用於培養哺乳動物細胞的生物反應器的製作方法

2023-10-23 22:00:57 2

專利名稱：用於培養哺乳動物細胞的生物反應器的製作方法
用於培養哺乳動物細胞的生物反應器本發明涉及生物反應器以及使用這些生物反應器大規模培養哺乳動物細胞的方法。在哺乳動物細胞培養工藝中重要的是維持溶解氧、培養pH、溫度和剪切敏感性方面的物理化學環境。營養環境的維持也是重要的。培養條件的維持限制了進行大規模哺乳動物細胞培養的可能性。特別是濃度梯度能夠抑制在大規模生物反應器中哺乳動物細胞的細胞生長。本發明的目的之一是提供允許大規模體積培養哺乳動物細胞的生物反應器和方法。此外，本發明的目的是提供生物反應器和方法，即使大規模體積生長，其也允許在最佳條件下培養哺乳動物細胞，並由此允許與生物反應器的尺寸無關的工藝性能和產量。本發明的目的是提供大規模生物反應器，其允許在諸如pH、溶氧張力(DOT)和溫度之類的工藝參數方面的均相環境下培養哺乳動物細胞，在所述生物反應器中保持良好的細胞懸浮和使營養補料(feed)混合。此外，本發明的目的是提供設備和方法，所述設備和方法允許以大規模的方式生產哺乳動物細胞和哺乳動物細胞產物，尤其是由哺乳動物細胞合成的蛋白、肽、抗體或胺基酸。通過提供如權利要求書中所述的用於培養真核細胞、特別是哺乳動物細胞的生物反應器、生物反應器系統和方法，本發明解決了構成本發明的基礎的技術問題。尤其是通過提供用於培養哺乳動物細胞的生物反應器，本發明解決構成本發明基礎的技術問題，所述生物反應器特徵在於其具有至少兩個葉輪。此外，通過提供用於培養和增殖哺乳動物細胞的方法，本發明解決了構成本發明基礎的技術問題，所述方法特徵在於在具有至少兩個葉輪的生物反應器中，在合適的條件下和合適的培養基中培養至少一個哺乳動物細胞。此外，通過提供用於培養哺乳動物細胞的生物反應器系統，本發明解決了構成本發明基礎的技術問題，所述生物反應器系統特徵在於具有至少500升體積的a)第一生物反應器與體積大於所述第一生物反應器並具有至少2000升體積的b)第二生物反應器連接，並且其中所述具有至少2000升體積的第二生物反應器與體積大於所述第二生物反應器體積並具有至少兩個葉輪和至少10000升體積的c)第三生物反應器連接。此外，通過提供培養和增殖哺乳動物細胞的方法，本發明解決了構成本發明基礎的技術問題，所述方法特徵在於a)在具有至少500升體積的第一生物反應器中，在合適的條件下和合適的培養基中培養至少一個哺乳動物細胞，b)將通過增殖至少一個哺乳動物細胞獲得的含細胞培養基轉移入具有至少2000升體積的第二生物反應器，c)在所述具有至少2000升體積的第二生物反應器中培養被轉移的細胞，d)將在步驟c)中獲得的含細胞培養基轉移入具有至少10000升體積的第三生物反應器以及e)在所述具有至少10000升體積的第三生物反應器中培養所述被轉移的細胞。根據本發明，培養細胞為真核細胞，優選動物細胞，更優選哺乳動物細胞。所述哺乳動物細胞可以為例如人類細胞系、小鼠骨髓瘤(NOS)細胞系，中華倉鼠卵巢(CHO)細胞系或雜交瘤細胞系。優選的哺乳動物細胞為中華倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
培養細胞優選用於生產抗體，更優選單克隆抗體，和/或重組蛋白，更優選用於治療應用的重組蛋白。所述細胞當然可以生產肽、胺基酸、脂肪酸或其它有用的生化中間體或代謝產物。根據本發明，通過培養細胞生產的蛋白的目標濃度為大於0.5g/l，優選大於 2.0g/l，最優選大於10.0g/l。能夠以分批或補料分批的方式使用本發明的方法。雖然在本發明的方法中使用的細胞培養基優選為無蛋白培養基，但該設計不排除使用含蛋白流體 (stream)0根據本發明，生物反應器為具有附加設備的生物相容性罐或容器，所述附加設備例如葉輪、擋板、分布器(sparger)和/或孔(port)，其尤其允許用於培養和增殖哺乳動物細胞。優選所述罐或容器為管道的形式，在管道的兩末端(其優選構建罐的頂和底)具有平板。這些平板被稱為頂板和基板。在本發明的一種特別優選實施方案中，基板為American Society of Mechanical Engineers Flanged and Dished (ASME F&D，美國機械工程師協會 F&D)設計的基板。所述頂板設計優選符合人孔或優選裝凸緣的頂板以允許安裝/拆卸葉輪。總罐高為從罐的底部的罐內側至罐的頂部的罐內側的切線。將自由空間(freeboard，淨空)高度定義為當將生物反應器填充至其操作體積時，在液體頂部之上直線側的長度。最小自由空間高度必需考慮在操作過程中形成泡沫的程度、在允許的最大攪拌和通氣下氣體容納以及液體測量誤差。本發明的生物反應器具有的體積為優選至少500升，更優選至少1000升，更優選至少4000升，甚至更優選至少10000升，甚至更優選至少20000升。最優選地，本發明的生物反應器具有的體積為1000升、1307升、4000升、5398升、20000升或27934升。優選，生物反應器具有最大體積100000升，更優選，生物反應器具有最大體積 50000升，最優選生物反應器具有最大體積30000升。本發明的生物反應器的設計保證在所述生物反應器中諸如pH、溶氧張力(DOT)和溫度之類的工藝參數方面的均相環境，保持良好混合細胞懸浮和使營養補料混合。這為最佳的細胞生長、產物積累和產物質量提供了必要的物理化學環境。