柱切換-液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法

2023-10-23 16:47:27 2

專利名稱：柱切換-液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法
技術領域：
本發明涉及柱切換技術應用和手性藥物對映體領域，尤其涉及柱切換-液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法。
背景技術：
從上世紀幾起震驚世界的藥害事件起，人們逐漸認識到手性藥物對映體之間立體構型上的微小不同，導致其在人體內的藥理活性、代謝過程及毒性等方面均存在顯著差異。隨著科學技術的不斷發展，對手性藥物單一對映體進行更加深入的體內研究，為評價手性藥物各對映體之間的生物學活性，闡明手性對映體之間的作用差異及開發單一對映體新藥均具有十分重大的意義。手性藥物各對映體的物理化學性質相似，僅旋光性不同，分析測定難度大，目前主要利用現代色譜技術(如高效液相色譜法、毛細管電泳法、超臨界流體色譜、高速逆流色譜法、模擬移動床色譜法等)實現對各對映體的拆分測定；但單一對映體的體內濃度測定方法則以高效液相色譜法、液相色譜_串聯質譜法為主。生物體液中基質成分複雜，單一對映體的濃度低，其分析測定均存在樣品前處理步驟複雜繁瑣、樣品損耗大、方法回收率及準確度低、耗費時間、耗費溶劑等一系列問題，因此建立一種生物體液中快速、靈敏、準確的單一對映體分析測定方法是十分有必要的。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種快速、方便、靈敏的柱切換_液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法。為解決上述問題，本發明所述的柱切換_液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法，包括以下步驟(1)將手性藥物消旋體標準品在5 30°C的溫度下用無水乙醇溶解，製成濃度為 4mg/mL 5mg/mL的標準溶液；該標準溶液在5 30°C的溫度下用空白血漿稀釋，製成濃度為0. 5mg/mL 1. 5mg/mL的血漿樣品；(2)將所述血漿樣品置ImL 5mL具塞離心試管中，以1000 8000r/min的轉速離心3 lOmin，精密吸取上清液置於一離心試管中作進樣備用；(3)製備限進填料柱將粒徑為5μπι的矽膠外表面鍵合親水性的聚乙烯醇，其內表面鍵合非極性的己胺，形成內徑為4. 6mm、長度為45mm的內表面反相限進填料柱；(4)製備手性固定相將粒徑為5 μ m的矽膠表面塗覆有3，5- 二甲基氨基苯甲酸酯的內徑為4. 6mm、長度為250mm的手性AE. Lichrom CE 4色譜柱構成手性固定相I ；將粒徑為5μπι的矽膠表面塗覆有4-甲基氨基苯甲酸酯的內徑為4. 6mm、長度為250mm的手性 AE. Lichrom CE 7色譜柱構成手性固定相II ；(5)將所述手性固定相I和所述手性固定相II分別與所述限進填料柱相連，並將所述限進填料柱作為預處理柱、所述手性固定相作為分析柱放入柱切換限進填料-手性固定相高效液相色譜系統中；所述預處理柱與所述分析柱之間通過聚醚醚酮(PEEK)樹脂管連接，該聚醚醚酮(PEEK)樹脂管上設有切換閥；所述分析柱外接紫外檢測器；(6)將所述步驟(2)所得的血漿樣品上清液注入到所述柱切換限進填料_手性固定相高效液相色譜系統中的進樣器，以硼酸鹽緩衝液-甲醇或水-甲醇為預處理柱流動相， 以硼酸鹽緩衝液_異丙醇_無水乙醇為分析柱流動相，在紫外檢測波長為230 350nm、預處理流動相流速為0. 5mL/min 2. OmL/min、分析流動相流速為0. 5mL/min 2. OmL/min、 溫度為15 40°C的條件下進行分離，得到不同出峰時間不同單一對映體的色譜圖。所述步驟(1)中的手性藥物消旋體標準品是指鹽酸普萘洛爾消旋體標準品。所述步驟(5)中的切換閥的切換時間為Imin 5min。所述步驟(6)中預處理柱流動相中的硼酸鹽緩衝液與甲醇或水與甲醇的體積比為30 98 2 70。所述步驟(6)中分析柱流動相中的硼酸鹽緩衝液與異丙醇、乙醇的體積比為10 70 10 40 20 50。