穩定的含tpo的凍幹組合物的製作方法

2023-10-23 21:17:07 3

專利名稱：：穩定的含tpo的凍幹組合物的製作方法
技術領域：
：本發明背景1.發明領域本發明涉及一種含有TPO蛋白的組合物，更具體地講，涉及一種穩定的含TPO的凍幹組合物。2.有關公開技術人TPO(血小板生成素)是一種作為Mpl配體克隆的蛋白，其為細胞因子受體超家族的一員(deSauvage等，Nature(London)，Vol.369，pp.533-565(1994)；Bartley，T.D.等，Cell，Vol.77，pp.1117-1124(1994))。在患有血小板減少症的動物(包括人、小鼠和犬)的血清和血漿中可檢測到Mpl配體，它與巨核細胞和血小板生成之間的關係已被證實。為了開發一種用於血小板減少症的治療劑，本發明人已從血小板減少的大鼠的血漿中純化了大鼠TPO，以能刺激大鼠骨髓中高度純化的巨核細胞祖代細胞使之產生巨核細胞的活性為指示，而且，根據大鼠TPO的部分胺基酸順序已成功地克隆了大鼠TPOcDNA和人TPOcDNA，從而通過重組DNA技術獲得了大量的同源人TPO(H.Miyazaki等，Exp.Hematol.，Vol.22，p.838(1994))。由此成功獲得的人TPO具有與上述作為人Mpl配體獲得的因子相同的胺基酸順序(見下述序列表的序列1)。本發明人業已發現，本發明的TPO能有效治療血小板減少症，因為當給患有血小板減少症的小鼠使用所述人TPO時，觀察到血小板的減少受到抑制，血小板生成改善而增多血小板和造血機能得到改善，所述小鼠由於使用抗癌劑或免疫抑制劑或通過輻射或BMT誘發了骨髓抑制症狀。TPO是以極小的量使用，因為其活性高。即，通常根據症狀、性別和服用途徑，以0.05μg-1mg/kg體重至1mg/kg體重，優選0.5μg-50μg/kg體重的劑量，作為活性成分一般每日服用數次。因此，需要生產含有極少量TPO的藥物製劑，提供可以完全阻止該活性成分活性降低的穩定的藥物製劑。本發明人對可長時間保存的穩定TPO蛋白組合物的開發進行了研究。結果發現，在TPO蛋白中加入一種可以藥用的糖類，接著進行冷凍乾燥，可以顯著改善TPO蛋白的穩定性；除所述糖類外，再加入表面活性劑可以進一步有效改善含TPO的凍幹組合物之穩定性，並且可以改善該含TPO的凍幹組合物在重新配藥時的溶解性、進一步加入胺基酸或蛋白可以更有效地改善含TPO的凍幹組合物的穩定性。本發明概述按照本發明，提供一種含TPO的凍幹組合物，其中含有TPO蛋白和可以藥用的糖類，並選擇性地含有至少一種選自表面活性劑、胺基酸和蛋白一類的可以藥用的添加劑。附圖簡介圖1表示當加入糖類(甘露糖醇、乳糖、蔗糖或麥芽糖)時TPO蛋白的穩定性圖解，其中，殘餘TPO％被用作TPO穩定性的指標。圖2表示除所述糖類外再加入表面活性劑(多乙氧基醚20或多乙氧基醚80)時TPO蛋白的穩定性圖解，其中，殘餘TPO％被用作TPO穩定性的指標。圖3表示除所述糖類和表面活性劑外再加入胺基酸(精氨酸或甘氨酸)或蛋白(明膠)時TPO蛋白的穩定性，其中，殘餘TPO％被用作TPO穩定性的指標。本發明詳細描述作為本發明中使用的TPO，可以使用一種具有序列1所示胺基酸序列的蛋白。製備TPO的方法沒有特別的限制，但TPO製品是高度純化的蛋白。具有序列1所示胺基酸序列加以部分修飾(通過取代、缺失、插入和/或加成)的胺基酸序列的蛋白也可以採用，只要其保留TPO活性即可。換句話說，也可以採用其胺基酸序列大體上與序列1所示胺基酸序列相同的蛋白。本文所說的「大體上與序列1所示胺基酸序列相同」是指「除序列1所示胺基酸序列外，也包括對序列1所示胺基酸序列進行部分取代、缺失、插入和/或加成而得到的胺基酸序列，只要其保留TPO活性即可」。本發明人業已證實，即使序列1所示胺基酸序列的C-末端一側的胺基酸殘基缺失直到位置152殘基，或其N-末端一側的胺基酸殘基缺失直到位置6，該人TPO仍能保持其活性。舉例說明的數據如表1所示。表1衍生物TPO活性位置1-231+位置1-211+位置1-191+位置1-171+位置1-163+位置1-157+位置1-156+位置1-155+位置1-154+位置1-153+位置1-151+位置1-150位置7-163+位置8-163-位置13-231-因此，本發明所用的TPO還包括具有相當於序列1所示胺基酸序列的位置7-151的胺基酸序列並具有TPO活性的蛋白。更具體地講，可作為本發明TPO的例子包括分別含有序列1所示胺基酸序列的位置1-231、位置1-211、位置1-191、位置1-171、位置1-163、位置1-157、位置1-156、位置1-155、位置1-154、位置1-153、位置-151和位置7-163的各種蛋白。本發明的TPO還包括這樣的蛋白其含有上述位置7-151序列的裡面或外面至少一個胺基酸殘基加以取代、缺失、插入和/或加成的胺基酸序列，以不破壞其TPO活性為度。用於本發明的TPO的其它例子包括以下蛋白具有序列1胺基酸序列的TPO的至少1位上的絲氨酸殘基和3位上的丙氨酸殘基分別被丙氨酸殘基和纈氨酸殘基所取代的蛋白，其25位上的精氨酸殘基被天冬氨酸殘基所取代的蛋白，其33位上的組氨酸殘基被蘇氨酸殘基所取代的蛋白，其25位上的精氨酸殘基被天冬氨酸殘基所取代，而且231位上的穀氨酸殘基被賴氨酸殘基所取代的蛋白，以及在上述各蛋白的C-末端加上多肽ThrSerIleGlyTyrProTyrAspValProAspTyrAlaGlyValHisHisHisHisHisHis後得到的蛋白。還包括在序列1所示序列中至少具有以下胺基酸殘基的缺失和/或加成的蛋白，即其33位上的組氨酸殘基缺失的蛋白，其116位上的甘氨酸殘基缺失的蛋白，其117位上的精氨酸殘基缺失的蛋白，在33位的組氨酸殘基和34位的脯氨酸殘基之間插入一個蘇氨酸殘基的蛋白，在33位的組氨酸殘基和34位的脯氨酸殘基之間插入一個丙氨酸殘基的蛋白，在33位的組氨酸殘基和34位的脯氨酸殘基之間插入一個甘氨酸殘基的蛋白，在33位的組氨酸殘基和34位的脯氨酸殘基之間插入一個甘氨酸殘基，而且其38位的脯氨酸殘基被一個絲氨酸殘基取代的蛋白，在116位的甘氨酸殘基和117位的精氨酸殘基之間插入一個天冬氨酸殘基的蛋白，在116位的甘氨酸殘基和117位的精氨酸殘基之間插入一個丙氨酸殘基的蛋白，以及在116位的甘氨酸殘基和117位的精氨酸殘基之間插入一個甘氨酸殘基的蛋白。