可懸浮培養的牛腎細胞在病毒培養及疫苗生產的應用的製作方法

2023-10-23 16:20:22

本發明屬於細胞工程技術領域，特別是涉及可懸浮培養的牛腎細胞(mdbk)懸浮培養後在病毒培養及疫苗生產方面的應用。

背景技術：

牛腎細胞(mdbk)傳代細胞系來自公牛腎細胞，可用於病毒培養、原材料檢驗、營養代謝研究。mdbk通常可採用克氏瓶、轉瓶甚至反應器載體培養，但實質均未改變，細胞均為貼壁培養工藝，貼壁培養工藝培養批量較小、批間差異大、生產效率低下、勞動強度大、佔用場地多，細胞單位產量低，大規模生產工藝複雜。

牛病毒性腹瀉/黏膜、牛傳染性鼻氣管炎、偽狂犬等病毒培養或疫苗生產通常採用mdbk貼壁細胞靜置培養或轉瓶培養的方法進行擴增，但存在貼壁培養工藝放大繁瑣、培養批量較小、批間差異大、生產效率低下、勞動強度大、佔用場地多等諸多問題，細胞單位產量低，大規模生產工藝複雜。cn104162154a中提出利用懸浮培養技術生產牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯滅活疫苗，其使用經過馴化的mdbk細胞並未形成能夠穩定傳代的懸浮細胞株，由於細胞懸浮馴化存在不確定因素，並不是每次都能成功複製，在生產應用中存在較大困難。

技術實現要素：

本發明的目的在於利用懸浮培養的牛腎細胞mdbk進行各類敏感病毒的培養和疫苗生產，以解決現有技術中利用貼壁細胞進行病毒培養和疫苗生產中存在的問題。

本發明可懸浮培養的牛腎細胞在病毒培養及疫苗生產的應用，所述可懸浮培養的牛腎細胞mdbk，具有以下特徵：1)細胞直徑：14-25μm；2)核型：2n＝60；3)可在不依賴附著物條件下純懸浮培養，懸浮液中細胞密度≥1.0-2.0×106細胞/ml；4)使用無血清或低血清培養基培養；5)可使用生物反應器大規模培養；

所述病毒為偽狂犬病毒、牛病毒性腹瀉/黏膜病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、羊口瘡病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛副流感3型病毒等；

所述疫苗為滅活疫苗或弱毒活疫苗。

具體的，所述可懸浮培養的牛腎細胞為mdbk-scgmccno.11795細胞株經過懸浮培養獲得的細胞。

以上所述應用中，可懸浮培養的牛腎細胞mdbk，是用牛腎細胞專用懸浮培養基將牛腎細胞mdbk種細胞懸液稀釋至密度為0.3-0.5×106細胞/ml，然後接種至反應器中，加入所述牛腎細胞專用懸浮培養基，在溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉速40-60rpm條件下培養48-72小時至反應器內的牛腎細胞mdbk密度達到1.0×106-4.0×106細胞/ml；所述牛腎細胞專用懸浮培養基為含1％-5％(體積百分比v/v)新生牛血清的低血清培養基或無血清培養基；優選牛腎細胞專用懸浮培養基為含有cd培養基粉末15-20g/l、碳酸氫鈉2-3g/l的水溶液，ph值7.0-7.2；優選牛腎細胞專用懸浮培養基中含使用注射用水溶解的cd培養基粉末17.7g/l，再加入碳酸氫鈉至2.32g/l，調節ph值至7.0-7.2。

以上所述應用中，病毒培養方法包括以下步驟：

1)種毒培養與製備

取生長良好的mdbk貼壁細胞，待細胞長滿單層後棄去原培養液，更換含有1％-10％(體積比)所述病毒的維持液(dmem培養基)，在36℃-37℃培養，待細胞cpe達到75％-85％以上時，收穫病毒液作為種毒，保存備用；

2)懸浮毒液製備

取經生物反應器培養的權利要求1中所述懸浮培養的牛腎細胞mdbk或權利要求2中所述mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞，棄去原培養液，加入無血清或含0.5-2％(體積比)血清的sfm培養基恢復至原體積，按體積比加入0.1-10％步驟1)的種毒，在病毒適宜培養條件下培養48h-96h，待細胞活力低於15％-30％時收穫病毒液。

具體的，所述病毒為偽狂犬病毒，種毒加入量為體積比1％，在溫度36-37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值6.8-7.2、轉速40-60rpm下培養72h-96h至細胞活力低於30％時收穫得到懸浮培養的偽狂犬病毒液；

具體的，所述病毒為羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒，種毒加入量為體積比1-2％，在溫度36-37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.4±0.1、轉速40-60rpm下培養48h-72h至細胞活力低於15％時收穫得到懸浮培養的羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒液；

具體的，所述病毒為牛病毒性腹瀉/黏膜病毒，種毒加入量為體積比0.1-10％，在溫度36-37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.2-7.4、轉速40-60rpm下培養72-96h至細胞活力低於30％時收穫得到懸浮培養的牛病毒性腹瀉/黏膜病毒液；

具體的，所述病毒為牛傳染性鼻氣管炎病毒，種毒加入量為體積比0.1-1％，在溫度36-37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.2-7.4、轉速40-60rpm下培養48-72h至細胞活力低於20％時收穫得到懸浮培養的牛傳染性鼻氣管炎病毒液；

具體的，所述病毒為牛呼吸道合胞體病毒，種毒加入量為體積比1-5％，在溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.2-7.4、轉速40-60rpm下培養56h-72h至細胞活力低於15％時收穫得到懸浮培養的牛呼吸道合胞體病毒液；

具體的，所述病毒為牛副流感3型病毒，種毒加入量為體積比0.1-1％，在溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.2-7.4、轉速40-60rpm下培養48-72h至細胞活力低於20％時收穫得到懸浮培養的牛副流感3型病毒液。

以上所述應用中，滅活疫苗的製備方法包括以下步驟：

(1)毒液滅活

將以上得到的懸浮培養的病毒液去除細胞碎片，按體積0.025％加入滅活劑，4℃滅活24小時，升溫至37℃保持2小時，將滅活後毒液保存備用；所述滅活劑為β-丙內酯、二乙烯亞胺或甲醛；