所述硼酸鹽緩衝液是指將0. 05mol/L的硼砂溶液與0. 2mol/L的硼酸溶液按照 1 8 2 9的體積比配製的pH值為7. O 9. 5的溶液。本發明與現有技術相比具有以下優點1、限進填料是一個新的色譜填料家族，它們的分離機制主要是通過對填料外表面進行適當的親水性修飾，使得生物樣品溶液中的大分子不能進入填料的內孔中去，生物大分子在近乎死體積的情況下被洗脫除去，而該類填料的內孔表面仍為反相萃取劑性質，被分析物則通過疏水作用和靜電作用被保留。柱切換技術是通過改變切換閥的位置，實現進樣器、不同色譜柱、檢測器之間的變換連接，從而實現被分析物與其它幹擾成分的分離，達到純化與富集的目的，進而完成對被分析物的濃度測定。本發明建立了新的柱切換限進填料-手性固定相液相色譜模式，該模式利用柱切換技術，實現生物體液中手性藥物單一對映體濃度的快速、在線檢測。該模式可實現複雜樣品的直接進樣分析，實現被分析物與生物體液中其它無效成分的在線分離，減少了傳統的離線生物樣品製備方法中繁瑣的步驟，避免了被分析物由於前處理所造成的損失，縮短了分析時間，提高了自動化程度，實現了快速、方便、靈敏的手性藥物對映體濃度的在線檢測。 實驗證明該模式在生物體液中手性藥物單一對映體的分析檢測中具有巨大的優越性。2、本發明利用PEEK管連接切換閥的接口，形成切換閥在不同位置時，限進填料柱、手性固定相、檢測器流路之間的改變，通過改變切換閥的位置，從而實現生物體液中手性藥物單一對映體濃度的快速、在線測定。3、本發明具有特異性高、重現性好、靈敏度高、分析速度快，操作簡單等特點，並可適用於手性藥物單一對映體的藥代動力學研究。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細的說明。圖1為本發明實施例1空白血漿的色譜圖。圖2為本發明實施例lR(+)-、S(-)_普萘洛爾對映體的色譜圖。圖3為本發明實施例2空白血漿的色譜圖。
圖4為本發明實施例2R(+)_、S(-)_普萘洛爾對映體的色譜圖。圖5為本發明實施例3R(+)_、S(-)_普萘洛爾對映體的色譜圖。圖6為本發明實施例4R(+)_、S(-)_普萘洛爾對映體的色譜圖。
具體實施例方式實施例1柱切換-液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法，包括以下步驟(1)將手性藥物消旋體標準品——鹽酸普萘洛爾消旋體標準品在20°C的溫度下用無水乙醇溶解，製成濃度為5mg/mL的標準溶液；該標準溶液在20°C的溫度下用空白血漿 (參見圖1)稀釋，製成濃度為0. 5mg/mL的血漿樣品。(2)將血漿樣品置1. 5mL具塞離心試管中，以4000r/min的轉速離心5min，精密吸
取上清液置於一離心試管中作進樣備用。(3)製備限進填料柱將粒徑為5μπι的矽膠外表面鍵合親水性的聚乙烯醇，其內表面鍵合非極性的己胺，形成內徑為4. 6mm、長度為45mm的內表面反相限進填料柱。(4)製備手性固定相將粒徑為5μπι的矽膠表面塗覆有3，5-二甲基氨基苯甲酸酯的內徑為4. 6mm、長度為250mm的手性AE. Lichrom CE 4色譜柱構成手性固定相I ；將粒徑為5μπι的矽膠表面塗覆有4-甲基氨基苯甲酸酯的內徑為4. 6mm、長度為250mm的手性 AE. Lichrom CE 7色譜柱構成手性固定相II。(5)將手性固定相I和手性固定相II分別與限進填料柱相連，並將限進填料柱作為預處理柱、手性固定相作為分析柱放入柱切換限進填料_手性固定相高效液相色譜系統中；預處理柱與分析柱之間通過聚醚醚酮(PEEK)樹脂管連接，該聚醚醚酮(PEEK)樹脂管上設有切換閥；分析柱外接紫外檢測器。切換閥的切換時間為Imin 5min。利用PEEK管連接切換閥，實現分析流路的改變，通過改變切換閥的位置，實現預處理柱的除去血漿中的幹擾物質及血漿中鹽酸普萘洛爾對映體濃度的測定。(6)將步驟(2)所得的血漿樣品上清液注入到柱切換限進填料_手性固定相高效液相色譜系統中的進樣器，以硼酸鹽緩衝液-甲醇為預處理柱流動相，以硼酸鹽緩衝液-異丙醇-無水乙醇為分析柱流動相，在紫外檢測波長為293nm、預處理流動相流速為LOmL/ min、分析流動相流速為0. SmL/min、溫度為25°C的條件下進行分離，得到R(+)_普萘洛爾對映體的出峰時間在16. 