本發明的生物反應器的設計進一步保證了維持幾何相似性。這允許在12升實驗室規模和500升中試規模開發按比例縮小的模型。本發明的用於培養哺乳動物細胞的生物反應器具有至少兩個葉輪。更優選，所述生物反應器具有兩個葉輪，甚至更優選頂部葉輪(top impeller)和底部葉輪(bottom impeller)。本發明的用於培養哺乳動物細胞的生物反應器優選具有至少一個頂部葉輪和至少一個底部葉輪，其中頂部葉輪優選水翼式葉輪(hydrofoil impeller)。本發明的用於培養哺乳動物細胞的生物反應器優選具有至少一個頂部葉輪和至少一個底部葉輪，其中頂部葉輪為水翼式葉輪。本發明的用於培養哺乳動物細胞的生物反應器優選具有至少1000升的體積以及至少一個頂部葉輪和至少一個底部葉輪，其中頂部葉輪為水翼式葉輪。本發明用於培養哺乳動物細胞的生物反應器優選具有至少4000升的體積以及至少一個頂部葉輪和至少一個底部葉輪，其中頂部葉輪優選水翼式葉輪。本發明用於培養哺乳動物細胞的生物反應器優選具有至少4000升的體積以及至少一個頂部葉輪和至少一個底部葉輪，其中頂部葉輪為水翼式葉輪。在本發明一種優選的實施方案中，頂部葉輪為水翼式葉輪。優選可使用頂部葉輪以提供強的主體混合。在本發明一種優選的實施方案中，底部葉輪為水翼式葉輪。在本發明一種優選的實施方案中，頂部葉輪和底部葉輪為水翼式葉輪。在本發明一種優選的實施方案中，至少頂部葉輪為水翼式葉輪。在本發明的一種優選實施方案中，所有葉輪都為水翼式葉輪。根據本發明的一種優選實施方案，底部葉輪為大稠度斜葉式葉輪(high-solidity pitch-blade impeller)或大稠度水翼式葉輪。優選可使用底部葉輪以分散分布的 (sparged)氣體。優選地，水翼式葉輪提供大得多的液體運動，對於給定量的功率輸入導致更大的主體混合。這也可依賴於流量數(flow number, Nq)。優選地，非水翼式葉輪能夠提供液體運動，但是在更大的功率輸入下提供。這對於剪切敏感性哺乳動物細胞的健康具有重要性。在本發明一種優選的實施方案中，水翼式葉輪為向下流動葉輪或向上流動葉輪。在本發明一種優選的實施方案中，頂部葉輪為向下流動葉輪。在本發明一種優選的實施方案中，頂部葉輪為向下流動軸向水翼式葉輪。在本發明一種優選的實施方案中，使用頂部葉輪下推特性來混合充分充氣的液體表面和液體主體。在本發明的一種優選實施方案中，水翼式葉輪為高效水翼式葉輪。在本發明的一種優選實施方案中，水翼式葉輪為Chemineer-SC-3型葉輪、LIGHTNIN-A310或A510型葉輪、 I^romix-PHF 型系列葉輪或 Cleaveland Eastern Mixers 葉輪。在本發明的一種優選實施方案中，頂部葉輪為高效水翼式葉輪。在本發明的一種優選實施方案中，頂部葉輪為Chemineer-SC-3型葉輪、LIGHTNIN-A310或A510型葉輪、 I^romix-PHF 型系列葉輪或 Cleaveland Eastern Mixers 葉輪。頂部葉輪優選三葉水翼式設計的葉輪，例如來自LIGHTNIN的A310型葉輪。底部葉輪優選四斜葉大稠度葉輪，例如來自LIGHTNIN的A315型葉輪。頂部葉輪(Dw/T)和/ 或底部葉輪(DlilZt)的葉輪與罐直徑之比優選0.35以上至0.55以下，更優選0.40以上至 0. 48以下，最優選0. 44以上至0. 46以下。大於0. 5的直徑導致破壞軸向流動，由此導致差的攪拌和充氣。頂部葉輪功率數(power number, Np)優選0. 1以上至0. 9以下，更優選0. 25以上至0. 35以下，最優選0. 3。頂部葉輪流量數(N,)優選0. 4以上至0. 9以下，更優選0. 50以上至0. 60以下，最優選0. 56。底部葉輪功率數(Np)優選0.5以上至0.9以下，更優選0. 70 以上至0.80以下，最優選0.75。底部葉輪流量數(N,)優選0.50以上至0. 85以下，更優選 0. 70以上至0. 80以下，最優選0. 73。葉輪功率數(Np)為將旋轉葉輪葉片的動能傳遞至流體的葉輪效率的度量。量化氣體分散是重要的。葉輪流量數(N,)為葉輪泵送能力的度量標準且在量化流體主體運動方面是重要的。所述至少兩個葉輪的攪拌速率由規模決定。然而，在本發明一種特別優選的實施方案中，所述至少兩個葉輪的攪拌速率為200轉/分鐘(rpm)以下，更優選165rpm以下。葉輪間距(Ds)為所述至少兩個葉輪間的距離。在本發明一種特別優選的實施方案中，其為IX底部葉輪的直徑(D底)以上至2XD底以下，更優選其為1.2^XD底或2XD底。 這將允許兩葉輪在最小接種後體積下均保持浸沒。在本發明一種特別優選的實施方案中，上葉輪(upper impeller)以上的液體高度(D0)為0.3X頂部葉輪的直徑(D頂)以上至2.5XD頂以下。更優選其為0. 5XD頂以上至 2. 0XDw。底部間隙(D。)為罐底部與底部葉輪中心線間的間隙。在本發明一種特別優選的實施方案中，其為0. 35XD底以上，更優選其為0. 4XD底或0. 75XD底。在本發明的生物反應器中，葉輪的設計在主體混合、氣體分散和低剪切力方面提供了最佳的流體動力學特性。通過經由本發明的葉輪系統的攪拌，將哺乳動物細胞保持在勻相懸浮液中。在本發明的生物反應器中，葉輪的設計提供了快速混合、保持勻相、保持哺乳動物細胞懸浮和氣泡分散。