的TSHR的人抗體，該抗體是一種TSH的拮抗劑。根據本發明的第二方面，提供了一種分離的TS服的人源^^,該抗體是一種TSH的拮抗劑。才娥本發明第一方面或第二方面的M為"一種^^本發明的M"。才娥本發明的糾可為一種曱;)WJ激性脅的拮抗劑。才娥本發明的抗/^可具有患者血清TSHR自身:fe^---種TSH拮抗劑一一##本發明的M可具有患者血清TSHR自身M——甲^^激性^的拮抗劑一一的拮抗劑特徵。才娥本發明的抗/^可以是一種TSH、M22或者對TSHR有刺激活性的^#^有阻斷活性的絲與TSHR或其一^M合的抑制劑oTSHR部分可包括LRD或其相當大的部分。^to地，一種可阻斷這種結合的抗體。才娥本發明的M可為單克隆M或重組^^，或者包含其片段或由其片^iaj成，是一種TSH的拮抗劑。,^^發明的抗^^可包^1樣的Vh區，即該VH區包^-種或多種選自圖2中顯示的CDR1、CDR2或CDR3的CDR，或者一種或多種^i^這些CDR同源的JU^列。jtb^卜或另夕卜，才娥4^發明的^^可包^it樣的Vl區，即該VL區包^^種或多種選自圖3中顯示的CDR1、CDR2和CDR3的CDR，或者一種或多種J^這些CDR同源的^J^序列。才Nt本發明的M與人4^:TSHR可具有約10lflL/mol的結合親和力。地，根據本發明的M與人全長TSHR可具有約109L/mol的結合親和力。和產生的免k學機制。另外，'本i明可幫助本領域技^A員理)^"有曱^^'J激活性的TSHR自身^^具有阻斷活性的TSHR自身旨之間的分子差異。另外，本發明的治療處理方法和藥物組^^提供了新的曱W^目關病症療法。一種艦的本發明脅為5C9。已意外iik^現5C9可抑制促曱狀l^t素受體的糹誠型活性，也^iX^^^在促甲^^:素或M22的情況下，在測驗系統中產生環AMP。這可f沐別有利於對曱g中剩餘的或轉移的曱;^l^癌細胞的治療，尤其是在PJaL或^i^再生長方面，狄因為促曱^^:素受體的組成型活性可狄這些細胞更'^4^生長。本文^Jfl的術語"脅"及同系術i^^如"多種脅"才娥上下文包括基於免疫球蛋白的結飾分，例如單克紗多克隆脅、單鏈^^多特異性脅，並iLii包括本領域技^A員可用於^a^it種基於免疫^^蛋白的結^P分的結合部分，例如結構域糾、雙鏈糾、IgGACH2、F(ab')2、Fab、scFv、VL、VH、dsFv、微型抗體、三鏈抗體、四鏈脅、(scFv)2、scFv-Fc和F(ab03(HolligerP，ProsperoT，WinterG1993"Diabodies:smallbivalentandbispecificantibodyfragments"ProcNatlAcadSciUSA90:6444-6448.),(CarterPJ2006"Potentantibodytherapeuticsbydesign"NatRevImmunol6:343-357)。術語"TS服，，是指具有顯示於圖4中的^J^序列的^A促曱^^L素受體，或者它的與促甲^^:素受體高度同源的變體或片段。^ffei^也，這種變體和片賴:與顯示於圖4中的^J^序列有70-99.9%的同源性。才N^^發明的另一方面，提供了一種核苷酸，所述核苷酸包括a)編石射l^本發明第一方面的:^的核苷,列；b)編碼如圖2或3中所示的抗體Vh結枸域、抗體W結構J^CDR的^J^序列的如圖2或3中所示的核苦酸序列；或者c)與a)或b)的核苷酸序列高度同源並編碼以至少約109L/mol的親和力與TSHR結合的抗體的核苷酸序列。才娥4^發明的另一方面，4€供了一種包^##4^發明的以上方面的核苷酸的栽體。所ii^體可以為一種質粒、病毒或它們的片段。^4頁域技^pv員已知多種不同類型的載體。才娥本發明的另一方面，提供了一種包含##本發明的抗體、核苷酸和/或載體的分離的細胞；所述分離的細胞可表達一種根據本發明的松體。^i^，所述分離的細胞分^—種^l^本發明的松體。^i^，^4^^發明的分離的細胞來自一個穩定的異源雜^l細胞系。才娥本發明的又一方面，提供了一種包含確定、M的TSHR自身M並包含才Nt^^發明的M的組^。這種組合物可包^-種確定泉變的具有TSH拮抗劑活性的TSHR自身M，並包括一種4緣本發明的:^。或者，根據本發明的該方面的組合物可包^—種確定濃度的TSHR自身抗體一一曱^1激性^#抗劑，並包括一種才娥本發明的脅。一種組^可包^""種確定M的具有TSH拮抗劑活性的TS服自身M—一甲:J^'J激性^#抗劑，並包括一種才N^本發明的M。才娥本發明的另一方面,^_供了一種用於給予哺乳動物受M進行曱^Nl關病症治療的藥物組合物，包^—種4艮據^^發明的M和一種可藥用的載體。所述曱^W目關病症可選自曱:^活動it變、檔^t夫斯眼病、新生兒曱狀l^功能亢進症、Ai^l^促'l!il^L素誘導的甲狀腺功能亢進症、脛骨前粘液水腫、甲^^癌和甲M炎。才N^^發明的藥物組^可用於對A^藥。M地，4娥本發明的藥物組合物對受試者的免疫系MJt顯著的不利效應。才娥本發明的藥物組^可包含另外的促甲狀:素受##抗劑。一種合適的另外的促曱狀^1素受##抗劑為WO2004/050708中公開的9D33。已考慮到本發明的藥物組合物可具有多種形式。用於治療甲^f目關病症的才緣本發明的藥物組^可以為一種可注射的形式。用於治療脛骨前粘液7K腫的才Nt本發明的藥物組^^i^也為一種局部給藥形式。用於治療格雷A^f目艮病的4Nt本發明的藥物組^N^地為滴眼劑的形式。本發明的藥物組^包4^#^本發明的4壬意:^^可藥用的任意栽體、佐劑或運載體。可用於^^發明藥物組合物的藥用栽體、佐劑^載體包括但不限於離子交換劑、氧化鋁、石tJJ旨酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(如Ajk清白蛋白)、緩沖物質(如磷酸鹽)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部^"油酯;^^、水、鹽或電解質(如>^~蛋白)、磷^t^鈉、磷^l^鉀、t/ft#|、鋅鹽、矽溶膠、^:酸鎂、聚乙烯p比咯烷酮、纖維素基物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟，聚乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。本發明的藥物組^可通過口月峰藥、非糹1M給藥、通it噴霧PAA^藥、局部給藥、通過滴目ll^藥或眼膏給藥、JLM給藥、鼻J^藥、口,藥、陰道給藥或經由檔入儲存器給藥。我們m口月峰藥或注射給藥。4^文所用的術語"非診^"包括皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病灶內和煩內注射或％^液4支術。所述藥物組合物可為無菌可注射製劑的形式，如無菌可注射的水懸浮M油懸浮液。這種懸浮液可歉照本領域中已知技術^J^合適的分散劑或潤溼劑(如Tween80)和助懸劑製成。無菌可注射試劑也可是由無毒腸外可接受的稀釋劑或溶劑製成的無菌可注射溶液或懸浮液，如溶於1，3-丁二醇的溶液形式。可^fM的可接受的運載體和溶劑是甘露醇、水、沐格氏液和等滲t/f^溶液。另外，無菌的不揮發性油通常^U1作溶劑或助懸介質。為此目的，可^J^^T溫和的不揮;^性油，包括合成的單"^由S旨或雙甘油酯。脂肪酸(如油酸及其甘油酯衍生物)可用於製備可注射劑，正如天然的藥學可絲的油類(W^莧油或M^油)尤其是其IWL乙基化形式一樣。這些油溶液或懸浮液也可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑如Ph.Helv或刻以的醇。本發明的藥物組合物可以^^T口月良可接受的藥劑形式口月良給藥，包括但不限於膠嚢、片劑、水懸浮液和溶液。對於口月l用片劑，常用的載體包括乳糖和玉米澱粉。通常還加入潤滑劑如^JJ旨酸鎂。對於口月良用膠嚢形式，有用的稀釋劑包括乳糖和幹的玉米澱粉。當水懸浮液為口月M^藥時，其活性成分與乳化劑和懸浮劑結合。如果需要，還可加入某些甜"未劑和/或調味劑和/或著色劑。本發明的藥物組合物也可以直腸給藥用栓劑形式給藥。可通過將本發明的化合物與合適的非刺激性賦形劑混合來製備這些組合物，所逸陚形劑在室溫下為固態但在直腸溫度下為液體，因而會在直腸中溶解從而釋，放出活'Iil且分。這種材料包括但不限於可可脂、蜂蠟和聚乙二醇。當所需治療包括局部施藥容易到達的區域或器官時，本發明藥物組合物的局部給藥尤其有用。對於局部皮膚給藥，所述藥物組合物應該用含有懸浮或溶解於栽體中的活性組分的合適軟膏來配製。用於本發明化合物局部用藥的載體包括但不限於礦物油、液體石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水。或者，所述藥物組合物可以用含有懸浮或溶解於載體中的活性化合物的合適洗劑或霜劑來配製。合適的栽體包括但不限於礦物油、脫水山梨醇單柳旨酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蠟、棕櫚醇、2-辛基十二烷醇、苯曱醇和水。本發明的藥物組合物也可通過直腸栓劑製劑或以合適的灌腸劑形式用於下腸道。本發明還包括局部經皮膏藥。本發明的藥物組合物可以鼻用噴霧劑或級人劑的形式給藥。這些組#是按照藥物製劑領域熟知的技術製備的，並可〗吏用苯甲醇或其他合適防腐劑、增強生物利用度的吸收ilii劑、碳氟化合物和/或其他本領域中已知的助溶劑或*劑來製備為鹽水溶液。才娥^^發明的又一方面，提供了一種產生^^本發明的M的方法，所^法包^養一種或多種才Mt本發明的分離的細胞，從而由所述細I^J^斤述抗體。^^k，所述脅由所述細胞分泌。才娥本發明的又一方面,提供了一種在哺乳動物受絲中或者來源自該受試者的細胞中治療甲W^目關病症的方法，所述方法包^^將所述受^r或所述細胞與4^發明的^N"^觸。##本發明的另一方面，提供了一種在哺乳動物受試者的曱*中抑制甲狀麟'J激性^^刺激TSHR的方法，所財法包括將所述受絲與本發明的4^目接觸。>^^，fJ^甲;l^'激性^^TS皿的結合。才H^^^發明的另一方面，提供了一種在哺乳動物受M中抑制甲:^'Jit'性M與曱^^卜TSHR結合的方法，所述方法包括將所述受試者與本發明的,相接觸。所述曱^U^卜TSHR可存在於所述受財的BI^組織和/或脛骨前組織中。當被應用於該方法中時，本發明的抗體M地阻斷TSHR自身^^與曱*外TSHR的結合。才娥本發明的另一方面，提供了一種在受逸奮中或在源自受M的曱細胞中治療曱M中的或轉移的曱狀腺癌的方法，所述方法包括將所述癌細胞與本發明的^M目接觸，目的是在所述細胞中抑制M^型促甲^^L素受體活性。^fe，PJohil艦甲她癌細胞的再生長。還提供了一種在受試者中或在源自受試者的曱M細胞中治療由組成型甲#活'1^成的甲*活動選變的方法，所述方法包括將所述受試者或曱M細胞與4^發明的^M目4^觸，目的是抑制由組成型曱*活'^^的曱^^舌動狄。在上ii^發明的^^方法中治療的受"^N^^為人。#^本發明的另一方面，提供了##本發明的^^治療曱W^目關病症中的用途。或者，提供了根據本發明的抗體在製備用於治療曱^Nl關病症的藥劑中的用途。還提供了一種在醫學療法中^^的才緣本發明的脅。M而言，提供了根據本發明的M用於治療曱^JI^目關病症的用途。所述曱^J!^目關病症可選自曱^^動it變、格雷夫斯眼病、新生兒曱^^功能亢進症、A^^J^促^J^激素誘導的曱*功能亢進症、脛骨前粘^7jc腫、曱狀腺癌和甲;l^炎。#4^^發明的另一方面，提供了一種表徵TS服M的方法，包括確定#^測驗的TSHR^與具有TSHR相關^J^序列的多肽的結合晴況，其中所述方法涉及一個方法步驟，該步驟包括^^J本發明的抗體。>f^k*,所述方法包^r確定本發明的抗體對TSHRM與該多M合的效應。具有TSHR相關的^J^f列的多肽^i^包括4^ATSHR。才娥本發明的另一方面，提供了一種用於表徵TSH;M目關分於的方法，包括確定#測驗的TSH或相關W與具有TSHR相關^tJ^序列的多肽的結合清況，其中所述方法涉及一步包^f捐本發明抗體的方法步驟。用於表徵TS肌^或TSH的方法以;SJiil描述的^目關方法可以為ELISA形式。才娥本發明的另一方面，提供了一種確定在結^ft為拮抗劑的TSHR自身抗^it程中涉及的TS服^J^的方法，所i^法包括提fr"條具有本發明M可結合的第一TSHR相關JLi^序列的多肽，在所述TSHR相關的^J^序列中#^至少一個#^以及確定這樣的#^對所述*結合的#。一種##本發明脅的方法，所財法包^f辦所述糾的至少一個絲酸以及確定這樣的修飾對於與TSHR相關序列的結合的效應。選擇對TSHR的親和力增強的經^^的TSHR。才娥本發明的另一方面，提供了一種鑑定可抑制曱W^激性脅與TS服結合的分子的方法，所述方法包括提供至少一種，本發明的抗體作為參照物。^4^,選擇可卩ibli甲;l^^激性^^TSHR結合的幹測輛襯。還提供了一種鑑定可抑制甲旨阻斷性松本與TS皿結合的分子的方法，所述方法包括提供至少一種^^本發明的抗體作為參照物。>^i^，選擇可阻止曱M阻斷性抗體與TS服結合的分子。