(2)配苗

取經滅活後的病毒液，按體積比46:54加入206佐劑(seppic)混合製成滅活疫苗。

具體的，所述毒液為懸浮培養的偽狂犬病毒液，按體積比46:54加入206佐劑(seppic)，得到針對偽狂犬病的滅活疫苗；

具體的，所述毒液為懸浮培養的羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒液，按體積比46:54加入206佐劑(seppic)，得到針對羊接觸傳染性膿皰性皮炎的滅活疫苗；

具體的，所述毒液為懸浮培養的牛病毒性腹瀉/黏膜病毒液，按體積比46:54加入206佐劑(seppic)，得到針對牛病毒性腹瀉/黏膜病的滅活疫苗；

具體的，所述毒液為懸浮培養的牛傳染性鼻氣管炎病毒液，按體積比46:54加入206佐劑(seppic)，得到針對牛傳染性鼻氣管炎病的滅活疫苗；

具體的，所述毒液為懸浮培養的牛呼吸道合胞體病毒液，按體積比46:54加入206佐劑(seppic)，得到針對牛呼吸道合胞體病的滅活疫苗；

具體的，所述毒液為懸浮培養的牛副流感3型病毒液，按體積比46:54加入206佐劑(seppic)，得到針對牛副流感3型病的滅活疫苗。

以上所述應用中，弱毒活疫苗的製備過程為：將懸浮培養的弱毒病毒液按體積比1:1-2加入保護劑，經真空冷凍乾燥製成病毒活疫苗；所述保護劑為蔗糖牛奶保護劑或耐熱保護劑。

具體的，所述毒液為懸浮培養的偽狂犬病毒液，保護劑為蔗糖牛奶保護劑，病毒液與保護劑體積比為1:1-2蔗糖牛奶，得到針對偽狂犬病的弱毒活疫苗；

具體的，所述毒液為懸浮培養的羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒液，保護劑為蔗糖牛奶保護劑，病毒液與保護劑體積比為1:1-2蔗糖牛奶，得到針對羊接觸傳染性膿皰性皮炎的弱毒活疫苗；

具體的，所述毒液為懸浮培養的牛病毒性腹瀉/黏膜病毒液，保護劑為蔗糖牛奶保護劑，病毒液與保護劑體積比為1:1-2蔗糖牛奶，得到針對牛病毒性腹瀉/黏膜病的弱毒活疫苗；

具體的，所述毒液為懸浮培養的牛呼吸道合胞體病毒液，保護劑為蔗糖牛奶保護劑，病毒液與保護劑體積比為1:1-2蔗糖牛奶，得到針對牛呼吸道合胞體病的弱毒活疫苗。

本發明中所述生物反應器的容積為5l、50l、300l、500l、1000l、或5000l。

本發明是在實現了牛腎細胞的懸浮培養後(特別是mdbk-scgmccno.11795細胞馴化及驗證工作之後)，進行懸浮培養牛腎細胞應用方面的研究，發現此懸浮培養的細胞可用於各類敏感病毒的培養，經驗證可用於：偽狂犬病毒、羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒、牛病毒性腹瀉/黏膜病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛副流感3型病毒的培養及疫苗生產等。

本發明利用懸浮培養的牛腎細胞mdbk進行各類敏感病毒的培養和疫苗生產，優勢在於可利用反應器大規模懸浮培養細胞，生產放大工藝簡單，批間差較小，勞動強度小，佔地空間少，可大大提高生產效率。另一方面，相較cn104162154a工藝，本發明是利用可穩定懸浮培養的牛腎細胞(mdbk-scgmccno.11795)，該細胞從液氮中復甦後直接懸浮培養，省去了細胞重複馴化工作，應用更為方便可靠。

下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。

具體實施方式

實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，不應成為對本發明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實施例中的提示替換使用。

實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，實施例將有助於理解本發明，但是本發明所公開的內容不限於下述實施例。

為克服牛腎細胞貼壁培養的不足，實現牛腎細胞的大規模懸浮培養，本發明的發明人長期致力於牛腎細胞的馴化研究，終於獲得了一株可以懸浮培養的牛腎細胞。

發明人通過對貼壁mdbk細胞進行懸浮培養篩選、克隆等多種方法，成功獲得了一株可以純懸浮培養的mdbk細胞，並利用該細胞通過懸浮培養工藝生產mdbk細胞。本發明利用生物反應器大規模懸浮培養mdbk細胞並將其應用於大規模病毒培養和疫苗生產中，該大規模培養可用100l、300l、1000l反應器按比例將培養體積逐漸放大進行擴大培養。

實施例1、懸浮牛腎細胞株(懸浮mdbk細胞株)的獲得及保藏

本發明中的懸浮mdbk細胞株是將普通貼壁mdbk細胞經過適應低血清貼壁培養、低血清懸浮培養、無血清懸浮培養等程序，篩選獲得的一株能夠懸浮培養的mdbk細胞株。

具體篩選過程如下：

1.貼壁mdbk細胞培養

通常貼壁mdbk細胞採用市售dmem培養基(購自：gibco)，添加10％(體積百分比，v/v)新生牛血清(購自：金源康生物工程有限公司)37℃靜置培養，待細胞長滿單層後，用0.25％(v/v)胰酶消化分散，按1:3至1:5的比例稀釋分種傳代，擴大培養。

2.低血清貼壁培養

取長滿單層的貼壁mdbk細胞，經0.25％(v/v)胰酶消化分散後加入dmem培養基(含10％(v/v)新生牛血清)與低血清培養基(cd培養基，含3％(v/v)新生牛血清，以下同)的混合培養基，低血清培養基混合比例按30％、50％、80％逐部增加，待細胞完全適應混合培養基培養後再增加低血清培養基的含量，最終全部替代為低血清培養基，細胞生長穩定可連續傳代。

3.低血清懸浮培養

3.1.細胞懸液製備：取經低血清培養馴化好的貼壁mdbk細胞，經0.25％(v/v)胰酶消化分散後加入低血清培養基(cd培養基，含3％(v/v)新生牛血清)，稀釋細胞至0.5×106細胞/ml備用。