在本發明的生物反應器中，葉輪的設計使由剪切力造成的細胞損傷最小化，所述剪切力源自葉輪幾何結構以及在葉輪葉片後面產生的漩渦或渦流。在本發明一種特別優選的實施方案中，所述至少兩個葉輪為頂部驅動攪拌系統。優選通過至少一個分布器釋放來供應空氣，尤其是壓縮空氣，或特定氣體，優選氧氣、氮氣和/或C02。本發明的生物反應器優選具有至少一個分布器，更優選所述生物反應器具有一個分布器或兩個分布器。本發明的生物反應器優選具有兩個分布器。優選所述生物反應器具有至少一個管幾何結構分布器。優選至少一個分布器為槽式(flute-type)或為燒結的分布器。優選至少一個分布器為槽式。在本發明特別優選的實施方案中，採用了新月形管道。 新月形的曲率優選為0.8XD&為了有助於從生物反應器的側孔安裝和移出，所述新月形圓周優選0.8XD底圈的完整圓周的。至少一個分布器提供充分的氧傳質(通過體積傳質係數(Kp)來表徵)以滿足培養物的氧需求。所述至少一個分布器提供I^a高達2( -1,用於培養具有每小時5mmol/l氧攝取速率的多達每毫升20X IO6個細胞的培養物。用作雙分布器系統的兩個分布器允許去除溶解的CO2和控制溶氧張力(DOT)。槽式分布器提供了容易就地清洗(CIP)和就地消毒 (SIP)、幫助d(X)2去除並由於其多種用途而減少操作成本的益處。燒結分布器提供較高的 K^值。槽式分布器設計的較低固有I^a值能夠通過使用富氧空氣得到補償。氣體流動速度在恆定表觀氣速的基礎上按比例增加。在哺乳動物細胞的大規模培養中，重要的是保持在溶解氧、培養pH和溫度、以及溶解CO2、營養物和代謝物濃度梯度方面的均相物理化學環境。在通過使用適當攪拌和充氣而確保物理化學環境為均相的同時，重要的是確保所選的攪拌和充氣操作條件不產生不利的剪切環境。本發明涉及在確保均相環境和同時使剪切環境的不利影響最小化之間的適當平衡，所述均相環境將促進良好的細胞生長和哺乳動物細胞培養工藝的產率。這將通過限定以下來實現特定生物反應器幾何結構、葉輪設計和定位、分布器設計和定位以及特定的用於攪拌和充氣速率的操作限制。在攪動和分布的生物反應器中對哺乳動物細胞的主要損害來自界面剪切。當分布氣泡合併和破裂時發生界面剪切[參考文獻Ma N,Koelling Kff,Chalmers JJ. Biotechnol Bioeng. 2002 Nov 20 ；80 (4) :428-37.勘誤於Biotechnol Bioeng. 2003 Feb 5 ；81 (3) 379]。因此，期望使分布氣體的流動和泡沫的過度產生最小化。界面剪切能夠通過合併以下方法而最小化首先，通過藉助液體表面和液體主體的良好混合來促進表面充氣，其次， 通過藉助優選兩個分布器來分開進行培養物的充氧。水翼式葉輪的指定位置，尤其是上葉輪以上的液體高度( )，優選為液體表面下約0. 5XDW，這能夠幫助強且連續的液體表面和液體主體的交換，從而使充分充氧的液體表面和不充分充氧的液體主體混合。規定的葉輪間距優選為Ds= 1乂0/!|至2乂0；!|，這能夠允許由上葉輪產生的液體的向下流動去補充流入下葉輪(lower impeller)的液體，由此保證整個流動主體良好混合且不產生單獨的混合區域。規定的葉輪底部間隙優選為D。= 0. 35XD至0. 75XD，這能確保主體流動能夠偏離彎曲的ASME F&D基底並沿著生物反應器的壁上升。流經控制分布器的「按需」充氧分布氣體從流經鎮流分布器(ballast sparger)的非充氧分布氣體(如CO2、空氣和氮氣鎮流(ballast))的分離，能夠允許在流體中的高度充氧的分布氣泡在從流體主體中分離並進入頂部空間之前更長的駐留時間和路徑長度。對於給定容積的傳質係數ky這能夠允許提供更大的氧傳輸速率。分布氣泡的駐留時間和路徑長度還可以通過限定向下流動軸向水翼式葉輪來進一步延長，所述向下流動軸向水翼式葉輪連續向下推動液體表面和液體主體。本發明的生物反應器優選具有至少一個擋板，更優選具有至少兩個擋板。本發明的生物反應器最優選具有四個擋板。擋板為垂直輻射狀設置的板。擋板用於防止形成漏鬥或形成渦旋。在本發明一種優選的實施方案中，所述至少一個擋板的長度為1. IX生物反應器的總直線高度。擋板寬度(W)優選為0. IX罐內部直徑(T)。擋板間隙(Wc)優選為0. OlX 罐內部直徑(T)。所述至少一個擋板的高度(Heft)優選為1. IX總直線高度(H)-生物反應器頂部高度(Hh)。因此，Heft優選根據式Heft= 1. IXH-Hh來計算。不限定所述至少一個擋板的厚度，但該厚度應確保對流體流的徑向分量的剛性。 需要額外的厚度以確保在SIP期間擋板不被變形從而影響擋板至罐壁的間隙。本發明的生物反應器優選具有至少兩個用於添加鹼的孔。更優選，所述生物反應器具有兩個用於添加鹼的孔。最優選，生物反應器具有兩個用於添加鹼的孔，其中第一個孔位於底部葉輪的中線，第二個孔位於頂部葉輪的中線。優選，PH探頭(probe)與鹼添加孔在直徑方向相對地位於生物反應器中。在本發明一種優選的實施方案中，生物反應器具有1000升的體積。1000升的生物反應器的頂部體積(Vh)優選45升以上至65升以下，更優選頂部體積為55升。1000升的生物反應器的基部體積(Vb)優選45升以上至65升以下，更優選基部體積為55升。本發明的1000升生物反應器的罐內部直徑(T)優選850mm以上至900mm以下，更優選罐內部直徑為864mm。本發明的1000升生物反應器的罐橫截面面積(A)優選0. 55m2以上至0. 65m2以下，更優選罐橫截面面積為0. 586m2。本發明的1000升生物反應器的頂部高度(Hh)(其為頂板的高度)，和/或基部高度(Hb)(其為基板的高度)優選為120mm以上至180mm以下， 更優選頂部高度和/或基部高度為151mm。本發明的1000升生物反應器的總罐高度優選
