水稻抗白葉枯病基因Xa26(t)的製作方法

2023-10-23 15:56:22 2

專利名稱：水稻抗白葉枯病基因Xa26(t)的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域。具體涉及一種DNA片斷的分離克隆和應用。所述的DNA片斷能夠賦予植物抵抗由白葉枯病菌引起的病害。將該片段與其內源調節序列直接轉入植物體，或者將該片段和合適的調節序列連接後轉入植物體，轉基因植物可以產生Xa26(t)介導的對多種病原菌的防衛反應。
背景技術：
植物在生長的過程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病毒、細菌、黴菌和線蟲等。病原物侵入植物導致兩種結果(1)病原體成功的在寄主植物內繁殖，引起相關的病症；(2)寄主植物產生防衛反應，殺死病原物或阻止其生長。
雖然植物缺乏像動物一樣的循環系統和抗體，也缺乏特化的防衛細胞，但它有一套區別於脊椎動物免疫系統的抗病防衛體系。在這一體系中，植物的每一個細胞都有對病原物的侵染產生組成型抗性(constitutive resistance)和誘導型抗性(induced resistance)的能力。組成型抗性又稱為被動抗病性，主要靠形態和組織結構產生的機械障礙(主要指能夠抗穿刺和阻止病原物的移動物質，如角質層、木栓質、蠟質、木質素、矽和二價陽離子等)以及抗病原物的化學因子(如酚類化合物、生物鹼等，但不包括病原物侵染後發生防衛反應產生的活性因子)來降低病原物對宿主的損害(王金生，1999，分子植物病理學，中國農業出版社)。組成型抗性相對較弱。誘導抗性又稱為主動抗性，是在植物和病原微生物長期相互作用中產生的，指寄主植物被病原物侵染後，產生或激活的抗病特性。植物對病原物的這種主動抗病形式由植物的抗病基因介導，其可見的標誌是過敏反應，抗性很強。許多植物抗病基因已經被遺傳定位。
植物和病原菌的互作分為親和性互作和非親和性互作兩種。前者是指病原物侵染寄主植物並引起發病；後者是指病原物遇上抗病寄主和非寄主植物時病害一般不會發生。植物的主動抗病反應主要是針對非親和性病原菌產生。這種反應一般具有病原小種特異性。Flor(1956，Adv.Genet.829-54)根據對亞麻(Linumusitatissmum)銹病(Melampsora lini)的研究提出基因對基因學說解釋植物主動抗病反應。該學說認為，當植物攜帶的抗病基因的產物能夠識別病原菌無毒基因(avirulent gene)產物時，植物表現出抗病。針對寄主的每一個抗病基因，在病原菌方面或遲或早都會發現一個毒性基因(virulent gene)。毒性基因只能克服其對應的抗病基因，而產生致病效應。這一遺傳假說為深刻理解植物宿主-病原物的相互作用提供了理論基礎，並進一步引導了研究者們對病原物無毒基因和植物抗病基因的克隆。研究者們對抗病基因的深入研究進一步證明了基因對基因學說的合理性，並從分子水平上對這一學說作出了解釋植物對病原物的防衛反應起始於對病原物特殊信號分子-激發子(elicitor)的識別(激發子是病原物無毒基因直接或間接產物)；抗病基因編碼這些信號分子的受體，受體和激發子的結合啟動宿主對病原物產生抗性，抑制病原物的生長(Staskawicz等，1995，Science 268661-667)。
植物中已有多個抗病基因被克隆。在已被克隆的植物抗病基因中，大多數基因都編碼信號分子識別蛋白。這類抗病基因介導的抗病反應可以用基因對基因學說解釋(Baker等，1997，Science 276726-733)。根據基因產物的結構，一般可將採用基因對基因學說原理介導抗病反應的抗病基因分為5類(Jones，2000，InDickinson M and Beynon J.Molecular Plant Pathology，Annual Plant Reviews，Vol 4.108-143；Dangl和Jones，2001，Nature 411826-833)(表1)。
表1 部分已克隆的採用基因對基因學說原理介導抗病反應的植物抗病基因類基因 宿主 病原菌 蛋白質結構 參考文獻a群1Rps2擬南芥Pseudomonas CC-NBS-LRR Bent等，1994syringaeRps4擬南芥P.SyringaeCC-NBS-LRR Gassmann等，1999RPS5擬南芥P.syringaeCC-NBS-LRR Warren等，1998Rpp8擬南芥P.Parasitica CC-NBS-LRR McDowell等，1998Rpp13 擬南芥P.parasitica CC-NBS-LRR Bittner-Eddy，2000Rpm1擬南芥P.maculicola CC-NBS-LRR Grant等，1996HRT 擬南芥TCV CC-NBS-LRR Cooley等，2000Prf 番茄 P.syringaeCC-NBS-LRR Salmeron等，1996Mi 番茄 Meloidogyne， CC-NBS-LRR Milligan等，1998MacrosiphumI2番茄 Fusarium. CC-NBS-LRR Simons等，1998OxysporumXa1 水稻 Xanthomonas CC-NBS-LRR Yoshimura等，1998oryzae
Pita 水稻Magnaporthe CC-NBS-LRRBryan等，2000griseaPi-b 水稻M.griseaCC-NBS-LRRWang等，1998，Dm3 萵苣Bremia lactucae CC-NBS-LRRMyers等，1998Mla1 大麥Bluserta graminis CC-NBS-LRRZhou等，2001Mla6 大麥B.graminis CC-NBS-LRRHalterman等，2001Rp1-D玉米Puccinia.Sorghi CC-NBS-LRRCollins等，1999Rpp5 擬南芥 P.parasiticaTIR-NBS-LRR Parker等，1997Rpp1 擬南芥 P.parasiticaTIR-NBS-LRR Botella等，1998N菸草TMV TIR-NBS-LRR Whitham等，1994L6亞麻Melampsora lini TIR-NBS-LRR Lawrence等，1995M亞麻M.lini TIR-NBS-LRR Eliss等，1995N亞麻M.lini TIR-NBS-LRR Dodd等，20012 Cf9 番茄CladosporiumLRR-TMJones等，1994FulvumCf2 番茄C.fulvumLRR-TMDixon等，1996Cf4 番茄C.fulvumLRR-TMThomas等，1997Cf5 番茄C.fulvumLRR-TMDixon等，1998HS1pro-1甜菜Heterodera LRR-TMCai等，1997Schachtii3 Pto 番茄P.syringae 蛋白激酶 Martin等，1993PBS1 擬南芥 P.syringae 蛋白激酶 Swiderski和Innes，20014 Xa21 水稻X.oryzaeLRR-TM-蛋白 Song等，1995激酶5 RPW8 擬南芥 E.Cichoracearum CC-NBSXiao等，2001a參考文獻目錄Bent A F et al.Science，1994，2651856-1860Bitter Eddy P D et al.Plant J，2000，21177-188Botella M A et al.Plant Cell，1998，101847-1860Bryan G T et al.Plant Cell，2000，122033-2045Cai D et al.Science，1997，275832-834Collins N et al.Plant Cell，1999，111365-1376Cooly M B et al.Plant Cell，2000，663-676Dixon M S et al.Cell，1996，84451-459
Dixon M S et al.Plant Cell，1998，101915-1925.