Syaif過參考附圖1-4、僅以例證的方^W本發明的抗體和方法進^f彌述，其中圖1的3幅系列圖示出了來自患格雷A^f病的患者(n=40)和健泉的捐血者(n=10)的血清對1251-509IgG、125I-TSH或125I~M22與經TS服塗覆的管結合a125I-5C9IgG結合與125I-TSH結合b125I-5C9IgG結合與125I~M22IgG結合c125I-TSH結合與125IHi!22IgG結合；圖2給出的序列為5C9重鏈(HC)的可變區序列a以未^#^^#的形式顯示的5C9HC的^fe苷酸序列。在注釋的形式中，用於PCR引物的序列為框示的各個互補決定區(CDR);瓦繁體所示的恆定區。b源自以未:;^#^^^#^式顯示的暮該苷#列的5C9HC的^J^列；圖3給出的序列為5C9^(LC)的可變區序列a以未^#^^#(按照圖2)的形式顯示的5C9LC的募fe苷酸序列。b源自以未ii^注，式顯示的S^苷^列的5C9LC的^tJ^列；圖4顯示了人TSHR的共有#^,列(射己號P16473,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=protein&val=62298994)。具體實施方式才法乂賴鏖萌々,絲^辦s勿粉絲^i靴^J1記載於W02004/050708A2中的方法，常皿分離單克隆自身M5C9。最初從收集自患產後曱^功能減退症並具有高水平TRAb的患者的j&^中分離到淋巴細胞(得到地方倫理委員會的批准)。如WO2004/050708A2中所述，以愛潑斯坦巴爾病毒(EBV)(EuropeanCollectionofCellCultures-ECACC;PortonDown,SP40JG，UK)感染所述林巴細胞，並培養於小鼠巨噬細胞飼養層上。將分泌TS服自身抗體的永生化淋巴細胞與小鼠/人雜交細胞系K6H6/B5(ECACC)融合，通過有1:|1#釋克隆4次，以得到單集落。通過抑制125I-才射己的TSH與TS服的結合，檢測了處在不同克隆化階度的細皿養上清液中TS服自身M(W02004/050708A2)的存在情況。將產生TSHR自身抗體的單克隆擴大，並M^^收ILh清^I於進行自身M純化。^JI蛋白質A親和色i普法在MabSelect(GEHealthcare,UK)上，4^L據(SandersJ，JeffreysJ,DepraetereH，EvansRichardsT，KiddieA，BreretonK，PremawardhanaU)，ChirgadzeDY，NunezMiguelR，BlundellTL，Fur咖niakJ，ReesSmithB2004Characteristicsofahumanmonoclonalautoantibodytothethyrotropinreceptor:sequencestructureandfunction.Thyroid200414:560-570)記^c培絲上清液中純化5C9IgG,並通過SDS-聚丙烯Sfe^凝歐電泳(PAGE)評估純度。使用徑向擴散測定(TheBindingSite;Birmingham,B296AT，UK)確定5C9的重鏈同種型，通過蛋白質印跡法以^Ak鏈和M人鏈的特異性小鼠單克隆脅(Sigma-AldrichCompanyLtd,Poole，UK)確定i^同種型。在室溫下，將溶於20咖ol/L乙酸鈉溶液(pH4.5)的10mg/mL的5C9IgG與依照製造商i兌明書(PerbioScienceUKLtd,Cramlington，UK)製備的固定化胃蛋白酶振蕩孵育4.5小時。jH^，通過離心(在室溫下，1000xg,5^4中)除去固定化胃蛋白酶，並在41C下將上清^JU300咖ol/LNaCl，10咖ol/LTris-HC1(pH7.5)透析過l4捐SephacrylS-300HighResolutionMatrix(GEHealthcare,ChalfontStGiles,UK)，分離包含5C9F(ab')2和少量完整IgG的透析後〉V給物。以這〕種方式純化的5C9F(ab02製品不包含完整的IgG,i^l通過SDS-PAGE和HPLC^01i^慮^^斤來判斷的。再者，在37X:下，使用終濃度100咖ol/L的L-半JiJt^酸對F(ab02消減l小時。在室溫下以終濃變50咖ol/L的琳r乙St^f止該反應30分鐘。如上文所述，使用S鄰hacrylS-300柱純化F(ab')。以這種方式純化的F(abO製品不包含F(ab')2,itl通過SDS-PAGE和HPLC^^±>慮^^斤來判斷的。另外，用汞木;^Jl(mercuripapain)(Sigma，UK)以1:100的酶/蛋白質比處理5C9IgG、將其透析入50咖ol/LNaCl，Tris-HCl(pH9.O)中，絲過陰離子交換S印harose(購自GEHealthcare的Q-S鄰haroseFastflow)柱，以從Fab製品分離完整的IgG或Fc。通過SDS-PAGE和^Mi^慮(S印hacrylS-300柱；如上必的分析表明，在所述Fab製品中沒有檢測到完整的IgG。如SandersJ，OdaY,RobertsS，KiddieA，RichardsT，BoltonJ，McGrathV，WaltersS，JaskolskiD，FurmaniakJ，ReesSmithB1999.TheinteractionofTSHrec鄰torautoantibodieswith125I-labelledTSHreceptor.JournalofClinicalEndocrinologyandMetabolisnu199984:3797-3802中所述，以125I5C9IgG，或者以生物素sw(PerbioScience,Cramlington，UK)樹己5C9IgG。#"/-ZSy、jfe'與7y朋潛合^^刺如W02004/050708A2中的描述，4吏用經TSHR塗覆的管進4亍了結合抑制測定。在該測定中，在室溫下將IOOjiL試驗樣品(Mab製品、患者血清或未標記的TSH)和50jnL起始緩衝液(RSRLtd)在經TS服塗覆的管中輕輕振蕩孵育2小時。在吸出後，將所述管洗滌，並iUn入100jaL的^I-標記的蛋白質(5x10、pm)並在室溫下振蕩孵育l小時。然後，將所述管吸出、洗滌並在Y計數器中計數。按照下式計算對經標記蛋白質的結合的抑制-inn「在存在測驗材料的情況下結合的cpm—L在存在對照材料的情況下結合的cpi^對照材料為混合的^J:捐血者血清、個體的#^捐血者血清或在各個實驗結果中指示的其他材料。#W7y朋潛合^5t"c力aiY/》、浙在室溫下，將溶於50nL測定緩沖液(50mmo1/LNaC1，10mmo1/LTris(pH7.8)和1%TritonX-100)中未標記的5C9IgG和50jjL的1251-標記的5C9IgG(溶於測定緩衝液中30，000cpm)在經TSHR塗覆的管中振蕩孵育2小時(在這些條件下出現最大結合)、吸出、以lmL測定緩衝液洗滌兩次並在Y計數器中計數。對結合的IgG的濃度與結合的/游離的IgG的濃度進行作圖(ScatchardG1949Theattractionofproteinsforsmallmoleculesandions.AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences51:660—672)，以推導締合常數。養,y^聰麟俯如W02004/050708A2中所述，測驗了5C9IgG和其他製品在以人TS服轉染的中國倉鼠卵巢(CH0)細胞中刺激環AMP產生的能力。4^個細Ji^達大約5x104個或大約5x1S個TSHR的CH0細胞以每個孔3x104個細^^種於96-孑Ul中，在無胎牛血清的DMEM(InvitrogenLtd，Paisley,UK)中進行適應，然後添加"^^樣品(TSH、IgG或患者血清)(100pL稀釋於環層測定緩衝液，即無NaCl的Hank，s緩衝鹽溶液，包含lg/L葡萄糖、20咖ol/LHEPES、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白和0.5咖ol/L的3-異丁基-l-曱基黃嘌呤(pH7.4))，並在371C下孵育1小時。在除去試驗溶液後，將細胞裂解並通過以下兩方法的一種測定所述裂解產物中的環層濃度l)使用來自GEHealthcare,ChalfontStGiles,UK的Biotrak酶免疫觀'J定系統；和2)使用來自AssayDesigns;CambridgeBioscience,UK的DirectCyclicAMPCorrelateEIA試劑盒。結^^示為細胞裂解產物(200jiL)中pmol/mL的環AMP，或者表示為fmol/細胞孔。欣斷雜^被評估了5C9IgG和其他製品抑制豬(p)TSH、天然人(h)TSH和重組體人(rh)TSH、MAbM22和患者血清TRAb在表達TSHR的CH0細胞中的刺激活性的能力。這一點的實現是通it^存在及不存在5C9IgG(或其他試驗製品)的情況下，比較TSH、M22或TRAb的刺激效應。按上文所述進行該測定，除了將50yL稀釋於環層測定緩沖液中的5C9(或其他^^，J品)添加至所述細胞孔，然後添加50pL的TSH、M22或患者血清(在環AMP測定緩衝液中適當稀釋)，並如上文所^'J激測定進行賻育和M。除了5C9"卜，在該測定中測驗了其他MAb和來自具有阻斷類型TRAb的患者的血清。如W02004/050708A2中所述，使用從lx107個分泌5C9IgG的異源雜交瘤細胞製備的總RNA以產生用於RT-PCR(逆轉錄PCR)反應的mRNA，確定了5C9重鏈和輕鏈的可變區基因。^J1MedicalResearchCouncil的V-base(http:〃vbase.mrc-cpe,cam,ac,uk/)設計特異性IgGlHC和kLC正義和反義鏈寡核苷酸引物，並由Invitrogen(Paisley，PA49RF，UK)合成這些引物。在以下條件下進行RT^^應50"C下15分鐘；然後進行40個PCR循環，每個循環為94匸下15秒、50t:下30秒及72t:下30秒。將DNA產物克隆至pUC18中，並用Sanger-Coulson法進行測序(SangerF，NicklenS，CoulsonAR1977DNAsequencingwithchainterminatinginhibitors.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUSA74:5463-5467)。使用Igblas"http:〃麗.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)將V區序列與已有人Ig基因序列比較。#乂7y朋^^尹^絲邀^^對W夕承遂^^t^^》Vf用於將具體突變引入TSHR序列的方法已經被記載於專利申請W02006/016121A中。而且，使用Flp-In系統將突變的TS服構建體轉染至CHO細胞中也被記載於W02006/016121A中。將表達野生型或突變TSHR的Flp-In-CHO細M種於96孑Ul中，並如上文所述用於測驗5C9製品阻斷TSH、M22或患者血清TRAb的刺激活性的能力。村7OT絲、OT弄被為、，差f將2.55mg/mL的5C9IgG透析至100咖ol/L磷酸鈉緩衝液(pH8.5)中，並與EZ-LinkNHS-LC-Biotin(Perbio)進行反應，IgG與生物素的摩爾比為1/10。在室溫下，將試驗血清樣品(75pL)在經TSHR-塗覆的ELISA板孔(RSRLtd)中振蕩(每分鐘振蕩500次)孵育2小時。在除去所述^^樣品並洗滌後，添加生物素標記的5C9IgG(100pL中2ng)，並在室溫下不振蕩繼續孵育25分鐘。將孔清空、洗滌並添加100pL鏈親合素-過氧化物酶(100juL中10ng;RSRLtd),並在室溫下不振蕩繼續賻育20分鐘。然後，將孔洗滌3次，添加itfU匕物酶的底物四甲J^^^(tetramethylbenzidine)(TMB;100RSRLtd),並在避光且不振蕩的條件下，在室溫下孵育30分鐘。然後，添加50juL的0.5mol/LH2S04以終止該反應，佳月ELISA板讀lt儀在"0nm下讀取每個板孔的吸光度。按照下式計算對5C9IgG-生物素結合的抑制-inn「,試驗樣品在450nm下的吸光度—lOOx1--陰性對照血清樣品在450nm下的吸光度絲W為、必勿靡粉"^鋭將從20mL患者血液中獲得的淋巴細胞(27x103以EBV感染，並在48孑U1中以每孔1x106個細胞鋪展於小鼠巨噬細胞飼養層之上。在EBV感染後第13天，^孔上清液中監測對"I-TSH結合的抑制。將來自陽性孔的細胞擴大，與K6H6/B5雜交瘤細胞系融合，並在96孑M1中鋪展。獲得了一個穩定產生具有125I_TSH結合抑制活性的抗體的克隆，並進行4次再克隆。從異源雜交瘤培養物上清液中純化的被命名為5C9的單克隆抗體是具有k輕鏈的亞類IgGl。W#7OT潛合承妙賄雜表1中顯示了，不同濃度的5C9IgG抑制標記的TSH、標記的M22或標記的5C9自身與TS服結合的能力。如表1中所示，在4吏用少至0.005ng/mL的5C9IgG的情況下，125I-TSH的結合出現了12%的抑制，並且該抑制以劑量依賴的方式增大，在IOO]Lig/mL的5C9時抑制最高升至84。