82000mm以上至^OOmm以下，更優選總罐高度為2347mm。本發明的1000升生物反應器的頂部葉輪直徑(Dw)和/或底部葉輪直徑(D底)優選350mm以上至400mm以下，更優選頂部葉輪直徑和/或底部葉輪直徑為381mm。本發明的1000升生物反應器的罐底部與底部葉輪中線的間隙(D。)優選120mm以上至180mm以下，更優選該間隙為152mm。本發明的1000升生物反應器的所述至少兩個葉輪間的距離(也稱為葉輪間距(Ds)優選730mm以上至790mm以下，更優選該葉輪間距為762mm。本發明的1000升生物反應器的葉輪軸直徑優選為102mm 以上至152mm以下。如果本發明的1000升生物反應器具有擋板，則擋板的長度優選2000mm 以上至MOOmm以下，更優選該長度為2250mm。本發明的1000升生物反應器的擋板寬度優選70mm以上至IOOmm以下，更優選該寬度為86mm。本發明的1000升生物反應器的擋板間隙優選7mm以上至Ilmm以下，更優選該擋板間隙為9mm。本發明的1000升生物反應器的擋板高度(Heft)優選2000mm以上至2200mm以下，更優選該擋板高度為2099mm。本發明的 1000升生物反應器優選具有至少一個分布器，更優選其具有一個分布器。本發明的1000升生物反應器的至少一個分布器優選具有1. 5mm以上至2. 5mm以下的噴嘴徑或孔徑，更優選該噴嘴徑或孔徑為2mm。噴嘴數或孔數優選為20以上至40以下，更優選該噴嘴數或孔數為 30。分布器長度(SL)優選為150mm以上至550mm以下，更優選該分布器長度為305mm。本發明的1000升生物反應器的分布器至罐底的間隙(Sc)優選50mm以上至75mm以下，更優選分布器至罐底的間隙為64mm。本發明的1000升生物反應器的分布器至底部葉輪的間隙 (Dc-Sc)優選75mm以上至IOOmm以下，更優選分布器至底部葉輪的間隙為88mm。
在本發明一種優選的實施方案中，生物反應器具有體積4000升。4000升的生物反應器的頂部體積(Vh)優選340升以上至370升以下，更優選頂部體積為359升。4000升的生物反應器的基部體積(Vb)優選340升以上至370升以下，更優選基部體積為359升。 本發明的4000升生物反應器的罐內部直徑(T)優選1600mm以上至1650mm以下，更優選罐內部直徑為16沈讓。本發明的4000升生物反應器的罐橫截面面積(A)優選1. 90m2以上至2. 30m2以下，更優選罐橫截面面積為2. 076m2。本發明的4000升生物反應器的頂部高度 (Hh)和/或基部高度(Hb)優選260mm以上至300mm以下，更優選該頂部高度和/或基部高度為觀2讓。本發明的4000升生物反應器的總罐高度優選2300mm以上至3100mm以下，更優選總罐高度為觀17讓。本發明的4000升生物反應器的頂部葉輪直徑(Dw)和/或底部葉輪直徑(Dlil)優選680mm以上至740mm以下，更優選頂部葉輪直徑和/或底部葉輪直徑為710mm。本發明的4000升生物反應器的罐底部與底部葉輪中線的間隙(D。)優選500mm 以上至560mm以下，更優選該間隙為531mm。本發明的4000升生物反應器的所述至少兩個葉輪間的距離(也稱為葉輪間距(Ds)優選840mm以上至900mm以下，更優選該葉輪間距為 872mm。本發明的4000升生物反應器的葉輪軸直徑優選為51mm以上至64mm以下。如果本發明的4000升生物反應器具有擋板，則該擋板的長度優選為2200mm以上至^OOmm以下， 更優選該長度為M77mm。本發明的4000升生物反應器的擋板寬度優選150mm以上至180mm 以下，更優選該寬度為163mm。本發明的4000升生物反應器的擋板間隙優選12mm以上至 20mm以下，更優選該擋板間隙為16mm。本發明的4000升生物反應器的擋板高度(Heft)優選2100mm以上至2300mm以下，更優選該擋板高度為2195mm。本發明的4000升生物反應器優選具有至少一個分布器，更優選其具有一個分布器。本發明的4000升生物反應器的至少一個分布器優選具有1. 5mm以上至2. 5mm以下的噴嘴徑或孔徑，更優選該噴嘴徑或孔徑為2mm。本發明的4000升生物反應器的噴嘴數或孔數優選為80以上至120以下，更優選該噴嘴數或孔數為100。分布器長度(SL)優選為250mm以上至800mm以下，更優選該分布器長度為568mm。本發明的4000升生物反應器的分布器至罐底部的間隙(Sc)優選315mm以上至360mm以下，更優選分布器至罐底部的間隙為337mm。本發明的1000升生物反應器的分布器至底部葉輪的間隙(D。-S。)優選180mm以上至205mm以下，更優選分布器至底部葉輪的間隙為194mm。 在本發明一種優選的實施方案中，生物反應器具有20000升的體積。20000升的生物反應器的頂部體積(Vh)優選1600升以上至2000升以下，更優選頂部體積為1803升。 