Dodds P N et al.Plant J.2001，27439-452Ellis J G et al. Proc Nat Acad Sci USA，1995，924185-4188Gassmann Wet al.Plant J.1999，20265-277Grant M Ret al.Science，1995，269843-846Halterman D et al.Plant J.2001，25335-348Jones D A et al.Science，1994，266789-793Lawrence G J et al.Plant Cell，1995，71195-1206Martin G B et al.Science，1993，2621432-1436Meyers B C et al.Plant Cell，1998a，101817-1832Milligan S B et al.Plant Cell，1998，101307-1319Parker J E et al.Plant Cell，1997，9879-894Salmeron J M et al.Cell，1996，86123-133Simons Get al.Plant Cell，1998，101055-1068Song W Y et al.Science，1995，2701772-1804Swiderski M R and Innes R W.Plant J.2001，26101-112Thomas C M et al.Plant Cell，1997，92209-2224Wang Z X et al.Plant J.1999，1955-64Warren R F et al.Plant Cell，1998，101439-1452Whitham S et al.Cell，1994，781101-1115Xiao S et al.Science，2001，291118-120Yoshimura S et al.Proc Natl Acad Sci，1998，951663-1668Zhou F et al.Plant Cell，2001，13337-350第一類抗病基因編碼具有NBS-LRR(nucleotide binding site-leucine richrepeat)結構域的蛋白質，它是已被克隆的抗病基因中最大的一群(表1)。這類抗病基因可被進一步分為兩個亞群(Richter和Ronald，2000，Plant Mol.Bio.42195-204)。一個亞群其抗病基因編碼的蛋白氨基端是CC(Coiled-coil)結構域，擬南芥中的RPS2和RPM1以及番茄中的Mi基因屬於這一亞群。另一亞群含有TIR結構域(homology to the cytoplasmic domains of the Toll receptor ofDrosophila melanogaster and the IL-1 receptor of birds and mammals)，如菸草中的N基因、擬南芥中的Rpp5和亞麻中的L基因。該類基因編碼的蛋白一般存在於細胞質內，抗病基因編碼蛋白和激發子的相互作用也發生在細胞內；其NBS結構域比較保守，LRR結構域不很規則，相互之間同源性較差(Baker等，1997，Science 276726-733；Kobe和Deisenhofer，1994，Trend Biochem.Sci.19415-421)。
第二類抗病基因編碼胞外LRR結構域(表1)。這類抗病基因編碼的LRR結構域比第一類抗病基因編碼的LRR規則。LRR存在於細胞外，通過跨膜結構域(TM)將其錨定於細胞膜上。在這類抗病基因介導的抗病反應中很可能激發子和胞外的LRR結合，由TM將信號傳遞入胞內。該類蛋白質的胞內結構域很小，較保守，可能涉及到和細胞內的信號傳遞體的相互作用(Jones等，1994，Science 266789-793；Dixon等，1998，Plant Cell 101915-1925；Thomas等，1997，Plant Cell 92209-2224)。
第三類抗病基因編碼蛋白激酶(表1)。如番茄的Pto基因(Martin等，1993，Science 2621432-2436；美國專利第5,648,599)編碼一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白質激酶。這個蛋白質是一種典型的信號傳遞蛋白質。從結構分析該蛋白似乎缺乏受體的功能。但目前已證明該蛋白能直接和由病原菌avrPto編碼的蛋白結合，亦能和植物體內其它的蛋白-很可能是與信號傳遞相關的蛋白相互作用。Pto蛋白發揮作用時需要Prf基因編碼的LZ(leucine zipper)-NBS-LRR類蛋白質的協助(Scofield等，1996，Science 2742063-2065；Tang等，1996，Science2742060-2063)。另一個抗病基因-PBS1也屬於這一類群。PBS1也編碼一種蛋白激酶，但和Pto不屬於一類。它發揮作用同樣需要一類NBS-LRR蛋白質-RPS5的協助。
第四類抗病基因編碼受體激酶(表1)。從水稻中分離克隆的抗白葉枯病基因Xa21屬於此類。Xa21蛋白由LRR、TM和蛋白激酶三部分結構域組成。一般認為LRR位於胞外，激酶部分在胞內(Song等，1995，Science 2701772-1804)。到目前為止，Xa21蛋白是唯一發現具有抗病活性的受體激酶。從結構上分析，這個蛋白具有典型的信號識別和傳遞功能。
第五類抗病基因編碼產物僅包含截短的CC-NBS結構(表1)。擬南芥的RPW8基因屬於此類(Xiao等，2001，Science 291118-120)。目前，研究者們還不知道該基因編碼的蛋白質如何完成對病原菌的識別。
水稻白葉枯病是一種非常嚴重的病害，由稻黃單孢桿菌中的致病變種Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)侵染引起。這種病害在亞洲、歐洲、非洲、南美、美國和澳大利亞都有發生；而以日本、印度和中國發生比較嚴重。我國主要發生在華東、華中、華南稻區，在西北、西南、華北和東北部分稻區也有分布。白葉枯病在潮溼和低洼地區發病比較頻繁，一般秈稻重於粳稻，雙季晚稻重於雙季早稻，單季中稻重於單季晚稻(過崇儉，1995，中國農作物病蟲害，中國農業出版社，14-24)。受侵染的水稻一般減產20-30％，嚴重時能夠達到50％(Ou，1985，Rice disease，2nd edition.)。白葉枯病造成米質鬆脆，發芽率降低。如果在分櫱期出現凋萎型白葉枯，則造成稻株的大量枯死，損失會更大。