本發明TPO蛋白的其它例子還有至少其129位上的亮氨酸殘基被一個精氨酸殘基所取代的蛋白，其133位上的組氨酸殘基被一個精氨酸殘基所取代的蛋白，其143位上的蛋氨酸殘基被一個精氨酸殘基所取代的蛋白，其82位上的甘氨酸殘基被一個亮氨酸殘基所取代的蛋白，146位上的甘氨酸殘基被一個亮氨酸殘基所取代的蛋白，其148位上的絲氨酸殘基被一個脯氨酸殘基所取代的蛋白，其59位上的賴氨酸殘基被一個精氨酸殘基所取代的蛋白，以及其115位上的穀氨醯胺殘基被一個精氨酸殘基所取代的蛋白。本發明的TPO蛋白還包括在具有序列1所示胺基酸序列的人TPO蛋白或其上述衍生物的位置-2和-1上分別增加蛋氨酸和賴氨酸殘基的蛋白；以及在具有序列1所示胺基酸序列的人TPO蛋白或其上述衍生物的位置-1上接合一個蛋氨酸殘基的蛋白。優選用於本發明的TPO蛋白可以通過從含有其cDNA、染色體DNA或化學合成的DNA的重組載體而轉化的宿主細胞中提取和純化得到。可以將原核細胞(例如，細菌，優選埃希氏大腸桿菌)或真核細胞(例如，酵母、昆蟲或哺乳動物細胞)用作宿主。哺乳動物細胞的例子包括COS細胞、中國倉鼠卵(CHO)細胞、X63.6.5.3.細胞、C-127細胞、BHK(幼倉鼠腎)細胞、人細胞(例如，Hela細胞)等。酵母的例子包括麵包酵母(釀酒酵母)、甲醇同化酵母(巴斯德畢赤酵母)等。昆蟲細胞的例子包括蠶培養細胞(例如，Sf2細胞)等。同CHO細胞和埃希氏大腸桿菌細胞生產本發明TPO的例子分別披露於參考實施例1和2中。當TPO蛋白是用埃希氏大腸桿菌生產的時，可以用如下方法獲得該TPO蛋白將一個編碼所述蛋白的DNA片段(其上有一個或多個限制位點和/或加入了可促進其表達的DNA)插入合適的表達載體中，培養用該載體轉化過的原核細胞(如細菌細胞，優選埃希氏大腸桿菌)，然後分離並純化產生的具有TPO活性之蛋白，當埃希氏大腸桿菌被用作宿主時，可以整合適於在該大腸桿菌中表達的密碼子(即優先密碼子)。用於轉化埃希氏大腸桿菌的載體例子包括pKC30(ShimatakeH.和M.Resenberg，Nature，292，pp.128-132，1981)，pTrc99A(AmannE.等，Gene，108，pp.193-200，1991)、pCFM536(ATCCNo.39934；見JP-A-60-501988)等。例如，當生產具有序列1所示的1-332胺基酸序列的TPO蛋白時，合成編該1-332胺基酸序列的DNA片段；將編碼一個蛋氨酸殘基和一個賴氨酸殘基的DNA序列加至其N-末端，並將構成一個XbaI位點的DNA序列加至該DNA序列的上遊位點；將一個編碼終止密碼子的DNA序列加至其C-末端，並還將構成一個HindIII位點的DNA序列加至該DNA序列的下遊位點。用XbaI/HindIII處理該DNA片段，可以獲得諸如序列2所示的DNA片段。將由此獲得的DNA片段克隆到預先用XbaI和HindIII消化過的pCFM536(ATCCNo.39934；見JP-A-60-501988)上，並將用pMW1(ATCCNo.39933)預轉化過的埃希氏大腸桿菌JM109製備成含有表達TPO蛋白的表達載體的轉化子。表達質粒pCFM536的表達可以在cI857阻遏基因的調節下受控於λPL啟動子。培養以這種方式獲得的轉化子，以分離並純化表達的TPO蛋白。在所述純化過程中，採用組織蛋白酶處理或類似處理，將加在N-末端的蛋氨酸-賴氨酸殘基切除，以得到具有1-332胺基酸序列的TPO蛋白。就此而言，轉化到大腸桿菌DH5菌株裡的具有編碼1-332胺基酸序列(見序列3)的質粒pHTF1已按照布達佩斯條約規定於1994年3月24日交由日本國際貿易及工業部、工業科學與技術署、國家生物科學和人類技術研究所保存，入藏號為FERMBP-4617。也將同一質粒pHTF1保存於中國的保藏機構CCTCC(中國，武漢，珞珈山，430072)，入藏號CCTCC-M95004。根據本發明，可將糖類、表面活性劑、胺基酸和蛋白，作為用於製備穩定的含TPO的凍幹組合物之添加劑例子。改進所述TPO組合物穩定性的上述添加劑的例子包括(但不限於)以下物質就糖類而言，可以採用甘露糖醇、乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、肌醇、木糖、山梨糖、果糖、半乳糖、核糖、甘露糖、纖維二糖、環糊精等。就表面活性劑而言，可以採用聚氧乙烯加氫蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油、多乙氧基醚80之類的聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖單月桂酸酯(又名多乙氧基醚20)等，聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、山梨聚糖單油酸酯之類的山梨聚糖脂肪酸酯、蔗糖單月桂酸酯之類的蔗糖脂肪酸酯，氯化苯乙氧銨、氯化苯甲羥銨之類的芳香季銨鹽，以及辛酸鈉和亞硫酸鈉等。就胺基酸而言，可以採用甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸及其鹽、穀氨醯胺、穀氨酸及其鹽、組氨酸、賴氨酸、精氨酸等。就蛋白而言，可以採用明膠、人血清白蛋白、酪蛋白、膠原、人血清球蛋白等。用於本發明的添加劑的用量範圍，在含TPO的凍幹組合物中相對於每含1重量份TPO而言，用10-10000重量份糖類，0.01-10重量份表面活性劑，1～1000重量份胺基酸或1～1000重量份蛋白。另外，根據其製劑使用目的，本發明的含TPO凍幹組合物還可以含有稀釋劑、溶解劑、防腐劑、抗氧化劑、賦形劑、等滲劑等。用於本發明中的凍幹技術可以常見方式實施。例如，將本發明的水溶液形式的TPO組合物，以每份1ml的量分裝到小瓶中，然後放在預冷至-40℃的冷凍乾燥機的乾燥室中冷凍。當證實小瓶中的內容物已冷凍充分(通常為2-3小時)時，啟動真空泵，通過升華作用除去小瓶中冷凍體內的水分。此時，將乾燥室的溫度設定為-10℃使乾燥在低溫下進行。當上述乾燥步驟結束時(通常需要0.5～2天)，在室溫下在乾燥室中進行最終的乾燥(通常需要幾小時至1天)，以獲得想要的TPO凍幹組合物。實施例將通過下面所給出的實施例、試驗例和參考例對本發明進行說明。