20000升的生物反應器的基部體積(Vb)優選1600升以上至2000升以下，更優選基部體積為1803升。本發明的20000升生物反應器的罐內部直徑(T)優選2500mm以上至3000mm 以下，更優選罐內部直徑為2794mm。本發明的20000升生物反應器的罐橫截面面積(A)優選5. Sm2以上至6. 5m2以下，更優選罐橫截面面積為6. 131m2。本發明的20000升生物反應器的頂部高度(Hh)和/或基部高度(Hb)優選460mm以上至500mm以下，更優選該頂部高度和/或基部高度為485mm。本發明的20000升生物反應器的總罐高度優選4800mm以上至 5100mm以下，更優選總罐高度為4933mm。本發明的20000升生物反應器的頂部葉輪直徑(D 頂)禾P /或底部葉輪直徑(D底)優選IlOOmm以上至1300mm以下，更優選頂部葉輪直徑和/ 或底部葉輪直徑為1219mm。本發明的20000升生物反應器的罐底部與底部葉輪中線的間隙 (Dc)優選890mm以上至945mm以下，更優選該間隙為913mm。本發明的20000升生物反應器的所述至少兩個葉輪間的距離(也稱為葉輪間距(Ds)優選1200mm以上至1700mm以下，更優選該葉輪間距為1498mm。本發明的20000升生物反應器的葉輪軸直徑優選為51mm以上至64mm以下。如果本發明的20000升生物反應器具有擋板，則擋板的長度優選4000mm以上至4600mm以下，更優選該長度為4365mm。本發明的20000升生物反應器的擋板寬度優選 260mm以上至^Omm以下，更優選該寬度為279mm。本發明的20000升生物反應器的擋板間隙優選20mm以上至35mm以下，更優選該擋板間隙為觀讓。本發明的20000升生物反應器的擋板高度(Heft)優選3600mm以上至4050mm以下，更優選該擋板高度為3882mm。本發明的20000升生物反應器優選具有至少一個分布器，更優選其具有兩個分布器。如果本發明的20000升生物反應器具有兩個分布器，則一個優選為控制分布器，一個優選為鎮流分布器。本發明的20000升生物反應器的控制分布器優選具有3mm以上至5mm以下的噴嘴徑或孔徑，更優選該噴嘴徑或孔徑為4mm。本發明的20000升生物反應器的鎮流分布器優選具有 5mm以上至7mm以下的噴嘴徑或孔徑，更優選該噴嘴徑或孔徑為6mm。本發明的20000升生物反應器的控制分布器的噴嘴數/孔數優選為230以上至270以下，更優選該噴嘴數或孔數為250。本發明的20000升生物反應器的鎮流分布器的噴嘴數或孔數優選為85以上至 115以下，更優選該噴嘴數或孔數為100。用於控制和/分布器或鎮流分布器的分布器長度 (Sl)優選500mm以上至2000mm以下，更優選該分布器長度為1077mm。對於控制分布器和/ 或鎮流分布器，本發明的20000升生物反應器的分布器至罐底的間隙(S。)優選560mm以上至620mm以下，更優選分布器至罐底的間隙為593mm。對於控制分布器和/或鎮流分布器， 本發明的20000升生物反應器的分布器至底部葉輪的間隙(D。-S。)優選300mm以上至:340mm 以下，更優選分布器至底部葉輪的間隙為320mm。從分離的分布器添加鎮流(鎮流分布器) 的要求，防止用鎮流氣體稀釋氧或富氧DOT需求氣體。為確保最好的氧傳輸速率(OTR)，從分布器形成的氣泡的氧濃度梯度是最大的。其次，使用鎮流分布器允許將分布器安置在不同的位置以避免為了 PC02控制而傳遞需要的鎮流時影響DOT控制。鎮流分布器能夠獨立於控制分布器而設計。用本發明的生物反應器設計，能夠完成不同的傳代培養比。在一種特別優選的實施方案中，完成的傳代培養比為1比5(20% V/V)以上至1比9(11%V/V)以下，更優選1 比5(20% V/V)或1比9(11% V/V)的傳代培養比。本發明還包括培養和增殖哺乳動物細胞的方法，特徵在於，在本發明的生物反應器中在合適的培養基中在合適的培養條件下培養至少一個哺乳動物細胞。本發明的生物反應器包括具有至少兩個葉輪並顯示上述至少一個特徵或不同特徵的組合的所有生物反應器。在本發明的方法中，生物反應器的至少兩個葉輪的攪拌速率優選55W/m3以上至 85ff/m3以下。優選地，以至少5X 10_5m/S的速度，更優選以至少IOX 10_5m/S的速度，將空氣分布入培養基中。在本發明一種特別優選的實施方案中，通過優選在空間上彼此分離的兩個添加孔加入鹼，以分散鹼。如果在罐中發生長再循環時間，這確保鹼的快速混合。優選通過控制分布器來添加CO2。優選使用鹼和/或(X)2來調節培養基的pH。優選控制探頭和備用探頭位於距罐底部913mm的下孔圈。在本發明一種優選的實施方案中，本發明的方法發生於體積為1000升的生物反應器中。在使用1000升生物反應器的方法中，使用的培養基體積優選在接種前期間為50 升至250升。在接種後期間，培養基的體積優選300升以上至960升以下。在轉移前/收穫期，在1000升生物反應器中的培養基體積優選300升以上至960升以下。在本發明的具有1000升體積的生物反應器中，最小操作體積(V·、)優選在80升至120升之間，更優選該最小操作體積為100升，最大操作體積(V)優選900升以上至1100升以下，該最大操作體積更優選為1000升。最小攪拌體積優選為230升以上至255升以下，更優選最小攪拌體積為245升。