控制白葉枯病害流行的最好的方法改良水稻品種的抗性。轉基因技術為品種改良提供了高效技術途徑。但利用這一途徑的前體是必須具有優良基因克隆。目前已被鑑定的抗白葉枯病基因有20多個，但國際國內已報導被分離克隆的抗白葉枯病基因只有兩個Xa21(Song等，1995，Science 2701804-1806，美國專利號5,859,339)和Xa1(Yoshimura等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA951663-1668)。Xa21基因抗譜廣，但它只具有成株期抗性。Xa1基因雖然具有全生育期抗性，但它的抗譜窄。另外，Xa21基因的智慧財產權不屬於我國，使利用這個基因克隆改良水稻品種的抗性受到限制。秈稻品種明恢63是我國水稻生產中種植面積最大、使用時間最長的雜交水稻的恢復系。由明恢63配製的雜交水稻的主要優勢是產量高和適應性強。這些雜交水稻適應性強的一個重要方面是它們具有較好的抗白葉枯病性能。明恢63攜帶至少兩個抗白葉枯病基因(Chen等，2002，Phytopathology 92750-754)。明恢63攜帶的抗病基因在我國的水稻品種改良中具有很好的應用前景。
克隆抗病基因是對水稻抗病機理研究的前提，揭示水稻抗白葉枯病的機理可以更好的控制和減低Xoo對水稻的危害。同時，對克隆的抗病基因的修飾和改造，可以人為控制和增加植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。這些方面是採用常規植物育種和改良技術所不能達到的。

發明內容
本發明的目的是分離克隆水稻品種明恢63中攜帶的一個抗白葉枯病基因和包含調控這個基因的啟動子的DNA片段，利用這個基因改良其它水稻品種或其它植物抵禦病害的能力。
本發明涉及分離和應用一種包含Xa26(t)基因的DNA片段，該片段賦予植物對由白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害產生特異性的抗病反應。這一發明適用於所有對該病原菌敏感的植物。這些植物包括單子葉植物和雙子葉植物。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當於SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相當於SEQ ID NO1所示序列的亞片段。該DNA序列編碼一種受體蛋白激酶，它包含細胞外的LRR結構域和細胞內的蛋白質激酶結構域，其胺基酸序列如(

圖11)所示。本發明所示的DNA片段的表達具有組織特異性。
所分離克隆的Xa26(t)抗病基因編碼受體蛋白激酶。這種蛋白質包含兩個主要結構域由26個LRR組成的胞外結構域和胞內的蛋白激酶結構域。已被克隆的水稻抗白葉枯病基因Xa21也編碼受體蛋白激酶。但Xa21蛋白的胞外結構域由23個LRR組成。另外，Xa26(t)基因和Xa21基因編碼的蛋白激酶結構域也存在序列上的差異。Xa26(t)基因中編碼LRR或蛋白激酶結構域的核酸片段可能具有獨立的功能。將Xa26(t)基因中編碼胞內或胞外結構域的片段與其它核酸片段重組，可構成嵌合基因或蛋白質，使之具有新的功能。對Xa26(t)基因進行修飾或改造，可改變或增加基因的某種功能。例如，將該基因的胞外結構域替換為Xa21基因的胞外結構域，可能會改變基因的抗譜；對該基因的胞外結構域進行定點突變，可能會改變基因的抗性和抗譜等。
本發明同樣包括將Xa26(t)抗病基因的主要結構部分有效連接上合適的調節序列所形成的嵌合基因，以及在基因組中包含這種基因的植物和這種植物的種子。如這種基因可以是天然的或是嵌合的。例如，將包含該基因的片段和一個組成型表達的啟動子連接，該啟動子可以在任何環境條件下和細胞發育的任何時期表達。這種組成型表達的啟動子包括花椰菜花葉病毒35S的啟動子等。另一方面，也可以將該基因和一個組織特異性表達的啟動子或發育時期特異性表達的啟動子或精確環境誘導的啟動子連接，這些啟動子稱之為誘導型啟動子。這樣，環境的改變，發育時期的不同都可以改變該基因的表達，同樣，也可以將該基因的表達限定在某一個組織內，使由該基因誘導的抗病反應得到人為的控制。其中環境條件包含病原菌的攻擊、厭氧條件、和光等，組織和發育時期包括葉、果實、種子和花等。
本發明中，Xa26(t)基因的內源啟動子也可以控制該基因的表達。該啟動子同樣也可以控制嵌合基因或其它基因的表達。因此將該基因的啟動子和任何其它基因連接、特別是與抗病基因連接，同樣會改變植物的抗性，包括抗真菌和細菌的抗性的等。本發明的Xa26(t)基因的啟動子是一種組織特異性的啟動子。我們檢測到它在葉、根中表達，沒有檢測到它在花期莖和穗中的表達。
在cDNA和基因組文庫中，可以採用已經克隆的Xa26(t)基因為探針，篩選到本發明的基因或同源基因。同樣，可以在基因組中、mRNA和cDNA中，採用PCR技術，擴增到本發明中的核苷酸序列中任何感興趣的一段或與其同源的一段。例如，所擴增的序列用於蛋白質的表達、用作探針篩選文庫、測序或其它目的等。採用以上技術，可以分離到包含Xa26(t)基因的序列，將這一序列與合適的載體連接，可以轉入植物細胞，產生轉基因植物。
本發明為增強植物對細菌性病害的抗性提供了一種新的方法。這些方法包括將該片段轉入感病植物或者將Xa26(t)結構基因和可調控的啟動子連接或將Xa26(t)的重組基因轉入植物，拓寬和增強植物對病原菌的抗性。另一方面，本發明涉及到重組表達載體，所述載體賦予植物在侵染點對細菌性病原體所致病害的防衛反應。所述重組表達構件包含分離的DNA片段，其賦予植物對細菌性病原體的抗性，其中，所述DNA片段基本上相當於SEQ ID NO1中所述的核酸序列或其功能等同的亞片段。
將克隆的抗病基因轉入感病的植物，有助於產生新的抗病植物。特別是可以用轉化技術在植株中累加多個抗病基因，而不會產生傳統育種技術中伴隨出現的連鎖基因組序列。抗病基因的克隆是克服傳統育種不能在植物種間轉移抗病基因的問題前提。
本發明能夠進一步提供或應用利用上述DNA片段獲得的抗病的轉基因植株和相應的種子，以及用本發明的基因或基於該基因的重組體轉化的植株或由這類植株獲得的種子。可以用有性雜交的方式將本發明的基因轉入其它的植株。
在本發明的實施例部分，我們闡述了Xa26(t)基因的分離過程和該基因的特點，分離的Xa26(t)基因能夠和適當的載體連接，轉入植物體中，使該植物體帶有一定的抗性(圖1)。
序列表、附圖及其說明序列表SEQ ID No1.包括Xa26(t)基因和Xa26(t)基因啟動子的DNA序列。
圖1.是本發明的水稻抗白葉枯病基因Xa26(t)的分離克隆和應用流程圖。
圖2.是本發明的水稻抗白葉枯病基因Xa26(t)在第11染色體分子標記遺傳連鎖圖上的位置。
圖3.用DNA雜交技術分析Xa26(t)基因區段的BAC克隆之間的重疊關係。將提取的BAC質粒(33P4、65H1、3H8、5B14、31B6、65A17、39F18、26G20、57B2和38G13)用Hind III完全酶切，電泳後轉移至尼龍膜。然後用經Hind III酶切消化、放射性同位素P32標記的BAC克隆3H8、39F18和57B2分別與尼龍膜雜交，根據雜交帶型的重疊情況確定BAC克隆之間的重疊關係。