3.2.懸浮培養適應：將稀釋好的細胞懸液加入125ml三角瓶中，培養體積50ml，至37℃恆溫搖床100-110rpm培養。72h取樣計數，細胞結團較多時可離心棄上清後加入等體積胰酶消化分散細胞後計數。

3.3.懸浮細胞富集：細胞培養初期無法生長，大量結團，生長緩慢。將細胞懸液沉降約1分鐘，棄去沉澱團塊，取細胞上清液100rpm離心5分鐘，取沉澱。用低血清培養基將細胞沉澱稀釋為0.5×106細胞/ml，細胞少時可將多瓶細胞懸液經上述步驟處理後混為一瓶，不足體積補加經上述3.1步製備的低血清貼壁mdbk細胞懸液，補足至50ml。至37℃恆溫搖床100-110rpm培養。細胞培養72h後取樣計數，若游離細胞密度≥1.0×106細胞/ml，則進行懸浮細胞傳代，否則離心換液繼續進行懸浮細胞富集工作。細胞需長期富集，直至細胞可穩定培養。

3.4.懸浮細胞傳代：取懸浮細胞，100rpm離心5分鐘，棄去上清，用低血清培養基重懸沉澱細胞並將細胞濃度調節至0.5×106細胞/ml，至37℃恆溫搖床100-110rpm培養72h。若該懸浮細胞生長不穩定，72h細胞密度未能達到1.0×106細胞/ml，則重複步驟3.3和3.4，直到細胞可穩定傳代。若該懸浮細胞可穩定連續傳代，說明細胞已適應低血清懸浮培養方式，即初步得到了懸浮mdbk株，得到的細胞即為懸浮mdbk細胞。

4.懸浮mdbk細胞適應無血清培養

取初步適應低血清懸浮培養的懸浮mdbk細胞，100rpm離心5分鐘，棄去上清，加入混合培養基重懸細胞。混合培養基為低血清培養基(含3％(v/v)新生牛血清的cd培養基)與無血清cd培養基(gibco市售產品，貨號：1688240)的混合物，無血清cd培養基含量為30％，連續培養。待細胞可穩定培養後增加混合培養基中無血清cd培養基的含量至50％，連續培養。待細胞培養穩定後最終全部替代為無血清培養基，使細胞穩定連續傳代。

5.懸浮mdbk細胞優化篩選

取適應無血清cd培養基培養的懸浮mdbk細胞，將細胞液通過70μm細胞過濾器截留細胞團塊，將濾過液100rpm離心5分鐘，棄上清，用新鮮cd培養基重懸細胞，調節細胞密度至0.5×106細胞/ml，至37℃恆溫搖床100-110rpm培養。重複上述步驟直至細胞結團有所減輕。更換為40μm細胞過濾器，重複上述步驟，經過連續處理細胞結團逐步減輕，分散良好。

用上述方法獲得的能夠懸浮培養的mdbk細胞株，這些能懸浮培養的mdbk細胞株均屬於本發明所公開的內容。

將其中一株命名為牛腎細胞mdbk-s，該細胞株已於2015年12月14日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為cgmccno.11795。

經鑑定，以上方法獲得的能懸浮培養的mdbk細胞的特徵如下：

1)細胞直徑：14-25μm；

2)核型：2n＝60；

3)該細胞可在不依賴附著物條件下純懸浮培養；

4)該細胞使用無血清或低血清培養基培養；

5)該細胞可使用生物反應器大規模培養。

實施例1獲得的能懸浮培養的mdbk細胞株以及保藏的牛腎細胞株mdbk-scgmccno.11795可用於牛腎細胞mdbk的懸浮培養生產。培養中可利用三角搖瓶、攪拌瓶或生物反應器，通過流加培養、批培養或灌注培養的方式，採用牛腎細胞專用懸浮培養基(低血清或無血清培養基)批量懸浮培養牛腎細胞mdbk，使最終懸浮細胞培養密度大於1.0×106細胞/ml，培養體積可達1000l以上。

所述牛腎細胞專用懸浮培養基為含1％-5％(體積百分比v/v)新生牛血清的cd培養基(低血清培養基)或cd培養基(無血清培養基)。

優選的牛腎細胞專用懸浮培養基配方：含cd培養基粉末15-20g/l，碳酸氫鈉2-3g/l，ph值7.0-7.2的水溶液。

最優化配方：cd培養基(gibco市售產品，貨號：1688240)粉末17.7g/l，使用注射用水溶解後加入碳酸氫鈉2.32g/l，調節ph值至7.0-7.2。實施例中使用該優化牛腎細胞專用懸浮培養基配方。

以下實施例詳述牛腎細胞mdbk的懸浮培養/生產方法。

實施例2、牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795種細胞懸液的獲得

牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795種細胞懸液的獲得方法，包括以下步驟：

1)牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795的復甦

從液氮中取出一支凍存的懸浮牛腎細胞株mdbk-scgmccno.11795，至37℃-40℃水浴中快速融化，1000rpm離心5min，棄上清液，加入上述牛腎細胞專用懸浮培養基重懸細胞，轉至三角搖瓶中，補加牛腎細胞專用懸浮培養基，調節細胞密度至0.3-0.5×106細胞/ml，置於搖床中37℃、100rpm懸浮培養。

2)牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795的傳代

步驟1)細胞培養48-72h後取樣計數，若細胞密度≥1.0×106細胞/ml時進行細胞傳代，否則繼續培養，取能夠傳代的牛腎懸浮細胞，轉移至離心管中，1000rpm離心5min，棄上清液(原牛腎細胞專用懸浮培養基)，加入新的牛腎細胞專用懸浮培養基重懸細胞，轉至三角搖瓶中，補加牛腎細胞專用懸浮培養基，調節細胞密度至0.3-0.5×106細胞/ml，置於搖床中37℃、100rpm懸浮培養1-3代，得到牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795種細胞懸液。