在具有1000升體積的生物反應器中，在最小操作體積時的液體高度(H·、)優選210mm以上至240mm以下，更優選在最小操作體積時該液體高度為2觀讓。在具有1000 升體積的生物反應器中，在最大操作體積時的液體高度( )優選1500mm以上至1900mm以下，更優選在最大操作體積時該液體高度為1764mm。最小高寬比(Η·、/Τ)優選0. 15以上至0. 19以下，更優選該最小高寬比為0. 17。在本發明的方法中使用的具有1000升體積的生物反應器的最大高寬比Ot-T)優選1. 8以上至2. 1以下，更優選該最大高寬比為1. 96。 自由空間體積優選270升以上至310升以下，更優選該自由空間體積為293升。自由空間高度優選450mm以上至550mm以下，更優選該自由空間高度為500mm。總直線高度(H)優選 1900mm以上至2200mm以下，更優選總直線高度為2045mm。上探頭圈(probe-ring)或樣品圈(sample-ring)的高度優選900mm以上至1200mm以下，更優選上探頭圈或樣品圈的高度為1093mm。下探頭圈或樣品圈的高度優選152mm以上至觀6讓以下。在本發明一種優選的實施方案中，本發明的方法發生在體積為4000升的生物反應器中。在使用4000升生物反應器的方法中，使用的培養基體積優選在接種前期間為1914 升至3077升。在接種後期間，培養基的體積優選2153升以上至3846升以下。在轉移前/
11收穫期，在4000升生物反應器中的培養基體積優選2153升以上至3846升以下。在本發明的具有4000升體積的生物反應器中，最小操作體積(V·、)優選在1500升至2200升之間， 更優選該最小操作體積為1900升，最大操作體積(V)優選3800升以上至4200升以下，該最大操作體積更優選為4000升。最小攪拌體積優選1500升以上至1800升以下，更優選最小攪拌體積為16M升。在具有4000升體積的生物反應器中，在最小操作體積下的液體高度 (ΗΛ/>)優選800mm以上至1200mm以下，更優選在最小操作體積下的液體高度為1024mm。在具有4000升體積的生物反應器中，在最大操作體積時的液體高度( )優選1800mm以上至 2200mm以下，更優選在最大操作體積時該液體高度為2034mm。最小高寬比(H^、/T)優選 0. 55以上至0.75以下，更優選該最小高寬比為0.63。在本發明的方法中使用的具有4000 升體積的生物反應器的最大高寬比Ot-T)優選1. 1以上至1. 4以下，更優選該最大高寬比為1.25。自由空間體積優選850升以上至1250升以下，更優選該自由空間體積為1039升。 自由空間高度優選450mm以上至550mm以下，更優選該自由空間高度為500mm。總直線高度 (H)優選2000mm以上至MOOmm以下，更優選總直線高度為2252mm。上探頭圈或樣品圈的高度優選1200mm以上至1600mm以下，更優選上探頭圈或樣品圈的高度為1403mm。下探頭圈或樣品圈的高度優選500mm以上至550mm以下，更優選下探頭圈或樣品圈的高度為531mm。在本發明一種優選的實施方案中，本發明的方法發生在體積為20000升的生物反應器中。在使用20000升生物反應器的方法中，使用的培養基體積優選在接種前期間為 13913升至17096升。在接種後期間培養基的體積優選17391升以上至19231升以下。在轉移前/收穫期，在20000升生物反應器中的培養基體積優選20000升以上至21739升以下。在本發明的具有20000升體積的生物反應器中，最小操作體積(V^、)優選在9000升至16000升之間，更優選該最小操作體積為13000升，最大操作體積(V)優選19000升以上至25000升以下，該最大操作體積更優選為22000升。最小攪拌體積優選為8100升以上至 8500升以下，更優選最小攪拌體積為8379升。在具有20000升體積的生物反應器中，在最小操作體積時的液體高度(H·、)優選2100mm以上至2500mm以下，更優選在最小操作體積時該液體高度為2309mm。在具有20000升體積的生物反應器中，在最大操作體積時的液體高度( )優選3550mm以上至3950mm以下，更優選在最大操作體積時該液體高度為3777mm。 最小高寬比(Η·、/Τ)優選0. 70以上至0. 99以下，更優選該最小高寬比為0. 83。在本發明的方法中使用的具有20000升體積的生物反應器的最大高寬比Ot-T)優選1. 2以上至1. 5 以下，更優選該最大高寬比為1.35。自由空間體積優選5750升以上至6500升以下，更優選該自由空間體積為6131升。自由空間高度優選900mm以上至IlOOmm以下，更優選該自由空間高度為1000mm。總直線高度(H)優選3700mm以上至4100mm以下，更優選總直線高度為3968mm。上探頭圈或樣品圈的高度優選2200mm以上至沈50讓以下，更優選上探頭圈或樣品圈的高度為Ml 1mm。下探頭圈或樣品圈的高度優選880mm以上至940mm以下，更優選下探頭圈或樣品圈的高度為913mm。對於具有20000升體積的生物反應器，優選使用的接種比為11 % ν/ν (1比9稀釋) 或20% ν/ν(1比5稀釋)，優選的補料應用為接種後體積的4% ν/ν至25% ν/ν。優選調整20000升生物反應器中接種後的體積，使補料應用達15%，以便在添加所有補料後到收穫時最終體積為20000升。