/。。這可與捐^MT的血清IgG對125I-TSH結合的抑制相似；在0.05mg/mL時抑制13%，並JL^1mg/mL時以劑量依賴的方式增大至抑制94%。在捐獻者的血漿的情形下，在以1:160稀釋^J:捐血者的^^血清時，"I-TSH結合出現了16%的抑制，在以1:IO稀釋時抑制為95%。5C9IgG狄1251-1422IgG與塗覆在管上的TS服的結合有效應(表l)。在O.01pg/mL的5C9IgG時，125I-M22IgG的結合出現了9%的抑制，並且在增加濃度時引起該抑制以劑量依賴的方式增大，在IOOug/mL時最高達85%。捐a血清IgG在O.01mg/mL下是有效的，引起9%的抑制，並且在1mg/mL時以劑量依賴的方式增大至89y。的抑制。在以1:320稀釋時，捐^T的血清血漿顯示出對1251-M22IgG結合的13%的抑制，在以1:10稀釋時抑制91%。未標記的5C9IgG能夠以劑量依賴的方式抑制125I-5C9與經TSHR塗覆的管的結合(在0.005ng/mL時抑制11%，在100jig/mL時最多升至抑制88%)(表1)。125I-5C9的結合還被捐獻者的血清IgG抑制(在0.05jig/mL時抑制15%，在1mg/mL時抑制91%)，以及被捐a血漿的稀釋物抑制(在1:320的稀釋度時抑制10%,在1:10的稀釋度時92%)。表2a-c中顯示了，5C9IgG在表達TS服的CH0細胞中阻斷TSH和M22-介導的對環AMP的刺激的能力。豬TSH(3ng/mL)強烈地刺激環AMP的產生(19,020±2154fmol/細胞孔；平均值土SD;n=3)(表2a)。在存在0.1pg/mL的5C9IgG的情況下，豬TSH的刺激活性降低至11874±4214fmo1/細胞孔(平均值土SD;n=3)，並且該抑制效應於5C9濃度，在存在1jhg/mL的5C9時僅產生2，208±329fmol/細胞孔的環AMP(表2a)。淋巴細胞捐獻者的血清ii^CH0-TSHR細胞中對TSH介導的環AMP刺激有強效應。如表2a中所示，在存在1:10稀釋度的捐a血清的情況下(該稀釋度下的總血清IgG濃度為1.43mg/mL)，對環AMP產生的抑制將其降低至大約6000fmol/細胞孔，這類似於不存在血清下的19000fmol/細胞孔。該效應對應於大約0.37mg/mL的純化5C9IgG的效應(利用表2a中所示不同濃度5C9IgG的效應的稀釋度曲線計算而得)。it4明，在阻斷TSH刺激環AMP產生的能力這方面，純化5C9IgG的活性比捐^T血清IgG高出大約3900倍。5C9的片段，例如5C9F(aV)2和5C9Fab也是有效的TSH刺激的抑制物。脅而言，5C9IgG、5C9F(ab。2和5C9Fab在100jag/mL時的TSH刺'激抑制活性是相同的(表2b)。在10mg/mL時，所有三種製品5C9IgG、5C9F(ab')2和5C9Fab也是TSH刺激活性的強效抑制劑，然而，5C9IgG似乎比5C9F(ab')2或5C9Fab更有效(表2b)。M22Fab(3ng/mL)是一種環層的強鈔!]激物(9，432±822fmol/細胞孑L)(表2c)，並iL^E存在5C9的情況下，M22Fab的刺激效應被以劑量皿的方式抑制，環AMP的水平在存在0.1pg/mL的5C9IgG的情況下降j氐至1,298±134fmol/細胞孔。M22刺激的完4^抑制出現於100jLig/mL的5C9時(表2c)。Scatchard分析表明了，1251-標記的5C9以4x101L/mol的締合常數結合於TSHR。j^U6WiCP7y湖潛合耕斧/表3和圖1中顯示了，血清TRAb抑制125I-5C9IgG與經TSHR塗覆的管結合的能力。還為了比較之目的示出了相同血清TRAb對125I-TSH結合及125I-M22IgG結合的效應。125I-5C9IgG與TS服的結合沒有被來自10個不同*捐血者的血清(Nl-N10，表3)明顯抑制(抑制範圍3.4-18.9%)。在125I-TSH和125I-M22抑制測定中(表3)，來自40名均為TSHR自身抗體陽性的格雷夫斯病患者的血清(Gl-G40，表3)對125I-5C9與經TS服塗覆的管結合(抑制範圍22.0-85.2%)的抑制，達到了比來自Ai:捐血者的血清更大的程度(表3)。患者血清TRAb抑制化I-5C9IgG、125I-TSH或125I-M22IgG與TS服結合的能力是相當的，Pearson相關係數r=0.95(125I-5C9IgG與125I-TSH;圖la)和r=0.95(125I-5C9IgG與"5l-M22IgG;圖lb)。圖lc顯示相同血清對125I-TSH和125I-M22IgG抑制的比較(Pearson係數r=0.99)。這些實驗表明，5C9IgG與TSHR的結合可被血清TRAb有皿抑制，並且血清TRAb對5C9IgG結合的抑制效應類似於它們對TSH或M22結合的抑制效應。表4顯示了不同稀釋度的具有TSH阻斷活性的患者血清TRAb(Bl-B5)及具有強曱狀腺刺激活性的患者血清TRAb(Sl、S2和S4)對^I-5C9IgG結合的抑制。125I-5C9IgG的結合被血清Bl-B5,以;Sjk清Sl、S2和S4以劑量依賴的方式抑制。同樣這些阻斷和刺激血清還以劑量依賴的方式抑制125I-TSH和1251-M22IgG結合，而且在同樣的血清稀釋度下所有三種經標記配體的抑制百分lbl相當的(表4a&b)。這些結a明，具有刺激活性和阻斷活性的TSHR自身抗體可抑制5C9與TSHR的結合。輿,75^潛合丼浙;^遂^^/、扃旭6W^7-i^/^7^7y朋潛合^^命/測驗具有125I-TSH結^^抑制活性的不同小鼠TSHRMab抑制125I-5C9與TS服結合的能力，並與對1251-M22IgG結合的效應進行比較(表5)。如表5中所示，具有抑制125I-TSH結合和125I-M22IgG結合的能力的所有Mab還抑制了125I-5C9結合，但在某些Mab的情況下對125I-5C9結合和125I-M22結合的抑制效應弱於對125I-TSH結合的^i:應。這些實驗表明，5C9在TS服上的結合位點和小鼠TSHRMAb在TS肌上的結合位點之間有大量的重疊，所述小鼠TSHRMAb具有抑制TSH結合的能力。JC夕/^^4這7Sffi^勿應^^悉者j^^^^",/2^^^^遂^妓如表2中所示，5C9IgG能夠在表達TSHR的CHO細胞中阻斷TSH或M22對環AMP7jc平的刺激。在不同系列的實驗中，測驗了5C9IgG對患者血清TRAb的刺激活性的效應，結果顯示於表6a中。血清Tl-T9和T11-T18在CHO-TS肌細胞中刺激了環AMP的產生，並且與對照MAbIgG(對人甲狀llit氧化物酶特異性的2G4)的孵育對它們的刺激活性沒有效應。然而，在存在5C9IgG(50nL的200jLig/mL)的情況下，所有測驗血清的刺激活性都顯著降低(表6a)。6種不同血清(T1、T6、T3、T19、T20和T21)的劑量響應效應顯示於表6b-g中。在這些實驗中，濃度範圍O.lyg/mL-100jug/mL的5C9IgG導致了血清刺激活性的劑量依賴的降低，並JL^除血清T3^卜的所有測驗^血清中，5C9IgG的效應都與9D33的效應相當，後者是具有阻斷活性的抗TSHR的小鼠單克隆抗體(記載於W02004/050708A2中)。對於T3血清的情況(表6a&6d)，在存在100ng/mL的5C9IgG的情況下觀察到對環AMP產生的約50%的抑制，而IOOng/mL的9D33IgG導致了幾乎完全抑制。i^明，在5C9和9D33所識別的表位之間可能有一些微小差異。W7OT^C朋雄拃對J^W絲麟,豕廁/^絲除了抑制TSH和TS服抗體的剌激活性O卜，5C9在不存在這些甲狀JW'J激物的情況下抑制了環AMP的產生量。M地，表6b顯示了，在存在100jug/mL對照單克隆的IgG(2G4)的情況下所產生的1207±123fmol/細胞孔的環層，在存在100jig/mL的5C9IgG的情況下降低至301±38fmol/細胞孔。9D33IgG的效應較小，存在IOOpg/mL9D33IgG的情況下產生721±183fmol/細胞孔。在顯示於表6d、6e、6f和6g的獨立實驗中得到了類似的結果。ii^明，5C9IgG對TSHR的基礎活性或組成型活性具有顯著的效應。iCP/W^4這逸含M磁^^^7^朋^C朋勿應9^^豕，,i辨_^圖7中顯示了，在CH0-TSHR細胞中，TSHR的單胺基酸突變對5C9阻斷豬TSH的環AMP刺激活性的能力的效應。具體而言，在這樣的CH0細胞中研究了5C9對環AMP產生的刺激的效應，即這種CH0細J^達以下殘基突變成丙氨酸的TSHR:Lys58、lie60、Arg80、Tyr82、Thr104、Arg109、Lys129、Phe134、Asp151、Lys183、Gin235、Arg255、Trp258和Ser281。另外，在以下TS服戎基的情況下研究了對荷電突變進行改變的效應Arg80Asp、Aspl51Arg、Lysl83Asp和Arg255Asp,其中依照常規的表示法，被替換的胺基酸^J^其在原始序列的多肽中的位置被標明於替換胺基酸^t&之前。以前的研究已表明，對TSHRAspl60Lys的荷電突變進行改變導致TSHR失去了對TSH的響應性，而對M22的響應未受影響(專利申請W02006/016121A)。因此，使用M22作為環AMP的刺'激物，在CH0-TSHR細胞中研究了TSHRAspl60Lys突變對5C9生物活性的效應(表71)。在所研究的所有TSHR突變中，^現3個突變對5C9作為拮抗劑的能力有影響。Lysl29突變成Ala(表7h)導致5C9IgG完全喪失了阻斷TSH對環AMP產生的刺激的能力。而且，TSHR突變Lysl83Ala引起了5C9IgG阻斷活性的部分降低；在用TS服Lysl83Ala突變進行測驗時，1jlig/mL時觀察到對TSH刺激的28%#制，不同於l吏用野生型TSHR時的84。/浙制(表7m)。甚至在IOO/ig/mL的5C9IgG時，在用TSHRLysl83Ala突變的實驗中僅檢測對TSH刺激的部分抑制(43%),而在該濃度時，在用野生型受體的實驗中觀察到對TSH刺激活性的完全阻斷(93%)(表7m)。如果正電荷的Lysl83突變成負電荷的天冬氨酸，那麼對5C9生物活性的效應類似於使用Lysl83Ala突變時，見察到的效應(表7m)。這說明了，Lysl83對5C9的生物活性是重要的。在Aspl51Ala的情形下，觀察到5C9IgG阻斷活性出現了輕微的降低在lpg/mL時49。/浙制，不同於野生型的88。/。的抑制(表7j)。然而，在存在IOOjug/mL的5C9IgG的情況下，該活性與野生型TSHR相同。當負電荷的Aspl51突變成正電荷的精氨酸時，不會觀察到5C9IgG阻斷活性的顯著降低(表7k)。可以將TS服突變對5C9活性的效應與TSHR突變對9D33活性的效應相比較。如專利申請W02006/016121A中所述，TSHR突變Lys58、Arg80、Tyr82、Arg109、Lys129和Phe134均對9D33活性有效應。然而，除了Lys129O卜，這些突變中沒有一種狄5C9活性有效應。再者，如專利申請W02006/016121A中所述,在影響M22活性的突變(Arg80、Tyr82、Glu107、Arg109、Lys129、Phe130、Lys183、Tyr185、Arg255和Trp258)中，除Lys129之外沒有一種影響了5C9活性。另外，Lys183突變對5C9活性和M22活性有部分的效應，但對9D33活性無效應。這些結^4明以下的TSHR戎基中存在不同，所述戎基即對於與曱狀船'J激'I^A抗體M22、與小鼠阻斷抗體9D33及與人阻斷抗體5C9相互作用來i兌重要的TS肌■。因此，5C9與其他具有拮抗劑活性的TSHR抗體(如9D33)的結合可能是一種特別有效的方式，用於抑制患者血清TRAb的刺激活性、其他刺激物和/或TS服的組成型活性。對編碼5C9的基因的序列分析表明，HCV區基因來自VH3-53家族，D基因來自D2-2家族，並且J基因來自JH4家族。在LC的情形下，V區基因來自012家族且J區基因來自JK2種系。HC的核苷酸和^J^^列分別顯示於圖2a和2b中，並且LC的核苷酸和^酸序列分別顯示於圖3a和3b中。與種系序列相比，HC基因序列中有體細胞突變；具體是FWR1中1個沉默突變、CDR2中2個替換突變、CDR3中1個沉默突變和1個替換突變以及FWR4中1個沉默突變。然而，HCV區序列的特徵在於兩個插入片段；一個在V基因和D基因之間長6個^i^JJft,另一個在D基因和J基因之間長15^Ntt對。因此，HCCDR1長5個胺基酸、CDR2長16個M酸且CDR3長18個胺基酸(圖2b)。在LC序列中有FWR1中1個沉默突變、CDR1中1個替換突變、CDR3中1個替換突變;MLV基因和J基因之間6個>^1^長的插入片段。LCCDR1由11個M酸組成、CDR2由7個M酸組成且CDR3由10個^酸組成(圖3b)。OT4'絲;fW#敗表8中顯示了用於檢測TSHR自身抗體的ELISA實例，該ELISA基於5C9IgG-生物素與經TS服塗覆的板孔的結合。在該測定中，對於TSH-生物素結合的抑制呈陽性的所有樣品均也對5C9IgG-生物素結合呈陽性。