實施例3、反應器流加培養牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795

牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795的流加培養，包括以下各級以及逐級放大培養：

1)5l反應器中的流加培養

先用牛腎細胞專用懸浮培養基將牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795的種細胞懸液(實施例2製備得到)稀釋至密度為0.3-0.5×106細胞/ml，然後取經稀釋的細胞懸液1000-2000ml(根據反應器情況定)轉移至5l反應器中，設定細胞培養條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉速40-60rpm，待細胞密度達到0.8×106細胞/ml時(判斷細胞生長旺盛)，開始流加牛腎細胞專用懸浮培養基，流加速度為1000ml/天，待培養體積達到5l時停止流加，取出即得到5l生產規模的牛腎懸浮細胞(根據生產規模可將其轉移至下一級反應器中繼續進行擴大培養)。

2)50l反應器中的流加培養

取經三臺5l反應器培養的牛腎懸浮細胞的細胞液15l，轉入50l反應器中，設定細胞培養條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉速40-60rpm，開始流加牛腎細胞專用懸浮培養基，流加速度為8l/天，待培養體積達到50l時停止流加，取出即得到50l生產規模的牛腎懸浮細胞(根據生產規模可將其轉移至下一級反應器中繼續進行擴大培養)。

3)300l反應器中的流加培養

取經兩臺50l反應器培養的牛腎懸浮細胞的細胞液100l，轉入300l反應器中，設定細胞培養條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉速40-60rpm，開始流加牛腎細胞專用懸浮培養基，流加速度為50l/天，待培養體積達到300l時停止流加，取出即得到300l生產規模的牛腎懸浮細胞(根據生產規模可將其轉移至下一級反應器中繼續進行擴大培養)。

4)1000l反應器中的流加培養

取經300l反應器培養的牛腎懸浮細胞的細胞液300l，轉入1000l反應器中，設定細胞培養條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉速40-60rpm，開始流加牛腎細胞專用懸浮培養基，流加速度為150l/天，待培養體積達到1000l時停止流加，取出即得到1000l生產規模的牛腎懸浮細胞(根據生產規模還可將其轉移至下一級反應器中繼續進行擴大培養)。

經鑑定，本實施例用各容積的反應器流加培養牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795，密度可達1-2×106細胞/ml。生產規模可逐級擴大，擴大至1000l反應器仍可獲得穩定的mdbk懸浮細胞。

實施例4、反應器批培養牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795

牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795的批培養，包括以下各級以及逐級放大培養：

1)5l反應器中的批培養

先用牛腎細胞專用懸浮培養基將牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795的種細胞懸液(實施例2製備得到)稀釋至密度為0.3-0.5×106細胞/ml，然後取經稀釋的種細胞懸液5l轉移至5l反應器中，設定細胞培養條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉速40-60rpm，待細胞密度≥1.0×106細胞/ml時，取出即得到5l生產規模的牛腎懸浮細胞(根據生產規模可將其轉移至下一級反應器中繼續進行擴大培養)。

2)50l反應器中的批培養

取經5l反應器培養好的細胞懸液，用牛腎細胞專用懸浮培養基稀釋細胞密度至0.3-0.5×106細胞/ml，將稀釋好的種細胞懸液50l轉移至50l反應器中，設定細胞培養條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉速40-60rpm，待細胞密度≥1.0×106細胞/ml時，取出即得到50l生產規模的牛腎懸浮細胞(根據生產規模可將其轉移至下一級反應器中繼續進行擴大培養)。

3)300l反應器中的批培養

取經50l反應器培養好的細胞懸液，用牛腎細胞專用懸浮培養基稀釋細胞密度至0.3-0.5×106細胞/ml，將稀釋好的種細胞懸液300l轉移至300l反應器中，設定細胞培養條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉速40-60rpm，待細胞密度≥1.0×106細胞/ml時，取出即得到300l生產規模的牛腎懸浮細胞(根據生產規模可將其轉移至下一級反應器中繼續進行擴大培養)。

3)1000l反應器中的批培養

取經300l反應器培養好的細胞懸液，用牛腎細胞專用懸浮培養基稀釋細胞密度至0.3-0.5×106細胞/ml，將稀釋好的種細胞懸液1000l轉移至1000l反應器中，設定細胞培養條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉速40-60rpm，待細胞密度≥1.0×106細胞/ml時，取出即得到1000l生產規模的牛腎懸浮細胞(根據生產規模可將其轉移至下一級反應器中繼續進行擴大培養)。

經鑑定，本實施例用各級反應器批培養牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795，密度可達1-2×106細胞/ml，生產規模可逐級擴大，擴大至1000l反應器仍可獲得穩定的mdbk懸浮細胞。

實施例5、反應器灌注培養牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795

牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795的灌注培養，包括以下各級以及逐級放大培養：

1)5l反應器中的灌注培養

先用牛腎細胞專用懸浮培養基將牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795的種細胞懸液(實施例2製備得到)稀釋至密度為0.3-0.5×106細胞/ml，然後取經稀釋的種細胞懸液5l轉移至5l反應器中，設定細胞培養條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉速40-60rpm，待細胞密度達到0.8×106細胞/ml時時，開始灌注牛腎細胞專用懸浮培養基，灌注速度為1.5l/天，廢液經旋轉濾器或atf系統(atf細胞截留系統，購自refinetechnology公司)或其它細胞截留裝置排出，待細胞密度≥2.0×106細胞/ml時可轉移至下一級反應器中繼續進行擴大培養。

2)50l反應器中的灌注培養

取經5l反應器培養好的細胞懸液，用牛腎細胞專用懸浮培養基稀釋細胞密度至0.3-0.5×106細胞/ml，將稀釋好的種細胞懸液50l轉移至50l反應器中，設定細胞培養條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉速40-60rpm，待細胞密度達到0.8×106細胞/ml時，開始灌注牛腎細胞專用懸浮培養基，灌注速度為15l/天，廢液經旋轉濾器、atf系統或其它細胞截留裝置排出，待細胞密度≥2.0×106細胞/ml時，取出即得到50l生產規模的牛腎懸浮細胞(根據生產規模可將其轉移至下一級反應器中繼續進行擴大培養)。

