一種工業黃酒酵母單倍體的分離方法

2023-10-23 11:23:37 2

專利名稱：一種工業黃酒酵母單倍體的分離方法
技術領域：
本發明屬於生物工程和發酵技術領域，具體涉及一種工業黃酒酵母單倍體的高效分離方法。
背景技術：
工業黃酒酵母菌株大多數是從自然界或發酵產品中分離而來，這些野生型菌株多為二倍體甚至多倍體，其複雜的倍性給酵母改良、代謝工程改造和遺傳研究帶來了諸多困難，很難直接通過誘變處理或基因改造得到二倍體突變株，這是因為上述改造處理只能得到顯性突變，許多隱性突變則被漏掉，且由於多倍體菌株缺少營養缺陷型等篩選標記，增加了改造難度，而以單倍體形式存在的黃酒酵母(如經改造的實驗室黃酒酵母菌株)基因信息簡單明了，交配能力 強，因此，一般先將二倍體或多倍體菌株通過生孢拆分獲得單倍體菌株，首先對單倍體進行基因工程改造獲得性狀優良的突變株後再通過有性交配恢復為二倍體菌株。綜上可見，單倍體的篩選分離是極為關鍵的一步。現有技術一般直接通過工業菌株生孢、蝸牛酶酶解以及YPD平板分離來獲得單倍體，往往單倍體的分離率和成活率較低；此外，已有研究表明，黃酒酵母的HO基因能表達一種內切酶，在酵母生孢過程中將導致單倍體配型(a型或α型)轉換，從而與周圍的異型孢子結合恢復為二倍體，因此，HO基因具有活性的菌株不易分離出單倍體，而工業黃酒酵母HO基因一般具有活性，這就進一步增大了其單倍體的分離難度。鑑於此，尋找一種快速、高效的工業黃酒酵母單倍體分離方法十分必要。

發明內容
針對現有技術存在的上述缺陷，本申請人經過研究改進，提供一種工業黃酒酵母單倍體的分離方法。本發明可快速、高效地分離獲得不含外來抗性基因的工業黃酒酵母單倍體，具有單倍體分離率和成活率高、工藝簡單、生產成本低的優點。本發明的技術方案如下:一種工業黃酒酵母單倍體的分離方法，是通過同源重組將所述工業黃酒酵母的HO基因進行了敲除；該分離方法具體操作步驟如下:(I)HO基因敲除組件的構建:首先利用普通PCR擴增得到黃酒酵母HO基因的上、下遊同源臂擴增片段以及帶有G418抗性標記的kanMX基因擴增片段，再通過降落PCR擴增得到上述三個片段的融合片段，最後利用普通PCR對所述融合片段進行特異性擴增即得黃酒酵母HO基因敲除組件；所述上遊同源臂擴增片段包括上遊同源臂序列及與kanMX基因5』端互補的序列(簡稱序列A)，所述下遊同源臂擴增片段包括下遊同源臂序列及與kanMX基因3』端互補的序列(簡稱序列B);所述kanMX基因擴增片段包括kanMX基因序列及位於該片段兩端分別與上遊同源臂序列3』端、下遊同源臂序列5』端互補的序列(分別簡稱序列C和序列D);所述kanMX基因序列與所述序列C、序列D之間均含有可被Cre重組酶識別的1xp位點；所述序列A、序列B、序列C和序列D均為20 30bp ；
(2)黃酒酵母HO基因的敲除:將步驟(I)所得HO基因敲除組件轉化工業黃酒酵母菌株，通過G418抗性篩選獲得陽性轉化子並鑑定；(3)黃酒酵母單倍體的分離:取步驟(2)中鑑定正確的陽性轉化子接種於YPD培養基進行活化；收集酵母泥並將其堆積於生孢培養基，於26 28°C培養3 5d ;挑取所述生孢培養基上的菌落，經蝸牛酶酶解破壁處理得酶解菌液，振蕩打散孢子，再塗布於YPD培養基於28 30°C培養至菌落長出，挑取菌落經鑑定正確後得到含有抗性基因kanMX的單倍體菌株；(4)抗性基因的切除:將含有Cre重組酶基因的工程質粒轉化步驟(3)所得單倍體菌株，取陽性克隆轉化子接種於半乳糖培養基連續培養5 10代，誘導Cre重組酶表達以切除抗性基因kanMX，得到抗性基因丟失菌株；將該菌株連續培養10代以上，丟失上述工程質粒，即得不含外來抗性基因的工業黃酒酵母單倍體菌株。其進一步的技術方案為:步驟(I)所述降落PCR擴增反應無引物參與，其擴增條件如下:95°C預變性4 5min，98°C變性10 15s，70°C退火15 30s，每個循環退火溫度降低I°C，共15個循環，於72°C延伸2.5 3min，然後於55°C退火溫度下再循環一次，最後於72°C再延伸5 lOmin。優選的，所述降落PCR的擴增條件如下:95°C預變性4min，98°C變性10s，70°C退火15s，每個循環退火溫度降低1°C，共15個循環，於72°C延伸3min，然後於55°C退火溫度下再循環一次，最後於72°C再延伸lOmin。步驟(I)所述上遊同源臂擴增片段的擴增引物序列如SEQ ID N0:UPSEQ ID NO:2所示，步驟(I)所述下遊同源臂擴增片段的擴增引物序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。