再者，TSH-生物素測定和5C9-生物素測定中的吸it^信號、抑制百分數和派生的單位/L值是相當的(表8)。"夕/W在或這7^朋^C朋勿應*#7、篇fn如表9中所示，5C9IgG能夠阻斷所有5種測驗TSMAb(l、2、4、5和7)對環AMP產生的刺激。例如，TSMAbl(表9)刺激環AMP水平至18.94±7.4pmol/mL，而在存在IOOlag/mL的5C9IgG情況下僅產生1.24±0.07pmol/mL的環AMP。這可以與在存在100pg/mL的對照MAb2G4的情況下16.5±1.1pmol/mL的環層7JC平相比較(表9)。表9中以及下iL^10-15中顯示的環AMP水平以pmol/mL表示，即每個細胞孔的環AMP水平為pmol/mL+5(>R^200iaL的來自每個測定孔的樣品)。，7娜W哪滅9^義取OT々,iZAOT藉襲發遂絲^表2和表10中顯示了5C9IgG阻斷豬TSH對環AMP刺激的能力。另夕卜，5C9IgG顯示了抑制天然人TSH(來自NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl,SouthMi咖s，PottersBarEN63QGUK的NIBSC參照製品81/565)和重組TSH(NIBSC參照製品94/674)兩者對環AMP刺激的能力(表IO)。M而言，100ng/mL的重組或天然人TSH對環AMP產生的刺激需要O.1—1.0pg/mL的5C9IgG,以獲得對環AMP產生的完全抑制。在採集用於分離5C9的血液時，捐"血清中的循環系統TSH的水平為160mU/L(大約32ng/mL),所得的結果(表2a和表10)表明，在血清中存在32-320ng/mL的5C9IgG的情況下將完全阻斷該水平的循環系統TSH。使月對mI-M22與TSHR結合的抑制，評估了所述捐絲血清中TS服自身抗體的水平(如NakatakeN，SandersJ，RichardsT,BurneP，BarrettC，DalPraC，PresottoF，BetterleC,FurmaniakJ，ReesSmithB2006EstimationofserumTSHreceptorautoantibodyconcentrationandaffinity.Thyroid16:1077-1084中所述)，為1700ng/mL(120ng/mg),即比用於阻斷TSH的曱狀^^刺激所需的5C9濃度高出lt倍。iC夕/W敘^l^"絲奴W《7/、/柳r和，J/^T^朋^OT勿應^z^菱邀^;豕，話遂^放^在不存在曱狀腺刺激物(即TSH或TS服抗體)時，5C9IgG在表達具有活化突變的TSHR的CHO細胞中能夠降低環AMP的產生量。如表lla中所示，在不存在5C9的情況下，基礎環AMP在表達具有活化突變S281I的TSHR的CHO細胞中的濃度為9.90±1.51pmol/mL，並JL^存在0.01jig/mL的5C9IgG的情況下它降低至4.17±0.60pmol/mL，JL^E存在1jng/mL的5C9IgG的情況下降低至3.44±0.63pmol/mL。阻斷性小鼠TSHRMAb9D33和對照MAb2G4都幾乎沒有效果(表lla)。偵J1TS服活化突變1568T獲得了類似的結果(表llb)，該結果顯示了21.39±5.31pmol/mL的l^l;環層濃度。在添加1jag/mL的5C9IgG時它降低至5.29±0.75pmol/mL,不同於添加2G4IgG和5C9IgG的情形下分別至20.52±0.95pmol/mL和21.65±1.99pmol/mL。在_4>5*環AMP濃度為36.89pmol/mL的第三種TSHR活化突變研究(即A623I)的情形下，添加lpg/mL的5C9IgG將環AMP水平降低至16.43±1.27pmol/mL,這不同於^i4^無效應的ljag/ml的對照IgG2G4(28.96±2.29pmol/mL)或1jug/mL的9D33IgG(40.09±7.73pmol/mL)(表llc)。這些結W明，與小鼠阻斷性MAb9D33不同，5C9對與TS服活化突變相關的環AMP產生具有顯著的效應，即便是當所述突變在TSHR的不同部分時(即細胞外結構域中的S281I、跨膜結構域的第二細胞外環中的1568T及跨膜結構域的第三細胞內環中的A623I)。^或迷野jf7^朋^^朋^^9^#"7"妓^^^;凝.'iT夕、小^zy朋賄財2發絲卯"及這耕絲郝^#^洽yy踏,財豕,如前文的實驗中和表12中所示，低至lMg/mL的濃度的人TSHR阻斷性MAb5C9和小鼠TS服阻斷性MAb9D33在CH0-TSHR細胞中具有阻斷TSH的TSHR環鍵刺激活性的能力。如表12的實驗l-5中所示，9D33IgG和5C9IgG對於由TSH介導的對環AMP的刺激的效應是可相加的。當兩個不同濃度的TSH(3ng/mL和0.3ng/mL)用於刺激時(分別在表12的實驗1-3及實驗4和5中)，出現了同樣的相加效應。在4這野i^7y朋WC朋勿^9^^"7"妓^^^凝iCP、V、^7y朋鷹4^^^^z^戎脊卯"及這席;^##^^遂^##於洽#"介爭^^f豕,如前文所示，5C9和9D33還能在CH0-TSHR細胞中抑制由M22Fab介導的對環AMP的刺激。9D33IgG和5C9IgG對於由M22介導的對環AMP的刺激的效應是可相加的(表13,實驗l-4)。當兩個不同濃度的M22Fab(3ng/mL和0.3ng/mL)用於刺激時(分別在表13的實驗1和2及實驗3和4中)，出現了同樣的相加效應。5C9IgG和9D33IgG對於由TSH和M22兩者介導的對環AMP產生的刺激的相加效應都是類似的(表12和13)。^每個勿^;^4迷義量野i^^朋WfiW*^^iT夕;^^&^伊或f每個細胞均表達大約5x1S個受體的CH0細胞系與前文實驗中(例如表9-13)使用的標準CH0細胞系(每個細胞表達大約5x1(T個TS肌)相比，顯示了較高水平的基礎(即未受激的)環AMP,即分別是47.1±11.7pmol/mL和大約1.0pmol/mL。使用每個細胞均表達大量受體的細胞系評估了5C9IgG和9D33IgG對野生型TSHR基礎活性的效應。與9D33IgG和抗GAD(5B3)的陰性對照抗體的孵育導致了對基礎環層活性的0-5.3%抑制(表14;實驗1),表明該阻斷性小鼠MAb9D33或對照MAb在表達野生型TSHR的CH0細胞中對基礎環AMP產生沒有效應。然而，在5C9IgG的情形下觀察到對基礎環AMP活性的明顯抑制(表14;實驗2)，0.1jig/mL和10ng/mL分別導致45.7%和74.6%的抑制。另外，在每個細胞均表達大量野生型TSHR的CHO細胞中，5C9Fab和5C9F(ab')也^礎環AMP活性的有效抑制劑(表14實驗3)。例如，1jLig/mL和100Mg/mL的5C9Fab分別顯示了對基礎環AMP產生的39%和61%的抑制，均不同於IOOjug/mL的5C9F(abO的48%的抑制(表14實驗3)。#^"#戎浙^^錄乃矛#沐悉4^^75^々,戎雄"這輿才承化爻^/w《r邦7^朋^c朋勿應拃;^^a^伊4菱遂^^,^^^^t^在存在20.5±8.7pmol/mL的環AMP測定緩衝液的情況下，TS服I568T細胞的基礎環AMP產生M上不會受到添加來自使豪捐血者的正常混合血清(NPS)或3種不同個體的^J:捐血者血清(N1-N3)的影響，所iiA清是以1/10和1/50的稀釋度測驗的。與在存在環AMP測定緩衝液的情況下的基礎環AMP產生相比，在存在NPS和Nl-N3血清的情況下的基礎環AMP產生顯示了0-14%的抑制(表15)。然而，在存在具有高水平阻斷型TRAb的4種不同血清(B2-B5)的情況下則觀察到對基礎環AMP產生的23-89%的抑制(表15)。在存在5C9IgG(ljug/mL)的情況下，》見察到對TSHR1568T基礎環AMP活性的83%的抑制。表15中還顯示了，2種阻斷性血清(B3和B4)在表達具有I568T突變的TSHR的CH0細胞中對基礎環AMP產生的劑量響應效應。這些結a明，5C9具有患者阻斷性TSHR自身抗體的TSHR阻斷活性特徵，具體地有關TS服活化突變體I568T中對基礎環AMP產生的抑制。#才潛#浙話遂沐惑4^#7^朋々^#戎#^4^#,承化^^W《7/^7y朋#OT滅^IU^屍4狄粉豕,承顯放^"在存在環AMP測定緩衝液的情況下，TSHRS281I細胞的基礎環AMP產生為11.2±2.0pmol/mL，並且與*捐血者^^血清或個體的#^捐血者血清(1/10或1/50稀釋)的孵育沒有效應(表16)。相反，在存在具有高水平阻斷類型TRAb的4種不同血清(B2-B5)的情況下，觀察到對^5dl環AMP產生的31-56°/。的抑制(表16)。在使用TSHRS281I的實驗中，1pg/mL的5C9IgG引起了對M環AMP活性的71%的抑制。:^才祟戎W;^^沐悉者j^,7y朋^,戎沐^4這4I發化^^J"J/^r腳^，雄付^^/^狄紛法絲淑在存在環AMP測定緩衝液的情況下，TSHRA623I細胞的基礎環AMP產生為43.5±11.2pmol/mL，並JLi^不受與^^捐血者;^^血清或個體的血清的孵育的影響(表17)。在這些實驗中，與具有高水平阻斷型TRAb的4種不同血清(B2-B5)進行孵育引起了對環層的-1%-56%的抑制(表17)。這可以與在相同實驗中由1|ig/mL的5C9IgG引起的49°/。的抑制相比較。^辜個勿^J^4迷Jx7《個野j^7^朋^C卵^^^,^^jf祟戎浙法遂沐惑者J^fW朋々,戎#考^^^^《邀^>豕,承#^妓^在該系列實驗中，在每個細胞均表達較高數目野生型TSHR的CH0細胞中的J^環AMP產生為28.1±0.7pmol/mL。當所述細胞與1/10稀釋度的健康捐血者〉'^^血清或個體血清(Nl-N3)進行孵育時，基礎環AMP水平的範圍是在存在環AMP測定緩衝液的情況下的環AMP7JC平的99%-146%,而該範圍在1/50的稀釋度時為93%-137%。在具有阻斷型TSHR自身抗體的4種測驗血清中，一種血清(B2)對基礎環AMP產生無效應(表18)。在兩種血清(B3和B5)的情形下，環AMP的水平高於在存在環AMP測定緩衝液的情況下觀察到的水平(表18)。有充分理由的是，血清B3和B5包^—種具有刺激活性和阻斷活性的TSHR自身抗體的混合物。相反，以1/10和1/50稀^^度的血清B4對基礎環AMP產生有明顯的抑制效應，即相與在存在環AMP測定緩衝液的情況下的水平相比分別為基礎環AMP水平的31%和61%(表18)。與在存在環AMP測定緩衝液的情況下的水平相比，這可以與在存在lyg/mL的5C9IgG的情況下33%的水平相比較(表18)。總5C9IgG在以野生型TSHR或以具有活化突變的TS服轉染的CHO細胞中對基礎環AMP產生的效應，與使用來自對阻斷型TS服自身抗體陽性的患者的血清時觀察到的效應類似。然而，在不同突變的情形下個體患者血清的效應是不同的(表19)。在野生型TSHR的情形下，一些血清顯示了刺激效應，19):'、；''1、化夕^或這逸含郝凝^^^7Sffi^C朋勿^7^AlCZJ^t^邀W放,在表達具有胺基酸突變的TSHR的CH0細胞中，將5C9對環AMP產生的刺激的效應擴展至包括以下至丙氨酸的突變Asp43、Glu61、Hisl05、Glul07、Phel30、Glul78、Tyrl85、Asp203、Tyr206、Lys209、Asp232、Lys250、Glu251、Thr257、Arg274和Asp276(表20a-p並總結於表21中)。將TS服的胺基酸Asp43、Glu61、Hisl05、Glul07、Tyrl85、Asp232和Thr275突變成丙氨酸，對5C9IgG抑制TSH刺激環AMP產生的能力沒有效應。通過將TSHRPhel30、Glul78、Asp203、Tyr206、Lys250、Glu251和Asp276突變成丙氨酸，降低了5C9抑制TSH刺激環AMP產生的能力。在Lys209Ala和Asp274Ala這兩個突變的情形下，5C9IgG抑制TSH刺激環AMP產生的能31力升高。總之(表7、20和21)，與野生型TS服比較，10個TSHR戎基Lys129、Phel30、Aspl51、Glul78、Lysl83、Asp203、Tyr206、Lys250、Glu251和Asp276都降低了5C9抑制TSH的環層刺激的能力。TSHR的Lysl29和Asp203突變顯示了最大的效應並引起對5C9活性的完全抑制。^t迷野j^7y朋^fiW勿^f"^^^迷^^^W^朋v^/^。A/a^勿^尹化凝逸4^Wj&;^""^考,洽75^介尋^^/*^^^邀^放^92%的抑制)在TSHRAsp203Ala突變的情形下降低至4%(表22)。阻斷'I;ijk清B4活性不受TSHRAsp203Ala突變的影響，而與野生型TSHR相比，在TS服Asp203Ala的情形下，使用阻斷'hijfe清B2和B3時觀察到對TSH誘導的環AMP刺激的抑制百分數稍低。在一種血清B5的情形下，觀察到對TSH誘導的環AMP刺激的抑制百分數出現了顯著降低；即在野生型和突變的TSHR中不同，分別抑制69%和30%。TSHRAsp203Ala突變對5C9活性的效應大於對阻斷'I^血清活性的效應，然而3/4的測驗血清的阻斷活性被影響至不同的程度。