例1將可用參考例1所披露的方法獲得的TPO250μg和30mg甘露糖醇溶於1ml5mM磷酸鹽緩衝液(pH6.0)中，將由此製成的水溶液以每份1ml的量分裝到小瓶中並凍幹，然後密封所述小瓶，以得到凍幹的組合物。例2將可用參考例1所披露的方法獲得的TPO250μg和30mg乳糖溶於1ml5mM磷酸鹽緩衝液(pH6.0)中，將由此製成的水溶液以每份1ml的量分裝到小瓶中並凍幹，然後密封所述小瓶，以得到凍幹的組合物。例3將可用參考例1所披露的方法獲得的TPO250μg和30mg蔗糖溶於1ml5mM磷酸鹽緩衝液(pH6.0)中，將由此製成的水溶液以每份1ml的量分裝到小瓶中並凍幹，然後密封所述小瓶，以得到凍幹的組合物。例4將可用參考例1所披露的方法獲得的TPO250μg和30mg麥芽糖溶於1ml5mM磷酸鹽緩衝液(pH6.0)中，將由此製成的水溶液以每份1ml的量分裝到小瓶中並凍幹，然後密封所述小瓶，以得到凍幹的組合物。例5將可用參考例1所披露的方法獲得的TPO250μg、30mg麥芽糖和40μg多乙氧基醚20溶於1ml5mM磷酸鹽緩衝液(pH6.0)中，將由此製成的水溶液以每份1ml的量分裝到小瓶中並凍幹，然後密封所述小瓶，以得到凍幹的組合物。例6將可用參考例1所披露的方法獲得的TPO250μg、30mg麥芽糖和40μg多乙氧基醚80溶於1ml5mM磷酸鹽緩衝液(pH6.0)中，將由此製成的水溶液以每份1ml的量分裝到小瓶中並凍幹，然後密封所述小瓶，以得到凍幹的組合物。例7將可用參考例1所披露的方法獲得的TPO250μg、29mg麥芽糖、40μg多乙氧基醚80和1mg精氨酸溶於1ml5mM磷酸鹽緩衝液(pH6.0)中，將由此製成的水溶液以每份1ml的量分裝到小瓶中並凍幹，然後密封所述小瓶，以得到凍幹的組合物。例8將可用參考例1所披露的方法獲得的TPO250μg、29mg麥芽糖、40μg多乙氧基醚80和1mg甘氨酸溶於1ml5mM磷酸鹽緩衝液(pH6.0)中，將由此製成的水溶液以每份1ml的量分裝到小瓶中並凍幹，然後密封所述小瓶，以得到凍幹的組合物。例9將可用參考例1所披露的方法獲得的TPO250μg、29mg麥芽糖、40μg多乙氧基醚80和1mg明膠溶於1ml5mM磷酸鹽緩衝液(pH6.0)中，將由此製成的水溶液以每份1ml的量分裝到小瓶中並凍幹，然後密封小瓶，以得到凍幹的組合物。比較例1將可用參考例1所披露的方法獲得的TPO250μg溶於1ml5mM磷酸鹽緩衝液(pH6.0)中，將由此製成的水溶液以每份1ml的量分裝到小瓶中，然後密封小瓶，以得到組合物的水溶液。用於製備例1-9含TPO組合物的添加成分種類和含量歸納於表2中。表2試驗例的說明如下。在該試驗中，以下述方式通過反相液體層析法和生物學測定法測定殘餘TPO的百分比(％)。反相液體層析法將含有1μg或更多TPO的每一種樣品注射入C8反相柱(4.6mm×250mm)，用正丙醇和三氟乙酸作為流動相，並在如下的梯度條件下測定殘餘TPO量(見表3)。表3時間溶劑(A)溶劑(B)梯度條件0分100％0％線性梯度30分0％100％35分0％100％線性梯度40分100％0％溶劑(A)20％正丙醇，0.1％三氟乙酸溶劑(B)60％正丙醇，0.1％三氟乙酸波長280nm生物學測定法(a)採用32D-hu-mpl+細胞(32D-mpl測定)的測試系統〔測定方法〕(1)用於該測定方法的小鼠32D-hu-mpl+細胞的建立將全長人Mpl受體基因(Vigon，I.等，PNASVol.89，pp.5640-5644(1992))亞克隆到含有源於Moloney鼠肉瘤病毒LTR的轉錄啟動子之表達載體上。用CaPO4哺乳動物轉染試劑盒(由Stratagene生產)將6μg上述重組載體和6μg兼嗜性逆轉錄病毒包裝結構(Landau，N.R.和LittmanD.R.，J.Virology，Vol.66，pp.5110-5113(1992))轉染到3×106個293細胞中。2天後對所述細胞進行再轉染，並於4天後再次轉染。在最後轉化後的當天，將所述293細胞與IL-3-依賴型鼠細胞系(32D，克隆23；Greeberger等，PNAS，Vol.80，pp.2931-2936(1983))一起共培養。培養24小時後收回32D細胞，並用BSA梯度(Path-O-Cyte；Mills公司)通過密度梯度法進行分離。在有1ng/ml鼠IL-3的條件下擴增細胞，然後用20％APK9進行挑選(Vigon等，PNAS，Vol.89，pp.5640-5644(1992)；Landau，N.R.和LittmanD.R.，J.Virology，Vol.66，pp.5110-5113(1992))。用一種抗人Mpl受體肽的兔抗血清，通過FACS分選有在細胞表面上表達的人Mpl受體的細胞(32D-hu-mpl+細胞)。(2)用32D-hu-mpl+細胞測定回收在有小鼠IL-3存在下傳代培養的32D-hu-mpl+細胞，充分洗滌以除去小鼠IL-3，然後再懸浮於生長培養基(含有10％FCS的MEM培養基)中。另一方面，用所述生長培養基分別稀釋一種標準物和一種待測試樣品，並將該稀釋液以每份100μl的量分配到平板的孔中。用所述生長培養基將按上述方法製備的32D-hu-mpl+細胞懸浮液稀釋至1×105細胞/ml的濃度，並以每份100μl的量分配到上述平板的孔中。在高溼培養箱中，37℃下，在10％CO2中培養所述平板48小時。隨後以20μl的量將MTS溶液加入該平板的每一孔中，然後再在高溼培養箱中，37℃下，在10％CO2中培養該平板4小時，經過上述培養之後，用一臺微平板讀數儀在490nm處測吸收率。(b)採用人巨核細胞系的測試系統(M-07e測定)已知人巨核細胞系M-07e的細胞生長受GM-CSF、IL-3、SCF或IL-2等的影響(Avanzi等，J.Cell.Physiol.，Vol.145，pp.458-464(1990)；Kiss等，Leukemia，Vol.7)，而且發現這些細胞受TPO影響。〔測定方法〕回收在有GM-CSF的條件下繼代培養的M-07e細胞，充分漂洗，然後再懸浮於含有10％FCS的IMDM培養基中。將所得到的M-07e細胞懸浮液以104細胞/孔的量分配到96孔組織培養板上，再向每孔中加入標準物或待測定的樣品，由此將終體積調整至200μl/孔。將所述板放入含有5％CO2的培養箱中，再在37℃下培養3天。