步驟(I)所述kanMX基因擴增片段的擴增引物序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8所示。步驟(I)所述融合片段的特異性引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示。步驟(3)所述活化溫度為30°C，培養時間24 36h。步驟(4)所述含有Cre重組酶基因的工程質粒選自pSH47、pSH62、pSH63或pSH65。步驟(4)所述半乳糖培養基含有100 μ g/mL的博來黴素(Zeocin)本發明的有益技術效果在於:本發明首先利用降落PCR和普通PCR成功構建得到高特異性黃酒酵母HO基因敲除組件(HO基因上遊同源臂一篩選標記抗性基因kanMX——HO基因下遊同源臂)並轉化工業黃酒酵母，通過同源重組敲除黃酒酵母HO基因，從而大大降低了酵母單倍體的分離難度，再分離獲得單倍體菌株，同時，利用半乳糖培養基誘導Cre重組酶的表達將kanMX基因切除，最終成功獲得不含外來抗性基因的工業黃酒酵母單倍體菌株。與現有工業黃酒酵母單倍體分離方法相比:在HO基因敲除組件的構建中，本發明採用降落PCR融合各基因片段，只需進行一次PCR反應即可達到片段一次性融合的目的，無需添加任何引物，較之傳統的基於融合PCR的基因敲除組件構建方法，省去了兩兩片段融合時繁瑣的退火溫度摸索過程，省時省力，能有效富集目的條帶從而獲得高特異性高純度的HO基因敲除組件，融合效率高；本發明可快速、高效地分離獲得不含外來抗性基因的工業黃酒酵母單倍體，具有單倍體分離率和成活率高、工藝簡單、生產成本低的優點，為後續黃酒酵母代謝工程改造和遺傳學研究奠定了物質基礎。