這可能表明了，用於阻斷TS服自身抗體的結合位點和5C9有重疊，但是與不同血清接觸的實際TSHR胺基酸中存在一些差異。總結和結論上文描述的實驗提供了這樣的證據，即根據本發明的抗體(例如5C9)能阻斷不同曱狀腺刺激物的刺激活性，所述甲狀船'J激物包括人和小鼠TSHR刺激性抗體、天然的人和動物TSH以及重IEATSH。再者，提供了這樣的證據，即兩種不同的阻斷類型的抗體——人MAb5C9和小鼠MAb9D33,在被單的刺激的能力，並且在被混合在一塊時顯示出對TSH或M22刺激的可相加阻斷效應。根據本發明的抗體(例如5C9)對TSHR基礎(即未受激的)環AMP活性的新效應。已通過使用具有更高基礎環AMP水平的TSHR轉染CHO細胞的實驗研究了這些效應，即已確證了根據本發明的抗體(例如5C9)對基礎環AMP活性的阻斷效應。再者，已表明，一些含有具有阻斷(拮抗劑)活性的TSHR自身抗體的血清在這些TSHR轉染的細胞中具有阻斷基礎環AMP活性的能力。這些實^ii提供了這樣的證據，即根據本發明的抗體(例如5C9和血清TSHR阻斷性抗體)對與活化TSHR突變相關的基礎環AMP活性有阻斷效應。這些結果強調，5C9是一種顯示阻斷類型的TSHR自身抗體的特徵的人Mab，即它是與自身免疫曱狀腺疾病相關的患者血清TSHR自身抗體的^R表。所述的實M使得可鑑定這樣的一些TSHR胺基酸，即這些TSHR胺基酸對於根據本發明的抗體的阻斷活性是重要的。總的來說，這些結a明，根據本發明的抗體(例如5C9)與在來自患自身免疫曱狀腺疾病患者的不同血清中出現的TSHR阻斷性抗體相比，顯示出類似的TSHR結合活'J^類似的對TS肌功能的生物效應。因此，由於具有血清阻斷性TSHR自身抗體的特徵和生物活性，根據本發明的抗體(例如5C9)可在多種臨床病症中用於將TSHR失活。這些病症包括TSH介導的TSHR活化、由曱狀腺刺激性TSHR自身抗體介導的TS肌活化、^A(即未受激的、組成型)TSHR活性以及與活化性TSHR突變相關的TSHR活化。因此，梠4t本發明控制；例如格雷夫k病、格雷一夫斯眼:、由TSHR活化突變引起的曱狀腺功能亢進症、由TSH水平異常(病理學的或藥理學的)引起的甲狀腺功能亢進症、曱狀腺癌和曱狀腺癌轉移。33力5C9IgG、捐淋巴細胞者IgG、捐淋巴細胞者血漿對於mI-TSH、1251-M22IgG或1251-5C9IgG與經TSHR塗覆的管結合的抑制tableseeoriginaldocumentpage34tableseeoriginaldocumentpage35標記的示蹤物與經TSHR塗覆的管的平均結合%為:在用"5l-TSH的實驗中14%;在用125I-M22IgG的實驗中21%;並JL在用125I-5C9的實驗中20%;HBD混合物=^J:捐血者血清的混合物；2G4=對照IgG(抗甲狀腺過氧化物酶的人MAb)。或2a5C9IgG或捐、淋巴細胞者血清IgG在表iiATSHR的CH0細胞中對於環AMP產生的TSH刺激的效應tableseeoriginaldocumentpage36a按所示將捐^血清稀釋於環AMP測定緩衝液b通過濁度法測定的未稀釋血清IgG濃度為14.3mg/mL5C9IgG和TSH稀釋於環AMP測定緩衝液中。5C9IgG、F(ab')2和Fab片M表iiATS服的CHO細胞中對TSH誘導的環AMP產生的抑制實施例1tableseeoriginaldocumentpage37樣品tableseeoriginaldocumentpage38i^M0^羊品的平均值2G4=對照IgG(抗甲狀lM:氧化物酶的人MAb)。抗體和TSH製品稀釋於環AMP測定緩衝液中。tableseeoriginaldocumentpage39tableseeoriginaldocumentpage409D33是一種可在表達TSHR的CHO細胞中阻斷由TSH和TRAb介導的對環AMP產生的刺激的小鼠抗體。抗體和TSH製品稀釋於環AMP測定緩沖液中。125I-5C9IgG、1251-TSH和125I-M22IgG與經TS肌塗覆的管的結合及患者血清樣品對其的抑制血清樣品'"I-5C9結合抑制(％)")I-TSH結合抑制(％)'"I-M22結合抑制(％)Nl15.709.3N23.31.27.2N315.31.90.7N44.04.20N518.96.311.4N65.92.91.4N717.17.29.4N85.500N911.24.22.9畫10.56.55.8Gl79.683.680.5G275.877.573.5G382.277.578.1G477.774.974.8G577.073.671.5G664.771.669.1G775.674.366.0G873.774.77741G976.178.579.2G1075.975.869.9Gll81.682.579.7G1271.676.673.9G1372.371.170.2G1481.985.880.9G1584.985.384.4G1680.584.981.7G1785.086.985.3G1884.98584.2G1985.187.385.4G2084.489.387.7G2177.684.977.0G2267.159.761.5G2357.562.259.5G2465.767.164.4G2559.356.362.3G2638.467.769.4G2722.059.158.9G2868.369.772.8G2940.954.250.4G3071.269.172G3162.259.262.042tableseeoriginaldocumentpage43或比較具有阻斷或刺激活性的患者血清對於,-5C9IgG、1251-TSH和I-M22IgG與經TS服塗覆的管的結合的抑制測定樣品'"I-5C9結合抑制(％)結合抑制(％)"5I-M22結合抑制(％)測定校驗物40U/L879084.48U/L626763.02U/L152725.61U/L4.31514.8陽性對照血清343538.7阻斷性血清Bl1/5939591.71/10929489.21/20919185.91/40858078.8函675567.4l膽333345.91/320201726.444tableseeoriginaldocumentpage45tableseeoriginaldocumentpage46tableseeoriginaldocumentpage47tableseeoriginaldocumentpage48Bl-B5為含有高水平的具有拮抗劑(阻斷)活性的TRAb的患者血清。B3是來自捐淋巴細胞者的5C9血清S1、S2和S4為含有高水平的具有激動劑(刺船活性的TRAb的患者血清。測定校驗物40U/L、8U/L、2U/L和1U/L為M22IgG在他豪捐血者血清混合物(HBD混合物)中的稀釋物，以U/L的NIBSC90/672表示的活性是通it^t經標記的TSH與經TSHR塗覆的管的結合的抑制來進#^估。formulaseeoriginaldocumentpage48其中A=試^^樣品；B=HBD混合物NT=未#1/5、1/10等表示"^^血清在HBD^^物中的稀釋因子，純品=未稀釋的血清在存在HBD混合物的情況下，大約20%、17%和12%的經1251-標記的M22IgG、5C9IgG和TSH分別結合於經TSHR塗覆的管。tableseeoriginaldocumentpage49tableseeoriginaldocumentpage50tableseeoriginaldocumentpage51tableseeoriginaldocumentpage52tableseeoriginaldocumentpage53tableseeoriginaldocumentpage54抗體稀釋於使泉捐血者血清混合物(HBD混合物)中,抑制％=100.百xlOO其中A=存在測驗樣品的情況下的結合％;B=存在HBD混合物的情況下的結合％。1具有曱狀腺刺激活性的小鼠TSHRMAb2可阻斷由TSH和TRAb介導的對環AMP產生的刺激的小鼠TSHRMAb(見表2)3抗曱狀J!^itlU匕物酶MAb的人MAb(陰性對照)4具有TSH阻斷活性的小鼠TSHRMAb(可識別由TS服胺基酸381-385形成的表位)5具有TSH阻斷活性的小鼠TSHRMAb(可識別由TSHR胺基酸36-42形成的表位)6具有TSH阻斷活性的小鼠TSHRMAb(可識別由TS服胺基酸246-260形成的表位)3小鼠TgMAb(陰性對照)在存在HBD混合物的情況下，大約13%、24%和15%的經1251-標記的5C9IgG、M22IgG和TSH分別結合於經TSHR塗覆的管。5C9IgG在表達人TS服的CH0細胞中對於由患者血清中TRAb對環AMP產生的刺激的效應實驗latableseeoriginaldocumentpage55tableseeoriginaldocumentpage56tableseeoriginaldocumentpage57T17+5C9IgGud僅T18910±126T18+2G4IgG830±21T18+5C9IgGud實驗ld樣品環AMP(ftnol/細胞孔平均值士SD;n=3)僅環AMP測定緩衝液487±75僅HBD混合物285±71HBD混合物+2G4IgG311±68HBD混合物+5C9IgG108±33僅Tll4052±233Tl1+2G4IgG4659±1260Til+5C9IgG154±33僅m4058±721T12+2G4IgG5556±593T12+5C9IgG145±241=兩次測定HBD混合物為M捐血者血清的混合物；這些實驗中所用的是在環AMP測定緩沖液中以1:10的稀釋度稀釋。Tl-T9和T11-T18為在表達TSHR的CH0細胞中刺激環層產生的血清。Tl-T9和Til-T18以1:10稀釋於環AMP測定緩衝液中進行"^。2G4是一種抗曱狀腺it!U匕物酶的人單克隆抗體(陰性對照)。2G4IgG和5C9IgG在lOOjig/mL下進行試驗。58tableseeoriginaldocumentpage59tableseeoriginaldocumentpage60Tl為在表達TS服的CHO細胞中刺激環AMP產生的患者血清樣品；以1:10稀釋於環AMP測定緩衝液中進行試驗。2G4是一種抗甲狀腺過氧化物酶的人單克隆抗體(陰性對照)。9D33為一種抗阻斷由TSH和TRAb刺激的環AMP產生的TSHR的小鼠單克隆抗體(膽2)formulaseeoriginaldocumentpage615C9IgG在表iiATSHR的CHO細胞中對於由患者血清TRAb對環AMP產生的刺激的劑量響應效應實驗3tableseeoriginaldocumentpage61單次測定見表6a和6b的說明性腳註。《M5C9IgG在表iiATSHR的CH0細胞中對於由患者血清中TRAb對環AMP產生的刺激的劑量響應效應樣品環AMP(finol/細胞孔平均值士SD;n-3)僅環AMP測定緩衝液622±79僅HBD混合物479±53僅T314023±2487僅100ng/mL2G4IgG745±136T3+100pg/mL2G4IgG12086±2613T3+10|ag/mL2G4IgG12862±250T3+1(jg/mL2G4IgG12931±891T3+0.1(xg/mL2G4IgG13853±1589T3+0.01pg/mL2G4IgG11939±131T3+0.001pg/mL2G4IgG13650±1679僅100Hg/mL9D33IgG616±U1T3+100|ag/mL9D33IgG1597±323T3+10ng/mL9D33IgG4262±367T3+1pg/mL9D33IgG7385±554T3+0.1pg/mL9D33IgG11960±13卯T3+0.01ng/mL9D33IgG12178±167662tableseeoriginaldocumentpage63或fe5C9IgG在表達人TSHR的CH0細胞中對於由TRAb患者血清對環AMP產生的刺激的劑量響應效應樣品環AMP(finol/細胞孔平均值土SD;n=3)僅環AMP測定緩衝液616±161僅HBD混合物312±56僅T196014±280僅100pg/mL2G4IgG1058±75T19+100jig/mL2G4IgG7142±215T19+10ng/mL2G4IgG6182±46T19+1|ag/mL2G4IgG7280±1052T19+0.1ng/mL2G4IgG7275±145T19+0.01ng/mL2G4IgG6820±729T19+0,001pg/mL2G4IgG7620±870僅IOO(xg/mL9D33IgG592±168T19+100pg/mL9D33IgG550±65T19+10ng/mL9D33IgG448±76T19+1ng/mL9D33IgG404±36T19+0.1pg/mL9D33IgG23941T19+0.01pg/mL9D33IgG5765164tableseeoriginaldocumentpage651xM^樣品的平均值2單次測定參見表6a和6b的說a月性腳註。