在第3天結束培養前4小時，將1μCi(37KBq)的3H-胸苷加至各孔中，並在結束培養之後，用細胞收集器將細胞收集在玻璃纖維濾膜上，以便用一臺液體閃爍計數器(例如，由Pharmacia生產的BetaPlate)測定3H放射性。試驗例將例1-9和比較例1中製備的含TPO的組合物在50℃下保存1個月。通過反相液相層析法和生物學測定方法(a)即32D-mpl測試測定TPO的殘餘效價，並在對保存物作目測觀察後各組合物恢復原狀。結果歸納於表4中。表4由上表可以看出，當凍幹處理是通過向TPO中添加糖類而進行時，可明顯改善TPO的穩定性。而且，當凍幹處理是通過除所述TPO和糖類外，進一步還加入至少一種選自表面活性劑、胺基酸和蛋白質的可以藥用的添加劑而進行時，其穩定性可得到進一步改善。另外，在例5-9中通過添加表面活性劑而製成的含TPO的凍幹組合物在重配製時表現出進一步改善的可溶性。糖類的穩定作用如圖1所示，表面活性劑的穩定作用如圖2所示，而胺基酸和蛋白的穩定作用如圖3所示。業已發現，與無添加劑的TPO液體製劑相比，在上述每種情況下其穩定性均有所改善。在方法(b)-M-07e測試中獲得了與生物學測定法(a)32D-mpl相同的結果。下面的參考例用於說明TPO的生產實例，該TPO是本發明的活性成分。參考例1TPO(1-332)生產的實例(1)在平板(直徑6cm，由Falcon生產)上用含有10％胎牛血清的α-極小必需培養基(α-MEM(-)；補充了胸苷和次黃嘌呤)培養CHO細胞(dhfr株；Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.77，p.4216，1980)，然後通過CaPO4方法(Cellphect，由Pharmacia生產)用質粒pDEF202-hTPO-P1轉化上述生長的細胞。就是說，將含有序列4所示的cDNA插入段的質粒pDEF202-hTPO-P110μg，與120μl緩衝液A和120μlH2O混合，並在室溫下放置10分鐘。然後將120μl緩衝液B加入到所得溶液中，再次混合，再於室溫下放置30分鐘。將該DNA溶液滴加到上述平板上，接著在CO2培養箱中培養6小時。除去平板上的培養基，然後用α-MEM(-)將該培養物洗2遍，隨後加入含有10％二甲基亞碸的α-MEM(-)，並在室溫下處理2分鐘。然後，將含有10％透析過的胎牛血清的非選擇培養基(α-MEM(-)，補充了次黃嘌呤和胸苷)加入到上述培養物中，並再培養2天，此後，用含有10％透析過的胎牛血清的選擇培養基(α-MEM(-)，無次黃嘌呤和胸苷)進行選擇。選擇是通過下述方法進行用胰蛋白酶處理獲自各6cm平板的細胞，將其分到5個新的10cm平板或20個24孔平板上，然後繼續培養，同時每隔2天用選擇培養基更換所述培養基。測定細胞在其中生長的平板或孔中的培養上清液中人TPO活性。將培養上清液中測出確有人TPO活性的細胞以1∶15的比例分至盛有含25nM氨甲蝶呤的選擇培養基的新平板或孔中，並繼續培養，以使抗氨甲蝶呤的細胞得以生長而實現克隆。就此而言，CHO細胞的轉化也可以通過與pHTP-1和pMG1一起共轉染CHO細胞而得以實現。已按照布達佩斯條約規定，於1995年1月31日將用質粒pDEF20-hTPO-P1轉化的CHO細胞株(CHO-DUKXB11)交由日本國國際貿易和工業部、工業科學和技術署、國家生物科學和人類技術研究所保存，入藏號為FERMBP-4988。上述CHO細胞系也已交由中國的指定保藏機構CCTCC(中國，武漢，珞珈山，430072)保存，入藏號為CCTCC-C95004。(2)培養生產人TPO的CHO細胞系並純化人TPO以下述方式培養通過重複MTX抗性而獲得的生產人TPO的CHO細胞株(CHO28/1/1/3-C6株，抗400nMMTX)。用含有400nMMTX和10％FCS的DMEM/F-12培養基(GIBCO)培養所述細胞。用胰蛋白酶溶液剝離長成的細胞，並將1×107個細胞接種到裝於Falcon滾瓶(Falcon300)中的體積為200ml的同一種培養基中，在37℃下以1rpm的轉速培養3天。然後，通過抽吸除去培養上清液，用50mlPBS漂洗殘留細胞，將細胞懸浮在300mlDMEM/F-12培養基(GIBCO)中，該培養基中補充了2μg/ml胰島素和10μM硫酸銅，以取代400nMMTX和10％FCS，然後，在37℃下以1rpm的轉速培養4天，回收培養上清液(命名為收穫物-1)。接著，將300ml上述生產培養基加入到其餘細胞中，並在37℃下以1rpm的轉速培養4天，回收培養上清液(命名為收穫物-2)。讓收穫物-1和收穫物-2約220L混合的無血清CHO細胞培養上清液，通過0.5μm的濾膜(FILTERCARTRIDGE，由NihonPall生產，日本)，通過超濾(CENTRASETTETMOMEGA30K截斷，由FILTRON生產)濃縮至約5L體積，與此同時，將溶劑換成10mM磷酸鉀緩衝液(pH6.8)。向該濃縮物中加10μM(終濃度)蛋白酶抑制劑E-64(由日本肽研究所生產)，所得溶液以100ml/分的流速加至SPSepharoseFF柱(直徑11cm，床高10cm，由Pharmacia生產)中，該柱已用10mM磷酸鉀緩衝液(pH6.8)平衡過。用所述平衡緩衝液洗滌，然後用含有0.3MNaCl的10mM磷酸鉀緩衝液(pH6.8)1700ml洗脫。將洗脫物與363g硫酸銨混合，並以12,000×g離心20分鐘，將所得到的上清液以100ml/分的流速加至MacroPrepMethylHIC柱(直徑6cm，床高30cm，由Bio-Rad生產)中，該柱用含有1.2M硫酸銨的10mM磷酸鉀緩衝液(pH6.8)平衡過。加樣後，用上述平衡緩衝液洗柱，並用700ml含有0.5M硫酸銨的10mM磷酸鉀緩衝液(pH6.8)洗脫。洗脫物與80ml丙醇混合，並以16ml/分的流速加至SOURCE15RPC柱(直徑3.5cm，床高10cm，由Pharmacia生產)中。加樣以後，用含有10％丙醇的10mMTris緩衝液(pH7.5)(被稱為展開溶劑A)洗柱，並用由展開溶劑A至含80％丙醇的10mMTris緩衝液(pH7.5)(被稱為展開溶劑B)的60分鐘線性梯度進行洗脫，直至丙醇濃度達到70％。收集在上述線性梯度開始後25分鐘左右的洗脫級分192ml，並將其分成兩份，將各份加至用PBS平衡過的Superdex200pg柱(直徑10cm，床高56cm，由Pharmacia生產)，然後以40ml/分的流速洗脫。