一株產納他黴素的利迪鏈黴菌及其應用的製作方法

2023-10-22 18:09:57 2

專利名稱：一株產納他黴素的利迪鏈黴菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域中的一株利迪鏈黴菌及其應用。

背景技術：
納他黴素(Natamycin)是一種多烯大環內酯類抗真菌抗生素，也稱遊黴素或匹馬黴素(Pimaricin)，它由5個多聚乙醯合成酶基因編碼的多酶體系合成，能夠專性抑制酵母菌和黴菌，阻止絲狀真菌中黃麴黴素的形成。其實際使用劑量為10-6數量級，具有低劑量、高效率，抗菌作用時間長的特點，是一種高效、安全的天然生物性食品防腐劑和抗菌添加劑，目前已在30多個國家廣泛使用，包括歐盟、大部分北美和東歐國家以及一些中東國家，甚至瑞士這樣對食品安全非常重視的國家也允許在麵包和奶酪產品中使用納他黴素。1996年我國食品添加劑委員會對納他黴素進行評價並建議批准使用，1997年3月，我國衛生部正式批准納他黴素作為食品防腐劑，其商品名稱為黴克(NatamycinTM)。
納他黴素對幾乎所有的黴菌和酵母菌具有抗性，抑菌作用比山梨酸強50倍左右，且連續數年使用也不易引起靶標真菌形成抗性，但對細菌和病毒無效。因此它在以細菌發酵為基礎的食品行業有著廣泛的應用前景。作為食品防腐劑，可應用於果醬、黃油、桔汁、生肉和沙拉醬等的防黴，延長食品的保質期，防止酵母和黴菌引起的黴變，減少因為變質而引起的食品回收，降低生產成本，且不改變食品的風味，滿足消費者對天然食品的要求。納他黴素也可以作為醫學上的高效抗菌劑，對口腔念球菌感染，真菌性眼角膜潰瘍，角膜炎，皮膚及粘液膜真菌感染等疾病都有很好的治療效果。隨著研究的不斷深入，納他黴素的應用範圍正在繼續擴大，發揮著越來越大的作用。
利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus DeBoer et al.)是習居於土壤的腐生微生物，研究歷史悠久，已知有許多菌株在代謝過程中能夠產生各種抗菌活性物質。其著名的代表菌株是S.lydicus NRRL2433，該菌株在醫藥領域研究和應用廣泛，可產生具有廣譜抗細菌和分枝桿菌作用的利迪黴素(Lydimycin)和抗革蘭氏陽性細菌和分枝桿菌的利迪鏈菌素(Streptolydigin)；另外有產生抗少數大腸桿菌和克氏肺炎桿菌的蘋果酸氧黴素(Malioxamycin)的S.lydicus 1574，以及產生抗革蘭氏陽性細菌和耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的抗生素Lydicamycin的菌株。


發明內容
本發明的一個目的是提供一株利迪鏈黴菌，該菌株能產生納他黴素。
本發明所提供的利迪鏈黴菌為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCCNo.1653，是從北京密雲縣蔬菜田土壤中分離篩選獲得的，其已於2006年03月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏登記號為CGMCC No.1653。
本發明的利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653可用於納他黴素敏感菌抑制劑的製備。
其中，所述納他黴素敏感菌為納他黴素對其具有抑制作用的真菌，如黴菌或酵母菌。
所述酵母菌具體可為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；所述黴菌具體可為灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。
本發明的另一個目的是提供一種納他黴素敏感菌的抑制劑。
本發明所提供的納他黴素敏感菌的抑制劑，是發酵所述利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653得到的代謝產物。