5 18. 9min範圍內、S (-)-普萘洛爾對映體的出峰時間在19. 0 22. 2min範圍內色譜圖(參見圖2)。其中預處理柱流動相中的硼酸鹽緩衝液與甲醇的體積比(mL/mL)為95 5。分析柱流動相中的硼酸鹽緩衝液與異丙醇、乙醇的體積比(mL/mL)為 40 30 30。硼酸鹽緩衝液是指將0. 05mol/L的硼砂溶液與0. 2mol/L的硼酸溶液按照1 9 的體積比(mL/mL)配製的pH值為8. 5的溶液。實施例2柱切換_液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法，包括以下步驟(1)將手性藥物消旋體標準品——鹽酸普萘洛爾消旋體標準品在30°C的溫度下用無水乙醇溶解，製成濃度為4mg/mL的標準溶液；該標準溶液在30°C的溫度下用空白血漿(參見圖3)稀釋，製成濃度為1. 5mg/mL的血漿樣品。(2)將血漿樣品置2. OmL具塞離心試管中，以2000r/min的轉速離心3min，精密吸
取上清液置於一離心試管中作進樣備用。(3)製備限進填料柱將粒徑為5μπι的矽膠外表面鍵合親水性的聚乙烯醇，其內表面鍵合非極性的己胺，形成內徑為4. 6mm、長度為45mm的內表面反相限進填料柱。(4)製備手性固定相將粒徑為5μπι的矽膠表面塗覆有3，5-二甲基氨基苯甲酸酯的內徑為4. 6mm、長度為250mm的手性AE. Lichrom CE 4色譜柱構成手性固定相I ；將粒徑為5μπι的矽膠表面塗覆有4-甲基氨基苯甲酸酯的內徑為4. 6mm、長度為250mm的手性 AE. Lichrom CE 7色譜柱構成手性固定相II。(5)將手性固定相I和手性固定相II分別與限進填料柱相連，並將限進填料柱作為預處理柱、手性固定相作為分析柱放入柱切換限進填料_手性固定相高效液相色譜系統中；預處理柱與分析柱之間通過聚醚醚酮(PEEK)樹脂管連接，該聚醚醚酮(PEEK)樹脂管上設有切換閥；分析柱外接紫外檢測器。切換閥的切換時間為Imin 5min。利用PEEK管連接切換閥，實現分析流路的改變，通過改變切換閥的位置，實現預處理柱的除去血漿中的幹擾物質及血漿中鹽酸普萘洛爾對映體濃度的測定。(6)將步驟(2)所得的血漿樣品上清液注入到柱切換限進填料_手性固定相高效液相色譜系統中的進樣器，以硼酸鹽緩衝液-甲醇為預處理柱流動相，以硼酸鹽緩衝液-異丙醇-無水乙醇為分析柱流動相，在紫外檢測波長為230nm、預處理流動相流速為1. 2mL/ min、分析流動相流速為1. OmL/min、溫度為30°C的條件下進行分離，得到R(+)_普萘洛爾對映體的出峰時間在25. O 28. 2min範圍內、S (-)-普萘洛爾對映體的出峰時間在28. 2 31. 3min範圍內色譜圖(參見圖4)。其中預處理柱流動相中的硼酸鹽緩衝液與甲醇或水與甲醇的體積比為90 10。分析柱流動相中的硼酸鹽緩衝液與異丙醇、乙醇的體積比為50 20 30。硼酸鹽緩衝液是指將0. 05mol/L的硼砂溶液與0. 2mol/L的硼酸溶液按照8 2 的體積比配製的PH值為9. O的溶液。實施例3柱切換_液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法，包括以下步驟(1)將手性藥物消旋體標準品——鹽酸普萘洛爾消旋體標準品在5°C的溫度下用無水乙醇溶解，製成濃度為4. 5mg/mL的標準溶液；該標準溶液在5°C的溫度下用空白血漿稀釋，製成濃度為1. Omg/mL的血漿樣品。(2)將血漿樣品置ImL具塞離心試管中，以lOOOr/min的轉速離心lOmin，精密吸