^U屍5C9IgG在表達人TSHR的CH0細胞中對於由患者血清中TRAb對環AMP產生的刺激的劑量響應效應樣品環AMP(finol/細胞孔平均值±SD;n=3)僅環AMP測定緩衝液255±40僅HBD混合物200±82僅T214764±732僅100pg/mL2G4IgG835±94T20+100ng/mL2G4IgG6684±931T20+10|ig/mL2G4IgG4571±776T20+1ng/mL2G4IgG5744±727T20+0.1pg/mL2G4IgG4323±849T20+0.01ng/mL2G4IgG6396±1314T20+0.001ng/mL2G4IgG6789±893僅100pg/mL9D33IgG382±142T20+100jag/mL9D33IgG287±164T20+10pg/mL9D33IgG204±49T20+1ng/mL9D33IgG9801T20+0.1|ag/mL9D33IgG5362±574T20+0.01jag/mL9D33IgG5389±113966tableseeoriginaldocumentpage67^紐5C9IgG在表達人TSHR的CHO細胞中對於由患者血清中TRAb對環AMP產生的刺激的劑量響應效應樣品環AMP(finol/細胞孔平均值土SD;n=3)僅環AMP測定緩衝液466±65僅HBD混合物390±118僅T219781±1672僅100ng/mL2G4IgG999±55T21+100|^g/mL2G4IgG10848±373T21+10ng/mL2G4IgG10355±469T21+1|ig/mL2G4IgG廳l±140T21+0.1pg/mL2G4IgG12215±793T21+0.01|ag/mL2G4IgG13014±855T21+0細jxg/mL2G4IgG10500±162僅100pg/mL9D33IgG534±89T21十100ng/mL9D33IgG442±32T21+10ng/mL9D33IgG605±254T21+1pg/mL9D33IgG1383±66T21+0.1pg/mL9D33IgG8719±389T21+0.01ng/mL9D33IgG10772±79968tableseeoriginaldocumentpage69參見表6a和6b的說明性腳註。47a在表達野生型TSHR和Lys58突變成丙氨酸的TSHR的CH0細胞中TSH誘導的環AMP產生。不同稀釋度的5C9IgG的效應。tableseeoriginaldocumentpage701xM^樣品的平均值pTSH濃度=3ng/mL所有稀釋都於環AMP測定緩衝液中2G4是一種抗甲狀J^it!U匕物酶的人單克隆抗體(5C9的陰'l^照)。在表達野生型TSHR和Ile60突變成丙氨酸的TSHR的CHO細胞中TSH誘導的環AMP產生。不同稀釋度的5C9IgG的效應。tableseeoriginaldocumentpage71在表達野生型TSHR和Arg80突變成丙氨酸的TSHR的CHO細胞中TSH誘導的環AMP產生。不同稀釋度的5C9IgG的效應。試驗樣品產生的環AMP(finol/細胞孔；平均值土SD,n=3)突變/野生型(%)野生型TSHR突變TSHR僅環AMP測定緩衝液775±661165±32150僅TSH12467±51012930±1791042G410pg/mL+TSH13600±155514849±4621092G400|ag/mL+TSH11726±17713539±3141155C90.01pg/mL+TSH14410±133114273±1845995C90.1ng/mL+TSH11256±16279278±837825C91.0pg/mL+TSH6704±7911358±500205C910ng/mL+TSH2107±2641163±415555C9100ng/mL+TSH2234±540518±13323僅5C9100ng244±92494±163202參見表7a的說明'I":iJ鄉注。72在表達野生型TSHR和Arg80突變成天冬氨酸的TS服的CHO細胞中TSH誘導的環AMP產生。不同稀釋度的5C9IgG的效應。tableseeoriginaldocumentpage73參見表7a的說明，I;iJ御注。在表達野生型TSHR和Tyr82突變成丙氨酸的TSHR的CHO細胞中TSH誘導的環AMP產生。不同稀釋度的5C9IgG的效應。tableseeoriginaldocumentpage74tableseeoriginaldocumentpage75在表達野生型TSHR和Argl09突變成丙氨酸的TSHR的CHO細胞中TSH誘tableseeoriginaldocumentpage76參見表7a的說明性腳註。《7力在表達野生型TS服和Lysl29突變成丙氨酸的TSHR的CH0細胞中TSH誘導的環AMP產生。不同稀釋度的5C9IgG的效應。tableseeoriginaldocumentpage77參M7a的說明性腳註。《7/在表達野生型TSHR和Phel34突變成丙氨酸的TS肌的CHO細胞中TSH誘導的環AMP產生。不同稀釋度的5C9IgG的效應。tableseeoriginaldocumentpage78參見表7a的說明性腳註。^7_/在表達野生型TS服和Aspl51突變成丙氨酸的TSHR的CH0細胞中TSH誘導的環AMP產生。不同稀釋度的5C9IgG的效應。tableseeoriginaldocumentpage79tableseeoriginaldocumentpage80formulaseeoriginaldocumentpage81在表達野生型TS服和Aspl60突變成賴氨酸的TS服的CHO細胞中TSH誘導的環AMP產生。不同稀釋度的5C9IgG的效應。tableseeoriginaldocumentpage81參膽7a的其他說明',注。tableseeoriginaldocumentpage8247/7在表達野生型TSHR和Lysl83突變成天冬氨酸的TSHR的CH0細胞中TSH誘導的環AMP產生。不同稀釋度的5C9IgG的效應。tableseeoriginaldocumentpage83參見表7a的說明性腳註。47o在表達野生型TSHR和Gln235突變成丙氨酸的TSHR的CHO細胞中TSH誘導的環AMP產生。不同稀釋度的5C9IgG的效應。tableseeoriginaldocumentpage84參見表7a的說明性腳註。或7;在表達野生型TSHR和Arg255突變成丙氨酸的TSHR的CH0細胞中TSH誘導的環AMP產生。不同稀釋度的5C9IgG的效應。tableseeoriginaldocumentpage85或7《在表達野生型TSHR和Arg255突變成天冬氨酸的TSHR的CH0細胞中TSHi秀導的環AMP產生。不同稀釋度的5C9IgG的效應。tableseeoriginaldocumentpage86參見表7a的說明性腳註。在表達野生型TS服和Trp258突變成丙氨酸的TSHR的CH0細胞中TSH誘導的環AMP產生。不同稀釋度的5C9IgG的效應。tableseeoriginaldocumentpage87tableseeoriginaldocumentpage88formulaseeoriginaldocumentpage89比較使用基於對TSH-生物素結合或5C9IgG-生物素結合的抑制的ELISA獲得的血清TRAb測定結果tableseeoriginaldocumentpage89tableseeoriginaldocumentpage90tableseeoriginaldocumentpage91tableseeoriginaldocumentpage92tableseeoriginaldocumentpage93tableseeoriginaldocumentpage94重組體人TSH100ng/mL和0.1ng/mL5C9IgG7.39±1.74重組體人TSH100ng/mL和1.0ng/mL5C9IgG0.07±0.01重組體人TSH100ng/mL和10pg/mL5C9IgG0.07±0.01重組體人TSH100ng/mL和100pg/mL5C9IgG0.11±0.03僅天然的豬TSH0.3ng/mL40.2±4.0天然的豬TSH0.3ng/mL和O週|ag/mL5C9IgG.32.7±4.0天然的豬TSH0.3ng/mL和0.01ng/mL5C9IgG28.2±2.04天然的豬TSH0.3ng/mL和0.1pg/mL5C9IgG18.0±1.36天然的豬TSH0.3ng/mL和1.0pg/mL5C9IgG2.14±0.85天然的豬TSH0.3ng/mL和10pg/mL5C9IgG0.20±0.14天然的豬TSH0.3ng/mL和0.18±0.13100ng/mL5C9IgG95tableseeoriginaldocumentpage96tableseeoriginaldocumentpage97477a5C9IgG和9D33IgG對具有活化突變S281I的TSHR的組成型活性的效應稀釋於環AMP測定緩衝液中的試驗樣品表達TSHRS281I的CHO細胞中的環AMP濃度(p邁ol/mL平均值土SD;n=3)tableseeoriginaldocumentpage98a2G4是一種對照的抗曱狀腺過氧化物酶的人單克隆抗體。5C9IgG和9D33IgG對具有活化突變I568T的TSHR的組成型活性的效應tableseeoriginaldocumentpage99力7c5C9IgG和9D33IgG對具有活化突變A623I的TSHR的組成型活性的效應稀釋於環AMP測定緩衝液中的試驗樣品表達TSHRA621I的CH0細胞中的環AMP濃度(pmo1/mL平均值±SD;n=3)僅緩衝液36.89a0細|ig/mL2G4IgG28.46±2.310.01ng/mL2G4IgG33.44±1.120.1jiig/mL2G4IgG30.40±7.931)ng/mL2G4IgG28.96±2.290遍pg/mL5C9IgG26.52±1.330.01pg/mL5C9IgG27.03±2.130.1jng/mL5C9IgG19.79±0.481pg/mL5C9IgG16.43±1.270扁pg/mL9D33IgG29.55±3.150.01)ig/mL9D33IgG27.64±3.490.1pg/mL9D33IgG31.78土9.181pg/mL9D33IgG■9±7.73兩次測定100tableseeoriginaldocumentpage101實驗3環AMP測定緩衝液中的試驗樣品環層濃度(pmoI/mL平均值±SD;n=3)僅緩衝液0.99±0.03TSH3ng/mL51.3+5.0100pg/mL9D331.14±0.13100ng/mL5C90.50±0.04100pg/mL9D33+100^g/mL5C90.66±0.9100ng/mL9D33+TSH10.53±0.84100pg/mL5C9+TSH1.4±0.18100pg/mL9D33+100pg/mL5C9+TSH1.3±0.3610ng/mL9D33+TSH13.5土2.9lOpg/mL5C9+TSH1.9±U10ng/mL9D33+10|ag/mL5C9+TSH1.2±0.11Mg/mL9D33+TSH27.8±2.21ng/mL5C9+TSH5.4土1.81ng/mL9D33+1|ag/mL5C9+TSH5.2±0.30.1ng/mL9D33+TSH35.1土2.30.1ng/mL5C9+TSH18.7±3.40.1lig/mL9D33+0.1ng/mL5C9+TSH14.4土1.00.01ng/mL9D33+TSH47.1±1.90.01^g/mL5C9+TSH33.9±7.80.01jag/mL9D33+0.01ng/mL5C9+TSH27.8±1.3102tableseeoriginaldocumentpage103環AMP測定緩衝液中的試驗樣品環AMP濃度(pmol/mL平均值士SD;n=3)僅緩衝液1.83+0.64TSH0.3ng/mL17.26±1.5lO^g/mL9D332.07土0.5210pg/mL5C90.38±0.210jig/mL9D33+10Mg/mL5C90.96±0.14lO^g/mL9D33+TSH3.57±0.5810|ag/mL5C9+TSH1.17±0.0010ng/mL9D33+10pg/mL5C9+TSH1.58±0.205pg/mL9D33+TSH3.71±0.105|ig/mL5C9+TSH1.21±0.361(ag/mL9D33+TSH6.38±1.351pg/mL5C9+TSH2.57±0.651jag/mL9D33+1|a^mL5C9+TSH1.46±0.590.1pg/mL9D33+TSH14.67±4.690.1ng/mL5C9+TSH12.43±1.590.1pg/mL9D33+0.1jag/mL5C9+TSH9.99±3.781044"5C9加9D33在表達野生型TSHR的CH0細胞中對於阻斷由M22Fab介導的對基礎環AMP產生的刺激的效應實驗l環tableseeoriginaldocumentpage105環AMP測定緩沖液中的試驗樣品環AMP濃度(praol/mL平均值土SD;n=3)tableseeoriginaldocumentpage106tableseeoriginaldocumentpage107環AMP