3)300l反應器中的灌注培養

取經50l反應器培養好的細胞懸液，用牛腎細胞專用懸浮培養基稀釋細胞密度至0.3-0.5×106細胞/ml，將稀釋好的種細胞懸液300l轉移至300l反應器中，設定細胞培養條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉速40-60rpm，待細胞密度達到0.8×106細胞/ml時，開始灌注牛腎細胞專用懸浮培養基，灌注速度為150l/天，廢液經旋轉濾器、atf系統或其它細胞截留裝置排出，待細胞密度≥2.0×106細胞/ml時，取出即得到500l生產規模的牛腎懸浮細胞(根據生產規模可將其轉移至下一級反應器中繼續進行擴大培養)。

4)1000l反應器中的灌注培養

取經300l反應器培養好的細胞懸液，用牛腎細胞專用懸浮培養基稀釋細胞密度至0.3-0.5×106細胞/ml，將稀釋好的種細胞懸液1000l轉移至1000l反應器中，設定細胞培養條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.0-7.2、轉速40-60rpm，待細胞密度達到0.8×106細胞/ml時，開始灌注牛腎細胞專用懸浮培養基，灌注速度為300l/天，廢液經旋轉濾器、atf系統或其它細胞截留裝置排出，待細胞密度達2-4×106細胞/ml時，取出即得到1000l生產規模的牛腎懸浮細胞(根據生產規模還可將其轉移至下一級反應器中繼續進行擴大培養)。

經鑑定，本實施例用各級反應器灌注培養牛腎細胞mdbk-scgmccno.11795，密度可達2-4×106細胞/ml，生產規模可逐級擴大，擴大至1000l反應器仍可獲得穩定的mdbk懸浮細胞。

mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞的應用

本發明的mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞可用於各類敏感病毒(例如：偽狂犬病毒、牛病毒性腹瀉/黏膜病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、羊口瘡病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛副流感3型病毒等)培養、抗體蛋白生產、疫苗生產、產品外源病毒檢驗等。以下實施例將做具體說明。

實施例6、偽狂犬病毒懸浮培養的方法及疫苗製備

1.病毒培養

本實施例中偽狂犬病病毒為bartha-k61(弱毒株)或閩a株等(來源：中國獸醫微生物菌種保藏管理中心)。也可使用其它偽狂犬病毒毒株，本發明不做限制。

1.1.種毒培養與製備

取生長良好的mdbk貼壁細胞，待細胞長滿單層後棄去原培養液，更換含有1％(體積比)偽狂犬病毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強毒株)的維持液(維持液配方：市售dmem培養基，調節ph至7.0)，37℃培養，待細胞cpe達到75％以上時，收穫病毒液作為種毒，-20℃保存備用。

1.2.懸浮毒液製備

取經反應器培養的mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞(細胞密度≥2.0×106細胞/ml)，棄去原培養液，加入維持液(無血清或含0.5-2％血清的低血清sfm培養基)恢復至原體積，按體積比加入1％種毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強毒株)，設定病毒培養條件：溫度36-37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值6.8-7.2轉速40-60rpm。

反應器培養72h-96h，培養過程定期取樣計數觀察，待細胞活力低於30％時，停止培養，收穫病毒液至-20℃保存。收穫的弱毒液可用作下一級培養懸浮種毒或生產弱毒疫苗、滅活疫苗抗原，收穫的強毒毒液可用作下一級培養懸浮種毒或生產滅活疫苗抗原或疫苗效力檢驗攻毒使用。

2.疫苗製備

2.1.弱毒活疫苗製備

取反應器懸浮培養的偽狂犬病毒弱毒液(接種bartha株的毒液)，按體積比1：1-2加入蔗糖牛奶保護劑(或耐熱保護劑)，經真空冷凍乾燥，製成偽狂犬弱毒活疫苗。

2.2.滅活疫苗製備

2.2.1.毒液滅活

取懸浮培養的偽狂犬病病毒液，經離心或過濾去除細胞碎片，按體積加入0.025％的β-丙內酯滅活劑(或二乙烯亞胺、甲醛)4℃滅活24小時，升溫至37℃保持2小時，滅活結束。將滅活後毒液至4℃保存備用。

2.2.2.配苗

取經滅活後的偽狂犬病毒液，按體積比46:54加入佐劑(如206佐劑)，充分混合後，製成偽狂犬滅活疫苗。

本例中反應器為三角搖瓶、攪拌瓶或5l、100l、300l、500l、1000l甚至5000l等不同容積生物反應器，可視生產規模選擇。

3.懸浮毒液和疫苗檢測

按《中華人民共和國獸藥典》進行細胞半數感染量(tcid50)檢測，利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞培養的偽狂犬病毒半數細胞感染量可達到108.5tcid50/ml，達到並優於規程標準104.5tcid50/0.1ml水平。利用懸浮培養偽狂犬病毒毒液製備的疫苗均達到《中華人民共和國獸藥典》要求。

4.方法比較

將本發明培養偽狂犬病毒工藝與常規貼壁培養和載體懸浮培養進行比較，如表1所示：

表1：培養偽狂犬病毒工藝比較

表1的比較內容表明：利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞培養偽狂犬病毒，可以使用大容積生物反應器，能達到5000l，培養時間72-96h，一次收穫抗原量可製備成品疫苗5000萬頭份以上。相比傳統貼壁培養能夠節省大量勞動力，減少人為操作誤差因而能降低批間差異。較載體培養不需要微載體投入，也不需要消化放大，節約了成本，簡化了工藝。另外，病毒半數細胞感染量(tcid50)高於其他方法10倍以上，生產效能大大提高。可見，本發明的優勢在於可利用反應器大規模懸浮培養，生產放大工藝簡單，批間差較小，勞動強度小，佔地空間少，可大大提高生產效率。

實施例7、羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒培養方法及疫苗製備

1.病毒培養

本實施例中羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒(orfvirus)，又名羊接觸傳染性臁瘡病毒，羊口瘡病毒，羊接觸傳染性膿皰性口炎病毒(來源：美國菌種保藏中心)。也可使用其它羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒毒株，本發明不做限制。