當通過SDS-PAGE分析該洗脫物時，發現在保留時間42-52分鐘左右有一條分子量約為65,000-100,000的單一蛋白帶，預料其為TPO。Western分析證實了該蛋白確是TPO。對該樣品的一部分叫做的N-末端胺基酸分析及胺基酸組成分析的結果顯示，獲得了230mg高度純化的具有序列1所示1-322胺基酸序列的TPO。參考例2在埃希氏大腸桿菌中生產TPO(1-163)/E.coli的實例(1)構建用於hMKT(1-163)的大腸桿菌表達質粒pAMG11-hMKT(1-163)及其在大腸桿菌中的表達為了在埃希氏大腸桿菌中表達具有序列1所示胺基酸序列位置1-163的蛋白(以下稱之為「TPO(1-163)/E.coli」)，用大腸桿菌的優先密碼子化學合成編碼所述胺基酸序列的DNA片段。另外，將新加在N-末端一側的編碼蛋氨酸和賴氨酸的核苷酸序列與上述DNA片段連接，並將編碼終止密碼子的DNA序列加至相應於C-末端一側的位點。序列5表示由該DNA編碼的蛋白的胺基酸序列，即該蛋白中Met-Lys被連接於序列1所示1-163胺基酸序列的N-末端(以下稱之為「hMKT(1-163)」)。按上述方法合成的hMKT(1-163)基因片段，在其5′-末端和3′-末端分別有XbaI和HindIII限制位點，而且，含有一個核糖體結合位點，一個ATG起始密碼子、一段編碼hMKT(1-163)胺基酸序列的序列，以及一個終止密碼子。將上述片段克隆到乳糖誘導型表達載體pAMG11的XbaI-HindIII位點上。該pAMG11載體是具有pR100-衍生複製起點的低拷貝數質粒。表達載體pAMG11可以通過由與PCR相伴的誘變作用引起的一系列定點鹼基突變而從質粒pCFM1656(ATCCNo.69576，保存日1994年2月24日)獲得。該質粒具有一個恰好始於質粒複製啟動子PcopB5′一側的BglII位點(質粒bp#180)，其後是一個質粒複製基因。鹼基對的突變如表5所示。表5pAMG11bp#pCFM1656中的bp在pAMG11中改變後的bp#204T/AC/G#428T/AG/C#509G/CA/T#617--插入2個G/C對#679G/CT/A#980T/AC/G#994G/CA/T#1004A/TC/G#1007C/GT/A#1028A/TT/A#1047C/GT/A#1178G/CT/A#1466G/CT/A#2028G/C缺失#2187C/GT/A#2480A/TT/A#2499-2502AGTGGTCATCACCAGT#2642TCCGAGC缺失AGGCTCG#3435G/CA/T#3446G/CA/T#3643A/TT/A#4489-4512--插入下列鹼基對GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAGCTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC然後，用下列寡核苷酸置換單一AatII和ClaI位點之間的DNA序列。AatII(#4358)5′CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT-3′TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA--GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT3′-CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGC5′ClaI(#4438)導入pAMG11的hMKT(1-163)基因的表達，可以通過合成乳糖誘導啟動子誘導，如具有以下序列的Ps4啟動子5′GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA--ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT3′由Ps4啟動子誘導的hMKT(1-163)基因表達受乳糖阻抑物(LacI)的抑制，該阻抑物是大腸桿菌LacI基因的產物。然後用質粒pAMG11-hMKT(1-163)轉化含laqIq等位基因的大腸桿菌K-12菌株。laqIq等位基因在其lacI啟動子內有一個突變，該突變可加強lacI基因的表達，從而更嚴緊地控制由Ps4啟動子啟動的蛋白表達。結果，在缺少乳糖時，hMKT(1-163)的表達受到LacI的抑制。當加入乳糖時，LacI蛋白與Ps4啟動子的操縱基因位點的結合減弱，由Ps4啟動子啟動hMKT(1-163)基因的轉錄。在該例中被用作宿主細胞的大腸桿菌已於1994年11月30日交由ATCC保存，入藏號為ATCCNo.69717。用質粒pAMG11-hMKT(1-163)轉化上述大腸桿菌菌株(ATCCNo.69717)，並在以下條件下培養。(2)培養能夠表達hMKT(1-163)並生產TPO(1-163)/E.coli的重組埃希氏大腸桿菌將所獲得的轉化體放在LB培養基上，於30℃下培養大約12小時。然後在無菌條件下將細胞轉移到盛有培養基(每批容量20g/L酵母提取物；3.4g/L檸檬酸；15g/LK2HPO4；15mlDowP2000；5g/L葡萄糖；1g/LMgSO4-7H2O；5.5ml/L微量金屬；5.5ml/L維生素)的發酵罐中。繼續培養，直到培養物在600nm處的光密度(O.D.)達到5.0±1.0。然後補充第一種補料培養基(700g/L葡萄糖；6.75g/LMgSO4-7H2O)，同時按照已確定的方案以2小時的間隔調整補給速度。當培養物在600nm處的O.D.值達到20-25時開始補充第二種補料培養基(129g/L胰蛋白酶腖；258g/L酵母提取物)。保持以穩定的流速加入第二種補料培養基，同時繼續調整第一種補料培養基的加入。在整個培養期間將溫度維持在30℃左右。如果需要，通過加入酸或鹼保持培養物在pH在7左右。通過調整發酵罐中的攪拌速度、通氣速度和氧氣流入速度維持想要的溶解氧含量。當培養物的O.D.值在600nm處達到57-63時，以穩定的流速將第三種補料培養基(300g/L乳糖)引入發酵罐中。停止加入第一種補料培養基，並將第二種補料培養基的流速改變至一個新的穩定速度。在開始加第三種補料培養基以後繼續培養10小時左右。