測定緩衝液中的試驗樣品環AMP濃度(pmol/mL平均值土SD;n-3)僅緩衝液1.29+0.68M220.3ng/mL31.1+9.4100ng/mL9D332.38±1.11雨iag/mL5C90.12±0.09100ng/mL9D33+100ng/mL5C90.81±0.15100pg/mL9D33+M222.00±0.87100ng/mL5C9+M220.22±0.11100pg/mL9D33+100ng/mL5C9+M220.40±0.1810pg/mL9D33+M221.25±0.0910pg/mL5C9+M220.40±0.1710ng/mL9D33+10(ig/mL5C9+M220.45±0.311ng/mL9D33+M222.66±0.641pg/mL5C9+M220.21±0.181pg/mL9D33+1ng/mL5C9+M220.14土0.070.1ng/mL9D33+M2227.6土2.50.1pg/mL5C9+M226.0±2.60.1pg/mL9D33+0.1pg/mL5C9+M227.2±3.90.01ng/mL9D33+M2238.9±6.40.01ng/mL5C9+M2231.5±4.00.01jig/mL9D33+0.01jag/mL5C9+M2220.6±5.30細|ag/mL9D33+M2243.2±7.90.001pg/mL5C9+M2233.1±4.00.001jag/mL9D33+0.001pg/mL5C9+M2225.3±6.01084"5C9和9D33IgG在表達野生型TSHR的CHO細胞(每個細胞大約5x10個受體)中對基礎環AMP產生的效應實驗ltableseeoriginaldocumentpage109在不表達TSHR的對照CHO細胞中，在存在環AMP測定緩衝液的情況下基礎環層產生量為l.02±0.06pmol/mL(平均值土SD;n=3),站存在3ng/mL的TSH的情況下為0.74±0.32pmol/mL(平均值±SD;n=3)。-ve=陰性，即不抑制環AMP產生。tableseeoriginaldocumentpage1105C9Fab和F(ab')在表達野生型TSHR的CHO細胞中對基礎環AMP產生的效應環AMP測定緩衝液中的試驗樣品環AMP濃度P,VmL(平均值±SD;n=3)基礎環AMP產生量的抑制X僅環AMP測定緩衝液59.4±8.609D33IgG100ng/mL67.8±1.09D33IgGlOiag/mL79.4±9.8-V69D33IgG1jxg/mL71.5±8.8-V69D33IgG0.1|xg/mL75.6±8.9-V69D33IgG0.01ng/mL60.5±7.5-V69D33IgG0.001ng/mL52.3±6.3125C9IgG100pg/mL26.2±1.8565C9IgG10pg/mL24.5±5.859111tableseeoriginaldocumentpage112力J具有拮抗劑活性的患者血清TSHR自身抗體(B2-B5)在表達TSHRI568T活性突變的CHO細胞中對基礎環AMP水平的效應實驗ltableseeoriginaldocumentpage113實驗2試驗樣品和血清稀釋度環AMP濃度pmol/mL(平均值±SD;n=3)基礎環AMP產生量的抑制M僅環AMP測定緩衝液19.7±3.70HBD混合物/1028.0±1.6-V6HBD混合物/5018.1±3.98HBD混合物膽18.0±1.69HBD混合物/50017.8±1.310HBD混合物/100020.7±2.9-V6HBD混合物/500015.6±2.120B3/1014.7±2.225B3/5013.7±1.331B3細12.6±0.636B3/50019.0±0.84B3細O18.4±4.67B3/500017.6±0.911B4/104.0±0.580B4/503.6±0.881B4膽3.8±1.181B4/5007.2±2.664B4/100012.0±0.639B4/500017,7±2.710-ve=陰性，即不抑制環AMP產生。HBD混合物-#^捐血者血清的混#114Nl-N3=個體的^J:捐血者血清所有血清都稀釋於環AMP測定緩衝液中。幻f具有拮抗劑活性的患者血清TS服自身抗體(B2-B5)在表達TSHRS281I活性突變的CHO細胞中對基礎環AMP水平的效應試驗樣品和血清稀釋度環AMP濃度pmol/mL(平均值±SD;n喝基礎環AMP產量的抑制4僅環AMP測定緩衝液11.2±2.00HBD/1012.1±0.6-8HBD/5010.0±2.011Nl/108.0±1.628Nl/5010.8±3.34N2/108.8±1.421N2/508.8±2.322N3/1010.0±0.817N3/509.3±1.717B2/107.7±03931B2/505.7±1.349B3/105.4±0.552B3/506.6±1.141B4/105.4±1.152B4/504.910.756B5/109.1±2.518B5/507.610.832115參M15的說明性御注。在用TSHRS281I的實驗中，1pg/mL的5C9IgG引^hi^環層活性的71%#制。^t〃具有拮抗劑活性的患者血清TSHR自身抗體(B2-B5)在表達TSHRA623I活性突變的CHO細胞中對基礎環AMP水平的效應tableseeoriginaldocumentpage116參Ml5的說明性腳註。在用TS服A623I的實驗中，1pg/mL的5C9IgG引^t基礎環AMP活性的49%#制。《7《具有拮抗劑活性的患者血清TS肌自身抗體(B2-B5)在表達野生型TSHR的CHO細胞(每個細胞大約5x105個受體)中對基礎環雄水平的效應tableseeoriginaldocumentpage117基礎環AMP產生量的改變(%)=存在試驗樣品的情況下的環AMP產生量、:存在環AMP測定緩衝液的情況下的環AMP產生量XM在1pg/mL的5C9IgG的情況下，基礎環AMP水平降低至在存在環AMP測定緩衝液的情況下的水平的33%。《"具有拮抗劑活性的患者血清TSHR自身抗體(B2-B5)在TSHR轉染的CHO細胞中對基礎環AMP水平的效應的總結CHO細胞存在以下物質的情況下環AMP的濃度(fmol/細胞孑L;平均值士SD，n=3):.tableseeoriginaldocumentpage119。HBD混合物=健康捐血者血清的混合物所使用的HBD混合物和血清B2-B5為以1:10稀釋於環AMP測定緩衝液中。所使用的5C9IgG為以lpg/mL的濃度溶於環AMP測定緩衝液中。B2-B5在表達野生型TSHR的CHO細胞中阻斷由TSH或M22對環AMP產生的刺激。或2&5C9IgG在表達野生型TSHR和Asp43突變成丙氨酸的TSHR的CH0細胞中對pTSH刺激的環AMP產生的效應tableseeoriginaldocumentpage1201兩次測定的平均值2單次測定pTSH濃度=3ng/mL所有稀釋都是在環AMP測定緩衝液中a5B3是一種抗穀氨酸脫羧酶(GAD)的人單克隆抗體(5C9的陰性對照)。《2卵5C9IgG在表達野生型TSHR和Glu61突變成丙氨酸的TSHR的CH0細胞中對pTSH刺激的環AMP產生的效應試驗樣品tableseeoriginaldocumentpage121tableseeoriginaldocumentpage122雀廁5C9IgG在表達野生型TSHR和Glu107突變成丙氨酸的TSHR的CHO細胞中對pTSH刺激的環AMP產生的效應實驗ltableseeoriginaldocumentpage123參見表20a的說明性腳註。tableseeoriginaldocumentpage124參見表20a的說明性腳註。tableseeoriginaldocumentpage125tableseeoriginaldocumentpage1265C9IgG在表達野生型TSHR和Tyr185突變成丙氨酸的TSHR的CH0細胞中對pTSH刺激的環AMP產生的效應tableseeoriginaldocumentpage127UD=低於測定檢測的限值。參見表20a的說明性腳註。衷2處5C9IgG在表達野生型TSHR和Asp203突變成丙氨酸的TSHR的CHO細胞中對pTSH刺激的環AMP產生的效應tableseeoriginaldocumentpage128參見表20a的說明性腳註。5C9IgG在表達野生型TSHR和Tyr206突變成丙氨酸的TSHR的CHO細胞中對pTSH刺激的環AMP產生的效應試驗樣品tableseeoriginaldocumentpage1294W5C9IgG在表達野生型TSHR和Lys209突變成丙氨酸的TSHR的CHO細胞中對pTSH刺激的環AMP產生的效應tableseeoriginaldocumentpage130參見表20a的說明性腳註。tableseeoriginaldocumentpage1315C9IgG在表達野生型TSHR和Lys250突變成丙氨酸的TSHR的CHO細胞中對pTSH刺激的環AMP產生的效應試驗樣品產生的環AMP(finol鈿胞孔；平均值士SD，n=3)突變/野生型(％)tableseeoriginaldocumentpage132參見表20a的說明性腳註。5C9IgG在表達野生型TSHR和Glu251突變成丙氨酸的TSHR的CHO細胞中對pTSH刺激的環AMP產生的效應tableseeoriginaldocumentpage133參見表20a的說明性腳註。《，5C9IgG在表達野生型TSHR和Thr257突變成丙氨酸的TSHR的CH0細胞中對pTSH刺激的環AMP產生的效應tableseeoriginaldocumentpage134參見表20a的說明性腳註。tableseeoriginaldocumentpage1354卿5C9IgG在表達野生型TSHR和Asp276突變成丙氨酸的TSHR的CHO細胞中對pTSH刺激的環AMP產生的效應實驗l試驗樣品產生的環AMP(finol鈿胞孔；平均值士SD,n=3)突變/野生型(％)野生型TSHR突變TSHR僅環AMP測定緩衝液365±1661454±258398僅TSH17500±72722416±25701285B3alOpg/mL+TSH19354±179425180±56091305B3a100ng/mL+TSH21671±206425707±41011195C90.01ng/mL+TSH17236±270526212±25971525C90.1ng/mL+TSH5594±72316856±21103015C91.0pg/mL+TSH759'4788±5536315C9lO^g/mL+TSH366±1451384±6023785C9lOOjig/mL+TSH344±566565±176164僅5C9100ng/mL300±242602±274201參見表20a的i兌明性腳註。實驗2試驗樣品產生的環AMP(finol/細胞孔；平均值士SD，n=3)突變/野生型(％)野生型TSHR突變TSHR僅環AMP測定緩衝液156±30601±190385僅TSH13852±75614616±4531065B3a10|ig/mL+TSH13025±329217706'1365B3a100jig/mL+TSH14245±1024I翻±45611275C90.01|ig/mL+TSH14066±229121213±34431515C90.1n咖L+TSH4462±3637320±16141645C91.0|ag/mL+TSH657±2571513±8352305C910pg/mL+TSH541±2241301±9112405C9100ng/mL+TSH286±184288±87101僅5C9100pg/mL208±15314±69151參見表20a的說明性腳註。137tableseeoriginaldocumentpage138tableseeoriginaldocumentpage139所使用的pTSH濃度=3ng/mL。TSHR突變的相對效應表示為使用野生型所觀察到的百分數，如下一+++++=100%的野生型活性；++++=〈100-80%的野生型活性；+++=<80-60%的野生型活性；++=<60-40%的野生型活性；+=<40-20%的野生型活性；0=100%=+++++++。NT=未試驗。a由於對TSH無應答，使用M22測驗該實驗中對環AMP的刺激(詳見正文)。139TSHRAsp203Ala突變對以下方面的效應具有拮抗劑活性的患者血清TSHR自身抗體(B2-B5)阻斷由TSH對環AMP產生的刺激的能力試驗樣品和血清稀釋度a野生型TSHR環AMP濃度finol/細胞孔。平均值±SD;n=3野生型TSHR對TSH刺激的環AMP水平的抑制％&TSHRAsp203Ala環AMP濃度fino1/細胞孔。