取上清液置於一離心試管中作進樣備用。(3)製備限進填料柱將粒徑為5μπι的矽膠外表面鍵合親水性的聚乙烯醇，其內表面鍵合非極性的己胺，形成內徑為4. 6mm、長度為45mm的內表面反相限進填料柱。(4)製備手性固定相將粒徑為5μπι的矽膠表面塗覆有3，5-二甲基氨基苯甲酸酯的內徑為4. 6mm、長度為250mm的手性AE. Lichrom CE 4色譜柱構成手性固定相I ；將粒徑為5μπι的矽膠表面塗覆有4-甲基氨基苯甲酸酯的內徑為4. 6mm、長度為250mm的手性 AE. Lichrom CE 7色譜柱構成手性固定相II。(5)將手性固定相I和手性固定相II分別與限進填料柱相連，並將限進填料柱作為預處理柱、手性固定相作為分析柱放入柱切換限進填料_手性固定相高效液相色譜系統中；預處理柱與分析柱之間通過聚醚醚酮(PEEK)樹脂管連接，該聚醚醚酮(PEEK)樹脂管上設有切換閥；分析柱外接紫外檢測器。切換閥的切換時間為Imin 5min。利用PEEK管連接切換閥，實現分析流路的改變，通過改變切換閥的位置，實現預處理柱的除去血漿中的幹擾物質及血漿中鹽酸普萘洛爾對映體濃度的測定。(6)將步驟(2)所得的血漿樣品上清液注入到柱切換限進填料_手性固定相高效液相色譜系統中的進樣器，以硼酸鹽緩衝液-甲醇或水-甲醇為預處理柱流動相，以硼酸鹽緩衝液_異丙醇_無水乙醇為分析柱流動相，在紫外檢測波長為350nm、預處理流動相流速為0. 5mL/min、分析流動相流速為0. 5mL/min、溫度為15°C的條件下進行分離，得到R(+) _普萘洛爾對映體的出峰時間在33. 7 37. 4min範圍內、S (-)-普萘洛爾對映體的出峰時間在 37. 4 42. Imin範圍內色譜圖(參見圖5)。其中預處理柱流動相中的水與甲醇的體積比為98 2。分析柱流動相中的硼酸鹽緩衝液與異丙醇、乙醇的體積比為70 10 20。硼酸鹽緩衝液是指將0. 05mol/L的硼砂溶液與0. 2mol/L的硼酸溶液按照5 5 的體積比配製的PH值為7. 0的溶液。實施例4柱切換_液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法，包括以下步驟(1)將手性藥物消旋體標準品——鹽酸普萘洛爾消旋體標準品在25°C的溫度下用無水乙醇溶解，製成濃度為5mg/mL的標準溶液；該標準溶液在25°C的溫度下用空白血漿稀釋，製成濃度為0. 5mg/mL的血漿樣品。(2)將血漿樣品置5mL具塞離心試管中，以8000r/min的轉速離心4min，精密吸取
上清液置於一離心試管中作進樣備用。(3)製備限進填料柱將粒徑為5μπι的矽膠外表面鍵合親水性的聚乙烯醇，其內表面鍵合非極性的己胺，形成內徑為4. 6mm、長度為45mm的內表面反相限進填料柱。(4)製備手性固定相將粒徑為5μπι的矽膠表面塗覆有3，5-二甲基氨基苯甲酸酯的內徑為4. 6mm、長度為250mm的手性AE. Lichrom CE 4色譜柱構成手性固定相I ；將粒徑為5μπι的矽膠表面塗覆有4-甲基氨基苯甲酸酯的內徑為4. 6mm、長度為250mm的手性 AE. Lichrom CE 7色譜柱構成手性固定相II。(5)將手性固定相I和手性固定相II分別與限進填料柱相連，並將限進填料柱作為預處理柱、手性固定相作為分析柱放入柱切換限進填料_手性固定相高效液相色譜系統中；預處理柱與分析柱之間通過聚醚醚酮(PEEK)樹脂管連接，該聚醚醚酮(PEEK)樹脂管上設有切換閥；分析柱外接紫外檢測器。切換閥的切換時間為Imin 5min。利用PEEK管連接切換閥，實現分析流路的改變，通過改變切換閥的位置，實現預處理柱的除去血漿中的幹擾物質及血漿中鹽酸普萘洛爾對映體濃度的測定。(6)將步驟(2)所得的血漿樣品上清液注入到柱切換限進填料_手性固定相高效液相色譜系統中的進樣器，以硼酸鹽緩衝液-甲醇或水-甲醇為預處理柱流動相，以硼酸鹽緩衝液_異丙醇_無水乙醇為分析柱流動相，在紫外檢測波長為300nm、預處理流動相流速為2. OmL/min、分析流動相流速為2. OmL/min、溫度為40°C的條件下進行分離，得到R(+) _普萘洛爾對映體的出峰時間在15. 5 17. 3min範圍內、S (-)-普萘洛爾對映體的出峰時間在17. 3 20. 8min範圍內色譜圖(參見圖6)。其中預處理柱流動相中的硼酸鹽緩衝液與甲醇或水與甲醇的體積比為30 70。分析柱流動相中的硼酸鹽緩衝液與異丙醇、乙醇的體積比為10 40 50。所述硼酸鹽緩衝液是指將0. 05mol/L的硼砂溶液與0. 2mol/L的硼酸溶液按照 7 3的體積比配製的pH值為9. 5的溶液。
權利要求