其中，所述利迪鏈黴菌A01 CGMCC No.1653的發酵培養基為每升培養基中含有黃豆粉2％，蛋白腖0.5％，可溶性澱粉0.5％，葡萄糖2％，玉米漿0.25％，(NH4)2SO4 0.25％，MgSO4.7H2O 0.025％，K2HPO4 0.002％，NaCl 0.4％，CaCO3 0.2％，其餘為水；其中各組分的百分含量均為質量百分含量。
所述發酵利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的條件為在28℃的條件下，以13mm的旋轉半徑、180rpm的轉速振蕩培養96h-120小時。
本發明的另一個目的是提供一種製備上述任一所述的納他黴素敏感菌的抑制劑的方法。
本發明所提供的製備上述任一所述的納他黴素敏感菌的抑制劑的方法，是發酵利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653，得到的代謝產物即為納他黴素敏感菌的抑制劑。
其中，發酵培養基的組分及發酵條件同上。
本發明的利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653能產生納他黴素，在納他黴素敏感菌抑制劑的製備中將有廣泛的應用。



圖1A為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653無菌發酵濾液對酵母菌的抑制作用。
圖1B為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653無菌發酵濾液對灰葡萄孢的抑制作用。
圖2為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653活性產物的捷克八溶劑系統紙層析結果分析圖。
圖3為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653活性物質粗提物的紫外吸收光譜圖。
圖4為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653活性產物的HPLC第一次分離譜圖。
圖5為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653活性產物的HPLC第二次分離譜圖。
圖6為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性產物純樣品的紫外掃描圖譜。
圖7為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性產物純樣品的紅外吸收光譜。
圖8為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性產物純樣品的高分辨質譜圖(負離子)。
圖9為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性產物純樣品的高分辨質譜圖(正離子)。
圖10為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性產物純樣品的核磁共振氫譜(500MHz)。
圖11為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性產物純樣品的核磁共振碳譜(500MHz)。

具體實施例方式 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
實施例中所使用的培養基如下 1、高氏一號培養基每升培養基中含有K2HPO4 0.5g，NaCl 0.5g，KNO3 1.0g，FeSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，可溶性澱粉20g，瓊脂20g，其餘為水；所述高氏一號培養基的pH為7.2-7.4。
2、利迪鏈黴菌A01 CGMCC No.1653的種子培養基每升培養基中含有黃豆粉20g，蛋白腖5g，可溶性澱粉10g，葡萄糖20g，玉米漿2.5g，(NH4)2SO4 2.5g，K2HPO4 0.02g，NaCl 4g，CaCO3 6g，其餘為水；所述利迪鏈黴菌A01 CGMCC No.1653的種子培養基的pH為7.2。121℃滅菌30min。