圖4.覆蓋Xa26(t)基因區段的物理圖譜。短橫線代表不同BAC克隆。豎虛線表示某一BAC克隆包含的分子標記經過DNA雜交驗證。分子標記之間的阿拉伯數字表示在F2感病群體中某一分子標記與Xa26(t)基因之間存在重組的單株數目。Xa26(t)基因被定位在BAC克隆3H8上。
圖5.對BAC克隆3H8進行測序分析後，獲得兩條長DNA序列。一條長36.4kb，另一條長30.4kb。長36.4kb的序列中包含3個編碼LRR-蛋白激酶類蛋白質的基因，分別被命名為RKa、RKb和RKc。垂直虛線示來源於3H8的分子標記3H8-RKa、3/7A-8、2/15B-29、3H8-RKb、M196-1、3/7A-80和3/7A-10在3H8或3個基因(RKa、RKb和RKc)上的相對位置。用這些分子標記分析重組自交系群體中在Xa26(t)基因區段發生重組的5個家系(表型為抗病，但與Xa26(t)共分離的分子標記R1506和Xa26(t)基因兩側的分子標記RM224和RM144位點處是感病親本的基因型)，發現3H8-RKa、3/7A-8和2/15B-29在這5個家系中檢測出不規則(A)的雜交帶型(既非抗病親本的帶型，也非感病親本的帶型)，而3H8-RKb、M196-1、3/7A-80和3/7A-10在這5個家系中檢測到抗病親本的雜交帶型(R)。根據這些結果和圖3中的結果，可以確定RKb就是Xa26(t)基因。圖6.示3個轉基因T1家系(RKb17、RKb18和RKb22)的不同單株對白葉枯病菌生理小種PXO61的抗性(葉片病斑長度)發生分離。IR24和牡丹江8號(MDJ8)是對照感病品種，明恢63(MH63)是對照抗病品種。MDJ 8/MH63是兩個親本的雜交(F1)後代。
圖7.採用RKb基因的特異性引物，通過PCR擴增檢測3個T1轉基因家系(RKb17、RKb18和RKb22)中的各個單株。帶有RKb基因的陽性轉基因單株和抗病水稻品種明恢63(MH63)呈現出很強的帶，而陰性單株和感病品種牡丹江8號(MDJ 8)因只帶有與RKb同源的序列，故呈現出弱帶或無帶。
圖8.用RT-PCR方法分析明恢63接種白葉枯病菌和對照(假接種)處理中Xa26(t)基因的表達水平。用RKb2R和RKb/3』race-2引物擴增明恢63的總DNA和明恢63 RNA的反轉錄產物(cDNA)獲得大小不同的片段。
圖9.Xa26(t)基因內含子的剪切位點。
圖10.Xa26(t)基因的結構。
圖11.Xa26(t)基因編碼的受體激酶類膜蛋白質的結構，其中包括兩個主要的結構域LRR和激酶(kinase)。在Kinase結構域序列中用下劃線標註的胺基酸殘基是蛋白激酶的保守結構域。
圖12.Xa26(t)基因在不同組織內的表達分析。1、分櫱期的根；2、苗期的葉鞘；3、苗期葉；4、分櫱期的葉；5、抽穗期的莖；6、灌漿期穗。
具體實施例方式
以下實施例中進一步定義本發明。根據以上的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特徵，並且在不偏離本發明精神和範圍的情況下，可以對本發明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實施例一水稻品種明恢63中的抗白葉枯病基因的遺傳定位本發明採用兩個遺傳作圖群體定位水稻品種明恢63中的抗白葉枯病基因。其中一個群體是由感病親本珍汕97和抗病親本明恢63雜交配製的F2群體，該群體包含2533個F2單株。另一個群體是由珍汕97和明恢63雜交配製的重組自交系群體，包含241個家系。對F2群體進行白葉枯病菌接種鑑定，確定了477株極端感病單株，由它們組成感病群體。我們在前期工作中已經鑑定出明恢63的一個抗白葉枯病基因位於水稻第11染色體的兩個分子標記RM224和RM144之間(Chen等，2002，Phytopathology 92750-754)。因此，可以用這兩個分子標記篩選F2極端感病單株組成的群體，尋找和發現抗病基因和分子標記間的重組事件。分子標記和抗病基因之間發生的重組事件越多，兩者的遺傳距離越遠。二者之間的交換率採用最大似然法來估計(Allard，1956，Hilgardia 24235-278)，其中交換率c＝(N1+N2/2)/N，N為所測定的感病單株總數，N1為感病群體中呈現純合抗病帶型的個體數，N2是呈現雜合帶型的個體數。標準差為Vc＝c(1-c)/2N。
用RM224標記在感病群體內檢測出兩個重組單株，用RM144標記在感病群體中檢測出20個重組單株。這一結果進一步確認這兩個分子標記之間存在一個抗白葉枯病基因。進一步用這兩個標記之間的其它分子標記分析它們和抗病基因間的重組事件，將這個抗病基因定位於分子標記RM224和Y6855RA之間。這兩個分子標記距抗病基因的遺傳距離分別為0.21和2.1cM(centiMorgan)(圖2)。另外，這個抗病基因與分子標記R1506共分離(圖2)。根據這個抗病基因的染色體位置和攜帶這個基因的水稻品種明恢63的抗譜，我們認為該基因可能是一個抗白葉枯病新基因，命名為Xa26(t)。
實施例二建立覆蓋Xa26(t)基因區段的物理圖譜Xa26(t)基因區段的物理圖譜的構建採用本實驗室構建的明恢63 BAC文庫。該文庫由26,000個克隆組成，平均插入片段150kb，覆蓋水稻基因組9倍(Peng等，1998，Acta Botanica Sinica 401108-1114)。首先採用和Xa26(t)基因緊密連鎖的分子標記篩選BAC文庫。分子標記R1506屬於單拷貝探針，用該探針從文庫中篩選到3個重疊的BAC克隆，分別是33P4，65H1和3H8。分子標記S12886位於基因的另一側，用該標記篩選到另外3個重疊BAC克隆，分別為26G20、57B2和39F18。另外，用與S12886共分離的分子標記Y6855RA鑑定出3個BAC克隆，分別是31B6、65A17和7M24。從保存的文庫中將篩選到的BAC克隆取出，擴大培養，採用標準鹼裂解法(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press)分離提取BAC質粒。將所得BAC質粒用Hind III完全酶切、電泳、轉移至尼龍膜；然後用Hind III完全酶切的BAC克隆作探針與載有BAC質粒的尼龍膜雜交，根據電泳位置相同的雜交帶的有無和多少確立不同BAC克隆之間的重疊關係。兩個BAC克隆分享相同的雜交帶越多，則重疊區段越長，圖3顯示了跨越基因區段的10個BAC克隆之間的重疊情況。最後，從中確立了6個冗餘最少的BAC克隆，建立了覆蓋Xa26(t)基因區段的重疊群(圖4)。
為確定BAC克隆插入片段的大小，採用Not I對BAC克隆進行酶切，1％瓊脂糖脈衝場電泳分離酶切片段，並和已知大小的DNA片段的遷移率做比較，計算出插入片段的大小。電泳條件如下電泳緩衝液為0.5×TBE，轉換時間(switchtime)1-12秒，角度為120度，電壓6V/cm，溫度14℃，電泳時間16小時。通過脈衝電泳分析，確定了跨越Xa26(t)基因區段的重疊群長約500kb。