在培養結束時，將培養物冷卻至15±5℃，並通過離心收穫細胞。所得到的沉澱於-60℃或更低溫度下保存。用以下方法純化由此在大腸桿菌中所產生的hMKT(1-163)，並生產TPO(1-163)/E.coli。將1800g細胞沉澱懸浮於大約18升10mMEDTA中，並在15,000psi的壓力下通過高壓勻漿器。對破碎的細胞懸浮液進行離心處理，並將沉澱重懸於10L10mMEDTA中。對該懸浮液離心處理，並將200g沉澱溶解在2L含有8M氫氯酸胍、10mMDTT和5mMEDTA的10mMTris緩衝液中(pH8.7)。將該溶液緩慢稀釋於200L含有3M脲、30％甘油、3mM胱胺和1mM半胱氨酸的10mMCAPS中。在室溫下將稀釋的溶液緩慢攪拌16小時，並將pH調至6.8。在調整pH後將該溶液澄清，並加至用10mM磷酸鈉緩衝液(pH6.8)平衡的2-LCMSepharose柱中，該緩衝液中含有1.5M脲和15％甘油。加樣以後，用含15％甘油的10mM磷酸鈉(pH7.2)洗柱。hMKT(1-163)被由10mM磷酸鈉緩衝液(pH7.2)配製的OM-5MNaCl的線性梯度液洗脫。用濾膜(截斷分子量為10,000)濃縮從CMSepharose柱上洗脫的級分，與此同時將緩衝液換成10mM磷酸鈉緩衝液(pH6.5)。在環境溫度下用組織蛋白酶C(蛋白底物∶酶＝500∶1(摩爾比))處理上述濃縮液(蛋白約2mg/ml)90分鐘。然後將反應混合物加至用含有15％甘油的10mM磷酸鈉緩衝液(pH7.2)平衡的1.2LSP高效Sepharose柱上。加樣以後，用由10mM磷酸鈉(pH7.2)配製的0.1M-0.25M氯化鈉線性梯度液洗脫TPO活性蛋白TPO(1-163)/E.coli；其中的N-末端Met-Lys已從hMKT(1-163)上切除。將硫酸銨加入得自SP高效柱的洗脫物中，使其終濃度為0.6M。然後將該洗脫物加至1.6-LPhenylToyopearl柱(Toso公司，日本)中，該柱用含有0.6M硫酸銨的10mM磷酸鈉緩衝液(pH7.2)平衡過。TPO(1-163)/E.coli峰被由10mM磷酸鈉(pH7.2)配製的0.6M-0M硫酸銨線性梯度液洗脫。用濾膜(截斷分子量為10,000)濃縮得自PhenylToyopearl柱的洗脫物，同時把緩衝液換成含有5％山梨醇的10mMTris緩衝液(pH7.5)。序列表序列1資料(i)序列特徵(A)序列332個胺基酸(B)類型胺基酸(ii)分子類型蛋白(vi)來源(A)有機體人類(智人)(xi)序列描述序列1SerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLysLeuLeu151015ArgAspSerHisValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysProGluVal202530HisProLeuProThrProValLeuLeuProAlaValAspPheSerLeu354045GlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAlaGlnAspIleLeu505560GlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGln65707580LeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGln859095ValArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThrGlnLeu100105110ProProGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAspProAsnAlaIlePhe115120125LeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArgPheLeuMetLeu130135140ValGlyGlySerThrLeuCysValArgArgAlaProProThrThrAla145150155160ValProSerArgThrSerLeuValLeuThrLeuAsnGluLeuProAsn165170175ArgThrSerGlyLeuLeuGluThrAsnPheThrAlaSerAlaArgThr180185190ThrGlySerGlyLeuLeuLysTrpGlnGlnGlyPheArgAlaLysIle195200205ProGlyLeuLeuAsnGlnThrSerArgSerLeuAspGlnIleProGly210215220TyrLeuAsnArgIleHisGluLeuLeuAsnGlyThrArgGlyLeuPhe225230235240ProGlyProSerArgArgThrLeuGlyAlaProAspIleSerSerGly245250255ThrSerAspThrGlySerLeuProProAsnLeuGlnProGlyTyrSer260265270ProSerProThrHisProProThrGlyGlnTyrThrLeuPheProLeu275280285ProProThrLeuProThrProValValGlnLeuHisProLeuLeuPro290295300AspProSerAlaProThrProThrProThrSerProLeuLeuAsnThr305310315320SerTyrThrHisSerGlnAsnLeuSerGlnGluGly325330序列2資料(i)序列特徵(A)序列1043bp(B)類型核酸(C)鏈型雙(D)拓撲結構線性(ii)分子類型合成DNA(vi)來源(A)有機體人類(智人)(xi)序列描述序列2CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATA28ATGAAAAGTCCTGCACCACCTGCATGTGATTTACGGGTCCTGTCTAAA76MetLysSerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLys-2+1510CTGCTGCGCGACTCTCACGTGCTGCACTCTCGTCTGTCCCAGTGCCCG124LeuLeuArgAspSerHisValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysPro15202530GAAGTTCACCCGCTGCCGACCCCGGTTCTGCTTCCGGCTGTCGACTTC172GluValHisProLeuProThrProValLeuLeuProAlaValAspPhe354045TCCCTGGGTGAATGGAAAACCCAGATGGAAGAGACCAAAGCTCAGGAC220SerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAlaGlnAsp505560ATCCTGGGTGCAGTAACTCTGCTTCTGGAAGGCGTTATGGCTGCACGT268IleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArg657075GGCCAGCTTGGCCCGACCTGCCTGTCTTCCCTGCTTGGCCAGCTGTCT316GlyGlnLeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSer808590GGCCAGGTTCGTCTGCTGCTCGGCGCTCTGCAGTCTCTGCTTGGCACC364GlyGlnValArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThr95100105110CAGCTGCCGCCACAGGGCCGTACCACTGCTCACAAGGATCCGAACGCT412GlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAspProAsnAla115120125ATCTTCCTGTCTTTCCAGCACCTGCTGCGTGGCAAAGTTCGTTTCCTG460IlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArgPheLeu130135140ATGCTGGTTGGCGGTTCTACCCTGTGCGTTCGTCGGGCGCCGCCAACC508MetLeuValGlyGlySerThrLeuCysValArgArgAlaProProThr145150155ACTGCTGTTCCGTCTCGTACCTCTCTGGTTCTGACCCTGAACGAGCTC556ThrAlaValProSerArgThrSerLeuValLeuThrLeuAsnGluLeu160165170CCGAACCGTACCAGCGGCCTGCTGGAAACCAACTTTACCGCGAGCGCG604ProAsnArgThrSerGlyLeuLeuGluThrAsnPheThrAlaSerAla175180185190CGTACCACCGGCAGCGGCCTGCTGAAATGGCAGCAGGGCTTTCGTGCG652ArgThrThrGlySerGlyLeuLeuLysTrpGlnGlnGlyPheArgAla195200205AAAATCCCGGGCCTGCTGAACCAGACCAGCCGTAGCCTGGATCAGATC700LysIleProGlyLeuLeuAsnGlnThrSerArgSerLeuAspGlnIle210215220CCGGGCTATCTGAACCGTATCCATGAACTGCTGAACGGCACCCGTGGC748ProGlyTyrLeuAsnArgIleHisGluLeuLeuAsnGlyThrArgGly225230235CTGTTTCCGGGCCCGAGCCGTCGCACCCTGGGCGCGCCGGATATCAGC796LeuPheProGlyProSerArgArgThrLeuGlyAlaProAspIleSer240245250TCTGGCACCAGCGATACCGGCAGCCTGCCGCCGAACCTGCAGCCGGGC844SerGlyThrSerAspThrGlySerLeuProProAsnLeuGlnProGly255260265270TATAGCCCGAGCCCGACCCATCCGCCGACCGGCCAGTATACCCTGTTT892TyrSerProSerProThrHisProProThrGlyGlnTyrThrLeuPhe275280285CCGCTGCCGCCGACCCTGCCGACCCCGGTGGTTCAGCTGCATCCGCTG940ProLeuProProThrLeuProThrProValValGlnLeuHisProLeu290295300CTGCCGGATCCGAGCGCGCCGACCCCGACCCCGACCAGCCCGCTGCTG988LeuProAspProSerAlaProThrProThrProThrSerProLeuLeu305310315AACACCAGCTATACCCATAGCCAGAACCTGAGCCAGGAAGGC1030AsnThrSerTyrThrHisSerGlnAsnLeuSerGlnGluGly320325330TAATGAAGCTTGA1043序列3資料(i)序列特徵(A)序列1721bp(B)類型核酸(C)鏈型雙(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA至mRNA(vi)來源(A)有機體人類(智人)(B)組織類型肝臟(xi)序列描述序列3GCGGCACGAGGGGGGTGTCTGGCTGGCGTGGCTCCCTGTTTGGGGCCTCTCCCCTGAATC60CTTCCTGGGGCCATGGAGGCCAGACAGACACCCCGGCCAGA101ATGGAGCTGACTGAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCTCCTAACTGCA149MetGluLeuThrGluLeuLeuLeuValValMetLeuLeuLeuThrAla-20-15-10AGGCTAACGCTGTCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTC193ArgLeuThrLeuSerSerProAlaProProAlaCysAspLeuArgVal-51510CTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCATGTCCTTCACAGCAGACTGAGC245LeuSerLysLeuLeuArgAspSerHisValLeuHisSerArgLeuSer152025CAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTGCTGCCTGCT293GlnCysProGluValHisProLeuProHhrProValLeuLeuProAla303540GTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAG341ValAspPheSerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLys455055GCACAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATG389AlaGlnAspIleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMet60657075GCAGCACGGGGACAACTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGG437AlaAlaArgGlyGlnLeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGly808590CAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAGAGCCTC485GlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeu95100105CTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCTCACAAGGAT533LeuGlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAsp110115120CCCAATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTG581ProAsnAlaIlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysVal125130135CGTTTCCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGGCGGGCC629ArgPheLeuMetLeuValGlyGlySerThrLeuCysValArgArgAla140145150155CCACCCACCACAGCTGTCCCCAGCAGAACCTCTCTAGTCCTCACACTG677ProProThrThrAlaValProSerArgThrSerLeuValLeuThrLeu160165170AACGAGCTCCCAAACAGGACTTCTGGATTGTTGGAGACAAACTTCACT725AsnGluLeuProAsnArgThrSerGlyLeuLeuGluThrAsnPheThr175180185GCCTCAGCCAGAACAACTGGCTCTGGGCTTCTGAAGTGGCAGCAGGGA773AlaSerAlaArgThrThrGlySerGlyLeuLeuLysTrpGlnGlnGly190195200TTCAGAGCCAAGATTCCTGGTCTGClGAACCAAACCTCCAGGTCCCTG821PheArgAlaLysIleProGlyLeuLeuAsnGlnThrSerArgSerLeu205210215GACCAAATCCCCGGATACCTGAACAGGATACACGAACTCTTGAATGGA869AspGlnIleProGlyTyrLeuAsnArgIleHisGluLeuLeuAsnGly220225230235ACTCGTGGACTCTTTCCTGGACCCTCACGCAGGACCCTAGGAGCCCCG917ThrArgGlyLeuPheProGlyProSerArgArgThrLeuGlyAlaPro240245250GACATTTCCTCAGGAACATCAGACACAGGCTCCCTGCCACCCAACCTC965AspIleSerSerGlyThrSerAspThrGlySerLeuProProAsnLeu255260265CAGCCTGGATATTCTCCTTCCCCAACCCATCCTCCTACTGGACAGTAT1013GlnProGlyTyrSerProSerProThrHisProProThrGlyGlnTyr2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.01-10重量份。6.如權利要求4的含TPO的凍幹組合物，其中在含TPO的凍幹組合物中相對於每含1重量份TPO蛋白，所述胺基酸的含量為1-1000重量份。7.如權利要求4的含TPO的凍幹組合物，其中所述含TPO的凍幹組合物中相對於每含1重量份TPO蛋白，所述蛋白的含量為1-1000重量份。8.如權利要求4或5的含TPO的凍幹組合物，其中所述表面活性劑是聚氧化山梨聚糖脂肪酸酯。9.如權利要求4或6的含TPO的凍幹組合物，其中所述胺基酸是甘氨酸和精氨酸中的至少一種。10.如權利要求4或7的含TPO的凍幹組合物，其中所述蛋白是明膠。全文摘要一種含有TPO的冷凍乾燥的組合物,其中含有血小板生成素(TPO)蛋白和作為可以藥用的添加劑的糖類。該組合物還可以含有至少一種選自表面活性劑、胺基酸和蛋白的可以藥用的組合物。因此,在長時間貯存期間可以抑制或避免被作為活性成分使用的TPO的活性下降。文檔編號A61K47/18GK1192691SQ96196083公開日1998年9月9日申請日期1996年6月7日優先權日1995年6月8日發明者野村英昭申請人:麒麟麥酒株式會社