3、利迪鏈黴菌A01 CGMCC No.1653的發酵培養基每升培養基中含有黃豆粉2％，蛋白腖0.5％，可溶性澱粉0.5％，葡萄糖2％，玉米漿0.25％，(NH4)2SO4 0.25％，MgSO4.7H2O 0.025％，K2HPO4 0.002％，NaCl 0.4％，CaCO3 0.2％，其餘為水；所述利迪鏈黴菌A01 CGMCC No.1653的發酵培養基的自然起始pH值為約5.6。其中，各百分含量均為質量百分含量。
4、PDA培養基每升培養基中含有馬鈴薯200g，蔗糖10-20g，瓊脂17-20g，其餘為水；pH自然。
5、PDB培養基每升培養基中含有馬鈴薯200g，蔗糖10-20g，其餘為水；pH自然。
實施例1、利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的分離製備 從北京密雲縣蔬菜田採集土樣，取10g加入內裝100ml無菌水和適量玻璃珠的三角瓶中，置搖床上於100rpm振蕩20min，取0.5ml加入4.5ml無菌水中，再依次稀釋102、103、104倍，各取以上土壤懸液0.1ml分別均勻塗布在高氏一號培養基平板上，超淨工作檯內吹至略幹；每濃度3個重複，置於28℃恆溫箱中培養5-10天，挑取放線菌單菌落進行稀釋劃線分離純化，獲得純培養菌株。
初篩獲得的純培養菌株進行搖瓶發酵培養，發酵液經0.45μm的無菌微孔濾膜過濾除菌獲得無菌發酵濾液；以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ACCC20036)、黑麴黴(Aspergillus nigerACCC30005)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea ACCC30091)為指示菌，利用管碟法或洋菜打孔法檢測發酵液的抗菌活性； 對初篩獲得的有抗菌活性的菌株的無菌發酵濾液進行乙醇沉澱去雜質，上清液進行紫外掃描獲得紫外圖譜，並與多烯類抗生素的圖譜進行比較，篩選出具有多烯類典型吸收峰的紫外圖譜的菌株； 復篩獲得的菌株的無菌發酵濾液去雜濃縮後進行柱層析分離，並用指示菌跟蹤檢測各分離組分的活性，對主要活性組分進行製備型高效液相色譜分離得到其純樣品；檢測鑑定其純樣品，最終篩選出能夠產生納他黴素的菌株——利迪鏈黴菌A01CGMCC No.1653。
利迪鏈黴菌A01 CGMCC No.1653的微生物學特性鑑定 (1)菌體的形態特徵 革蘭氏染色陽性；在GYM瓊脂、JCM42#瓊脂、燕麥粉瓊脂等培養基上生長7天後，基內菌絲髮育良好，無橫隔，不斷裂；氣生菌絲生長良好，多分枝；孢子絲直、柔曲或彎曲，孢子橢圓形。
(2)培養特性 在6種固體培養基上的培養特性如表1所示。
表1 利迪鏈黴菌A01 CGMCC No.1653的培養特性 (3)生理生化特性 利迪鏈黴菌A01 CGMCC No.1653的生理生化特性如表2所示。
表2利迪鏈黴菌A01 CGMCC No.1653的生理生化特性 注「W」表示弱陽性結果；「+」表示陽性結果；「-」表示陰性結果。
(4)16SrDNA序列 利迪鏈黴菌A01 CGMCC No.1653的部分16SrDNA序列如序列表中序列1所示。與GenBank中相關序列Blast比較的結果表明其屬於鏈黴菌屬；其16SrDNA序列與已知的利迪鏈黴菌菌株NRRL2433相比相似性很高，為100％。
綜合其形態學特徵、培養特性、生理生化特性和16SrDNA序列分析的結果，將其鑑定為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)，並將此菌株定名為利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01。利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01已於2006年03月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏登記號分別為CGMCC No.1653。