分子標記R1506和Xa26(t)基因間在F2代感病單株組成的群體內沒有檢測出重組單株，但在重組自交系中找到5個重組單株。進一步以明恢63的BAC克隆3H8的亞克隆為探針，分析F2感病群體中所發生的重組事件。BAC克隆3H8的亞克隆3/7A-10和3/7A-80在這個感病群體內檢測到14個重組單株，3H8的另一個亞克隆M196-1和抗病基因共分離。綜合上述各方面的信息，我們將Xa26(t)基被定位在一個BAC克隆-3H8上(圖4)。
實施例三測序分析包含Xa26(t)基因的BAC克隆和Xa26(t)候選基因的分離克隆1.BAC克隆3H8的Shotgun文庫的構建採用超聲波法(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Laboratory Press)構建Shotgun文庫。用超聲波處理明恢63 BAC克隆3H8的環形質粒，通過1％瓊脂糖凝膠電泳分離出1.5-2.5kb的DNA片段，純化後用T4-DNA聚合酶補平末端，與Sma I酶切的去磷酸化的pUC18載體平端連接，電轉化大腸桿菌DH10B，進行藍白斑篩選。提取陽性克隆質粒，並與空pUC18質粒進行電泳比較，剔除假陽性克隆及小片段克隆，或用BamHI和EcoRI雙酶切，檢測插入片段大小。
2.隨機亞克隆片段的測序採用M13-R和M13-F引物、美國Perkin Elmer公司的測序試劑盒(Big DyeKit)、以雙脫氧核苷酸末端終止法分別從每個亞克隆的兩端測序。測序儀為PerkinElmer公司的ABI377 Sequencer。
3.原始序列的拼接使用Sequencher 4.1軟體(美國Gene Codes Corporation)拼接序列。用Sequencher 4.1軟體自動去除末端測序較差的序列和pUC18載體序列；用Sequencher 4.1軟體沒有去除乾淨的序列則用手工刪除。BAC載體pBeloBAC11的碎片序列和汙染的細菌DNA序列則通過和BAC序列進行比較或BLAST分析的方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)加以去除。用Sequencher 4.1軟體對兩條序列進行拼接的參數是重疊序列長度(Mini Overlap)大於20bp(base pair)，重疊序列的一致性(Mini Match)大於85％。每一個鹼基的確定都要參照重疊在該位點的多個Shotgun片段序列。對於由一個Shotgun片段序列所覆蓋的區域要再次測序驗證，以確保鹼基的準確性。而由一個亞克隆覆蓋的斷口處，則對該克隆進行長序列膠測序或用primer walking的方法，填補缺口。
4.BAC克隆的序列分析首先用Blastn和Blastx方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)分析所得序列。然後採用GenScan(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)和Fgenesh(http//www.softberry.com/)軟體分析預測基因結構，分析結果進一步用Blastp方法(Altschul等，1997，NucleicAcids Res.253389-3402)進行確證。兩條或多條核苷酸或胺基酸序列的比較分析使用BLAST 2 sequence方法(Tatiana等，1999，FEMS Microbiol Lett.174247-250)和ClustalW方法(http//www.ebi.ac.uk)。
對BAC克隆3H8測序和序列拼接形成兩個大的序列片段，一個片段長36.4kb，另一個片段長30.4kb，二者之間有一個小於1kb的間隙(圖5)。序列分析發現在36.4kb的片段上有3個區段編碼LRR-蛋白激酶類蛋白，並與水稻抗白葉枯病基因Xa21編碼的產物有不同程度的同源性，它們被分別稱之為RKa、RKb和RKc(圖5)。用GenScan、Fgenesh和Blastx分析表明，RKa、RKb和RKc是3個完整的基因。RKa和RKb的轉錄方向相同，而RKc的轉錄方向相反。
5.Xa26(t)候選基因的確定採用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)方法分析(具體操作方法見實施例四)，檢測到RKa和RKb基因的表達，沒有檢測到RKc基因的表達。
用與Xa26(t)共分離的分子標記R1506和Xa26(t)基因兩側的分子標記RM224和RM144檢測重組自交系群體，發現5個重組家系(R85，R96，R102，R117和R240)。這5個家系在上述3個分子標記位點處是感病親本的基因型，而表型則是抗病。用BAC克隆3H8的亞克隆3/7A-8、2/15B-29、M196-1、3/7A-80、3/7A-10以及3H8的PCR產物3H8-RKa和3H8-RKb作探針檢測這5個家系，發現3H8-RKa、3/7A-8和2/15B-29在這5個家系中檢測出不規則(A)的雜交帶型(既非抗病親本的帶型，也非感病親本的帶型)，而3H8-RKb、M196-1、3/7A-80和3/7A-10在這5個家系中檢測到抗病親本的雜交帶型(R)(圖5)。3H8-RKa、3/7A-8和2/15B-29是RKa基因的片段；3H8-RKb和M196-1是RKb基因的片段；3/7A-80是RKc基因的片段，但RKc基因不表達，且3/7A-80與Xa26(t)之間檢測到14個重組交換單株(圖4)。綜合上述各方面的信息，初步確定基因RKb就是Xa26(t)基因(圖5)。
6.分離克隆Xa26(t)候選基因和遺傳轉化鑑定候選基因的功能用Dra I限制性內切從BAC克隆3H8上獲得6.6kb包含RKa基因的編碼區、啟動子以及加尾序列的片段和7.5kb包含RKb基因的編碼區、啟動子以及加尾序列的片段。將這兩個片段分別連接到Sma I酶切的pCAMBIA1301遺傳轉化載體上。通過農桿菌介導得遺傳轉化，將攜帶RKa和RKb的片段分別導入感病水稻品種牡丹江8號，獲得轉化了包含RKa的DNA片段的轉基因植株120株，轉化了包含RKb片段的轉基因植株40株。對轉基因植株接種白葉枯病菌生理小種PXO61，所有轉化了包含Rka基因片段的轉基因植株都感病，在轉化了包含RKb基因片段的轉基因植株的T0代和T1代植株中都發現抗病單株(表2和圖6)。採用遺傳轉化載體所攜帶的報告基因Gus的引物和RKb基因的特異性引物擴增檢測(圖7)部分轉基因T1代單株，發現轉基因植株的抗性和RKb基因共分離(表2、圖6和圖7)。這說明轉基因單株的抗性是由RKb提供的，從而確定RKb基因就是Xa26(t)基因。
表2.轉基因植株和對照水稻品種對水稻白葉枯病菌生理小種PXO61的抗性以及轉基因T1代單株的抗性與RKb基因、Gus基因共分離分析水稻材料 單株 病斑長度(cm) RKb基因 Gus基因轉基因受體水稻品種(感病)牡丹江8號(MDJ8) 16.2 無轉基因T1代家系Rb1110.5 有218.3 無
3 14.0 無4 0.4 有5 1.4 有6 16.3 無7 16.7 無8 4.8 有9 0.6 有1021.0 無1116.2 無1210.9 無131.0 有1413.2 無150.6 有Rb161 17.6 無無2 1.6 有有Rb171 16.9 無2 0.2 有3 16.2 無4 12.5 無5 0.6 有Rb181 0.7 有有2 18.2 無無3 0.2 有有4 0.6 有有Rb221 16.7 無無2 0.6 有有3 0.2 有有4 1.3 有有5 1.0 有有6 0.7 有有7 18.1 無無8 2.0 有有9 1.2 有有101.4 有有實施例四Xa26(t)基因結構分析1.總RNA的抽提總RNA的抽提採用TRIzol Reagent(美國Invitrogen公司)。操作方法按公司提供的試劑盒說明書進行。
2.RT-PCR分析將接種白葉枯病菌生理小種PXO61的明恢63葉片和未接種白葉枯病菌的明恢63葉片用於RT-PCR分析。RT-PCR以兩步法進行(Zhou等，2002，Science inChina 45449-467)。首先，將用於反轉錄的總RNA用無RNA酶活性的DNA酶I處理，去除總RNA中可能汙染的DNA；將總RNA在65℃處理10分鐘，滅活DNA酶I；將RNA在72℃變性5分鐘，然後加入Oligo-dT15、dNTP、反轉錄酶等，在42℃反轉錄90分鐘。第二步，取1微升反轉錄產物作PCR擴增。PCR擴增引物為對於RKa基因RKaL和RKaR，RKa2L和RKa22R(表3)對於RKb基因RKbL和RKbR，RKb2R和RKb/3』race-2(表3)對於RKc基因RKcL和RKcR(表3)表3.用於PCR、RT-PCR和RACE分析的引物引物名稱 引物序列(5』-3』)RKaLCTGGCTCTGTCCCATCAAATRKaRGCTGAAAGCAAAAGCTCCAARKa2L CTGCATGGTCAGATACCAAAAGRKa22R TACGGGATCATGCTACTCGARKbLGGCTTGCAAACTTTGGACATRKbRGCTTCCCTTGTTCTGAGTGCRKb2R CAGTCCACCACATGGACAAGRKb/3』race-2 TGGTCAAATACCGGAAGGAGRKbL/3』race-1 CCATCCCAAACTACTTGGCTAadaptor CTGATCTAGAGGTACCGGATCCOligo-dT17-adaptor CTGATCTAGAGGTACCGGATCC(T)17RKcLTGTTTCGAGTGGCATACAGCRKcRATGAGCCGAGCAATGATACCRaceATCAACCGGCARKb/5』-race-A1 GCGTGTCCATACCTCCAAGT
RKb/5』-race-A2 CCAATCTTGATGCCATCTCCRKb/5』-race-S1 CGTAGAACTGGGAGGCTGAARKb/5』-race-S2 CCGCCCCAGTTAAGTTATTG3.基因末端序列分析採用大連TaKaRa公司的5』Full RACE Core Set試劑盒和3』RACE Core Set試劑盒，通過5』-RACE(rapid amplification of cDNA end)和3』-RACE分析方法，確定Xa26(t)基因的5』和3』末端序列。
進行3』-RACE的反轉錄和做RT-PCR的反轉錄條件一樣，只是用Oligo-dT17-adaptor代替Oligo-dT15。反轉錄完成後，進行兩輪擴增。第一輪擴增引物是RKbL/3』race-1和adaptor；第二輪擴增引物是RKb/3』race-2和adaptor。然後通過電泳回收目標大小的片段，用pGEM-T Vector System I試劑盒(美國Promega Corporation)對回收片段進行克隆。最後對克隆進行測序分析。
採用SuperscriptTMII反轉錄酶(美國Life Technologies公司)進行5』-RACE的反轉錄反應；用於反轉錄的特異性引物Race(表3)的磷酸化採用T4polynucleotide kinase(美國MBI Fermentas公司)，反應按試劑說明書進行。磷酸化後的引物用10mol/LNH4AC-乙醇沉澱，純化。以後的操作按TaKaRa公司提供的試劑盒說明書進行。進行5』-RACE第一輪擴增的引物是RKb/5』-race-A1和Kb/5』-race-S1；第二輪擴增引物是RKb/5』-race-A2和RKb/5』-race-S2。
4.基因內含子的確定採用GenScan(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)軟體對包含Xa26(t)基因區段的基因組DNA的分析發現在編碼激酶結構域的區段存在一個內含子，採用跨越該區段的引物RKb2R和RKb/3』race-2擴增基因組DNA和RNA反轉錄產物，RT-PCR產物比從基因組中擴增出的產物小(圖8)，這說明該區段確實存在一個內含子。將RT-PCR產物克隆、測序、與基因組DNA比較，確定內含子長105bp以及該內含子的剪切位點(圖9)。採用Xa26(t)基因區段的其它引物進行RT-PCR、5』RACE和3』RACE分析，沒有再發現其它內含子的存在。
5.基因結構分析Xa26(t)基因的5』端位於基因起始密碼子上遊48bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的1494bp)處，3』端位於終止密碼子下遊166bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的5124bp)處。該基因由兩個外顯子和一個內含子組成(圖10)。內含子靠近基因的3』端，長105bp，位於編碼蛋白激酶的結構域內(序列表SEQID NO1所示序列的4477-4581bp)。Xa26(t)基因的全長編碼序列是3312bp，被插入的內含子分為兩段，分別長2935bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的1542-4476bp)和377bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的4582-4958bp)。對水稻抗白葉枯病近等基因系IRBB3中與明恢63的Xa26(t)基因區段同源的片段進行測序分析，發現IRBB3中攜帶有與Xa26(t)序列完全相同的基因。