然而，對於大於15% ν/ν的補料應用，優選為了 15% ν/ν補料而調整接種後體積，但在補料應用後，最終收穫前體積將為最小20000升至最大22000升。期望20000升生物反應器在批次結束時容納總共20000升至22000升。具有20000升體積的生物反應器優選以10至15天的分批或分批補料模式來操作。本發明還包括用於培養哺乳動物細胞的生物反應器系統，所述生物反應器系統特徵在於具有至少500升、優選至少1000升體積的a)第一生物反應器與體積大於第一生物反應器體積並具有至少2000升、優選至少4000升體積的b)第二生物反應器連接，並且其中所述具有至少2000升、優選至少4000升體積的第二生物反應器與本發明的體積大於第二生物反應器體積並具有至少10000升、優選至少20000升體積的c)第三生物反應器連接。在本發明一種優選的實施方案中，生物反應器系統特徵在於生物反應器中至少一種為本發明的生物反應器。更優選，生物反應器系統的所有生物反應器均為本發明的生物反應器。在本文中，本發明的生物反應器為在說明書、實施例和權利要求書中描述的所有生物反應器。本發明的生物反應器也稱為生物反應器列(train)或設備。生物反應器列優選包括不同的生物反應器，其也稱為階段。具有至少500升、優選至少1000升體積的生物反應器對應於階段N-3和/或N-2。具有至少2000升、優選至少 4000升體積的生物反應器對應於階段N-I。具有至少10000升、優選至少20000升體積的生物反應器對應於階段N。根據需要設計生物反應器列，以確保諸如pH、溶氧張力(DOT)和溫度之類的工藝參數方面的均相環境，在所述生物反應器中保持良好混合的細胞懸浮和使營養補料混合。 生物反應器列的生物反應器優選顯示幾何相似性。這允許在例如12升實驗室規模或500 升中試規模開發按比例縮小模型。將階段N-3、N-2和N-I的生物反應器用作種子生物反應器。將階段N的生物反應器用作生產生物反應器。優選基於相同的原理設計種子生物反應器和生產生物反應器。然而，可以要求一些偏差以適應工藝中的靈活性。在本發明一種優選的實施方案中，高寬比Η/Γ為0. 17以上至1. 96以下。在本發明一種優選的實施方案中，存在另一生物反應器，尤其是對應於階段N-4 的50升生物反應器。在本發明一種優選的實施方案中，N-4生物反應器是S-200Seed wave生物反應器或100升攪拌罐反應器。在本發明的一種優選實施方案中，液體(例如培養基)能夠通過氣動輔助流動或通過蠕動泵從一個生物反應器運輸至另一生物反應器。本發明還包括培養和增殖哺乳動物細胞的方法，所述方法特徵在於a)在具有至少500升體積、優選具有至少1000升體積的第一生物反應器中，在合適的條件下在合適的培養基中培養至少一個哺乳動物細胞，b)將通過增殖至少一個哺乳動物細胞而獲得的含細胞培養基轉移入具有至少2000升體積、優選具有至少4000升體積的第二生物反應器，c)在所述具有至少2000升體積、優選具有至少4000升體積的第二生物反應器中培養被轉移的細胞，d)將在步驟c)中獲得的含細胞培養基轉移入具有至少10000升體積、優選具有至少 20000升體積的第三生物反應器，以及e)在具有至少10000升體積、優選具有至少20000升體積的第三生物反應器中培養所述被轉移的細胞。在本發明的一種優選實施方案中，所述方法特徵在於所使用的生物反應器中至少一種為本發明的生物反應器，更優選所使用的所有生物反應器都是本發明的生物反應器。在本文中，本發明的生物反應器為在說明書、實施例和權利要求書中描述的所有生物反應器。步驟e)的生物反應器優選以分批或分批補料模式來操作。優選將細胞在步驟e) 中培養10至15天。步驟a)也稱為階段N-3和/或N_2。步驟c)也稱為階段N_1。步驟e)也稱為階段N。優選在步驟a)、c)和e)的生物反應器中的培養條件相同。更優選，在步驟a)、c) 和e)的生物反應器中的培養條件諸如pH、溶氧張力和溫度的工藝參數方面的均相環境。優選在步驟a)、c)和e)中生物反應器中的pH、溶氧張力和溫度相同。在本發明的一種優選實施方案中，在轉移步驟b)和/或d)之後的接種比為至少 10% v/v，更優選11% v/v(l比9稀釋)以上至30% ν/ν以下，更優選20% ν/ν (1比5稀釋)。優選在步驟b)和d)中轉移全部培養基或僅部分培養基。本發明進一步優選的實施方案為從屬權利要求中的主題(subject-matter)。在接下來的實施例和附圖中將更詳細地說明本發明。

圖1顯示了本發明的生物反應器。1為生物反應器。10為罐(T)的直徑。20為生物反應器的總直線高度(H)。30為生物反應器的基部高度(Hb)。40為生物反應器的頂部高度(Hh)。50為最大操作體積時的液體高度(HJ。60為頂部葉輪直徑(Dw)。68為頂部葉輪。70為底部葉輪直徑(Dlis)15 78為底部葉輪。80為罐底部與底部葉輪中線之間的間隙(Dc)。90為葉輪間距(Ds)。100為液體表面以下至頂部葉輪的間隙(D。)。108為分布器。110為分布器至罐底部的間隙(S。)。120為分布器至底部葉輪的間隙(D。-S。)。128為擋板。138為位於下圈的孔。148為位於頂部葉輪68中線的孔。圖2顯示了本發明的生物反應器系統。111為具有1000升體積的生物反應器。11 為具有4000升體積的生物反應。1為本發明的具有20000升體積的生物反應器。