實施例2、利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653發酵液的抑菌活性測定 斜面培養將利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653接種到高氏一號斜面培養基上，28℃培養7-10天至其產生足量的孢子； 種子培養用無菌鉑環刮取其孢子3-5環接種於裝有100ml種子培養基的500ml三角瓶內，置可控溫搖床上，在28℃條件下，以13mm的旋轉半徑、180rpm的轉速恆溫振蕩培養20-24h； 發酵培養取上述種子培養液按3％(V/V)的接種量接種於裝有100ml發酵培養基的500ml三角瓶內，在28℃條件下，以13mm的旋轉半徑、180rpm的轉速恆溫振蕩培養96h-120h。
活性檢測發酵液經0.45μm的無菌微孔濾膜過濾除菌獲得無菌發酵濾液，分別以釀酒酵母ACCC20036和灰葡萄孢ACCC30091為指示菌。將釀酒酵母ACCC20036接種在PDB培養基中，在25-28℃、以200rpm的轉速振蕩培養12-24h獲得釀酒酵母ACCC20036的菌懸液；將灰葡萄孢ACCC30091接種於PDA培養基，22℃恆溫培養7天，刮取其分生孢子並將其用無菌水配製成106個孢子/ml濃度的灰葡萄孢ACCC30091的菌懸液。將兩種菌懸液分別按2％(體積比)的量加入到裝有融化後冷卻至50℃左右PDA培養基的三角瓶中，混勻後將其倒入直徑9cm的培養皿中，每皿30ml，製作帶菌平板，凝固後每皿用直徑7mm的打孔器等距離打4個孔，每孔中注入利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的無菌發酵濾液80μl，28℃恆溫培養48-96h，十字交叉法測量抑菌圈直徑。結果表明發酵濾液對釀酒酵母和灰葡萄孢的抑菌圈直徑分別達31.0mm和43.0mm(圖1A和圖1B)。
實施例3、利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653代謝產物的抑菌機理 一、發酵液中納他黴素的粗提和初步鑑定 將實施例2中所得發酵液用3倍體積的無水乙醇預處理，4℃靜置2h，以沉澱菌體、固形顆粒、可溶性粘膠狀物、核酸、雜蛋白質以及中間代謝產物等，上清液用2層濾紙以布氏漏鬥真空抽濾，濾液經旋轉蒸發儀在45℃下減壓濃縮，濃縮液即為活性物質粗提物，4℃保存備用。
採用捷克八溶劑系統紙層析來鑑別活性物質的化學類型，同時在190nm～400nm對其進行紫外全波長掃描。
1、捷克八溶劑系統紙層析 溶劑系統為I.水飽和的正丁醇；II.含2％(質量百分含量)對甲基苯磺酸的水飽和的正丁醇溶液；III.正丁醇∶醋酸∶水(體積比)＝2∶1∶1；IV.含2％(質量百分含量)六氫吡啶的水飽和的正丁醇；V.正丁醇飽和的0.5mol/l pH為7.0的磷酸緩衝液；VI.含2％(質量百分含量)對甲基苯磺酸的正丁醇飽和的水；VII.苯∶甲醇(體積比)＝4∶1，濾紙用0.5mol/l pH 7.0的磷酸緩衝液處理；VIII.甲醇∶3％(質量百分含量)NaCl水溶液(體積比)＝3∶1，濾紙用5％(質量百分含量)硫酸鈉水溶液處理； 採用新華一號濾紙，裁成長16×1cm的紙條；層析在20cm×3cm的試管中進行；具體操作步驟如下 ①每支試管中分別加入各溶劑系統展開劑4ml，用橡皮塞封口，讓展開劑的蒸汽充滿整個展層空間； ②取上述活性物質粗提物，用微量移液器或毛細管在濾紙條的一端分多次點樣，每次在自動幹手器下邊點邊以熱風吹乾，上樣量為15μl，點樣的直徑以不超過5mm為宜； ③待濾紙上的樣品吸乾後，先將其懸掛在試管內，用橡皮塞密閉管口，使濾紙在展開劑的蒸汽中平衡0.5h後，將其點樣端浸於展開劑中上行展層，勿使溶劑與樣品直接接觸；待展開劑接近前沿時，取出濾紙條懸於通風櫥中晾乾或用熱吹風使溶劑儘量揮發； ④在無菌條件下用定製的方形玻璃盤製備PDA平板，取適量培養好的灰葡萄孢ACCC30091的孢子懸浮液均勻塗布在平板上；將層析後的濾紙條依次貼於平板上，室溫靜置約30min，使紙條上相應部位的活性物質滲透擴散到培養基中；用無菌小鑷子取出紙條，並標記其在平板上的位置；將平板置25℃恆溫培養箱培養48h進行生物學顯影； ⑤根據生物活性顯示的結果，測量有效成分在不同pH下的展層距離，按下述公式計算遷移率Rf值，畫出pH層析譜 Rf＝原點到抑菌圈中心的距離/原點到溶劑前沿的距離。