實施例五Xa26(t)基因的產物和特徵根據Xa26(t)基因的結構特徵和對該基因表達序列的分析，以及結合BLAST分析，可以確定這個基因編碼一種受體激酶類膜蛋白質(圖11)。這個膜蛋白質的胞外的結構域由26個LRR組成，其保守結構特徵為L/I/VXXL/MXXLXXL/I/VXL/VXXNXL/FXGXI/L/VPXX(其中X代表任意胺基酸殘基)。該保守結構特徵與已知的LRR-蛋白激酶類蛋白質的LRR結構基本相同(Torii和Clark，2000，InKeris M，Walker J C and Callow J A.Plant ProteinKinases，Advances in Botanical Research.Academics Press)。與上述LRR的保守結構特徵相比，在Xa26(t)基因編碼的26個LRR中，第1個LRR不完整，第6、11和17個LRR中間多一個胺基酸殘基，第8和第15個LRR分別在末端多出一個和兩個胺基酸殘基。
Xa26(t)基因編碼的膜蛋白質的細胞內結構域是一個類似於蛋白激酶結構，它具有蛋白激酶的保守的結構域(圖11)。
實施例六Xa26(t)基因在葉片組織中呈組成型表達模式，但具有不同組織表達特異性Xa26(t)基因在沒有接種的葉片中和接種的葉片都表達，接種之後沒有發現明顯地表達增強，這說明該基因不受病原菌侵染的誘導(圖8)。但Xa26(t)基因在不同組織中表達有差異(圖12)。該基因在苗期的葉片中表達最強，在分櫱期的葉片中表達略差，在成株期的的葉片中能檢測到Xa26(t)基因的表達(圖8)。另外，在分櫱期的根和和苗期的葉鞘中也都檢測到Xa26(t)基因的表達。但在花期莖和灌漿期穗中未檢測到Xa26(t)基因的表達(圖12)。
術語定義本說明書、權利要求書和其它有關該專利申請文字材料中使用的術語的定義如下術語「植物」包括整個植株、植物的組織(如葉、莖、根等)、植物種子、細胞和其後代。本文中的植物主要是指可以用於轉化的高等植物，包括單子葉植物和雙子葉植物。
「抗病基因」是指編碼能夠在植物細胞或植物組織中激發防衛反應的多肽的基因。抗病的植物表現出較短或很短的菌斑，感病的植物菌斑很長。
「防衛反應」是由寄主(如植物)產生的特異性、抵抗侵染因子或病原體存在的防衛反應。
「功能等同的亞片段」是指分離的DNA片段的一部分或亞序列，其中無論這些片段或亞序列是否編碼活性蛋白質，都保留改變基因表達或產生一定表型的能力。如所述片段可用於嵌合基因的設計或反義抑制等。
「基因」是指表達特定蛋白的DNA片段，包括所述編碼序列之前(5』非編碼序列)和之後(3』非編碼序列)的調節序列。「天然基因」是指同自然界中發現的一樣具有其自身調節序列的基因。「嵌合基因」是指非天然基因的任何基因，包括在自然界中未發現在一起的調節序列和編碼序列組成的基因。因此，嵌合基因可以包括得自不同來源的調節序列和編碼序列，或得自同一來源、但排列方式不同於天然形式的調節序列和編碼序列。「內源基因」是指在生物體的基因組中於天然位置的天然基因。「外源基因」是指不是在所述寄主生物體中發現的、而是通過基因轉移被引入所述寄主生物體中的基因。外源基因可以包括插入非天然生物體中的天然基因或嵌合基因。「轉基因」是已經通過轉化程序被引入基因組中的基因。
「編碼序列」是指編碼特定胺基酸序列的DNA序列。「調節序列」是指位於編碼序列上遊(5』非編碼序列)、之中或下遊(3』非編碼序列)影響所連接的編碼序列轉錄、RNA加工、穩定性或翻譯的核苷酸序列。這種序列可以是天然的或是非天然的。調節序列可以包括但不限於啟動子、翻譯前導序列、內含子和聚腺苷酸化識別序列。
「病原體」是指其侵染到活植物組織的細胞周圍或細胞中激發病害反應的生物或侵染性因子。
「啟動子」是指能夠控制編碼序列或功能RNA表達的DNA序列。啟動子序列包括鄰近的上遊元件和更遠的上遊元件，後者通常被稱作「增強子」。因為增強子是刺激啟動子活性的DNA序列，可以是所述啟動子的固有元件，或是插入的以提高啟動子水平或組織特異性的異源元件。啟動子可以全部衍生白天然基因，或可以由衍生自自然界中發現的不同啟動子的不同元件組成，或甚至包括合成的DNA區段。本領域技術人員會理解，不同的啟動子可能指導基因在不同組織或不同細胞類型中表達，或指導基因在不同發育階段表達，或對不同環境條件應答而指導基因表達。引起基因在大多數時間、大多數細胞類型中表達的啟動子通常被稱為「組成型啟動子」。另外，由於在大多數情況下尚未完全確定調節序列的實際邊界，因此某些變異的DNA片段可以具有相同的啟動子活性。
「內含子」是基因中不編碼蛋白質序列的間插序列。雖然這種序列被轉錄成RNA，但隨後被剪切去掉。該術語也用於被切下的RNA序列。「外顯子」是基因中被轉錄且存在於成熟的信使RNA中的序列，但不必是編碼最終基因產物的序列的一部分。
「3』非編碼序列」是指位於編碼序列下遊的DNA序列，包括聚腺苷酸化識別序列和編碼能夠影響mRNA加工或基因表達的調節信號的其它序列。通常，聚腺苷酸化信號的特徵在於影響聚腺苷酸序列段添加至mRNA前體3』端。Ingelbrech等，1989，Plant Cell 1671-680例舉了不同3』非編碼序列的應用。
本文中的「表達」是指功能性終產物的產生。基因的表達或過量表達涉及該基因的轉錄和所述mRNA翻譯成前體蛋白或成熟蛋白。
「轉化」是指將核酸片段轉移到寄主生物體的基因組中，並形成穩定的遺傳。帶有所述轉化核酸片段的寄主生物體被稱為「轉基因」生物。水稻、玉米和其它單子葉植物的優選細胞轉化方法是應用加速粒子或「基因槍」轉化技術(Klein等，1987，Nature 32770-73；美國專利第4,945,050號)，或採用合適的含所述轉基因的Ti質粒的農桿菌介導的方法(Ishida等，1996，Nature Biotech.14745-750)。
「表達構件」是指所分離的DNA片段單獨使用，或與載體和其它的亞片段結合使用所形成的新的DNA片段。如果使用載體，載體的選擇決定於將來轉化寄主植物的方法。「表達構件」和「重組表達構件」在本文中通用。
「PCR」或「聚合酶鏈式反應」是用於合成大量特定DNA區段的技術，由一系列重複的循環組成(Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，CT)。通常由連續的三個步驟構成一個循環將雙鏈DNA於高溫(如95℃)下變性，將兩種與靶區段的3』邊界互補的引物於低溫(如55℃)下退火然後在中溫(如72℃)下延伸。