實施例1 :20000升生物反應器對於哺乳動物細胞培養，20000升生物反應器以分批或分批補料的模式運行10至 15天。通過經由葉輪系統的攪拌從而將哺乳動物細胞保持在均相懸浮液中。容器幾何結構用於20000升生物反應器的容器幾何結構通過反覆設計基礎來確定，在所述反覆設計基礎中改變最大工作體積、自由空間直線側距離、高寬比凡/T以及葉輪與罐直徑D/T 的比例，直到實現可接受的高寬比。生物反應器高寬比氏/T此關鍵設計參數允許對生物反應器幾何結構進行表徵。具有較高高寬比的罐提供較長氣體駐留時間，其允許較大的Kp。然而，增加的頂部壓力能夠引起可溶氣體的形成。在罐中較低的高寬比凡/τ可導致較短的氣體駐留時間，從而要求較大氣流用於充氣，導致更多的泡沫產生。還通過Η/Γ來限制葉輪驅動的攪拌以增加Κρ，因為在低高寬比中將在下葉輪旋轉時發生表面破壞(breakage)和產生渦旋。由此，高寬比的選擇在很大程度上以在表1中列出的議題的經驗為基礎。表1 各種高寬比的效果總結
權利要求
1.一種用於培養哺乳動物細胞的生物反應器，其特徵在於所述生物反應器(1)具有至少4000升的體積，以及至少一個頂部葉輪(68)和至少一個底部葉輪(78)，其中所述頂部葉輪(68)為水翼式葉輪。
2.根據權利要求1所述的生物反應器，其特徵在於所述生物反應器(1)具有頂部葉輪(68)和底部葉輪(78)，所述頂部葉輪(68)優選為三葉水翼式設計的葉輪，所述底部葉輪 (78)優選為四斜葉大稠度葉輪。
3.根據前述任一權利要求中所述的生物反應器，其特徵在於所述葉輪(60，70)與罐 (10)的直徑比為0.35以上至0.55以下，優選0.40以上至0. 48以下，最優選0.44以上至 0. 46以下。
4.根據前述任一項權利要求所述的生物反應器，其特徵在於所述頂部葉輪的功率數 (Np)為0. 1以上至O·9以下。
5.根據前述任一項權利要求所述的生物反應器，其特徵在於所述頂部葉輪的流量數 (Nq)為0.4以上至0.9以下。
6.根據前述任一項權利要求所述的生物反應器，其特徵在於所述底部葉輪的功率數 (Np)為O·5以上至O·9以下。
7.根據前述任一項權利要求所述的生物反應器，其特徵在於所述底部葉輪的流量數 (Nq)為0. 50以上至0.85以下。
8.根據前述任一項權利要求所述的生物反應器，其特徵在於所述生物反應器(1)具有至少一個分布器(108)。
9.根據前述任一項權利要求所述的生物反應器，其特徵在於所述生物反應器(1)具有至少一個擋板(128)。
10.根據前述任一項權利要求所述的生物反應器，其特徵在於所述生物反應器(1)具有至少兩個用於添加鹼的(138，148)，所述孔優選空間上彼此分離。
11.根據前述任一項權利要求所述的生物反應器，其特徵在於所述生物反應器(1)具有至少10000升的體積，最優選至少20000升的體積。
12.—種培養和增殖哺乳動物細胞的方法，其特徵在於在權利要求1至11任一項所述的生物反應器中，在合適的培養條件下，在合適的培養基中培養至少一個哺乳動物細胞。
13.根據權利要求12所述的方法，其特徵在於所述至少兩個葉輪的攪拌速率為55W/ m3以上至85W/m3以下。
14.一種用於培養哺乳動物細胞的生物反應器系統，其特徵在於a)具有至少500升、優選至少1000升的體積的第一生物反應器(111)連接至b)體積大於所述第一生物反應器(1)並具有至少2000升、優選至少4，000升的體積的第二生物反應器(11)，其中所述具有至少2000升、優選至少4000升的體積的第二生物反應器(11)連接至c)權利要求1至16任一項所述的第三生物反應器(1)，所述第三生物反應器(1)具有至少10000升、優選至少20000升的體積，其體積大於所述第二生物反應器(11)的體積。
15.根據權利要求14所述的生物反應器系統，其特徵在於所述第一或第二生物反應器(111、11)中的至少一種為權利要求1至11任一項所述的生物反應器。
16.一種培養和增殖哺乳動物細胞的方法，其特徵在於a)在具有至少500升的體積、優選至少1000升的體積的第一生物反應器中，在合適的條件下，在合適的培養基中培養至少一個哺乳動物細胞，b)將通過增殖所述至少一個哺乳動物細胞而獲得的含細胞培養基轉移至具有至少 2000升的體積、優選至少4000升的體積的第二生物反應器，c)在具有至少2000升的體積、優選至少4000升的體積的所述第二生物反應器中培養被轉移的細胞，d)將在步驟c)中獲得的含有細胞培養基轉移至第三生物反應器，所述第三生物反應器具有至少10000升的體積、優選至少20000升的體積，和e)在所述具有至少10000升的體積、優選至少20000升的體積的所述第三生物反應器中培養所述被轉移的細胞。
17.根據權利要求16所述的方法，其特徵在於所使用的所述生物反應器中至少一種為權利要求1至11任一項所述的生物反應器。
18.根據權利要求16或17所述的方法，其特徵在於在步驟a)、c)和e)的所述生物反應器中的培養條件相同。
全文摘要
本發明涉及具有至少兩個葉輪的大規模生物反應器、大規模生物反應器系統和使用這些生物反應器大規模培養和增殖哺乳動物細胞的方法。
文檔編號C12M1/06GK102307984SQ201080007208
公開日2012年1月4日 申請日期2010年2月9日 優先權日2009年2月9日
發明者莫斯汗·肯 申請人:英國龍沙生物醫藥股份有限公司