層析圖譜(圖2)表明，在溶劑II和溶劑VI中不顯跡，溶劑VII中不移動，即Rf值為0，這與多烯類抗生素在八溶劑系統中的紙層析圖譜相近。這表明活性物質可能屬於多烯類抗生素。其中在溶劑III中在點樣量大時偶爾出現一大(Rf＝0.333)一小(Rf＝0.754)兩個抑菌區域，表明該活性物質至少有兩個活性組分。
2、紫外掃描 將上述活性物質粗提物用去離子水稀釋40倍，以去離子水做空白對照，採用日立UV-VIS 3010紫外可見分光光度計在190nm～400nm範圍內進行全波長掃描。
結果表明紫外吸收光譜中，雖然雜質峰較多，但在292nm、305nm和319nm處有明顯的三個吸收峰(圖3)，多次重複該試驗發現樣品的濃度越大吸收峰的峰值越高，表明活性物質的含量越高。這三個典型的吸收峰是多烯類中四烯類抗生素所特有的特徵峰，這與捷克八溶劑系統紙層析的測定結果一致。
據上述分析，初步確定活性物質的有效組分屬於四烯類抗生素。
二、活性物質的分離純化 通過大孔樹脂柱層析、矽膠柱層析和高效液相色譜儀HPLC進行逐步分離純化。
1、大孔樹脂吸附柱層析 選用40cm×2.6cm玻璃層析柱，D4006大孔樹脂(天津南開大學化工廠)，大孔樹脂按廠家說明預處理後用適量去離子水調勻，緩慢加入裝有1/3體積去離子水的層析柱中，同時從柱底部以勻速緩慢放出蒸餾水，使柱中液面始終保持在樹脂層上面。裝至約3/4柱高度，自然沉降6～10h，使平衡後的裝柱體積為150ml。
將納他黴素粗提物與樹脂按2∶1的體積比進行動態吸附；吸附完畢後，關閉與柱所連的恆流泵，層析柱靜置2h，然後依次用1倍柱體積的去離子水、1.5倍柱體積的50％(體積百分含量)甲醇和2.5倍柱體積的80％(體積百分含量)乙醇洗脫，洗脫速度為0.5ml/min，用自動部分收集器分管收集洗脫液，每管15ml。以釀酒酵母菌ACCC20036為指示菌，利用濾紙片瓊脂擴散法檢測每管洗脫液活性。
結果表明活性洗脫液集中在第35～45管(即自流出量為3.5倍柱體積至4.5倍柱體積之間的洗脫液)。
合併有活性的洗脫液，45℃下減壓濃縮後供下一步分離。
2、矽膠吸附柱層析 選用40cm×2.6cm玻璃層析柱，200～300目矽膠，以體積比為1∶2∶1的正丁醇、甲醇和水的混合液為洗脫液；取約150g矽膠用去離子水浸泡3h，傾去細小顆粒，布氏漏鬥真空抽濾除去水分；再用6mol/L HCl浸泡12h，然後用去離子水洗至中性，真空抽乾；用無水乙醇浸泡過夜，真空抽乾；臨用前在120℃下活化2h，乾燥至恆重；層析柱中裝入1/3柱體積的洗脫液，然後緩慢加入用洗脫液混合均勻的矽膠，約至3/4柱高時停止加入，靜置6～10h，使矽膠緩慢沉降。然後用2～3倍體積的洗脫液以1mL/min的流速衝洗柱體，使之平衡。平衡後的柱體積為150ml。取步驟1的大孔樹脂活性洗脫濃縮液10ml上柱進行動態吸附，用2～3倍柱體積的洗脫液按0.5ml/min的流速進行洗脫，用自動部分收集器分管收集洗脫液，每管5ml。以釀酒酵母菌ACCC20036為指示菌，利用濾紙片瓊脂擴散法檢測每管洗脫液活性。
結果表明其洗脫液中的活性組分集中在第10～18管(即自0.33倍柱體積至0.6倍柱體積之間的洗脫液)。
合併活性洗脫液，45℃真空減壓濃縮，濃縮液用於下一步分離。
3、製備型HPLC分離純化 採用LC-9101型循環製備HPLC，JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15製備柱。
取步驟2的矽膠柱層析後的活性洗脫濃縮液，用0.45μm微孔濾器過濾，自動進樣器進樣，每次進樣量6ml；以甲醇∶水(體積比為7∶3)為流動相進行分離，利用UV檢測器在波長305nm處檢測並自動形成分離圖譜；利用餾分收集器分別收集圖譜中各曲線峰所對應的洗脫液；以釀酒酵母菌ACCC20036為指示菌，利用濾紙片瓊脂擴散法檢測每管洗脫液活性。以2ml/min的泵流速相繼分離2次。
實驗結果表明，第一次HPLC分離共檢測到6個峰，其中在保留時間為57.399min的峰為主要活性峰(圖4)；對其進行的第二次分離檢測到保留時間為38.399min的峰為活性峰(圖5)，其相對峰面積百分比為99.503％，表明樣品純度達99.503％以上。