水稻抗白葉枯病基因Xa26(t)序列表Organization Applicant----------------------Street獅子山街City武漢State湖北省Country中國PostalCode430070PhoneNumber027-87282038FaxNumber027-87397735EmailAddresszhanghb@mail.hzau.edu.cn110OrganizationName華中農業大學Application Project-------------------120Title水稻抗白葉枯病基因Xa26(t)130AppFileReference140CurrentAppNumber141CurrentFilingDate2002-10-27Sequence--------213OrganismName水稻(Oryza sativa)400PreSequenceString1aaaaatggcc atgggtccac acgcagtgag atgaatgcta gatctcacga gaaaaaagaa60atacatctca ggggttgtga tgtactggat aatttgctcg tcatattaac cattagctta120ctctagttga tgtgggcatg gatggagccg gcagccggcg atcctattta acctgcttaa180ctacacaatc gttgctggga gacggcaaaa atgcgcgctt ttggagctca aaatggttag240ataatcaaac gccgcaactg attgctccag atattttcat ggtctctaaa agaaaaaaca300gaaccgtgca agatgccatt ttagaaaaca actggatccg agatattgac atctcccgta360tcactgaggc atatcaactc caacagtatg tccacctttg gagaatgatc agagacatga420ggccgctcaa cgaaagctac gatagaatcc gatggaatat cacagcaaat ggacagtact480ttgcaaaatc ggccaatcgg ctacagttcc ttttggctgc gaaatccgtc ttctaccagt540caatttggaa ggcctgggcg cctccgaagt gcaaattctt ctcctggttg gtcactcaaa600acagagtatg cacggcagac agactggaaa aaagaggatg gcaaaaccaa aagacttgcc660cactctgcta catcgtcgat gagtcggcct tacatctcct ggccaaatgc agactcacaa720agaggatatg gacggaaatt caaagatgga ccgggactga cctccaaatg gacaattggg780aaaattgtca ctcggtcgaa caatggtgga ccctcgtagc ggagtcccca agcaccccac840gcaagcctct caggactcta gtgattctaa tctcatggga aatctggtgc aaacgaaacg900caagaatatt ctgcaacaat gcgtctgcgc cgtcctcaat tctagcaaaa atcaaggagg960aaggaagagc atgggtcaaa gcagaggctg caaccttgca agagtttgga atcttgggag1020atatcgccta attcctgctt tttttttcct tttcttttgc gggttattct tgtttaccgt1080cttttttgtc taaccctgta tatgtatatg gctcgttata attttttcta ttaatatata1140caaggcaaag ctattgtctt tccttaaaaa aaaaactaca caatcgttgc tgttctaacc1200accaaatcaa caaaagagta aggccgttgc cgtcagtgag tgtatggctg atgacggagc1260gacacagcta tcatatctag cgtgtcgtgc acaccgcgat ctgctgaata tatattttgt1320gatgtcttta ttttccagcg tttacctagt agtgctgtca aatatttatg accggaagga1380gtatcattta agtttctttc gctttctgag agcaacagtc aaggtcgtcc tacatgtcga1440taaagcaaac tagcactact gtgctaaata aagctcaact tgatcgtcac tgtgaagtat1500gatgcatact cttgctgcca atgcatcaca cacaaccaga catggctctt gttcgattgc1560
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權利要求
1.賦予植物Xa26(t)基因介導的對白葉枯病菌抗性的DNA片段，其中所述的片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當於SEQ ID NO1所示序列，或者與SEQ ID NO1所示序列的一部分功能等同的亞片段。
2.權利要求1的DNA片段，其核苷酸序列包含全長的Xa26(t)基因，該基因編碼的蛋白質包含富含亮氨酸重複序列(LRR)結構域和蛋白激酶結構域，其胺基酸序列如附圖11所示。
3.包含與合適調節序列連接的權利要求1的基因編碼區DNA片段。
4.權利要求1中的DNA片段，其中的基因編碼區與其它的基因形成嵌合基因，或者其中的基因經過修飾改造。
5.權利要求1中的DNA片段，其中的啟動子序列是組織特異性的，但在葉片中呈組成型表達；該啟動子可以和異源基因連接，調節異源基因的表達。
6.基因組中包含權利要求1、2、3、4、5中的DNA片段的轉基因植物和轉基因植物種子的應用。
7.一種增加植物對白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)抗性的方法，該方法包括將權利要求1的DNA片段轉入植物體或將權利要求1中基因區段的DMA片段連接上合適的啟動子轉入植物體或將權利要求1的DNA片段和其它的DNA片段組成嵌合基因轉入植物或將權利要求1的DMA片段經過修飾改造後轉入植物體，增加植物對病原菌的抗性。
8.權利要求7的方法，其中所述啟動子是組織特異性的啟動子或組成型表達的啟動子。
全文摘要
本發明涉及基因工程技術領域。具體涉及一種DNA片斷的分離克隆和應用。所述的DNA片斷能夠賦予植物抵抗由白葉枯病原菌引起的病害。將該片段與其內源調節序列直接轉入植物體，或者將該片段和合適的調節序列連接後轉入植物體，轉基因植物可以產生抗病基因介導的對多種病原菌的防衛反應。將該DNA片段和其它基因的DNA片段重組有可能使植物產生更強和更廣的抗病性。
文檔編號C12N15/11GK1493692SQ0213921
公開日2004年5月5日 申請日期2002年10月28日 優先權日2002年10月28日
發明者王石平, 孫新立, 曹應龍, 楊之芬, 張啟發 申請人:華中農業大學