1.1.種毒培養與製備

取生長良好的mdbk貼壁細胞，待細胞長滿單層後棄去原培養液，更換含有1-2％(體積比)羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強毒株)的維持液(維持液配方：市售dmem培養基)，37℃培養，待細胞cpe達到85％以上時，收穫病毒液，-70℃保存備用。

1.2.懸浮毒液製備

取經反應器培養的mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞(細胞密度≥2.0×106細胞/ml)，採用自然沉降或離心方式棄去原培養液，加入維持液(無血清或含0.5-2％新生牛血清的低血清sfm培養基)恢復至原體積，按體積比加入1-2％種毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強毒株)，設定病毒培養條件：溫度36-37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.4±0.1、轉速40-60rpm。

反應器培養48h-72h，培養過程定期取樣計數觀察，待細胞活力低於15％時，停止培養，收穫病毒液至-20℃保存。收穫的弱毒液可用作下一級培養懸浮種毒或生產弱毒疫苗、滅活疫苗抗原，收穫的強毒毒液可用作下一級培養懸浮種毒或生產滅活疫苗抗原或疫苗效力檢驗攻毒使用。

2.疫苗製備

2.1.滅活疫苗製備

2.1.1.毒液滅活

取懸浮培養的羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒液，經離心或過濾去除細胞碎片，加入0.025％的β-丙內酯(或二乙烯亞胺、甲醛)2-8℃滅活24小時，升溫至37℃保持2小時，滅活結束後將毒液至-20℃保存備用。

2.1.2.配苗

取經滅活後的羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒液，按體積比46:54加入206佐劑(seppic)，充分混合後，製成羊接觸傳染性膿皰性皮炎滅活疫苗。

2.2.弱毒活疫苗製備

取反應器培養的羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒(自然或人工至弱毒株)弱毒液，按比例1：1-2(體積比)加入蔗糖牛奶保護劑(或耐熱凍幹保護劑)，經真空冷凍乾燥，製成羊接觸傳染性膿皰性皮炎病活疫苗。

本例中反應器為三角搖瓶、攪拌瓶或5l、100l、300l、500l、1000l甚至5000l等不同體積生物反應器，可視生產規模選擇。

3.懸浮毒液和疫苗檢測

按《中華人民共和國獸藥典》經細胞半數感染量(tcid50)檢測，利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞培養的羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒半數細胞感染量可達到108.5tcid50/ml，毒價與貼壁培養持平。利用懸浮培養羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒毒液製備的疫苗均達到《中華人民共和國獸藥典》要求。

4.方法比較

將本發明培養羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒工藝與常規貼壁培養和載體懸浮培養進行比較，如表2所示：

表2：培養羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒工藝比較

表2的比較內容表明：利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞培養羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒，可以使用大容積生物反應器(能達到5000l)，培養時間48h-72h，一次收穫抗原量可製備成品疫苗百萬頭份以上。相比傳統貼壁培養能夠節省大量勞動力，減少人為操作誤差，降低批間差異。較載體培養不需要微載體投入，也不需要消化放大，節約了成本簡化了工藝。可見，本發明的優勢在於可利用反應器大規模懸浮培養，生產放大工藝簡單，批間差較小，勞動強度小，佔地空間少，可大大提高生產效率。

實施例8、牛病毒性腹瀉/黏膜病毒懸浮培養的方法及疫苗製備

1.病毒培養

本實施例中牛病毒性腹瀉/黏膜病毒為nadl株或oregonc24v株等，(來源：中國獸醫微生物菌種保藏管理中心)。也可使用其它牛病毒性腹瀉/黏膜病毒毒株，本發明不做限制。

1.1.種毒培養與製備

取生長良好的mdbk貼壁細胞，待細胞長滿單層後棄去原培養液，更換含有10％(體積比)牛病毒性腹瀉/黏膜病毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強毒株)的維持液(維持液配方：市售dmem培養基)，37℃培養，待細胞cpe達到75％以上時，收穫病毒液，-20℃保存備用。

1.2.懸浮毒液製備

取經反應器培養的mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞,細胞密度≥1.0×106細胞/時，棄去原培養液，加入維持液(無血清或含0.5-2％血清低血清sfm培養基)恢復至原體積，製備毒液時按體積比加入0.1％種毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強毒株，根據毒株的不同加入量可增加至1-10％)，設定病毒培養條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.2-7.4、轉速40-60rpm。

生物反應器培養72h-96h，培養過程定期取樣計數觀察，待細胞活力低於30％時，停止培養，收穫弱毒液或病毒液至-20℃保存。收穫的弱毒液可用作下一級培養懸浮種毒或生產弱毒疫苗、滅活疫苗抗原，收穫的強毒毒液可用作下一級培養懸浮種毒或生產滅活疫苗抗原或疫苗效力檢驗攻毒使用。

2.疫苗製備

2.1.弱毒活疫苗製備

取反應器培養的牛病毒性腹瀉/黏膜病弱毒液，按1：1-2(體積比)加入蔗糖牛奶保護劑(或耐熱保護劑)，經真空冷凍乾燥，製成牛病毒性腹瀉/黏膜病弱毒活疫苗。

2.2.滅活疫苗製備

2.2.1.毒液滅活

取懸浮培養的牛病毒性腹瀉/黏膜病毒液，經離心或過濾去除細胞碎片，按體積加入0.025％的滅活劑β-丙內酯(或二乙烯亞胺、甲醛)4℃滅活24小時，升溫至37℃保持2小時，將滅活後毒液至4℃保存備用。

2.2.2.配苗

取經滅活後的牛病毒性腹瀉/黏膜病毒液與206佐劑(seppic)按46:54(體積比)的比例充分混合，製成牛病毒性腹瀉/黏膜病滅活疫苗。

本例中反應器為三角搖瓶、攪拌瓶或5l、100l、300l、500l、1000l甚至5000l等不同體積生物反應器，可視生產規模選擇。

3.懸浮毒液和疫苗檢測

按《中華人民共和國獸藥典》經細胞半數感染量(tcid50)檢測，利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞培養的牛病毒性腹瀉/黏膜病毒半數細胞感染量可達到107.5tcid50/ml，毒價略高於貼壁培養。利用懸浮培養牛病毒性腹瀉/黏膜病毒毒液製備的疫苗均達到《中華人民共和國獸藥典》要求。