對最終樣品進行真空濃縮，乾燥後呈白色或奶油色粉末。利用島津分析型HPLC分別採用下述兩種方法對其進行純度驗證。
1)取少量樣品溶於70％甲醇水溶液，以甲醇(A)和水(B)為流動相進行梯度洗脫。色譜條件為C18反相柱，柱溫30℃，UV檢測器，檢測波長305nm，SIL-10ADVP自動進樣器進樣10μl，以1ml/min的流速洗脫60min。梯度洗脫步驟如下 結果顯示洗脫曲線為單一的峰，說明其為單一組分，純度達到化學結構測定的要求。
2)取少量樣品溶於70％甲醇水溶液，以乙腈(A)和水(B)為流動相進行梯度洗脫。色譜條件為C18反相柱，柱溫30℃，UV檢測器，檢測波長305nm，SIL-10ADVP自動進樣器進樣10μl，以1ml/min的流速洗脫60min。梯度洗脫步驟如下 結果顯示洗脫曲線為單一的峰，說明其為單一組分，純度達到化學結構測定的要求。
兩種驗證方法得到的結果一致。
三、純化樣品化學結構的解析鑑定 1、紫外吸收光譜(UV) 將上述步驟二純化的樣品極微量溶於超純水中，用日立UV-VIS 3010紫外可見分光光度計在190nm～400nm波長範圍內以超純水為空白對照進行全波長掃描，自動形成紫外吸收圖譜。
由紫外掃描圖譜可見，活性物質的紫外吸收峰均表現出典型的四烯類抗生素譜型，即在波長281nm、291nm、305nm和319nm附近均有典型的共軛四烯發色基團的吸收峰，其中波長305nm處吸收值最大，281nm處吸收值最小(圖6)，再次驗證了該活性物質屬於多烯類中的四烯抗生素。
2、紅外吸收光譜(IR) 採用KBr壓片法，用德國BRUKER公司TENSOR 27傅立葉紅外光譜儀進行400cm-1-4000cm-1區域內掃描。
活性物質純化樣品的紅外光譜如圖7所示，其中vmax3593、3493、3280cm-1為分子中N-H和-OH的伸縮振動特徵吸收峰；vmax3017、2978、2940cm-1為分子中-CH3和-CH2的伸縮振動特徵吸收峰；vmax1716cm-1為C＝O的強吸收特徵峰；vmax1634、1570cm-1為C＝C伸縮振動的特徵吸收峰；另外，在vmax1401、1267、1190、1107、1060、1003、885、847、798cm-1等處都有吸收峰。
3、高分辨質譜 採用德國BRUKER公司超高解析度9.4T混合型四級杆傅立葉串聯質譜儀(9.4TQ-FT-MS)；條件capillary 4000，Dry Gas4.0l/s，源溫180℃，scan range300～2000，syringe pump1.5ml/min，數據分析軟體為Bruker DaltonicsDataAnalysis 3.4。
由高分辨質譜可見，正離子檢測方式，檢測到分子離子峰[M+Na]+為m/z＝688.2938的化合物(圖9)；負離子檢測方式檢測到分子離子峰[M-H]-為m/z＝664.2976的化合物(圖8)。
綜上所述，分析確定活性物質的主要活性組分的分子式均為C33H47NO13，分子量為665；由公式不飽和度(n)＝1+Nc+(Nn-Nh)/2(Nc碳原子數；Nn氮原子數；Nh氫原子數)計算其分子式的不飽和度為11，表明其分子結構中含有多個不飽和鍵與環等。
4、核磁共振譜(NMR) 以氘代-二甲基甲醯胺(d-DMF)為溶劑，以四甲基矽烷(TMS)為內標，室溫下測定。
採用Bruker AVANCE DRX-500核磁共振譜儀(德國Bruker光譜儀器公司)，以氘代-二甲基甲醯胺(d-DMF)為溶劑，四甲基矽烷(TMS)為內標，進行氫譜(1HNMR)和碳譜(13CNMR)的測定；前者共振頻率為500.1325156MHz，採樣次數32768次；後者共振頻率125.7577612MHz，採樣次數為65536次。
實驗結果表明，活性產物純樣品的1H-NMR圖譜(圖10)中，由於採用DMF做溶劑，使得羧基上的氫被中和，δ＝12的峰消失，同時增加了δ＝3和8的兩處溶劑峰，δ＝6附近的一組峰代表了共軛多烯上的氫，δ＝5左右的一組峰則代表羥基；13C-NMR圖譜(圖11)中，強度最大的峰系由溶劑DMF產生，δ＝180和165的峰表明分子中羧基和酯基的存在，δ＝130左右的一組峰則由共軛多烯產生；當θ＝135°時，DEPT譜圖中CH和CH3峰的譜線朝上，CH2峰的譜線朝下，分子中共有5個-CH2。