平均^LhSD;n=3TSHRAsp203Ala對TSH刺激的環AMP水平的抑制f環AMP測定緩衝液242±130292±89TSHC9357±11557591±832TSHC+1pg/mL1110±811929400145C9HBD混合物/10183±67496±76TSHC+HBD13303±18190975610pool/10B2/10110±36270±72TSHC+B2/10454±381971963±35780B3/10329'582±74TSHC+B3/103407±1341744027±27859B4/1059±22161±36TSHC+B4/10278±7398150±4198B5/10647±1701064±228TSHe+B5/104173±515696871±618301稀釋於環AMP測定緩衝液中。b對TSH誘導的環AMP刺激的抑制W存在試驗樣品/10和TSH(3ng/mL)的情況下產生的環AMPX|_—存在/10HBD混合物和TSH(3ng/mL)的情況下產生的環AMP1雙份樣品的平均值epTSH以3ng/mL的終濃度使用。HBD混合物=健康捐血者血清的混合物。140權利要求1.一種分離的抗促甲狀腺激素受體(TSHR)的人抗體，所述抗體是一種促甲狀腺激素(TSH)的拮抗劑。2.—種分離的抗TSHR的人源化抗體，所述抗體是一種TSH的拮抗劑。3.根據權利要求1或2的抗體，所述抗體是一種甲狀腺刺激性抗體的拮抗劑。4.根據權利要求1、2或3的抗體，所述抗體具有患者血清TSHR自身抗體的TSH拮抗劑特性，所述患者血清TSHR自身抗體是TSH拮抗劑。5.根據權利要求3或4的抗體，所述抗體是一種TSH的拮抗劑，並且是一種曱狀腺刺激性抗體的拮抗劑。6.根據任一項前逸權利要求的抗體，所述抗體具有患者血清TSHR自身抗體的拮抗劑特徵，所述患者血清TSHR自身抗體是甲狀腺刺激性抗體的拮抗劑。7.根據任一項前it^利要求的抗體，所述抗體是一種TSH、M22或者對TS肌有刺激活性的抗體或有阻斷活性的抗體與TSHR或其一部分結合的抑制劑。8.根據權利要求7的抗體，其中所述TSHR部分包括TSHR的富含亮氨酸的結構域(LRD)或其相當大的部分。9.根據權利要求7或8的抗體，所述抗體阻斷這種結合。10.根據任一項前i^K利要求的抗體，所述抗體是一種單克隆抗體或重組抗體，或者包含其片段或由其片^i且成。11.根據任一項前逸&利要求的抗體，所述抗體包含一個Vh區，所述VH區包含一個或多個選自以下的互補決定區(CDR):a)S證S(CDR1);b)VTYSGGSTSYADSVKG(CDR2);或c)GGRYCSSISCYARSGCDY(CDR3)或者一種或多種基本與這些CDR同源的M酸序列。12.根據任一項前述權利要求的抗體，所述抗體包^-~個Vl區，所述VL區包含一個或多個選自以下的CDR:a)RASQSISNYLN(CDR1);b)AASSLQS(CDR2);或c)QQSYSSPSTT(CDR3)或者一種或多種基本與這些CDR同源的M酸序列。13.根據任一項前*利要求的抗體，具有約101。L/mol的對^v全長TSHR的結合親和力。14.根據ii^利要求1-12任一項的絲，具有約109L/mol的對人全長TS服的結合親和力。15.—種核苷酸，包括a.—種編碼根據權利要求1-14任一項的抗體的核苷酸序列；b.選自以下的核苷酸序列或其一部分gaagtgcagctggtggagtctggaggaggcctgatccagcctggggggtceetgagactctcct^gcagcctctgggtteaecgtcagtageaaetacatgag鄰ggtccgcc鄉eteeagggaagggget,gtgggtctcagttaettategcg織ggtagMcatcctacgcagactccgtg鄉ggccgattea^catctccagagacaattccaapacacgctgtatctteaaatgaacagcctga鵬ccgagg纖鄉ccgtgtattaet跑cgagaggggggcgatattgtagtagtataagctgctacgcgaggagcgggtgtgactact鵬gcoagg接aacectggtcacc^ctcctcagcctceaccaagggcceateggtottccccctggcaccctcctccaagageacctctgggggcaeagcggccetgggd:g<xtggteaaggactacttcccc,ccggtgacggt:gtcgtggaactcaggcgccctgacc8gcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctoaggactetact(xetcagcagegtggtgacc魄ecctccagcagcttgggcacccagacctacatetgcaaGgtgaateacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactagt;或gccatocagatgacccagtaccttcctccctgtet接catetgtag^tgacagagteaccateaettgccgggcaagtca鵬cattageaacta飾aatt敏atcagcagaaaeca鵬aaagccGctaagetcctgatetatgctgeatccagtttgcaaagtggggtoccateaaggttca魏geagtggatccaacttaetactgtcaacagagtt織gttecccctccaceaettttggecaggggaccaagctggagat備acgaactgtggctgcaecatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataaettetatcccagagaggccaaagtaeagtggaaggtggateacgccetecaatcgggtaacteccag鵬敏gtoacagagcagpicagcaaggacagcacctacagccteagcagcaccctgacgct伊gcaaagcagactacgagaaacac繊夢etacgcctgcgaagtcaeecatcagggcctgagetcgcccgt所述核苷酸序列或其一部分編碼抗體Vh結枸域;以及抗體Vl結枸域或者選自以下的CDR:i.SNYMS《CDIU);",VTYSGGSTSYADSVKG(CDR2);iii.GGRYCSSISCYARSGCDY(CDR3);iv.RASQSISNYLN(CDR1);v.AASSLQS(CDR2);或vi.QQSYSSPSTT(CDR3);或者C.一種與a.或b.的核苷酸序列高度同源的核苷酸序列，以及一種編碼以至少約109L/mo1的親和力與TS服結合的抗體的核苷酸序列。16.—種包含根據權利要求15的核苷酸的栽體。17.—種包含根據權利要求1-14任一項的抗體的分離的細胞。18.—種表達根據權利要求1-14任一項的抗體的分離的細胞。19.一種分泌根據權利要求1-14任一項的抗體的分離的細胞。20.根據權利要求17、18或19的分離的細胞，所述細胞來自一種穩定的雜交瘤細胞系。21.—種組合物，所述組合物包含確定濃度的TS服自身抗體，並包含一種根據權利要求1-14任一項的抗體。22.—種組合物，所iy且合物包^^確定濃度的具有TSH拮抗劑活性的TS肌自身抗體，包括一種根據權利要求1-14任一項的抗體。23.—種組合物，所述組合物包含確定濃度的TS肌自身抗體，包括一種根據權利要求1-14任一項的抗體，所述TSHR自身抗體為甲狀動'J激性抗體的拮抗劑。24.—種組合物，所i^i且合物包含確定濃度的具有TSH拮抗劑活性的TS肌自身抗體，包括一種根據權利要求1-14任一項的抗體，所述TSHR自身抗體為甲狀腺刺激性抗體的拮抗劑。25.—種用於給予哺乳動物受試者以治療一種甲狀糾目關病症的藥物組合物，包含根據權利要求1-14任一項的抗體和可藥用載體。26.根據權利要求25的藥物組合物，其中所述曱狀糾目關病症選自甲狀腺活動過度、格雷夫斯眼病、新生兒甲狀腺功能亢進症、M毛膜促性腺激素誘導的曱功能亢進症、脛骨前粘液水腫、甲狀腺癌和曱狀腺炎。27.根據權利要求25或26的藥物組合物，所述藥物組合物適^^對A^藥。28.根據權利要求25、26或27的藥物組合物，其中所述抗體對所述受試者的免疫系統沒有顯著不利影響。29.根據權利要求25-28任一項的藥物組合物，所i^J且合物包括一種或多種另外的促曱狀^素受⑩抗劑。30.根據權利要求29的藥物組合物，其中所述另外的促甲W^激素受體拮抗劑為9D33。31.根據權利要求25-30任一項的藥物組合物，用於以一種可注射形式治療一種甲狀l^目關病症。32.根據權利要求25-30任一項的藥物組合物，用於以一種局部給藥形式治療脛骨前粘液水肺。33.根據權利要求25-30任一項的藥物組合物，用於以滴眼劑的形式治療格雷夫斯眼病。34.—種產生根據權利要求1-14任一項的抗體的方法，所述方法包括培養一種根據權利要求17-20任一項的細胞，從而通過所述細胞表達所述抗體。35.根據權利要求34的方法，其中通過所述細胞分泌所述抗體。36.—種在哺乳動物受試者中或者在源自所述受試者的細胞中治療一種曱狀糾目關病症的方法，所述方法包括將所述受試者或所述細胞與4艮據權利要求1-14任一項的抗體相接觸。37.根據權利要求36的方法，其中所述甲狀斜目關病症選自甲狀腺活動過度、格雷夫斯眼病、新生兒甲狀腺功能亢進症、人絨毛膜促性g素誘導的曱M功能亢進症、脛骨前粘液水腫、曱狀腺癌和甲炎。38.—種在哺乳動物受試者的曱狀腺中抑制甲狀腺刺激性自身抗體剌激TSHR的方法，所述方法包括將所述受試者與根據權利要求1-14任一項的抗體相接觸。39.根據權利要求38的方法，其中甲旨刺激性自身抗體與TSHR的結^s故阻止。40.—種在哺乳動物受試者中抑制曱狀腺刺激性自身抗體與甲狀腺外TSHR結合的方法，所述方法包括將所述受試者與根據權利要求1-14任一項的抗絲接觸。41.根據權利要求40的方法，其中所述甲狀腺外TSHR位於所述受試者的眶後組織和/或脛骨前組織。42.#4§權利要求40或41的方法，其中所述抗體可阻斷TS服自身抗體與曱狀J!^卜TS服的結合。43.—種在受試者中或在源自受試者的甲#細胞中治療甲狀腺中的甲狀腺癌或者轉移的甲狀腺癌的方法，所述方法包括將所述癌細胞與^^據權利要求1-14任一項的抗體相接觸，目的是在所述細胞中抑制組成型促甲狀腺激素受體活性。44.根據權利要求43的方法，其中所述甲狀腺癌細胞的再生長被12Uh或者fel遲。45.—種在受試者中或在源自受試者的甲狀腺細胞中治療由組成型甲狀腺活'l^it成的曱狀腺活動it^的方法，所述方法包括將所述受試者或細胞與才艮據權利要求1-14任一項的抗體相接觸，目的是抑制這種甲狀腺活動it^。46.根據權利要求36-45任一項的方法，其中所述受試者是人。47.根據權利要求1-14任一項的抗體用於治療一種曱狀IM目關病症的用途。48.,權利要求1-14任一項的抗體在製備用於治療一種曱狀糾目關病症的藥劑製品中的用途。49.根據權利要求1-14任一項的抗體，用於醫學療法。50.根據權利要求l-14任一項的抗體用於治療一種甲狀糾目關病症。51.根據權利要求50的抗體，其中所述甲狀糾目關病症選自甲狀腺活動過度、格雷夫斯眼病、新生兒甲M功能亢進症、人絨毛膜促性腺激素誘導的甲狀腺功能亢進症、脛骨前粘液水腫、甲狀腺癌和甲狀腺炎。52.—種表徵TS服抗體的方法，所述方法包括確定一種待測驗TSHR抗體與一種具有TSHR-相關^酸序列的多肽的結合情況，其中所述方法涉及一步使用根據權利要求1-14任一項的抗體的方法步驟。53.根據權利要求52的方法，所述方法包括確定根據權利要求1-14任一項的抗體對於TSHR抗體與所述多肽的結合的效應。54.根據權利要求53的方法，其中所述TS服-相關多肽包含全長的人TSHR。55.—種^^徵TSH和相關分子的方法，包^^確定待測驗的TSH或一個相關分子與一種具有TSHR-相關^酸序列的多肽的結合情況，其中所述方法涉及一步使用根據權利要求1-14任一項的抗體的方法步驟。56.—種ELISA形式的根據權利要求55的方法。57.—種確定參與結合作為拮抗劑的TS服自身抗體的TSHRJL^酸的方法，所述方法包括提供一條具有根據權利要求1-14任一項的抗體可結合的TSHR-相關第一^J^酸序列的多肽、在所述TSHR-相關的^J^酸序列中修飾至少一個胺基酸，以及確定這樣的改變對所述抗體結合的效應。58.—種改變一種根據權利要求1-14任一項的抗體的方法，所述方法包括修飾所述抗體的至少一個胺基酸，以及確定這樣的修飾對結合於一條TS肌-相關序列的效應。59.根據權利要求58的方法，其中選擇對所述TSHR的親和力增強的經修飾TSHR抗體。60.—種鑑定可抑制甲狀腺刺激性抗體與TSHR結合的分子的方法，所述方法包括提供至少一種根據權利要求1-14任一項的抗體作為參照物。61.根據權利要求60的方法，其中選擇阻止甲狀腺刺激性抗體與TSHR結合的分子。62.—種鑑定可抑制甲狀腺阻斷性抗體與TS肌結合的分子的方法，所述方法包括提供至少一種根據權利要求1-14任一項的抗體，作為參照物。63.根據權利要求62的方法，其中選擇阻止甲狀腺阻斷性抗體與TS服結合的分子。全文摘要本發明提供了一種分離的TSHR抗體，所述抗體是一種TSH的拮抗劑。本發明還涉及應用本發明的抗體的方法。文檔編號C07K16/18GK101657468SQ200880011577公開日2010年2月24日申請日期2008年2月14日優先權日2007年2月15日發明者B·瑞斯史密斯,J·桑德斯,J·福爾曼克申請人:Rsr有限公司