4.方法比較

將本發明培養牛病毒性腹瀉/黏膜病毒工藝與常規貼壁培養和載體懸浮培養進行比較，如表3所示：

表3：牛病毒性腹瀉/黏膜病毒工藝比較

表3的比較內容表明：利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞培養牛病毒性腹瀉/黏膜病毒，可以使用大容積生物反應器(能達到5000l)，培養時間72h-96h，一次收穫抗原量可製備成品疫苗百萬頭份以上。相比傳統貼壁培養能夠節省大量勞動力，減少人為操作誤差，降低批間差異。較載體培養不需要微載體投入，也不需要消化放大，節約了成本簡化了工藝。較cn104162154a懸浮培養生產牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯滅活疫苗，其使用貼壁馴化的mdbk細胞並未形成能夠穩定傳代的懸浮細胞株，由於細胞懸浮馴化耗時較長，細胞病毒敏感性存在差異，不確定因素多，並不是每次都能成功複製，在生產應用中存在較大困難。本發明是利用可穩定懸浮培養的牛腎細胞(mdbk-scgmccno.11795)，細胞從液氮中復甦後直接懸浮培養，省去了細胞重複馴化工作，凍存形成的細胞批對病毒敏感性穩定，工藝可靠性強，應用更為方便可靠。可見，本發明的優勢在於可利用反應器大規模懸浮培養，生產放大工藝簡單，批間差較小，勞動強度小，佔地空間少，可大大提高生產效率。

實施例9、牛傳染性鼻氣管炎病毒懸浮培養的方法及疫苗製備

1.病毒培養

本實施例中牛傳染性鼻氣管炎病毒(來源：中國獸醫微生物菌種保藏管理中心)。也可使用其它牛傳染性鼻氣管炎病毒毒株，本發明不做限制。

1.1.種毒培養與製備

取生長良好的mdbk貼壁細胞，待細胞長滿單層後棄去原培養液，更換含有10％(體積比)牛傳染性鼻氣管炎病毒的維持液(維持液配方：市售dmem培養基)，37℃培養，待細胞cpe達到75％以上時，收穫病毒液，-20℃保存備用。

1.2.懸浮毒液製備

取經反應器培養的mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞(細胞密度≥1.0×106細胞/ml)，棄去原培養液，加入維持液(無血清或含0.5-2％血清的低血清sfm培養基)恢復至原體積，按體積比加入0.1-1％種毒(貼壁種毒或懸浮種毒)，設定病毒培養條件：溫度36-37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.2-7.4、轉速40-60rpm。

生物反應器培養48h-72h，培養過程定期取樣計數觀察，待細胞活力低於20％時，停止培養，收穫病毒液至-20℃保存。收穫的毒液可用作下一級培養懸浮種毒或生產疫苗抗原或疫苗效力檢驗攻毒使用。

2.疫苗製備

2.1.滅活疫苗製備

2.1.1.毒液滅活

取懸浮培養的牛傳染性鼻氣管炎病毒液，經離心或過濾去除細胞碎片，加入0.025％(體積比)的β-丙內酯滅活劑(或二乙烯亞胺、甲醛)4℃滅活24小時，升溫至37℃保持2小時，滅活結束後將滅活後毒液至4℃保存備用。

2.1.2.配苗

取經滅活後的牛傳染性鼻氣管炎病毒液，按體積比46:54加入206佐劑(seppic)，充分混合後，製成牛傳染性鼻氣管炎病毒滅活疫苗。

本例中反應器為三角搖瓶、攪拌瓶或5l、100l、300l、500l、1000l甚至5000l等不同體積生物反應器，可視生產規模選擇。

3.懸浮毒液和疫苗檢測

按《中華人民共和國獸藥典》經細胞半數感染量(tcid50)檢測，利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞培養的牛傳染性鼻氣管炎病毒半數細胞感染量可達到108.5tcid50/ml，毒價高於貼壁培養。利用懸浮培養牛傳染性鼻氣管炎病毒毒液製備的疫苗均達到《中華人民共和國獸藥典》要求。

4.方法比較

將本發明培養牛傳染性鼻氣管炎病毒工藝與常規貼壁培養和載體懸浮培養進行比較，如表4所示：

表4：牛傳染性鼻氣管炎病毒工藝比較

表4的比較內容表明：利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞培養牛傳染性鼻氣管炎病毒，可以使用大容積生物反應器(能達到5000l)，培養時間48h-72h，一次收穫抗原量可製備成品疫苗百萬頭份以上。相比傳統貼壁培養能夠節省大量勞動力，減少人為操作誤差，降低批間差異。較載體培養不需要微載體投入，也不需要消化放大，節約了成本簡化了工藝。較cn104162154a懸浮培養生產牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯滅活疫苗，其使用貼壁馴化的mdbk細胞並未形成能夠穩定傳代的懸浮細胞株，由於細胞懸浮馴化耗時較長，細胞病毒敏感性存在差異，不確定因素多，並不是每次都能成功複製，在生產應用中存在較大困難。本發明是利用可穩定懸浮培養的牛腎細胞(mdbk-scgmccno.11795)，細胞從液氮中復甦後直接懸浮培養，省去了細胞重複馴化工作，凍存形成的細胞批對病毒敏感性穩定，工藝可靠性強，應用更為方便可靠。可見，本發明的優勢在於可利用反應器大規模懸浮培養，生產放大工藝簡單，批間差較小，勞動強度小，佔地空間少，可大大提高生產效率。

實施例10、牛呼吸道合胞體病毒懸浮培養的方法及疫苗製備

1.病毒培養

本實施例中牛呼吸道合胞體病毒(來源：美國菌種保藏中心)。也可使用其它牛呼吸道合胞體病毒毒株，本發明不做限制。

1.1.種毒培養與製備

取生長良好的mdbk貼壁細胞，待細胞長滿單層後棄去原培養液，更換含有10％(體積比)牛呼吸道合胞體病毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強毒株)的維持液(維持液配方：市售dmem培養基)，37℃培養，待細胞cpe達到75％以上時，收穫病毒液，-20℃保存備用。