綜合分析上述實驗數據，判定活性產物的主要活性組分為納他黴素，其化學結構式為

序列表
1
1
1270
DNA
利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)
1
gggtctaata ccggatacga cacggggtcg catgacctcc gtgtggaaag ctccggcggt60
gaaggatgag cccgcggcct atcagcttgt tggtggggtg atggcctacc aaggcgacga120
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agccggtggc 1270
權利要求
1.利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653。
2.利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653在製備納他黴素敏感菌抑制劑中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述納他黴素敏感菌為酵母菌和黴菌。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述酵母菌為釀酒酵母。
5.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述黴菌為灰葡萄孢。
6.一種納他黴素敏感菌的抑制劑，是發酵所述利迪鏈黴菌(Streptomyceslydicus)A01 CGMCC No.1653得到的代謝產物。
7.根據權利要求6所述的抑制劑，其特徵在於所述利迪鏈黴菌A01 CGMCCNo.1653的發酵培養基為每升培養基中含有黃豆粉2％，蛋白腖0.5％，可溶性澱粉0.5％，葡萄糖2％，玉米漿0.25％，(NH4)2SO4 0.25％，MgSO4.7H2O 0.025％，K2HPO4 0.002％，NaCl 0.4％，CaCO3 0.2％，其餘為水；所述百分含量均為質量百分含量。
8.根據權利要求6或7所述的抑制劑，其特徵在於發酵所述利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的條件為在28℃的條件下，以13mm的旋轉半徑、180rpm的轉速振蕩培養96h-120小時。
9.一種製備權利要求6-8中任一所述的納他黴素敏感菌的抑制劑的方法，是發酵所述利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653，得到的代謝產物即為納他黴素敏感菌的抑制劑。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述利迪鏈黴菌A01 CGMCCNo.1653的發酵培養基為每升培養基中含有黃豆粉2％，蛋白腖0.5％，可溶性澱粉0.5％，葡萄糖2％，玉米漿0.25％，(NH4)2SO4 0.25％，MgSO4.7H2O 0.025％，K2HPO4 0.002％，NaCl 0.4％，CaCO3 0.2％，其餘為水；所述百分含量均為質量百分含量；
所述發酵利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的條件為在28℃的條件下，以13mm的旋轉半徑、180rpm的轉速振蕩培養96h-120小時。
全文摘要
本發明公開了一株利迪鏈黴菌及其應用。該菌株是利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653。該菌株能產生納他黴素，在納他黴素敏感菌抑制劑的製備中將有廣泛的應用。
文檔編號C12N1/20GK101182485SQ20071018743
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月23日 優先權日2007年9月29日
發明者劉偉成, 劉建華, 裘季燕, 盧彩鴿, 霆 劉, 劉德文 申請人:北京市農林科學院