1.柱切換-液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法，包括以下步驟(1)將手性藥物消旋體標準品在5 30°C的溫度下用無水乙醇溶解，製成濃度為4mg/ mL 5mg/mL的標準溶液；該標準溶液在5 30°C的溫度下用空白血漿稀釋，製成濃度為 0. 5mg/mL 1. 5mg/mL的血漿樣品；(2)將所述血漿樣品置ImL 5mL具塞離心試管中，以1000 8000r/min的轉速離心 3 lOmin，精密吸取上清液置於一離心試管中作進樣備用；(3)製備限進填料柱將粒徑為5μπι的矽膠外表面鍵合親水性的聚乙烯醇，其內表面鍵合非極性的己胺，形成內徑為4. 6mm、長度為45mm的內表面反相限進填料柱；(4)製備手性固定相將粒徑為5μ m的矽膠表面塗覆有3，5- 二甲基氨基苯甲酸酯的內徑為4. 6mm、長度為250mm的手性AE. Lichrom CE 4色譜柱構成手性固定相I ；將粒徑為5μπι的矽膠表面塗覆有4-甲基氨基苯甲酸酯的內徑為4. 6mm、長度為250mm的手性 AE. Lichrom CE 7色譜柱構成手性固定相II ；(5)將所述手性固定相I和所述手性固定相II分別與所述限進填料柱相連，並將所述限進填料柱作為預處理柱、所述手性固定相作為分析柱放入柱切換限進填料_手性固定相高效液相色譜系統中；所述預處理柱與所述分析柱之間通過聚醚醚酮樹脂管連接，該聚醚醚酮樹脂管上設有切換閥；所述分析柱外接紫外檢測器；(6)將所述步驟(2)所得的血漿樣品上清液注入到所述柱切換限進填料-手性固定相高效液相色譜系統中的進樣器，以硼酸鹽緩衝液-甲醇或水-甲醇為預處理柱流動相，以硼酸鹽緩衝液_異丙醇_無水乙醇為分析柱流動相，在紫外檢測波長為230 350nm、預處理流動相流速為0. 5mL/min 2. OmL/min、分析流動相流速為0. 5mL/min 2. OmL/min、溫度為15 40°C的條件下進行分離，得到不同出峰時間不同單一對映體的色譜圖。
2.如權利要求1所述的柱切換_液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法，其特徵在於所述步驟(1)中的手性藥物消旋體標準品是指鹽酸普萘洛爾消旋體標準品。
3.如權利要求1所述的柱切換_液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法，其特徵在於所述步驟(5)中的切換閥的切換時間為Imin 5min。
4.如權利要求1所述的柱切換_液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法，其特徵在於所述步驟(6)中預處理柱流動相中的硼酸鹽緩衝液與甲醇或水與甲醇的體積比為30 98 2 70。
5.如權利要求1所述的柱切換_液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法， 其特徵在於所述步驟(6)中分析柱流動相中的硼酸鹽緩衝液與異丙醇、乙醇的體積比為 10 70 10 40 20 50。
6.如權利要求4或5所述的柱切換-液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法，其特徵在於所述硼酸鹽緩衝液是指將0. 05mol/L的硼砂溶液與0. 2mol/L的硼酸溶液按照1 8 2 9的體積比配製的pH值為7. O 9. 5的溶液。
全文摘要
本發明涉及一種柱切換-液相色譜分析生物體液中手性藥物對映體的方法，該方法包括以下步驟(1)將手性藥物消旋體標準品製成一定濃度的標準溶液；將該標準溶液稀釋成一定濃度的血漿樣品；(2)將血漿樣品離心，取上清液作進樣備用；(3)製備限進填料柱；(4)製備手性固定相；(5)將限進填料柱作為預處理柱、手性固定相作為分析柱放入柱切換限進填料-手性固定相高效液相色譜系統中；(6)將血漿樣品上清液注入到柱切換限進填料-手性固定相高效液相色譜系統中的進樣器，以硼酸鹽緩衝液-甲醇或水-甲醇為預處理柱流動相，以硼酸鹽緩衝液-異丙醇-無水乙醇進行分離，得到不同出峰時間不同單一對映體的色譜圖。本發明具有快速、方便、靈敏的特點。
文檔編號G01N30/88GK102323368SQ20111021857
公開日2012年1月18日 申請日期2011年7月29日 優先權日2011年7月29日
發明者張娟紅, 武曉玉, 王榮, 謝華, 賈正平 申請人:賈正平