圖1為本發明實施例1中HO基因上、下遊同源臂，kanMX基因擴增片段及HO基因敲除組件的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M:DNA分子量marker，I:H0L (490bp)，2:H0R (546bp)，3:kanMX 基因擴增片段(1697bp)，4:H0L-kanMX-H0R (2632bp)。圖2為本發明實施例2中HO基因缺失轉化子的PCR鑑定電泳圖，其中，DNA分子量marker ;A5、B6分別為兩個陽性轉化子；N為陰性對照(2253bp)。圖3為本發明實施例3中單倍體菌株及其配型的菌落PCR鑑定電泳圖，其中，M:DNA分子量marker, a:a型單倍體(544bp), α: α型單倍體(404bp)。圖4為本發明實施例4中抗性基因kanMX丟失的PCR鑑定電泳圖，其中，M =DNA分子量marker，1:kanMX被切除後的H01/H02擴增片段(1028bp)。
具體實施例方式以下結合附圖，並通過實施例對本發明進行具體說明。以下實施例所涉及實驗材料如下:菌株和質粒:工業黃酒酵母由國家黃酒工程技術研究中心提供，pYX212-kan質粒和pSH65質粒均可從商業途徑購買獲得。試劑和試劑盒:Prime STAR DNA Polymerase (2.5U/ μ L)、Ex Taq (5U/ μ L)MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit 均購自寶生物工程(大連)有限公司。
其他試劑和原料均為國產或進口分析純產品。實施例1 實施例4實驗中所使用引物序列及其作用如表I所示。表I引物序列表
權利要求
1.一種工業黃酒酵母單倍體的分離方法，其特徵在於通過同源重組將所述工業黃酒酵母的HO基因進行了敲除；該分離方法具體操作步驟如下: (1)HO基因敲除組件的構建:首先利用普通PCR擴增得到黃酒酵母HO基因的上、下遊同源臂擴增片段以及帶有G418抗性標記的kanMX基因擴增片段，再通過降落PCR擴增得到上述三個片段的融合片段，最後利用普通PCR對所述融合片段進行特異性擴增即得黃酒酵母HO基因敲除組件；所述上遊同源臂擴增片段包括上遊同源臂序列及與kanMX基因5』端互補的序列(簡稱序列A)，所述下遊同源臂擴增片段包括下遊同源臂序列及與kanMX基因3』端互補的序列(簡稱序列B);所述kanMX基因擴增片段包括kanMX基因序列及位於該片段兩端分別與上遊同源臂序列3』端、下遊同源臂序列5』端互補的序列(分別簡稱序列C和序列D);所述kanMX基因序列與所述序列C、序列D之間均含有可被Cre重組酶識別的1xp位點；所述序列A、序列B、序列C和序列D均為20 30bp ； (2)黃酒酵母HO基因的敲除:將步驟(I)所得HO基因敲除組件轉化工業黃酒酵母菌株，通過G418抗性篩選獲得陽性轉化子並鑑定； (3)黃酒酵母單倍體的分離:取步驟(2)中鑑定正確的陽性轉化子接種於YH)培養基進行活化；收集酵母泥並將其堆積於生孢培養基，於26 28°C培養3 5d ;挑取所述生孢培養基上的菌落，經蝸牛酶酶解破壁處理得酶解菌液，振蕩打散孢子，再塗布於YPD培養基於28 30°C培養至菌落長出，挑取菌落經鑑定正確後得到含有抗性基因kanMX的單倍體菌株; (4)抗性基因的切除:將含有Cre重組酶基因的工程質粒轉化步驟(3)所得單倍體菌株，取陽性克隆轉化子接種於半乳糖培養基連續培養5 10代，誘導Cre重組酶表達以切除抗性基因kanMX，得到抗性基因丟失菌株；將該菌株連續培養10代以上，丟失上述工程質粒，即得不含外來抗性基因的工業黃酒酵母單倍體菌株。
2.根據權利要求1所述工業黃酒酵母單倍體的分離方法，其特徵在於:步驟(I)所述降落PCR擴增反應無引物 參與，其擴增條件如下:95°C預變性4 5min，98°C變性10 15s，70°C退火15 30s，每個循環退火溫度降低1°C，共15個循環，於72°C延伸2.5 3min，然後於55°C退火溫度下再循環一次,最後於72°C再延伸5 lOmin。
3.根據權利要求1所述工業黃酒酵母單倍體的分離方法，其特徵在於:步驟(I)所述上遊同源臂擴增片段的擴增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示。
4.根據權利要求1所述工業黃酒酵母單倍體的分離方法，其特徵在於:步驟(I)所述下遊同源臂擴增片段的擴增引物序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。
5.根據權利要求1所述工業黃酒酵母單倍體的分離方法，其特徵在於:步驟(I)所述kanMX基因擴增片段的擴增引物序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。
6.根據權利要求1所述工業黃酒酵母單倍體的分離方法，其特徵在於:步驟(I)所述融合片段的特異性引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:4所示。
7.根據權利要求1所述工業黃酒酵母單倍體的分離方法，其特徵在於:步驟(3)所述活化溫度為30°C，培養時間24 36h。
8.根據權利要求1所述工業黃酒酵母單倍體的分離方法，其特徵在於:步驟(4)所述含有Cre重組酶基因的工程質粒選自pSH47、pSH62、pSH63或pSH65。
9.根據權利要求1所述工業黃酒酵母單倍體的分離方法，其特徵在於:步驟(4)所述半乳糖培養基含有100 μ g/mL的博來黴素。
全文摘要
本發明公開一種工業黃酒酵母單倍體的分離方法。該方法利用Cre/loxp組件和G418抗性標記kanMX基因構建了HO基因敲除組件並成功轉化工業黃酒酵母，通過同源重組敲除黃酒酵母的HO基因，繼而分離獲得單倍體菌株，同時，利用半乳糖培養基誘導Cre重組酶的表達將kanMX基因切除，獲得不含外來抗性基因的工業黃酒酵母單倍體。本發明可快速、高效地分離獲得不含外來抗性基因的工業黃酒酵母單倍體，具有單倍體分離率和成活率高、工藝簡單、生產成本低的優點，為後續黃酒酵母代謝工程改造和遺傳學研究奠定了物質基礎。
文檔編號C12R1/865GK103194439SQ201310151599
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月27日 優先權日2013年4月27日
發明者陸健, 吳殿輝, 陳堅, 李曉敏, 謝廣發, 申超 申請人:江南大學