1.2.懸浮毒液製備

取經反應器培養的mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞(細胞密度≥2.0×106細胞/ml)，棄去原培養液，加入維持液(無血清或含0.5-2％血清的低血清sfm培養基)恢復至原體積，按體積比加入1-5％種毒(貼壁種毒或懸浮種毒，種毒分為弱毒株和強毒株)，設定病毒培養條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.2-7.4、轉速40-60rpm。

生物反應器培養56h-72h，培養過程定期取樣計數觀察，待細胞活力低於15％時，停止培養，收穫病毒液至-20℃保存。收穫的弱毒液可用作下一級培養懸浮種毒或生產弱毒疫苗、滅活疫苗抗原，收穫的強毒毒液可用作下一級培養懸浮種毒或生產滅活疫苗抗原或疫苗效力檢驗攻毒使用。

2.疫苗製備

2.1.弱毒活疫苗製備

取反應器培養的牛呼吸道合胞體病弱毒液，按1:1-2(體積比)加入蔗糖牛奶保護劑(或耐熱保護劑)，經真空冷凍乾燥，製成偽狂犬弱毒活疫苗。

2.2.滅活疫苗製備

2.2.1.毒液滅活

取懸浮培養的牛呼吸道合胞體病毒液，經離心或過濾去除細胞碎片，按體積加入0.025％的β-丙內酯滅活劑(或二乙烯亞胺、甲醛)4℃滅活24小時，升溫至37℃保持2小時，將滅活後毒液至4℃保存備用。

2.2.2.配苗

取經滅活後的牛呼吸道合胞體病毒液，按體積比46:54加入206佐劑(seppic)，充分混合後，製成牛呼吸道合胞體病毒滅活疫苗。

3.懸浮毒液和疫苗檢測

按《中華人民共和國獸藥典》經細胞半數感染量(tcid50)檢測，利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞培養的牛呼吸道合胞體病毒半數細胞感染量可達到107.0tcid50/ml，毒價與貼壁培養持平。利用懸浮培養牛呼吸道合胞體病毒毒液製備的疫苗均達到《中華人民共和國獸藥典》要求。

4.方法比較

將本發明培養牛呼吸道合胞體病毒工藝與常規貼壁培養和載體懸浮培養進行比較，如表5所示：

表5：牛呼吸道合胞體病毒工藝比較

表5的比較內容表明：利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞培養牛呼吸道合胞體病毒，可以使用大容積生物反應器(能達到5000l)，培養時間56h-72h，一次收穫抗原量大。相比傳統貼壁培養能夠節省大量勞動力，減少人為操作誤差，降低批間差異。較載體培養不需要微載體投入，也不需要消化放大，節約了成本簡化了工藝。可見，本發明的優勢在於可利用反應器大規模懸浮培養，生產放大工藝簡單，批間差較小，勞動強度小，佔地空間少，可大大提高生產效率。

實施例11、牛副流感3型病毒懸浮培養的方法及疫苗製備

1.病毒培養

本實施例中牛副流感3型病毒(來源：美國菌種保藏中心)。也可使用其它牛副流感3型病毒毒株，本發明不做限制。

1.1種毒培養與製備

取生長良好的mdbk貼壁細胞，待細胞長滿單層後棄去原培養液，更換含有10％(體積比)牛副流感3型病毒的維持液(維持液配方：市售dmem培養基)，37℃培養，待細胞cpe達到75％以上時，收穫病毒液，-20℃保存備用。

1.2懸浮毒液製備

取經反應器培養的mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞(細胞密度≥1.0×106細胞/ml)，棄去原培養液，加入維持液(無血清或含0.5-2％血清的低血清sfm培養基)恢復至原體積，按體積比加入0.1-1％種毒(貼壁種毒或懸浮種毒)，設定病毒培養條件：溫度37℃、溶氧40-60％(飽和度百分比)、ph值7.2-7.4、轉速40-60rpm。

生物反應器培養48h-72h，培養過程定期取樣計數觀察，待細胞活力低於20％時，停止培養，收穫病毒液至-20℃保存。收穫的毒液可用作下一級培養懸浮種毒或生產疫苗抗原或疫苗效力檢驗攻毒使用。

2.疫苗製備

2.1滅活疫苗製備

2.2.1毒液滅活

取懸浮培養的牛副流感3型病毒液，經離心或過濾去除細胞碎片，按體積加入0.025％的β-丙內酯滅活劑(或二乙烯亞胺、甲醛)4℃滅活24小時，升溫至37℃保持2小時，將滅活後毒液至-20℃保存備用。

2.2.2配苗

取經滅活後的牛副流感3型病毒液，按體積比46:54加入206佐劑(seppic)，充分混合後，製成牛副流感3型病毒滅活疫苗。

3.懸浮毒液和疫苗檢測

按《中華人民共和國獸藥典》經細胞半數感染量(tcid50)檢測，利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞培養的牛副流感3型病毒半數細胞感染量可達到108。5tcid50/ml，毒價與貼壁培養持平。利用懸浮培養牛副流感3型病毒毒液製備的疫苗均達到《中華人民共和國獸藥典》要求。

4.方法比較

將本發明培養牛副流感3型病毒工藝與常規貼壁培養和載體懸浮培養進行比較，如表5所示：

表6：牛副流感3型病毒工藝比較

表6的比較內容表明：利用mdbk-scgmccno.11795懸浮細胞培養牛副流感3型病毒，可以使用大容積生物反應器(能達到5000l)，培養時間48h-72h，一次收穫抗原量可製備成品疫苗百萬頭份以上。相比傳統貼壁培養能夠節省大量勞動力，減少人為操作誤差，降低批間差異。較載體培養不需要微載體投入，也不需要消化放大，節約了成本簡化了工藝。可見，本發明的優勢在於可利用反應器大規模懸浮培養，生產放大工藝簡單，批間差較小，勞動強度小，佔地空間少，可大大提高生產效率。